يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأنسجة الرئة في نموذج جرذ لمتلازمة الضيق التنفسي الحاد

435 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70491

⸱

أبريل 7, 2026

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولا موحدا لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) لأنسجة الرئة في نموذج الفئران لمتلازمة الضيق التنفسي الحاد (ARDS). يوضح الخطوات من تأسيس النموذج الناتج عن LPS إلى التحليل المعلوماتي الحيوي، ويحدد 21 مجموعة خلوية و6 مجموعات فرعية من البلاعمية، ويسلط الضوء على المسارات الالتهابية الرئيسية المشاركة في تكوين مرض ARDS.

الملخص

متلازمة الضيق التنفسي الحاد (ARDS) هي حالة رئوية التهابية شديدة ذات معدلات وفيات عالية، وتتميز باستجابات مناعية غير منظمة وتلف السنيخ، ومع ذلك لا تزال تباينها الخلوي غير مفهومة بشكل كامل. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) دقة غير مسبوقة لتحليل آليات نوع الخلية، لكن تطبيقه في ARDS يعيق التغيرات التقنية. هنا، نقدم بروتوكولا موحيدا لتحليل scRNA-seq لأنسجة الرئة في نموذج ARDS للفئران المستحثة بواسطة عديمة السكريات الدهنية (LPS). تشمل هذه الطريقة تفكك الأنسجة المحسن، ومراقبة الجودة الصارمة، وإزالة الطبقات المزدوجة، وتصحيح تأثير الدفعات، وخطوط أنابيب معلوماتية حيوية شاملة للتجميع، والتعليق، وتحليل التعبير التفاضلي. يحدد نهجنا بشكل موثوق 21 مجموعة خلوية مميزة ويكشف عن ست مجموعات فرعية من البلعميات/الخلايا الأحادية ذات توقيعات نسخية فريدة في ARDS. وقد حدد تحليل التعبير الجيني التفاضلي وتعزيز الوظائف في المجموعات الفرعية جينات ومسارات رئيسية وراء مسببات مرض ARDS. يتيح هذا السير القابل للتكرار توصيفا معمقا للتنوع الخلوي، ومسارات الالتهاب، والأهداف العلاجية المرشحة، مما يوفر أساسا قويا للدراسات الميكانيكية والانتقالية في متلازمة الالتهاب الضحيمي المتلازم.

المقدمة

متلازمة الضيق التنفسي الحاد (ARDS) هي مرض تنفسي حاد يتميز بالتهاب رئوي منتشر ووذمة رئوية غير ناتجة عن القلب، والتي تظهر بشكل رئيسي على شكل نقص تأكسج تدريجي وفشل تنفسي 1,2. تشمل الآليات المرضية لمتلازمة الحساسية الجنسية التعويضية العشوائية في التسلسل الالتهابي، واضطراب حاجز الشعيرات الدموية الحصي، والتنشيط غير الطبيعي والتفاعلات بين أنواع متعددة من خلايا المناعة 3,4. خلال تقدم ARD، تدفع الخلايا المناعية داخل نسيج الرئة سلاسل التهابية من خلال إفراز وسطاء التهابيين وتنظيم الاستجابات المناعية، مما يعطل بطانة الرئة، مما ينشط سلسلة التخثر الخارجي، ويزيد من تفاقم إصابة الرئة 5,6,7. ومع ذلك، لا يزال الفهم الحالي للآليات المرضية على مستوى الخلية في ARDS محدودا، مما يقيد تطوير العلاجات الدوائية المحددة، بينما تتكون استراتيجيات الإدارة الحالية بشكل أساسي من طرق مختلفة لدعم الأكسجين والتهوية الميكانيكية1. يعد التوصيف العميق لتباين الخلايا والتغيرات الديناميكية أثناء مسببات مرض ARDS ذا أهمية قصوى لتحديد الأهداف العلاجية الجديدة وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة 8,9,10.

