يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

التأثيرات العلاجية لتركيبة شينغدو بينغمو على الإمساك الناتج عن اللوبيراميد في الفئران عبر إشارات PI3K/AKT وتنظيم ميكروبيوم الأمعاء

123 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70470

⸱

مايو 12, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, 2Guangzhou University of Chinese Medicine,, 3Shenzhen Luohu Hospital of Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تظهر هذه الدراسة أن تركيبة شينغدو بينغمو تخفف الإمساك لدى الفئران من خلال زيادة محتوى ماء البراز ودفع الأمعاء. ترتبط التأثيرات بتنشيط مسار PI3K/AKT، وزيادة تنظيم AQP3 وAQP8، وتعديل تركيب ميكروبيوم الأمعاء.

الملخص

الإمساك هو اضطراب شائع في الجهاز الهضمي، وغالبا ما تكون للعلاجات الحالية حدود. تركيبة شينغدو بينغمو (SDPF)، وهي تركيبة معدلة مشتقة من الطب الصيني التقليدي، استخدمت سريريا لعلاج الإمساك، لكن آلية عملها لا تزال غير واضحة. استخدمت هذه الدراسة تحليل UPLC-Q/TOF-MS لتحديد 188 مركبا في SDPF، تم تأكيد 50 منها بشكل قاطع. في التجارب الحيوانية، عزز علاج SDPF دفع الأمعاء، وزاد محتوى ماء البراز، وقصر الوقت حتى البراز الأسود. أشارت تحليلات علم الأدوية الشبكي والالتحام الجزيئي إلى تورط مسار PI3K/AKT، والذي تم التحقق منه لاحقا من خلال ملاحظة زيادة في تنظيم هذا المسار وزيادة تعبير AQP3 وAQP8 في المستقيم. علاوة على ذلك، كشف تسلسل جينات 16S rRNA أن SDPF أعاد توازن ميكروبيوم الأمعاء عن طريق رفع البكتيريا المفيدة مثل اللاكتوباسيلوس والبكتيرويدات مع تقليل البكتيريا المرتبطة بالالتهابات. بشكل جماعي، يخفف SDPF الإمساك بشكل فعال من خلال آليات تنظم مسار PI3K/AKT وتنظم ميكروبيوم الأمعاء.

المقدمة

الإمساك هو اضطراب هضمي واسع الانتشار يتميز بحركات الأمعاء النادرة، والإجهاد، والبراز الصلب، ويؤثر على حوالي 20٪ من سكان العالم مع آثار اجتماعية واقتصادية كبيرة1. الإمساك المزمن لا يسبب فقط مضاعفات جسدية مثل البواسير، وشقوق الشرج، وانحناءات البراز، بل يساهم أيضا في الضيق النفسي، بما في ذلك القلق والاكتئاب، مما يؤثر بشدة على جودة حياة المرضى2. العلاجات التقليدية، بما في ذلك الملينات الأسموزية ومكملات الألياف الغذائية، غالبا ما تعطي نتائج غير مثالية بسبب محدودية الفعالية، والآثار الجانبية المحتملة، وخطر الاعتماد3. يقدم الطب الصيني التقليدي (TCM) نهجا شاملا، يستخدم التركيبات العشبية والوخز بالإبر لتنظيم حركة الأمعاء من خلال استعادة تدفق الطاقة والتوازن الداخلي الحشوي4. ومع ذلك، فإن غياب البروتوكولات الموحدة والوضوح الآلي يحد من التبني السريري الأوسع. تسلط الأبحاث الناشئة الضوء على إمكانات التدخلات الجديدة، مثل تعديل ميكروبيوم الأمعاء والمركبات النشطة حيويا المشتقة من طب الطب الصيني الصيني، والتي قد تعزز بشكل تآزري وظيفة الأمعاء مع أقل آثار جانبية5. وبالتالي، فإن تطوير علاج تكاملي قائم على الأدلة يجمع بين مبادئ الطب الصيني التقليدي والعلاج الدوائي الحديث يحمل وعدا لإحداث ثورة في إدارة الإمساك.

الإمساك البطيء أثناء العبور (STC) هو نموذج مرضي حيوي في الأبحاث الأساسية، يحاكي بفعالية اضطراب الحركة المميز لإمساك الإنسان — وهو تأخير كبير في عبور القولون6. يعمل ك"مفكك" لتوضيح الآليات الجزيئية للإمساك، مما يمكن الباحثين من فحص التغيرات المرضية مباشرة في نسيج المستقيم7، والجهاز العصبي المعوي8، والخلايا الخلالية في كاخال9، ومسارات الإشارات الرئيسية10، مما يربط الأعراض الكبيرة باضطرابات خلوية وجزيئية تتجاوز متناول الدراسات السريرية11. على الصعيد الدولي، تشمل الطرق المعتمدة لتطوير نماذج الفئران STC بشكل رئيسي الطرق الكيميائية12، لا سيما استخدام لوبراميد — وهو منبه مستقبلات الأفيون الطرفية الذي يثبط نشاط الخلايا العصبية وإفراز الأسيتيل كولين لتحفيز مرور متأخر بشكل مستمر خلال 5–7 أيام — واستراتيجيات تقليد الأسباب13، مثل إعطاء ملين منشط عالي الجرعة طويلة الأمد، مما يؤدي إلى ضعف الأعصاب القولونية، الميلانوزيس القولوني. وبعد ذلك قصور القولون المعتمد على الملين. لذا، فإن نموذج الفئران في STC لا يوفر فقط نافذة إلى التعقيد في أسباب الإمساك، بل يعمل أيضا كجسر حيوي يربط بين الرؤى الميكانيكية الأساسية والتطبيقات السريرية.

