مقالة منهجية

دراسة الآليات على مستوى الشبكة لتحفيز الدماغ العميق الشاحب باستخدام مصفوفات الأقطاب الدقيقة عالية الكثافة

212 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70507

⸱

يونيو 16, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نصف بروتوكولا لتسجيل مصفوفة الأقطاب الدقيقة عالية الكثافة خارج الجسم من شرائح دماغية حادة لنموذج هامستر خلل التوتر الذي تلقى في الجسم الحي. تحفيز عميق مستمر للدماغ الشاحب لمدة 11 يوما.

الملخص

خلل التوتر العضلي هو اضطراب عصبي في الحركة يتميز بتحكم غير طبيعي في العضلات يؤثر على الحركات الإرادية والوضعيات المستمرة. على الرغم من أن خلل التوتر العضلي مرتبط بخلل العقد القاعدية، إلا أن الأدلة المتزايدة تشير إلى أن المخيخ متورط في الفيزيولوجيا المرضية. يظهر هذا البروتوكول تحفيز عميق للدماغ البالي البالي ( DBS) في نموذج هامستر خلل التوتر (dtsz hamster) مع تسجيلات مصفوفة الأقطاب الدقيقة عالية الكثافة خارج الجسم الحي (HD-MEA) لدراسة نشاط المخيخ. يشمل البروتوكول (1) جراحة DBS لزرع الأقطاب الكهربائية والمنشطات، (2) تحضير قطع المخيخ الحادة، (3) تسجيلات كهربائية فيزيولوجية عالية الدقة، و(4) تحليل البيانات. تشير النتائج الممثلة إلى أن 11 يوما من متلازمة الدماغ العميق الشعرية أعادت نشاط الشوكة إلى مستويات طبيعية في الطبقات الجزيئية، والطبقات الحبيبية، مما يتوافق مع تورط شبكة المخيخ في خلل التوتر العضلي. يتيح هذا البروتوكول تحليلا تفصيليا لنشاط المخيخ وتعديله بواسطة DBS، مما يوفر منصة لدراسة الآليات على مستوى الشبكة التي تقوم عليها علاجات التعديل العصبي.

المقدمة

خلل التوتر العضلي هو ثالث أكثر اضطرابات الحركة شيوعا1 ويتميز بعلامات وأعراض سريرية مميزة2،3، رغم أنه قد يخطئ أحيانا مع اضطرابات حركية أخرى4،5،6. أبرز السمات السريرية تشمل انقباضات العضلات اللاإرادية، الحركات المتكررة، والوضعية غير الطبيعية و/أو الملتوية7. قد ترافق هذه السمات أعراض مثل الألم، وضعف الأداء الحركي، والإرهاق، والتي قد تزداد سوءا خلال فترات التوتر أو القلق أو الإرهاق الجسدي 8,9,10,11. لا تزال الفيزيولوجيا المرضية للخلل العضلي غير مفهومة بالكامل12,13. على الرغم من أن الدراسات ركزت تقليديا على العقد القاعدية، إلا أن الأدلة المتزايدة تدعم مفهوما على مستوى الشبكة للاضطراب، يشمل عدة مناطق دماغية، بما في ذلك المخيخ14، 15، 16، 17. يهدف هذا البروتوكول إلى دراسة نشاط الشبكات خارج الخلية عبر طبقات مميزة من قشرة المخيخ لتوضيح دورها في الفيزيولوجيا المرضية للخلل العضلي وفهم الآليات الشبكية العامة لتحفيز الدماغ العميق (DBS).

غالبا ما يستخدم التحفيز العميق للدماغ (DBS) الذي يستهدف الكتلة الشاحبة الداخلية (GPi) أو النواة تحت المهادية (STN) لعلاج بعض أشكال خلل التوتر العضلي 18,19، خصوصا تلك التي تكون مقاومة للأدوية. بالإضافة إلى ذلك، فإن نتيجة العلاج متجانسة وغير متوقعة، حيث قد يستجيب المرضى الذين يعانون من مظاهر سريرية متشابهة بشكل مختلف لنفسالنهج العلاجي. يمكن أن يحسن الفهم الشامل لشبكة الأعصاب الكامنة وراء خلل التوتر العضلي نتائج العلاج21. لذلك، هناك حاجة إلى أساليب واسعة النطاق وتجريبية، لا يمكن تحقيقها إلا من خلال الدراسات ما قبل السريرية في نماذج الحيوانات. يتيح دمج تجارب DBS في الجسم الحي مع تسجيلات مصفوفة الأقطاب الدقيقة عالية الكثافة خارج الجسم (HD-MEA) مراقبة عالية الدقة لنشاط الشبكة العصبية (شبه الفسيولوجية) لفهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية للخلل العضلي وآليات DBS.