لقد جلب ظهور تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) إنجازات ثورية في أبحاث تسلسل الحمض الريبي، مما مكننا من تحليل التباين الخلوي والديناميكيات الوظيفية في مسببات الأمراض11,12. مقارنة بالتسلسل الجماعي التقليدي للحمض النووي الريبي، يمكن لتقنية scRNA-seq تحديد مجموعات خلوية نادرة لكنها حرجة، وكشف العمليات الديناميكية لانتقالات الحالة الخلية، واكتشاف شبكات تفاعل بين الخلايا معقدة، وهي معلومات غالبا ما تخفي في تحليلات السكان 13,14,15. حققت الدراسات الحديثة لscRNA-seq في ARDS تقدما كبيرا، بما في ذلك تحديد توقيعات تعبير جينات الخلايا الأحادية المحددة، واكتشاف أنماط استقطاب الخلايا البلعمية غير الطبيعية، وتوضيح شبكات الاتصال بين الخلايا الليفية 16,17,18,19 . لا تعمق هذه النتائج فهمنا لآليات المرض الفسيولوجي لمتلازمة ARDS فحسب، بل توفر أيضا رؤى جديدة حول تطور المؤشرات الحيوية، وتقسيم المرض، والعلاج الدقيق20,21.

ومع ذلك، تواجه أبحاث ARDS الحالية في scRNA-seq تحديات، بما في ذلك عدم كفاية التوحيد المنهجي، والاختلافات الكبيرة في بروتوكولات معالجة العينات، وخطوط تحليل البيانات غير المتسقة، مما يحد من قابلية تكرار نتائج البحث وتطبيقاتها السريرية الترجمية22,23. يعالج هذا البروتوكول التحديات التقنية المرتبطة بتحليل scRNA-seq لأنسجة الرئة في ARDS من خلال تحسين إجراءات معالجة الأنسجة، ومراقبة الجودة، وتحليل البيانات، مما يوفر أساسا للدراسات الميكانيكية والتطوير العلاجي. يضمن النهج الموحد قابلية التكرار عبر المختبرات المختلفة ويسهل الدراسات المقارنة في أبحاث ARDS حول التغاير الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم شراء اثني عشر ذكرا من نوع سبراج-داولي (SD) الخالي من الممرضات المحددة (SPF)، تتراوح أعمارهم بين 6 و7 أسابيع ووزنهم 220 جراما ± 10 جرام، من مختبر بكين فيتال ريفر لتقنية الحيوانات المحدودة (رقم ترخيص الحيوان: SCXK (Jing) 2025-0008). تم إسكان الفئران في مركز الحيوانات المختبرية بمستشفى دونغتشيمن، جامعة بكين للطب الصيني، تماشيا مع المعيار الوطني "متطلبات الحيوانات المختبرية للبيئة والمرافق السكنية" (GB 14925-2010، الصادر عن اللجنة الفنية لتوحيد معايير الحيوانات المختبرية الوطنية في الصين). تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رفاهية الحيوان والأخلاقيات في مستشفى دونغتشيمن، جامعة بكين للطب الصيني (رقم الموافقة: 24-54). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. إنشاء النماذج وجمع العينات

ملاحظة: قبل التجربة، اجعل جميع الفئران تخضع لفترة تأقلم مدتها أسبوع لتقليل التأثيرات الناتجة عن التوتر.