تركيبة شينغدو بينغمو (SDPF)، التي تتكون من Radix Paeoniae Alba (بايشاو)، Curcuma longa (جيانغهوانغ)، Rhizoma cibotii (تانغغوجي)، Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao)، وClematis chinensis Osbeck (ويلينغشيان)، هي تحضير مستشفيات معدل مستمد من نظرية الطب الصيني التقليدي وقد استخدم منذ زمن طويل في قسمنا للاضطرابات ذات الصلة. أشارت الملاحظات السريرية الأولية من مستشفانا إلى أن SDPF قد يخفف من أعراض الإمساك (بيانات غير منشورة). أظهرت الأبحاث أن مسار إشارات PI3K/AKT يشارك في تنظيم حركة القولون14، حيث قد تلعب ميكروبيوميات الأمعاء ومستقلباتها دورا حاسما من خلالتعديل أنشطة العضلات المعوية والعضلات الملساء. ومع ذلك، لا تزال الآليات التنظيمية الدقيقة غير مفهومة بشكل كامل. نقترح أن يشكل مسار PI3K/AKT وميكروبيوم الأمعاء معا محورا أساسيا لتنظيم حركة القولون. يفترض أن التأثيرات العلاجية لتركيبات الطب الصيني التقليدي على خلل حركة القولون قد تكون مرتبطة بتعديل مسار PI3K/AKT وإعادة توازن محور الميكروبيوتا والأمعاء. تعالج هذه الدراسة هذه الفجوة من خلال اقتراح واختبار فرضية جديدة ومتكاملة: أن مسار PI3K/AKT وميكروبيوم الأمعاء يعملان كمحور حيوي ومترابط لحركة القولون. الهدف الأساسي من هذا العمل هو تحديد ما إذا كان التأثير العلاجي ل SDPF على الإمساك بطيء العبور يتم بواسطة التعديل المزدوج لهذا المحور. وبشكل خاص، باستخدام نموذج الفئران، بحثنا في تأثيرات SDPF على بروتينات الإشارة الرئيسية PI3K/AKT، والتحولات في تركيب ميكروبيوم الأمعاء، ووظيفة حركة القولون. من خلال توضيح هذه الآلية المشتركة، توفر هذه البحث، حسب علمنا، أول دليل تجريبي لمحور الميكروبيوتا-PI3K/AKT كهدف موحد للتدخل القائم على الطب الصيني التقليدي، مما يوفر أساسا جزيئيا أكثر شمولا لعلاج اضطرابات حركة القولون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا لدليل العناية واستخدام الحيوانات المخبرية (المعاهد الوطنية للصحة، معدل 2011) وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات في جامعة شاندونغ للطب الصيني التقليدي (رقم رخصة أخلاقيات الرفاهية: SDUTCM20250421238).

تحضير SDPF
يتكون الخليط العشبي من Radix Paeoniae Alba (Baishao) ب 20 جرام، وCurcuma longa (جيانغهوانغ) 10 جرام، وريزوما سيبوتي (Tanggouji) 10 جرام، وسيغسبيكيا أورينتاليس L. (Xixiancao) 30 جرام، وClematis chinensis Osbeck (ويلنغشيان) 30 جرام. تم تحديد هذه النسبة بناء على الخبرة السريرية. تم استخراج التركيبة أولا عن طريق نقعها في ماء منزوع الأيونات بنسبة 1:9 إلى سائل 1:9 (جم/مل) لمدة 30 دقيقة، ثم غليها لمدة 60 دقيقة. تم ترشيح المحلول الناتج فورا عبر الشاش وتم تخصيصه بقوة 4,500 × جرام لمدة 5 دقائق لجمع السوبرناتانت. ثم يعاد استخراج البقايا مرتين تحت نفس الظروف (نسبة 1:9، ماء منزوع الأيون) مع تقليل وقت الغليان بمقدار 30 دقيقة لكل استخراج لاحق. تم دمج المواد الفائقة من جميع الاستخلاصات الثلاثة وتركيزها وتجفيفها بالتجميد بفراغ لمدة 5–7 أيام للحصول على مسحوق SDPF، الذي كان يخزن في التبريد للاستخدام لاحقا.