تؤثر العقد القاعدية والمخيخ على التحكم الحركي، جزئيا على الأقل، من خلال اتصالاتها بالقشرة الحركية الأولية (M1)22. دراسة تشريحية مع آفة مخطط وإزالة المخيخ جراحيا تدعم هذه الفكرة23. في دراستنا، استخدمنا النموذج الحيواني للهامستر dtsz 24,25 الديستوني، الذي يظهر تشوهات مخيخية مرتبطة بخلل التوترالعضلي 26. باستخدام مصفوفات الأقطاب الدقيقة عالية الكثافة (HD-MEAs)، درسنا نشاط الشبكة القشرية المخيخية لدى الهامستر العضلي والصحي. ومع ذلك، تفتقر الأساليب الفيزيولوجية الكهربائية التقليدية إلى الدقة المكانية لالتقاط ديناميكيات الشبكات الخاصة بالطبقات، بينما تعالج هذه الطريقة هذا القيد. من ناحية أخرى، درسنا تأثير التحفيز العميق للدماغ في الكرة الشاحبة الداخلية على شبكات القشرة المخيخية.

يوفر نظام HD-MEA ميزة التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية التفصيلية بالتوازي، مما يتيح التحليل عبر طبقات قشرة المخيخ (الحبيبية، الطبقات الجريئة، والجزيئية)، حيث تلعب كل طبقة دورا أساسيا في معالجة تسلسلات الحركة27. الطبقة الحبيبية، المليئة بكثافة بالخلايا الحبيبية، تستقبل وتنقل المعلومات الحسية والحركية من الألياف المغطاة بالطحالب، مما يسمح بتكامل الإشارة الأولي قبل المعالجة الإضافية27. طبقة بوركينجي، التي تحتوي على خلايا بوركينجي، تنقل إشارات مثبطة إلى النوى المخيخية العميقة، حيث تقوم الطبقات الحبيبية والجزيئية بتعديل الإشارة الخارجة. تدعم الطبقة الجزيئية، الغنية بالتغصنات والخلايا العصبية الداخلية، التعديل المعقد من خلال التفاعلات المشبكية مع خلايا بوركينجي، مما يضبط ناتج الحركةبدقة 28. HD-MEA، على عكس تقنيات التسجيل الأخرى، لا يقتصر على الدقة المكانية أو مساحة العينة، مما يسمح بالتقاط المساهمات الفريدة لكل طبقة في الديناميكيات العصبية المتغيرة التي تظهر في خلل التوترالعضلي 15. يوفر هذا النهج دقة مكانية أعلى وقدرات تسجيل متوازي مقارنة بطرق التسجيل ذات القطب الواحد أو منخفضة الكثافة. هناك أنظمة HD-MEA تعتمد على تقنية أكسيد المعادن التكميلية (CMOS)29,30، مع مفهوم حساس البكسل النشط (APS)، توفر تصويرا وظيفيا لتصوير النشاط الكهربائي لمجموعات كبيرة من الخلايا العصبية عبر الزمن31,32. بهذه التقنية، يمكن مراقبة ديناميكيات كل طبقة من قشرة المخيخ، ويمكن دراسة عمليات النقل المشبكي المحددة عن طريق الغسل بمواد مختلفة. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تحقق في نشاط الشبكات العصبية المعقدة والتغيرات الخاصة بالطبقة في نماذج الأمراض العصبية.

يتناول هذا العمل التحديات التقنية المتعلقة بتغليف نظام التحفيز بالإضافة إلى تحضير الأنسجة، وجمع البيانات، وتحليل مجموعة بيانات كبيرة من الفيزيولوجيا الكهربائية. من خلال هذا العمل، نقدم خيارا للدراسة المخبرية لمعالجة الخلايا العصبية المعقدة للغاية، والتي تساهم في حالتنا، من جهة، في فهم أكثر تمايزا للديناميكيات الفسيولوجية المرضية في الشبكات العصبية الديستونية، ومن جهة أخرى، توفر معرفة حول آلية العلاج لعمل DBS.

البروتوكول

استخدم هامستر dtsz الديستوني وتحكم في الهامستر الذهبي السوري للتجارب26. تم فحص أربع مجموعات تجريبية في الدراسة الحالية: (1) هامستر ضابط غير ديستوني (النوع البري، WT)، (2) هامستر dtsz الأصلي غير المعالج، (3) dt sz-Sham (خضع للغرس ولكن بدون تحفيز نشط)، و(4) dtsz-DBS (مع DBS مستمر في الجسم الحي لمدة 11 يوما قبل تحضير الشريحة). أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد الأوروبي والقوانين الفيدرالية لحماية الحيوانات، بموجب الترخيص 7221.3-1-029/20.