  1. قم بإذابة إسشيريكا كولي ليبوبوليسكاريد (LPS) في محلول ملحي بنسبة 0.9٪ للحصول على محلول LPS بقوة 0.4 ملغ/مل.
  2. قسم عشوائيا 12 ذكرا من جرذ سبراج-داولي (SD) SPF إلى مجموعتين: مجموعة ضابطة (n = 6) ومجموعة نموذج ARDS (n = 6).
  3. أعط 0.9٪ محلول ملحي عن طريق الحقن داخل القصبة الهوائية بجرعة 0.5 مل/100 جرام من وزن الجسم للمجموعة الضابطة.
  4. أعط محلول LPS بقوة 0.4 ملغ/مل عبر الحقن داخل القصبة الهوائية بنفس الحجم (0.5 مل/100 جم) لمجموعة نماذج ARDS، وبعد 16 ساعة، تخدير الفئران باستخدام الإيزوفلوران (وفقا لبروتوكولات معتمدة مؤسسيا).
  5. اجمع الدم عبر الشريان الأبهر البطني، ثم استخدم الطرد المركزي (4 درجات مئوية، 1000 × جم، 30 دقيقة) للحصول على المصل.
  6. افتح تجويف الصدر واستخرج نسيج الرئة.
  7. قم بغسل الشعب الهوائية عبر جذع القصبات الهوائية باستخدام حقنة للحصول على سائل غسل القصبات الهوائية (BALF)24,25.
  8. احصد الفص الرئوي الأيمن وشطفها ب PBS للفحص المرضي لاحقا.
  9. احصد الفص الرئوي الأيسر وشطفها ب PBS لتسلسل الخلايا الأحادية وتجارب البيولوجيا الجزيئية اللاحقة26,27.

2. التقييم النسيجي المرضي لأنسجة الرئة

  1. اغمر نسيج الرئة اليمنى المحصودة للفئران في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ للتثبيت لمدة 12 ساعة.
  2. بعد التثبيت، جفف النسيج عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول (70٪، 80٪، 90٪، 95٪، 100٪، و100٪)، مما يسمح بساعتين في كل تركيز.
  3. عالج النسيج المجفف بالزيلين حتى يصبح شفافا.
  4. قم بتغمر النسيج الشفاف بالبارافين المنصهر في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  5. ضع كتلة الأنسجة المتسللة في قالب متغلغل، واصب البارافين الطازج، ودعها تبرد وتتصلب لتصبح كتلة بارافين.
  6. قسم كتلة البرافين إلى شرائح بسماكة 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم، ثم طفو الأقسام على حمام ماء بدرجة حرارة 45 درجة مئوية لنشرها، ثم التقطها باستخدام شرائح مغلفة بالبولي-إل-ليسين.
  7. اخبز الشرائح في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لضمان التصاق الأقسام بالسلايد.
  8. قم بإزالة البارارافين من الأقسام بالغمر في الزيلين وإعادة ترطيبها عبر تدرج تنازلي من الإيثانول (100٪، 95٪، 90٪، 80٪، و70٪).
  9. شطف الأقسام ب PBS، وقم بصبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين (HE)، وركب الغطاء باستخدام راتنج محايد.
  10. قيم إصابة الرئة على الأجزاء المسحوحة بالكامل باستخدام نظام تقييم موحد يعتمد على تسرب العدلات، الالتهاب الخلالي، الوذمة، والاحتقان.
    ملاحظة: تم تقييم كل معلم من 0 إلى 4 بناء على مدى التورط المرضي: 0 (لا شيء)؛ 1 (≤25٪)؛ 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75٪) 28,29.

3. اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيمات

ملاحظة: يمكن الحفاظ على العينات عند -80 درجة مئوية إذا لم يكن بالإمكان إجراء التحليل فور الاستحواذ.

  1. قم بإذابة المعايير ودعها تبقى على درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، ثم قم بتخفيف المحلول التسلسلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. جهز محلول الأجسام المضادة البيوتينيلي، ومحلول العمل المرافق الإنزيمي، ومخزن الغسيل كما هو موضح في الدليل.
  3. أضف 100 ميكرولتر من كل عينة أو 100 ميكرولتر من المعايير المخففة تسلسليا إلى الآبار المغطاة بالأجسام المضادة، وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  4. اغسل الطبق 4 مرات باستخدام غسالة اللوحة، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة البيوتينيلية العامل، واحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. اغسل الطبق 4 مرات، أضف 100 ميكرولتر من محلول الإنزيم المترافق العامل، وحضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة لكل بئر، واحتضن الحماية من الضوء عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  7. أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر، وامزج بلطف، وقس الكثافة البصرية (OD) عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكروبلايت.
  8. توليد منحنى قياسي عن طريق رسم قيم OD مقابل التركيزات القياسية باستخدام البرنامج المصمم.
  9. تحديد تركيزات العينات بناء على قيم OD المقاسة والمنحنى القياسي.