تحليل المكونات ل SDPF
لتحضير عينات صلبة، تم نقل كمية مناسبة من المادة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 2 مل، مع 1 مل من 70٪ ميثانول في الماء وخرز الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 3 مم، ثم معالجته في مطحنة آلية لمدة 3 دقائق، تليها 10 دقائق من الدوامة. تم تخفيف العينات السائلة بالميثانول النقي وتحويلها إلى دوامة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، تم طرد جميع العينات بحرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم ترشيح المواد الفائقة الناتجة عبر مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر. قبل التحليل الأداتي، تم دمج 2-كلوروفينيل ألانين (المعيار الداخلي، 100 ميكروغرام/مل) في الترشيح لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1 ملغ/لتر. تم إجراء فصل كروماتوغرافي على نظام LC-MS مزود بعمود C18 (1.8 ميكرومتر × 2.1 مم × 100 مم)، يحافظ عليه عند 30 درجة مئوية، بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة. تكونت المرحلة المتحركة من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الماء (A) وأسيتونيتريل نظيف (B). تم ضبط حجم الحقن على 2 ميكرولتر، وتم الحفاظ على جهاز الأخذ التلقائي عند 4 درجات مئوية. تم إجراء كشف الطيف الكتلي في أوضاع التأين الإيجابية والسالبة تحت الظروف التالية: درجة حرارة المسخن عند 325 درجة مئوية، غاز الغلاف عند 45 وحدة عشوائية، غاز مساعد عند 15 أرب، غاز المسح عند 1 أرب، جهد الارتعاش الكهربائي عند 3.5 كيلو فولت، درجة حرارة الشعيرات عند 330 درجة مئوية، ومستوى راديو العدسة S-Lens عند 55٪. تم جمع البيانات عبر نطاق m/z من 100–1500 في وضع MS الكامل بدقة 120,000، بينما تم تنفيذ تجزئة MS/MS في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات (dd-MS2، TopN=5) بدقة 60,000 باستخدام تفكك تصادم عالي الطاقة.

تجربة حيوانية
اثنان وسبعون ذكرا من جرذ سبراج-داولي (بعمر 6 أسابيع، وزن الجسم الأولي 180–200 جم؛ RRID: IMSR_JAX:000664) تم إيواؤهم تحت ظروف حماية الشمس (24 ± 1 درجة مئوية، دورة ضوء/ظلام 12 ساعة) مع وصول مجاني للطعام والماء. بعد أسبوع واحد من التكيف، تم تقسيمها عشوائيا إلى ست مجموعات (n=12/مجموعة) بناء على وزن الجسم: (1) مجموعة التحكم الفارغ (محلول ملحي طبيعي)، (2) مجموعة نموذج الإمساك (10 ملغ/كغ هيدروكلوريد لوبراميد)، (3) منخفضة (SDPF-L)-، (4) متوسطة (SDPF-M)-، و(5) مجموعات SDPF عالية (SDPF-H) (6، 9، و12 جرام/كجم على التوالي)، و(6) مجموعة ضابطة إيجابية (2 ملغ/كغ سترات موبرايد). تم تحضير SDPF حديثا كتعليق في ماء مقطر بتركيزات 3، 4.5، و6 جرام/مل، وأعطي بواسطة التمهيد الفموي بحجم ثابت 2 مل/كغ، وهو ما يعادل جرعات 6، 9، و12 جم/كجم على التوالي. تم تحضير هيدروكلوريد لوبيراميد حديثا كتعليق في ماء مقطر بتركيز 5 ملغ/مل، وتم إعطاؤه بواسطة الغافج الفموي بحجم ثابت 2 مل/كجم (ما يعادل 10 ملغ/كجم). بعد أسبوع من التأقلم، تم تحفيز الإمساك في مجموعات (2) – (6) عن طريق التجويف الفموي من لوبيراميد هيدروكلوريد مرة واحدة يوميا لمدة أسبوع. تلقت مجموعة التحكم الفارغة كمية مكافئة من المحلول الملحي الطبيعي. لاحقا، خلال الأسبوع التالي، تلقت الفئران في المجموعات (3)–(5) علاج SDPF عبر التمداد الفموي مرة واحدة يوميا، وتلقت مجموعة الضابط الإيجابية (6) أيضا سترات الموسابريد (2 ملغ/كغ) في نفس الوقت، بينما استمرت الفئران في المجموعات (2) – (6) في تلقي هيدروكلوريد لوبيراميد (10 ملغ/كغ) مرة واحدة يوميا للحفاظ على نموذج الإمساك. استمرت مجموعة التحكم الفارغ في تلقي محلول ملحي طبيعي. في نهاية فترة العلاج، تم صيام جميع الفئران طوال الليل مع إمكانية الوصول إلى الماء مجانا. ثم تم تخدير الحيوانات بحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (40 ملغ/كجم من وزن الجسم). بعد تخدير عميق تم تأكيده بغياب ردود فعل الدواسات، تم القتل الرحيم للفئران بسبب خلع عنق الرحم. وبعد ذلك مباشرة، تم جمع الأنسجة الشرجية بسرعة. في التحليلات الأنسجة والكيميائية المناعية، تم تثبيت أجزاء الأنسجة في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪. لتحليل تعبير البروتين، تم تجميد عينات الأنسجة بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

