تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا لإرشادات ARRIVE19. تمت مراجعة بروتوكول الدراسة والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية لتجارب الحيوانات بجامعة كيرشهير آهي إيفران (رقم الموافقة: 06/03/2025-05-1، تركيا). جميع الإجراءات كانت تتوافق مع الإرشادات المؤسسية لرعاية واستخدام حيوانات المختبر. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. اختيار الحيوانات والإسكان
تم استخدام اثنين وثلاثين ذكرا من فئران ويستار المهحب (RRID: RGD_2308852؛ عمره 8–12 أسبوعا، وزنها 200–250 جم). كانت الحيوانات توضع بشكل فردي في أقفاص من البولي كربونات (40 سم × 25 سم × 20 سم) مع فراش حلاقة خشبي. تم الحفاظ على الظروف البيئية عند 22–24 درجة مئوية مع دورة ضوء 12 ساعة و12 ساعة ظلام. تم توفير الطعام والماء بحرية تامة.
تم إجراء فترة تأقلم لمدة أسبوع قبل التجربة. خلال هذه الفترة، كانت الحيوانات تراقب يوميا من حيث تناول الطعام، وحالة الترطيب، وسلوك العناية بالأطفال، والنشاط الحركي. تم تضمين الحيوانات التي تظهر سلوكا فسيولوجيا طبيعيا فقط في الدراسة.
2. المجموعات التجريبية والعشوائية
تم توزيع الحيوانات عشوائيا على أربع مجموعات تجريبية (n = 8 لكل مجموعة) باستخدام تسلسل عشوائي مولد بالحاسوب. تم ضمان إخفاء التخصيص من خلال تعيين معرفات رقمية للحيوانات قبل تخصيص المجموعات. تكونت مجموعات التجربة من مجموعة الضابط (C)، التي لم تتلق أي تدخل؛ مجموعة التمارين (E)، التي خضعت فقط لتمارين جهاز المشي؛ مجموعة العلاج بالانقسام (H)، التي تلقت العلاج بالانقسام الهرودوغرابي فقط ثلاث مرات في الأسبوع؛ ومجموعة العلاج بالهيرودو-ترابي والتمارين (HE) المركبة، التي خضعت لكلا التدخلين وفقا لبروتوكول الدراسة. أجريت جميع التدخلات على مدى فترة أسبوعين. لتقليل التباين اليومي، أجريت جميع الإجراءات بين الساعة 09:00 و11:00 صباحا.
3. بروتوكول التمارين المزمنة
تم أداء التمرين باستخدام جهاز مشي للقوارض بمحرك مزود بشبكة تحفيز كهربائي قابلة للتعديل. تم وضع الحيوانات في مسارات فردية من جهاز جهاز المشي (الشكل 1). تم إجراء مرحلة تكيف لمدة يومين بسرعة 15 م/دقيقة لمدة 15 دقيقة يوميا. بعد فترة التكيف، زادت شدة التمارين إلى 20 م/دقيقة، وخضعت الحيوانات لجلسات جري يومية لمدة 45 دقيقة يوميا لمدة أسبوعين. تم تطبيق محفز كهربائي خفيف (1.0 مللي أمبير) عبر الشبكة عند الحاجة للحفاظ على التشغيل المستمر.
- معايير الاستنفاد
تم تعريف الإرهاق بأنه عدم القدرة على مغادرة شبكة الصدمات لثلاث محفزات متتالية (~5 ثوان لكل منها). كانت الحيوانات التي تصل إلى هذا الحد تتم إزالتها فورا. تم تكييف هذا البروتوكول من نماذج تمارين على جهاز المشي المعروفة سابقا مع معايير تحديد التكيف، وتطور الشدة، والإرهاق20.
- تطبيق العلاج بالهيرودورابي
تم الحصول على العلق الطبي (Hirudo verbana، ~2 جرام) من مصدر معتمد مؤسسيا. قبل التطبيق، كان يتم حلق المنطقة الظهرية لكل حيوان بمحلق كهربائي، ويتم تنظيف الجلد بلطف باستخدام محلول ملحي معقم دون مطهرات، لتجنب التصاق العلقات. ثم وضعت الحيوانات في أنبوب شفاف من الأكريليك للحد من الحركة وتقليل الإجهاد. تم وضع علقة واحدة على الخط الأوسط الظهري، وتم تأكيد نجاح الالتصاق بصريا من خلال تثبيت المصاص الفموي. تم السماح بالتغذية لمدة 10 دقائق (الشكل 2). بعد فترة التطبيق، تم فصل العلقات عن طريق تعريض منطقة التثبيت لبخار الإيثانول بنسبة 70٪ باستخدام أداة تطبيق قطنية تثبت على بعد حوالي 1–2 سم من الموقع. بعد الانفصال، تم التحكم في النزيف الموضعي باستخدام شاش معقم بضغط خفيف لمدة تقارب دقيقة إلى دقيقتين، ولم يتم تطبيق أي خياطة. تم إجراء الطلبات ثلاث مرات في الأسبوع لمدة أسبوعين. تم إجراء هذا الإجراء بناء على بروتوكولات العلاج بالهيرودو-روبي التجريبية والسريرية الموصوفة سابقا مع معايير تطبيق موحدة21.