4. تحضير التعليق أحادي الخلية للتسلسل

ملاحظة: بعد الحصول على نسيج الرئة، يجب وضعه على الثلج ومعالجته بسرعة للحفاظ على حيوية الخلايا.

  1. اغسل نسيج الرئة ثلاث مرات باستخدام PBS مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  2. أضف 2 مل من PBS المبرد مسبقا وقم بتقطيعه إلى شظايا أصغر باستخدام مقص معقم إلى حوالي 0.5 مم3 بوصة.
  3. استخدم ماصة باستور لنقل الأنسجة المفروم مع PBS إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
  4. أضف 1 مل إضافي من PBS المبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية إلى طبق الزراعة، شطف وأعد تعليق شظايا الأنسجة المتبقية، وانقل التعليق إلى نفس الأنبوب.
  5. اضبط الحجم إلى 6.5 مل مع تبريد PBS مسبقا إلى 4 درجات مئوية، وهضم شظايا الأنسجة في محلول إنزيمي يحتوي على كولاجناز I (100 U/mL) و Dispase II (1 U/mL)، وحضن بحركة خفيفة على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  6. عندما تصبح شظايا الأنسجة شفافة ولا تبقى قطع صلبة مميزة، قم بترشيح الأنسجة المهضومة عبر مصفاتين خلايا بحجم 70 ميكرومتر و40 ميكرومتر، ثم استخدم الطرد المركزي (4° مئوية، 500 × جم، 5 دقائق) وتخلص من الفائق.
  7. أعد تعليق الحبيبة فورا في 3 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء، وامزجه بلطف باستخدام الماصات، ثم أزيله على الثلج لمدة 10 دقائق.
  8. عندما يبدو الفائق الأصفر الباهت أو شبه عديم اللون، أضف 7 مل من PBS لإنهاء التفاعل، وجهاز الطرد المركزي (4 °C، 500 × جم، 5 دقائق)، وتخلص من السوبرناتينت.
  9. أضف 3 مل من PBS لإعادة تعليق الخلايا وتحديد تركيز الخلايا وقابليتها للبقاء باستخدام صبغة تريبان بلو.
    ملاحظة: إذا كانت قدرة البقاء على الخلايا أقل من 70٪، قم بإجراء إزالة الخلايا الميتة.
  10. اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول غسيل يحتوي على 0.04٪ ألبومين مصل البقري (BSA) محضر في DPBS.
  11. أعد تعليق الخلايا للعد واضبط التركيز إلى 1000 خلية/ميكرولتر للتحميل والكشف لاحقا.

5. مراقبة الجودة لبيانات تسلسل الخلايا الواحدة

ملاحظة: تم إعداد مكتبات RNA أحادية الخلية من معلقات الخلايا باستخدام طريقة بناء مكتبة خلية واحدة تعتمد على القطرات. تم تسلسل المكتبات على منصة عالية الإنتاجية باستخدام كيمياء تسلسل تعتمد على كرات الحمض النووي النانوية (DNA). تم تحميل حوالي 21,000 خلية في كل مكتبة، بهدف معدل استعادة خلية ~60٪. أنتج التسلسل ما مجموعه 5.0 ×10 8 قراءات لكل مكتبة، بمتوسط عمق يتراوح بين 30,000-40,000 قراءة لكل خلية. تمت معالجة بيانات التسلسل الخام باستخدام خط تحليل RNA الخلوي الواحد المقابل لإنتاج مصفوفة التعبير الجيني لكل عينة.