أول براز أسود
تم تسجيل وقت إخراج أول براز أسود لثلاثة فئران لكل مجموعة. قبل التجربة، كانت جميع الفئران تصوم لمدة 12 ساعة مع وصول مجاني للماء. بعد ذلك، تلقى كل حيوان إعطاءا داخل المعدة لتعليق الحبر المحضر (5٪ فحم نشط و5٪ صمغ عربي) بجرعة 10 مل/كجم من وزن الجسم، مع تسجيل الوقت الدقيق للإعطاء. بعد الحصانة، تم وضع الفئران بشكل فردي في أقفاص منفصلة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بشكل مرضي. تمت ملاحظة وتسجيل مظهر أول براز أسود من كل فأر بعناية لحساب وقت عبور الأمعاء.

محتوى الماء البراز
بعد تأسيس النموذج بنجاح وفي نهاية العلاج، تم جمع عينات براز طازجة تم إخراجه خلال ساعتين من كل مجموعة من الفئران (n = 6) ووضعها في أنابيب EP جافة تم وزنها مسبقا. تم تسجيل الوزن الرطب للبراز على الفور. بعد ذلك، تم نقل العينات إلى فرن تجفيف وجففها عند 60 درجة مئوية لمدة 36 ساعة. بعد فترة التجفيف الأولية، تم وزن العينات وإعادتها إلى الفرن، مع تكرار قياسات الوزن كل ساعتين حتى يتم تحقيق وزن ثابت (مما يشير إلى الجفاف الكامل). ثم تم حساب نسبة محتوى ماء البراز باستخدام الصيغة التالية:

محتوى ماء البراز (٪) = [(الوزن الرطب - الوزن الجاف) / الوزن الرطب] × 100٪

معدل الدفع المعوي
بعد فترة صيام استمرت 12 ساعة (مع وصول مجاني للماء)، تم إعطاء جرذان من كل مجموعة (n = 6) جرعة داخل المعدة (10 مل/كغ) من تعليق الحبر تحتوي على 5٪ فحم نشط و5٪ صمغ عربي. بعد خمسة وعشرين دقيقة، تم تخدير الحيوانات عن طريق حقن داخلي الصفاقي لهيدرات كلورال بنسبة 5٪. تم تعقيم منطقة البطن عن طريق المسح بنسبة 75٪ من الإيثانول قبل جمع الأنسجة، ثم تم تثبيت الأطراف على لوح تشريح. تم كشف تجويف البطن بعناية بالمقص الجراحي، وتم استئصال الجهاز الهضمي من البواب إلى الوصلة اللفائفي البحرية. تم فرد الأمعاء المعزول على ورق مرشح معقم، وتم تسجيل قياسين: (1) الطول الكلي للأمعاء الدقيقة، و(2) المسافة التي قطعها جبهة الحبر. ثم تم حساب نسبة الدفع المعوي باستخدام الصيغة التالية:

معدل الدفع المعوي (٪) = (مسافة هجرة الحبر / الطول الكلي للأمعاء) × 100٪

التلوين
بالنسبة لمجموعات الضابطة، والنموذج، وSDPF-M، وMos (n = 3 لكل مجموعة)، تم جمع ومعالجة عينات مستقيمة لتلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE). تم تثبيت العينات في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪، وجففت بالإيثانول المتدرج، وتم دمجها في كتل البارافين. تم تجهيز وتثبيت مقاطع رقيقة بسماكة 4–5 ميكرومتر، على شرائح زجاجية قبل الخضوع لصبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين التقليدي. بدأ الإجراء بإزالة البارافين باستخدام الزيلين، تلاها إعادة الترطيب عبر سلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة. تم صبغ النوى بتعريض أجزاء للهيماتوكسيلين لمدة 5–8 دقائق. بعد التمايز في الكحول الحمضي بنسبة 1٪ والتلوين في ماء الأمونيا بنسبة 0.2٪، تم صبغ السيتوبلازم والمصفوفة خارج الخلية بالإيوزين لمدة دقيقة إلى دقيقتين. وأخيرا، تم تجفيف الأجزاء المصبوغة، وإزالتها، وتركيبها بأغطية للمراقبة المجهرية. مكن هذا النهج من تقييم دقيق لشكل الغشاء المخاطي في الأمعاء، بما في ذلك بنية الزغابات والسرداب، وحالة الخلايا الطهارية، ووجود تسربات التهابية داخل الصفيحة المعدنية.