4. القتل الرحيم وجمع الدم
في نهاية التجربة (بعد 24 ساعة من آخر تدخل)6، تم تخدير الحيوانات داخل الصفاق بالكيتامين (75 ملغ/كغ) وزيلازين (10 ملغ/كغ). تم تأكيد عمق التخدير الكافي من خلال غياب انسحاب الدواسات وردود فعل القرنية. ثم تم جمع الدم داخل القلب باستخدام حقنة معقمة بقطر 5 مل عبر ثقب البطين الأيسر. تم الانتهاء من القتل الرحيم بفقدان الدم تليها فتح الصدر. لاحقا، تم جمع أنسجة عضلة الهضمي الوسطى وأنسجة الكبد لمزيد من التحليلات. تمت معالجة عينات الدم خلال ساعة واحدة من الجمع عن طريق نقلها إلى أنابيب تنشيط الجلطات والطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم تم تقسيم المصل المفصول إلى أجزاء بسعة 200 ميكرولتر وتخزينه عند −80 درجة مئوية حتى التحليل.
5. تحليل الكيمياء الحيوية وتحليل ELISA
تم تحليل المعايير الكيميائية الحيوية، بما في ذلك ALT، AST، LDH، CK، الجلوكوز، الإلكتروليتات، والكورتيزول، باستخدام محلل كيميائي حيوي آلي وفقا لإجراءات مختبرية موحدة. تم إجراء جميع اختبارات ELISA ل CAT وSOD وMDA وGPX وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتحت ظروف موحدة. تم تخفيف عينات المصل بنسبة 1:5 مع مخزن عينات عند الحاجة لبروتوكول المجموعة. لاحقا، أضيفت 50 ميكرولتر من عينات المصل و50 ميكرولتر من عينات المصل إلى الآبار المخصصة وحضنتها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد الحضانة، تم غسل الألواح خمس مرات باستخدام مخزن الغسيل المقدم لإزالة المكونات غير المربوطة. ثم أضيف الجسم المضاد للكشف (50 ميكرولتر) إلى كل بئر وحضنه عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، أضيف محلول الركيزة، وحضن خليط التفاعل لمدة 10–15 دقيقة تحت ظروف مظلمة للسماح بتطور اللون. تم إنهاء التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من محلول التوقف، وتم قياس الكثافة البصرية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكرولوتين. تم تحليل جميع العينات بشكل مكرر لضمان الموثوقية التحليلية وقابلية التكرار.
6. التحليل الأنسجي المرضي
للتقييم النسيجي المرضي، تمت معالجة عينات الأنسجة وفقا للإجراءات النسيجية القياسية22. تم تثبيت الأنسجة في البداية بفورمالين مخزن 10٪ محايد لمدة 72 ساعة، تلاها الجفاف عبر سلسلة إيثانول متدرجة تتكون من 50٪، 70٪، 80٪، 96٪، و100٪ إيثانول، مع حضانة لمدة ساعة في كل تركيز. بعد الجفاف، تم تنظيف الأنسجة في الزيلين لفترتين متتاليتين مدة كل منهما 30 دقيقة، ثم تم تضمينها في كتل البارافين. تم الحصول على مقاطع بسماكة 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم دوار وصبغت بالهيماتوكسيلين وإيوزين (H&E) وثلاثي كروم ماسون للفحص الأنسيجي. وأخيرا، تم فحص الشرائح الملونة باستخدام مجهر ضوئي مزود بنظام تصوير رقمي.
7. التحليل الإحصائي
تم إجراء تحليل البيانات باستخدام برامج إحصائية. تم تقييم توزيع البيانات باستخدام اختبار كولموغوروف–سميرنوف. بالنسبة للبيانات الموزعة عاديا، تم تطبيق تحليل أنوفاز أحادي الاتجاه يليه اختبار توكي بعد الاختبار. بالنسبة للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي، تم استخدام اختبار كروسكال–واليس يليه اختبار مان–ويتني U. تم اعتبار قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.