  1. إنشاء مكتبة أوليغو باستخدام PCR ووضع علامات الباركود، مع ضمان تركيز >10 نانوغرام/ميكرولتر وحجم الذروة 180 بيتن في ±10 بيتان.
  2. إنشاء مكتبة cDNA عن طريق التجزئة، وإصلاح الأطراف، وربط المحول، وPCR، لضمان تركيز >10 نانوغرام/ميكرولتر وحجم ذروة 350–550 بيزان.
  3. توليد كائن Seurat لكل عينة من مصفوفة التعبير الجيني باستخدام دالة Read10X في حزمة Seurat (v4.3.0) في برنامج R (v4.2.0).
  4. إزالة الخلايا منخفضة الجودة عن طريق تصفية تلك التي تحتوي على نسبة جينية الميتوكوندريا >10٪ أو نسبة جينات الهيموغلوبين >5٪.
  5. تطبيع البيانات باستخدام طريقة "LogNormalize" بعامل مقياس 10,000.
  6. حدد الميزات المتغيرة للغاية باستخدام طريقة "vst" واحتفظ بأفضل 2000 جين للتحليل اللاحق.
  7. قم بتقييم دورة الخلية باستخدام جينات مؤشر دورة الخلية المدمجة في سورا، واستعاد تأثيرات دورة الخلية (G2M). الدرجة ودرجة S.Score) أثناء مقياس البيانات.
  8. اكتشاف وإزالة الدوبلت المحتملة باستخدام DoubletFinder (v2.0.3) مع pN = 0.25، pK = 0.09، ومعدل مزدوج متوقع 0.06، واستبعادها من المعالجة اللاحقة.
  9. تصحيح تأثيرات الدفعات عبر العينات باستخدام حزمة Harmony (v0.1.1) مع theta = 2 و max.iter.harmony = 20.
  10. أضف أعمدة معلومات لأسماء العينات الفردية وتفاصيل تجميع مجموعة نماذج ARDS ومجموعة التحكم إلى البيانات الوصفية في كائن Seurat.

6. تقليل الأبعاد، التجميع، وشرح نوع الخلية

  1. إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) على جينات متغيرة للغاية باستخدام دالة RunPCA في سورا.
  2. حدد العدد الأمثل للمكونات الرئيسية من خلال تصور ElbowPlot.
  3. تحديد تجمعات الخلايا الرئيسية بتطبيق خوارزمية لايدن عبر دالة FindClusters من Seurat ودالة FindNeighbors بدقة 0.1.
  4. إجراء تقليل أبعاد UMAP باستخدام المكونات الرئيسية المختارة.
  5. قم بتحديد أنواع الخلايا من خلال تحديد جينات العلامات التي تستخدم وظيفة FindAllMarkers.
  6. تصور تعبير جينات العلامات عبر أنواع الخلايا باستخدام دالة DotPlot.
  7. أضف عمودا جديدا للمعلومات من نتائج تعليقات الخلية إلى البيانات الوصفية وتصور تعليقات نوع الخلية باستخدام Umap.
  8. احسب نسبة كل مجموعة تجريبية ضمن كل نوع خلية محددة باستخدام دوال dplyr لعد الخلايا وحساب النسب المئوية.
  9. قم بإنشاء مخططات أشرطة مكدسة باستخدام ggplot2 لتوضيح تركيب المجموعة لكل نوع خلية، بما في ذلك تسميات النسب المئوية والمقارنات الإحصائية بين المجموعات.

7. تحليل السكان الفرعيين

  1. استخلاص المجموعة الفرعية المستهدفة باستخدام دالة المجموعة الفرعية وإنشاء كائن Seurat المقابل لتحليل مستوى السكان الفرعيين في المراحل النهائية.
  2. إعادة تطبيع وإعادة تكبير بيانات السكان الفرعيين مع تراجع جينات الميتوكوندريا، وجينات الهيموغلوبين، وعدد الوحدات التوحدية، ودرجات دورة الخلية.
  3. قم بإجراء تحليل ثانوي ل PCA وتطبيق تصحيح دفعات هارموني خصيصا للفئة الفرعية.
  4. إجراء إعادة التجميع باستخدام وظائف FindNeighbors وFindClusters لتحديد الأنواع الفرعية المميزة داخل مجموعات الخلايا المستهدفة.
  5. إنشاء تضمينات UMAP جديدة وتصور مجموعات السكان الفرعية مع تعليقات نوع الخلية باتباع نفس النهج الموصوف سابقا.