تحليل مسار KEGG وتحليل إثراء GO
وباستخدام الملف الكيميائي السابق ل SDPF، تم تنفيذ توقعات السيليكو لأهداف البروتين لكل مكون باستخدام منصة SwissTargetPrediction. تم تصفية الأهداف المفترضة المتعلقة بالإمساك وخضوعها للتعليقات الوظيفية باستخدام قاعدة بيانات DAVID 6.8، مع حد للدلالة عند P < 0.05. تم لاحقا تخضع مجموعة الجينات الناتجة لتصنيف GO لتوضيح أدوارها في العمليات البيولوجية، والوظائف الجزيئية، ومكونات الخلية. ولتوضيح دورها في مسببات المرض، تم ربط هذه الأهداف لاحقا بمسارات KEGG، كاشفة عن عدة سلسلة إشارات أثريت بشكل كبير وربما كانت مرتبطة ببداية وتطور الإمساك.

بناء شبكة "المكون-الهدف-المسار"
تم تجميع شبكة "المكون-الهدف-المسار" في Cytoscape (الإصدار 3.6.1) من خلال دمج المكونات الكيميائية ل SDPF بشكل منهجي، وأهدافها العلاجية المقابلة للإمساك، والمسارات المغنية ذات الصلة. داخل هذا النموذج الرسومي، تم استخدام هندسات عقد مختلفة لتمثيل أنواع البيانات الثلاثة: دوائر للمركبات، ومثلثات للأهداف، ومستطيلات للمسارات. تم قياس قوة الروابط بين هذه العقد من خلال وزن الحواف، مما وفر رؤية شاملة للتفاعلات الدوائية المعقدة والمتعددة الطبقات.

الالتحام الجزيئي
لتحليل الالتحام الجزيئي، تم اختيار أربعة مركبات نشطة حيويا—وهي السيكلوكوركومين، الألبيفلورين، حمض الكلوروجينيك، والكويرسيتين—كجزيئات رابطية، وتم تحميل هياكلها من قاعدة بيانات PubChem باستخدام أرقام سجل CAS المقابلة. لتحضير مستقبلات البروتين، تم استشارة قاعدة المعرفة في UniProt لتأكيد البروتينات المستهدفة PI3K وAKT، وتم استرجاع هياكلها ثلاثية الأبعاد لاحقا من بنك بيانات البروتين RCSB. ثم تمت معالجة هذه البروتينات والهياكل المركبة في استوديو ديسكفري 2019، حيث أضيفت ذرات الهيدروجين، وتم تعيين الشحنات، وتحديد أنواع الذرات؛ بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد جيوب ارتباط محتملة على المستقبلات. تم حفظ الروابط والمستقبلات المحضرة لاحقا بصيغة PDBQT لمحاكاة الالتحط. تم تنفيذ عملية الالتحام بالتكوين التالي: نصف قطر تجمع وضعية 0.5، توليد 10 تشكيلات عشوائية للرابط، و10 اتجاهات تحسين. بعد الانتهاء من عمليات الالتحاط، تم تقييم وتصنيف مجمعات المرشحين وفقا لطاقاتهم الحرة المتوقعة للارتباط. تم اختيار وتصور أوضاع الربط الأكثر ملاءمة من حيث الطاقة باستخدام PyMOL لتوضيح التفاعلات بين الجزيئات الرئيسية.

الكيمياء المناعية النسية
تم تنظيف العينات المستقيمة المدمجة بالبارافين، المقطوعة إلى سمك 4 ميكرومتر والحصول عليها من مجموعات معالجة الضابطة، والنموذج، وSDPF-M، أولا من البارافين وترطيبها تدريجيا. تم كشف مواقع المستضدات عن طريق تسخين الشرائح في مخزن السيترات المعدل إلى درجة حموضة 6.0. لتهدئة البيروكسيدازات الداخلية، تم علاج الأنسجة بمحلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪، تلاها الحضانة باستخدام مصل الماعز الطبيعي لتقليل ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. ثم تم حضنة الأقسام طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع استهداف الأجسام المضادة الأولية PI3K الفوسفورية وAKT؛ كانت الأقسام المتوازية التي تم حضنها ب PBS بمثابة عناصر تحكم سلبية. بعد الغسل الشامل، تم تطبيق أجسام مضادة ثانوية مرافق بيروكسيداز الفجل الحار، وتم تطوير التلوين المناعي باستخدام كروموجين DAB تحت مراقبة مجهرية للتحكم في زمن التفاعل. وأخيرا، تم طلاء الأنسجة بشكل خفيف بالهيماتوكسيلين، وجففها عبر الكحوليات المصنفة، وإزالتها، وتركيبها. تم تقييم مستويات التعبير ل p-PI3K و p-AKT نوعيا بواسطة باحثين مستقلين تم تعميهما عن المجموعات التجريبية، وتم اختيار صور ممثلة لتوضيح الفروق بين المجموعات.

البلوط الغربي
تم شطف عينات الأنسجة المستقيمة من الفئران مرتين بمحلول ملحي مبرد بفوسفات مخزن قبل أن يتم توحيدها على الثلج لمدة 10 دقائق في حجم مناسب من محلول تحلل RIPA. بعد التجانس، تم طرد الخليط بقوة 15,000 × جرام، وتم الاحتفاظ بالسائل الفائق للتحليل. تم إجراء قياس البروتين باستخدام طريقة حمض البيسينشونيك. لاحقا، تم دمج العينات مع مخزن تحميل SDS وتفكيكها عبر الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم تم حل كميات البروتين المكافئة من خلال الرحلان الكهربائي الهلامي SDS-بولي أكريلاميد ونقلها كهربائيا إلى أغشية بولي فينيليدين ثنائية الفلوريد بحجم مسام 0.45 ميكرومتر. بعد النقل، تركت الأغشية لتجف بالهواء قبل أن تحجب بحليب جاف خالي من الدسم بنسبة 5٪ في TBST لمدة ساعة في درجة الحرارة المحيطة. بعد هذه الخطوة، تم غسل الأغشية ب TBST ثم حضنتها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف AQP3 (RRID: AB_2837708) وAQP8 (RRID: AB_605941). في اليوم التالي، وبعد غسلات إضافية باستخدام TBST، تم حضن الأغشية بالجسم المضاد الثانوي المناسب من الفجل الحار المرتبط ببيروكسيداز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم اكتشاف الأشرطة المناعية والتقاط الصداقة باستخدام نظام تصوير.

التألق المناعي
تم إجراء عملية التلوين المناعي على مقاطع نسيج المستقيم من فئران Control، Model، وSDPF-M كما يلي: بعد التقسيم بالتجميد، تم تثبيت الأنسجة في 4٪ بارافورمالديهايد، ونفرت بنسبة 0.1٪ من Triton X-100، وتم حجبها بحاجز مناسب لمنع الارتباط غير النوعي. ثم تم حضن الأقسام طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية ضد AQP3 وAQP8، ثم تم غسل الأجسام المضادة غير المرتبطة وحضانة الأنسجة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع مزيج من الأجسام المضادة الثانوية—وتحديدا، مضاد الأرانب IgG الماعز المرتبط ب Alexa Fluor 594 (أحمر) لتسمية AQP3، ومضاد الفأر IgG المضاد للماعز مرتبط بأليكسا فلور 488 (الأخضر) لتسمية AQP8. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية والغسلات اللاحقة، تم تلوين نوى الخلايا بمادة DAPI، وتم تغطية الشرائح بوسط تركيب مائي قبل التصوير والتقاط الصورة باستخدام المجهر الفلوري أو الكونفوكلي.

تسلسل 16S rRNA لميكروبيوم البراز
لكل مجموعة تجريبية (n = 8)، تم عزل الحمض النووي الجيني البكتيري من مادة فضلات الفئران باستخدام مجموعة استخراج DNA التربة التجارية، مع اتباع جميع الإجراءات بدقة لبروتوكول المورد. تم إجراء تضخيم PCR الذي استهدف مناطق المتغيرات الفائقة V3–V4 من جين 16S rRNA على جهاز دورة حراري باستخدام زوج البرايمر 338F/806R. تم إجراء تسلسل Amplicon على منصة Illumina MiSeq وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، مما أدى إلى توليد عمق تسلسل كاف لتحقيق تشبع منحنى الانكسار وضمان تحليل التنوع الميكروبي الموثوق. عند الانتهاء من التسلسل، تم تصفية القراءات الخام بجودة معينة، وإزالتها بواسطة المحولات، ودمجها باستخدام Trimmomatic وFLASH. تم تجميع التسلسلات عالية الجودة لاحقا في وحدات تصنيفية تشغيلية (OTUs) عند عتبة تشابه 97٪ باستخدام UPARSE، وتم تحديد وإزالة التسلسلات الكيميرية المحتملة باستخدام UCHIME. تم إجراء تعيين تصنيفي للتسلسلات الممثلة باستخدام مصنف RDP مقابل قاعدة بيانات سيلفا المرجعية، مع عتبة ثقة تبلغ 70٪. لتقييم التنوع الألفا داخل المجتمعات الميكروبية، تم حساب مقدر غنى Chao1 ومؤشر تنوع شانون باستخدام حزمة برنامج موثر (v.1.30.2). في تحليل التنوع البيتا، تم إجراء تحليل الإحداثيات الرئيسية لتصوير الاختلافات التركيبية بين المجموعات. تم إنشاء مخطط فين لتوضيح توزيع وحدات OTUs الفريدة والمشتركة عبر ظروف تجريبية مختلفة. تم تحديد الأنواع ذات الوفرة التفاضلية بين المجموعات باستخدام حجم تأثير التحليل الخطي المميز. أخيرا، تم إجراء تنبؤية لوظائف المجتمعات الميكروبية باستخدام PICRUSt2، الذي استنتج الجهد الوظيفي من تعليقات التهجئة في KEGG.