8. تحليل التعبير الجيني التفاضلي

  1. تحديد الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) بين مجموعة نموذج ARDS ومجموعة التحكم لكل عنقود فرعي باستخدام طريقة MAST الإحصائية.
  2. دمج الانحدار الكامن للمتغيرات للتحكم في تأثيرات عمق التسلسل أثناء اختبار التعبير التفاضلي.
  3. تصفية DEGs بناء على عتبات تغير طيات اللوغاريتيوم المحددة مسبقا وقيم p المعدلة باستخدام دالة FindMarkers.
  4. إنشاء مخططات بركانية باستخدام دالة مخطط gg لكل عنقود فرعي لعرض أنماط تعبير جيني تفاضلية مع تصنيف الدلالة.
  5. تصدير نتائج DEG وإنشاء جداول ملخصة شاملة لتسهيل التخصيب الوظيفي والتحليلات الأخرى في مرحلة ما بعد التدفق.

9. تحليل الإثراء

  1. قم بربط رموز الجينات بمعرفات ENTREZ باستخدام المنظمة. Rn.eg.db قاعدة بيانات التعليقات التوضيحية لتوافق تحليل المسارات.
  2. اجمع الجينات المهمة من جميع المجموعات الفرعية وتصفية الجينات المهمة بناء على عتبات تغير الطية اللوغاريتمية وقيم p المعدلة (اختبار ويلكوكسون، logfc.threshold = 0.25، p_val < 0.05).
  3. إجراء تحليل إثراء أنطولوجيا جينية (GO) باستخدام وظيفة GO مع فئات العملية البيولوجية، الدالة الجزيئية، أنطولوجيا المكونات الخلوية، وطريقة تصحيح بنجاميني-هوشبرغ.
  4. إجراء تحليل إثراء مسار موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) باستخدام دالة إثراء KEGG مع قاعدة بيانات الكائنات الجرذانية وتطبيق عتبات الدلالة الإحصائية.
  5. أنشئ مخططات نقطية لنتائج إثراء GO وKEGG باستخدام دالة المخطط النقطي، مع عرض أفضل 15 مصطلحا غنية بشكل ملحوظ مع نسب جينية وقيم p معدلة.
  6. تصدير نتائج الإثراء كملفات CSV وحفظ مخططات التصور لتفسير شامل لتحليل المسارات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهر تلوين الهواء في أنسجة رئة الجرذان هياكل سنخية واضحة مع تقليل الالتهاب في مجموعة الضابطين، في حين أظهرت مجموعة نموذج ARDS تجاويف الحويصلات المشوهة، وكثافة جدران، وتسرب كبير للخلايا الالتهابية، كما هو موضح في درجات إصابات الرئة المقابلة (الشكل 1A–E). أكدت مستويات مرتفعة من IL-6 وTNF-α وIL-1β في BALF والمصل نجاح النمذجة والاستجابة الالتهابية الجهازية (الشكل 2A–F). كشف تحليل ScRNA-seq بعد مراقب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يقدم هذا البروتوكول نهجا موحدا لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأنسجة الرئة في نموذج الفئران لمتلازمة الضيق التنفسي الحاد (ARDS). تظهر هذه النتائج نجاحا في تأسيس نموذج ARDS الناتج عن LPS، كما أكدته الفحوصات النسيجية المرضية، وارتفاع درجات إصابات الرئة، وزيادة مستويات السيتوكينات الالتهابية في BALF والمصل. كشف تحليل النسخ الخلوي الواحد عن 21 مجموعة خلوية مميزة، مع زيادات ملحوظة في الخلايا البلعمية/الخلايا الأحادية، والعدليات، والخلايا التغصنية في أنسجة ARDS. حدد المزيد من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يرغب المؤلفون في شكر الدعم من المشروع الأفقي لمستشفى دونغتشيمن، جامعة بكين للطب الصيني (HX-DZM-202114).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول تريبان الأزرق 0.4٪جيبكو، الولايات المتحدة الأمريكية15250061
4٪ بارافورمالديهيدسيرفسبيو، الصينG1101
ألبومين مصل البقر (BSA)سانغون بيوتك، الصينA600332-0005
كولاجناز Iييسين، الصين40507ES60
خبير المنحنىتطوير هيامزالإصدار 1.4
ديسباسي IIييسين، الصين40104ES60
الإشريكية القولونية الدهنية الدهنية (LPS) سيغما، الولايات المتحدة الأمريكيةL6511
صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين (HE)سولاربيو، الصينG1120
متسلسل جيني عالي الإنتاجية MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
مثبط الفوسفاتازبيوتايم بيوتكنولوجي، الصينP1081
محلول الفوسفات المخزنسولاربيو، الصينP1020
PMSFسولاربيو، الصينR0010
R software لوسنت تكنولوجيز، الولايات المتحدة الأمريكيةv4.2.0
rat IL-1β مجموعة ELISA4abio، الصينCRE0006
مجموعة RAT IL-6 ELISA4abio، الصينCRE0005
rat TNF-α مجموعة ELISA4abio، الصينCRE0003
مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC)سولاربيو، الصينR1010
مخزن تحلل خلايا الدم الحمراءتيانغن بيوتيك، الصينRT122-1
مياه خالية من RNaseأمبيون، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9937
مخزن TE، pH 8.0أمبيون، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9858
مخزن نقل تريس-جلايسينسيرفسبيو، الصينG2017

المراجع

  1. Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
  2. Gragossian, A., Siuba, M. T. Acute respiratory distress syndrome. Emerg Med Clin North Am. 40 (3), 459-472 (2022).
  3. Bos, L. D. J., Ware, L. B. Acute respiratory distress syndrome: causes, pathophysiology, and phenotypes. Lancet. 400 (10358), 1145-1156 (2022).
  4. Huang, Q., Le, Y., Li, S., Bian, Y. Signaling pathways and potential therapeutic targets in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Respir Res. 25 (1), 30(2024).
  5. Cutolo, M., Campitiello, R., Gotelli, E., Soldano, S. The role of M1/M2 macrophage polarization in rheumatoid arthritis synovitis. Front Immunol. 13, 867260(2022).
  6. Scozzi, D., Liao, F., Krupnick, A. S., Kreisel, D., Gelman, A. E. The role of neutrophil extracellular traps in acute lung injury. Front Immunol. 13, 953195(2022).
  7. Zheng, J., Li, Y., Kong, X., Guo, J. Exploring immune-related pathogenesis in lung injury: providing new insights into ALI/ARDS. Biomed Pharmacother. 175, 116773(2024).
  8. Qiao, Q., Liu, X., Yang, T., Cui, K., Kong, L., Yang, C., Zhang, Z. Nanomedicine for acute respiratory distress syndrome: The latest application, targeting strategy, and rational design. Acta Pharm Sin B. 11 (10), 3060-3091 (2021).
  9. Bonaventura, A., et al. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19. Nat Rev Immunol. 21 (5), 319-329 (2021).
  10. Yıldırım, F., Karaman, İ, Kaya, A. Current situation in ARDS in the light of recent studies: classification, epidemiology and pharmacotherapeutics. Tuberk Toraks. 69 (4), 535-546 (2021).
  11. Huminiecki, Ł Bulk and single-cell RNA sequencing elucidate the etiology of severe COVID-19. Int J Mol Sci. 25 (6), 3280(2024).
  12. Riemondy, K. A., et al. Single cell RNA sequencing identifies TGF-β as a key regenerative cue following LPS-induced lung injury. JCI Insight. 5 (8), e123637(2019).
  13. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  14. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. Int J Oral Sci. 13 (1), 36(2021).
  15. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  16. Zhang, F., Wei, K., Slowikowski, K. Defining inflammatory cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry. Nat Immunol. 20 (7), 928-942 (2019).
  17. Mulder, K., Patel, A. A., Kong, W. T. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaau0964(2019).
  19. Kang, Z. Y., et al. Heterogeneity of immune cells and their communications unveiled by transcriptome profiling in acute inflammatory lung injury. Front Immunol. 15, 1382449(2024).
  20. Wang, H. P., et al. Single-cell transcriptome analysis of the mouse lungs during the injury and recovery periods after lipopolysaccharide administration. Inflamm Res. 73 (12), 2087-2107 (2024).
  21. Yao, C., et al. Cell-type-specific immune dysregulation in severely ill COVID-19 patients. Cell Rep. 34 (1), 108590(2021).
  22. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  23. Su, M., et al. Data analysis guidelines for single-cell RNA-seq in biomedical studies and clinical applications. Mil Med Res. 9 (1), 68(2022).