الإحصائيات
تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام SPSS 23.0 وGraphPad Prism 8.0. تعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تقييم توزيع البيانات الطبيعي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. للمقارنات بين مجموعتين، استخدم اختبار Student للعينات المستقلة t للبيانات الموزعة بشكل طبيعي، واختبار Mann–Whitney U للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي. للمقارنات التي تشمل ثلاث مجموعات أو أكثر، تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) يليه اختبار توكي بعد التوزيع للبيانات الموزعة بشكل طبيعي، بينما تم استخدام اختبار كروسكال–واليس الذي تلاه اختبار دان بعد التوزيع للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي. في تحليلات الميكروبيوم، تم تحديد الأنواع ذات الوفرة التفاضلية باستخدام حجم تأثير التحليل الخطي المميز (LEfSe) مع العتبة الافتراضية (درجة LDA > 2.0)، وتم تطبيق تصحيح متعدد الاختبارات باستخدام طريقة معدل الاكتشاف الخاطئ بنجاميني-هوشبرغ (FDR). تم إجراء تحليلات إحصائية للميكروبيوم باستخدام Mothur (v.1.30.2)، LEfSe (أداة إلكترونية، مختبر هاتنهاور)، وPICRUSt2 (v.2.5.0). تم اعتبار قيمة p أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخراج SDPF والتجميد الليوفيلي
SDPF هو تركيبة متعددة الأعشاب تتكون من خمسة نباتات طبية: Radix Paeoniae Alba (بايشاو)، Curcuma longa (جيانغهوانغ)، Rhizoma cibotii (تانغوجي)، Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao)، وClematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (الشكل 1A). تم استخراج الخليط بماء منقى وتحويله إلى مسحوق لمزيد من التحليل (الشكل 1B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الإمساك المزمن هو اضطراب متعدد العوامل يتضمن تفاعلات معقدة بين خلل حيوية ميكروبات الأمعاء، وضعف الوظائف العصبية العضلية، وتغير إفراز الأمعاء. تستمر هذه المظاهر لأكثر من ستة أشهر وتؤثر بشكل كبير على جودة حياة المرضى19. يمكن تصنيف الإمساك إلى عدة أنواع فرعية، منها الانتقال البطيء، الانتقال الطبيعي، اضطراب التبرز، والأنواعالمختلطة 20. على الرغم من أن السببية الدقيقة للإمساك المزمن لا تزال غير واضحة بشكل كامل، إلا أن ذلك يعزى عموما إلى تفاعل عو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

التمويل: تم دعم هذا البحث من قبل برنامج شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (المنحة رقم JCYJ20220531092203007).

نحن ممتنون جدا للدكتورة ليقون كو من جامعة شاندونغ للطب الصيني التقليدي لتقديمها الإرشاد الفني في تأسيس نموذج إمساك الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المطحنة الآليةمتجانس الأنسجة عالي الإنتاجية لطحن العيناتJXFSTPRP-48
نظام LC-MSثيرمو فيشر العلميQ نظام إكساكتيف HF LC-MSالكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء – نظام مطيافية الكتلة
مطياف الكتلةثيرمو فيشر العلميQ HF الفعالمطياف الكتلة أوربيرتراب عالي الدقة
عمود C18تقنيات أجيلينتزورباكس إكليبس بلس C18 (2.1 &مرة؛ 100 مم، 1.8 & mu؛ m)عمود الطور العكسي للفصل المركب
نظام التصوير البصريجنرال إلكتريك للرعاية الصحيةImageQuant LAS 4000نظام تصوير الجل والبلوت
التيرموسايلرالأنظمة الحيوية التطبيقية (ثيرمو فيشر العلمي)نظام جين أمب PCR 9700جهاز تضخيم PCR
مجموعة استخراج الحمض النووي للتربةأوميغا بايو-تيكD5625مجموعة لاستخراج الحمض النووي الميكروبي من عينات البراز/التربة