  24. Yang, Q., et al. The interaction of macrophages and CD8 T cells in bronchoalveolar lavage fluid is associated with latent tuberculosis infection. Emerg Microbes Infect. 12 (2), 2239940(2023).
  25. Zheng, L., et al. Single-cell transcriptome sequencing reveals the immune microenvironment in bronchoalveolar lavage fluid of checkpoint inhibitor-related pneumonitis. Cancer Immunol Immunother. 74 (4), 128-145 (2025).
  26. Shi, X. Y. Single-cell transcriptomic analysis of radiation-induced lung injury in rat. Biomol Biomed. 24 (5), 1331-1349 (2024).
  27. Huang, H., et al. Single-cell RNA sequencing uncovered the involvement of an endothelial subset in neutrophil recruitment in chemically induced rat pulmonary inflammation. Int J Med Sci. 19 (4), 669-680 (2022).
  28. Kosaka, J., et al. Effects of biliverdin administration on acute lung injury induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats. PLoS One. 8 (5), e63606(2013).
  29. Hassan, N. H., El-Wafaey, D. I. Histopathological scoring system role in evaluation of electronic cigarette's impact on respiratory pathway in albino rat: Biochemical, histo-morphometric and ultrastructural study. Tissue Cell. 79, 101945(2022).
  30. Wang, P., et al. Single-cell suspension preparation from Nile Tilapia intestine for single-cell sequencing. J Vis Exp. (192), e64321(2023).
  31. Wang, F., et al. Integrating bulk and single-cell sequencing reveals the phenotype-associated cell subpopulations in sepsis-induced acute lung injury. Front Immunol. 13, 981784(2022).
  32. Zi, S. F., et al. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  33. Zi, S. F., Wu, X. J., Tang, Y., Liang, Y. P. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  34. Hurskainen, M., et al. Single cell transcriptomic analysis of murine lung development on hyperoxia-induced damage. Nat Commun. 12 (1), 1565(2021).
  35. Zhou, X., Zhang, C., Yang, S. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733(2024).
  36. Zhao, C. Q., et al. Heterogeneity of T cells and macrophages in chlorine-induced acute lung injury in mice using single-cell RNA sequencing. Inhal Toxicol. 34 (13-14), 399-411 (2022).
  37. Liu, D., Zhang, Y., Bai, B., Xiong, X. Integration of single-cell RNA sequencing and network pharmacology to elucidate the effect of Yantiao Formula on alleviating ALI by regulating the polarization of alveolar macrophages. J Ethnopharmacol. 343, 119436(2025).
  38. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1826299(2022).
  39. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  40. Dun, Y., et al. PTTG1 promotes CD34+CD45+ cells to repair the pulmonary vascular barrier via activating the VEGF-bFGF/PI3K/AKT/eNOS signaling pathway in rats with phosgene-induced acute lung injury. Biomed Pharmacother. 162, 114654(2023).
  41. Liu, Z., Wei, J., Sun, H., Xu, L. Plumbagin ameliorates LPS-induced acute lung injury by regulating PI3K/AKT/mTOR and Keap1-Nrf2/HO-1 signalling pathways. J Cell Mol Med. 28 (13), e18386(2024).
  42. Guo, Y., Zhang, H., Lv, Z., Du, Y. Up-regulated CD38 by daphnetin alleviates lipopolysaccharide-induced lung injury via inhibiting MAPK/NF-κB/NLRP3 pathway. Cell Commun Signal. 21 (1), 66(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.