المراجع

  1. Xu, X., Wang, Y., Long, Y., Cheng, Y. Chronic constipation and gut microbiota: current research insights and therapeutic implications. Postgrad Med J. 100 (1190), 890-897 (2024).
  2. Ong, S. S., et al. Global research trajectories in gut microbiota and functional constipation: a bibliometric and visualization study. Front Microbiol. 15, 1513723(2024).
  3. Kilgore, A., Khlevner, J. Functional constipation: pathophysiology, evaluation, and management. Aliment Pharmacol Ther. 60, S20-S9 (2024).
  4. Wang, K., Qiu, H., Chen, F., Cai, P., Qi, F. Considering traditional Chinese medicine as adjunct therapy in the management of chronic constipation by regulating intestinal flora. Biosci Trends. 18 (2), 127-140 (2024).
  5. Shahrajabian, M. H., Sun, W. The importance of traditional Chinese medicine in the intervention and treatment of HIV, while considering its safety and efficacy. Curr HIV Res. 21 (6), 331-346 (2023).
  6. Wang, Y., et al. Integrated analysis of slow transit constipation and colorectal cancer reveals the co-pathogenic targets and their potential clinical value. Cancer Invest. 43 (5), 337-354 (2025).
  7. Li, D., et al. Tongbian formula alleviates slow transit constipation by increasing intestinal butyric acid to activate the 5-HT signaling. Sci Rep. 14, 17951(2024).
  8. Tian, G., et al. Stereoscopic quantitative analysis of enteric nervous system in patients with slow transit constipation. Neurogastroenterol Motil. , e70128(2025).
  9. Hannigan, K. I., et al. Modulation of intracellular calcium activity in interstitial cells of Cajal by inhibitory neural pathways within the internal anal sphincter. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 327 (3), G382-G404 (2024).
  10. Liu, L., et al. Therapeutic effects of three-strain probiotic combination on slow transit constipation: mechanistic insights into MAPK signaling pathway and gut microbiota restoration. Front Pharmacol. 16, 1684442(2025).
  11. Jiang, J. G., et al. Cinnamic acid regulates the intestinal microbiome and short-chain fatty acids to treat slow transit constipation. World J Gastrointest Pharmacol Ther. 14 (2), 4-21 (2023).
  12. Gao, Z., Fu, L., Bai, W., Liang, J. Protective effects of medicinal plant-derived metabolites on slow transit constipation via the ENS-ICC-SMC pathway. Front Pharmacol. 16, 1598806(2025).
  13. Zou, S., et al. Olive oil solution of volatile oil from Citri Reticulatae Pericarpium Viride alleviates slow-transit constipation via regulating SCF/c-Kit signaling pathway and intestinal flora. Drug Des Devel Ther. 19, 4275-4295 (2025).
  14. Wang, L., et al. Electroacupuncture alleviates functional constipation in mice by activating enteric glial cell autophagy via PI3K/AKT/mTOR signaling. Chin J Integr Med. 29 (5), 459-469 (2023).
  15. Han, K., Kuo, B., Khalili, H., Staller, K. Metagenomics analysis reveals unique gut microbiota signature of slow-transit constipation. Clin Transl Gastroenterol. 15 (10), e1(2024).
  16. Zhai, Y., et al. Network pharmacology: a crucial approach in traditional Chinese medicine research. Chin Med. 20 (1), 8(2025).
  17. Madhagi, H. A., Nassar, H. Harnessing network pharmacology and in silico drug discovery to uncover new targets and therapeutics for Alzheimer's disease. Comput Biol Med. 187, 109781(2025).
  18. Liu, J., et al. Tongbian decoction inhibits cell autophagy via PI3K/Akt/mTOR signaling pathway to treat constipation rats. J Ethnopharmacol. 339, 119139(2025).
  19. Wlodarczyk, J., et al. Current overview on clinical management of chronic constipation. J Clin Med. 10 (8), 1738(2021).
  20. Bharucha, A. E., Lacy, B. E. Mechanisms, evaluation, and management of chronic constipation. Gastroenterology. 158 (5), 1232-1249.e3 (2020).
  21. Liu, N., et al. The mechanism of secretion and metabolism of gut-derived 5-hydroxytryptamine. Int J Mol Sci. 22 (15), 7931(2021).
  22. Wang, H., Lee, J. W. Pharmacologic treatment of chronic constipation. Korean J Gastroenterol. 83 (5), 184-190 (2024).
  23. Kochen, M. A., et al. Dynamics and sensitivity of signaling pathways. Curr Pathobiol Rep. 10 (2), 11-22 (2022).
  24. Bang, W. Y., et al. Therapeutic modulation of the gut microbiome by supplementation with probiotics (SCI microbiome mix) in adults with functional bowel disorders: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Microorganisms. 13 (10), 2283(2025).
  25. Tang, L., et al. Rosmarinic acid improves intestinal barrier integrity through PI3K/AKT/Nrf2-mediated regulation of tight junction protein expression. Int Immunopharmacol. 164, 115380(2025).
  26. Yin, N., et al. Farrerol alleviates microbiota dysbiosis-associated osteoporosis in IBD by inhibiting PI3K-AKT/MAPK signaling pathways. Phytomedicine. 148, 157279(2025).
  27. Liu, L., et al. Rotenone induces parkinsonism with constipation symptoms in mice by disrupting the gut microecosystem, inhibiting the PI3K-AKT signaling pathway and gastrointestinal motility. Int J Mol Sci. 26 (5), 2079(2025).
  28. Lin, L. W., et al. Efficacy of traditional Chinese medicine for the management of constipation: a systematic review. J Altern Complement Med. 15 (12), 1335-1346 (2009).
  29. Yan, L., et al. Effect of traditional Chinese medicine external therapy for functional constipation: a meta-analysis. Am J Transl Res. 15 (1), 13-26 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

16S rRNA AQP3
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.