1. الحيوانات

  1. احتوى الحيوانات في ظروف GV Solas33 القياسية بدورة ضوء 14 ساعة / 10 ساعات مظلمة، مع وصول مجاني للماء والطعام (هامستر النظام الغذائي القياسي، ألترومين).
  2. افحص هامستر dtsz المتحولين بحثا عن أعراض خلل التوتر باستخدام تقنية التحفيز الثلاثي26، في سن 20 ± 1 و27 ± 4 أيام
    ملاحظة: يتضمن هذا الإجراء المعياري للضغط الخفيف إخراج الهامستر من قفصه المنزلي ونقله إلى قفص جديد فارغ، يليه حقن محلول ملحي داخل الصفاق أو تحت الجلد، والحرمان قصير الأمد من النوم. هذا التسلسل من المحفزات الخفيفة التي تثير القلق يحفز بشكل موثوق نوبات ديستونية مع زمن استجابة قابل للتكرار، ولذلك يستخدم في الفحص الظاهري قبل إدراجها في مجموعات تجريبية. يخضع الهامستر الضابط غير الديستوني لنفس الإجراء لضمان ظروف تجريبية مماثلة بين المجموعات.
  3. لعلاج المسكنات، عالج الحيوانات من مجموعتيdt sz-Sham و dtsz-DBS بميتاميزول بجرعة 100 ملغ·كجم-1 بيروور (p.o.) زرع كلا المجموعتين وفقا للإجراء الجراحي الموضح أدناه.

2. تغليف نظام تحفيز STELLA

  1. يتم تغليف أنظمة تحفيز STELLA باستخدام نهج متوافق حيويا لحماية الأجهزة من اختراق السائل أثناء الزرع المزمن. يتم وضع الجهاز الإلكتروني في كبسولة PETG مطبوعة ثلاثية الأبعاد مخصصة.
    1. أغلق بين الغطاء والكبسولة باستخدام السيليكون.
    2. بالإضافة إلى ذلك، أغلق الغلاف بالسيليكون عند مخرج الكابل.
    3. إذا ظهرت الفجوات في السيليكون بعد التجفيف، كرر الخطوتين 1 و2.
    4. بعد تصلب السيليكون بالكامل، جهز راتنج الإيبوكسي بنسبة خلط 100:35 (وزن).
    5. قم بإزالة فقاعات الهواء من الراتنج تحت الفراغ (Vevor RS-1.5).
    6. قبل تجميع القالب، ضع طبقة رقيقة من الفازلين على سطح التزاوج في قالب السيليكون المخصص لتحسين العزل وتسهيل إزالة القالب بعد معالجة الإيبوكسي. ضع كبسولة المحفز في قالب السيليكون واملأ القالب ببطء براتنج الإيبوكسي حتى يتم تغطية وصلات المنبه والكابلات بالكامل. تجنب فقاعات الهواء أثناء الحشو.
    7. بعد أن يتصلب الراتنج، قم بإزالة الكبسولة من القالب وتسوية سطح الإيبوكسي باستخدام مبرد دقيق أو أداة تلميع لإزالة الحواف الحادة.
    8. ضع طبقة سيليكون رقيقة نهائية فوق كبسولة الإيبوكسي المعالجة عن طريق غمر الكبسولة في السيليكون السائل. استخدم ماصة بلاستيكية لوضع سيليكون إضافي حول الكابل بالقرب من منطقة التوصيل. يجب إزالة تراكم السيليكون الزائد بعصا قبل التصلب لتجنب سمك الطلاء.
    9. وأخيرا، قم بإجراء اختبار وظيفي بعد التغليف للتحقق من صحة التحفيز قبل الزرع أو الاستخدام التجريبي. ضع نظام تحفيز STELLA في محلول رينجر وفعل وظيفة BIST المغناطيسية. تأكد من نمط وميض LED الصحيح (2 × 2)، مما يشير إلى وجود إخراج تحفيز مناسب وعدم وجود دوائر قصر أو دوائر مفتوحة أو ظروف بطارية منخفضة34.

3. إجراء جراحي لزرع نظام تحفيز

  1. جهز الأدوات الجراحية (الشكل 1) ونظام التحفيز STELLA (منصة زرعية قابلة للزرع المعرفة برمجيا)34.
    1. قم بتعقيم الأدوات المعدنية من الشكل 1 لمدة تقارب 5 دقائق عند 200 درجة مئوية، مثلا باستخدام جهاز FST Sterilizer 250. لاحظ أن الأجهزة تكون ساخنة عند إزالتها.
    2. قم بتعقيم نظام تحفيز STELLA باستخدام قطبين DBS بنسبة 70٪ إيثانول. ضع نظام التحفيز المجفف في أنبوب فالكون (أنبوب مخروطي بحجم 50 مل) مملوء بمحلول رينجر طوال الليل.
  2. جهز الحيوان (في عمر 25–32 يوما)
    1. ضع غرفة التخدير (التي صنعها بنفسك) في قفص الهامستر. سيدخل الهامستر إلى الأنبوب طوعا بعد فترة قصيرة (الشكل 2A).
    2. عندما يكون الهامستر داخل الأنبوب، أغلق الأنبوب في النهاية واربط الأنبوب بخرج الإيزوفلوران المتطاير لمدة دقيقة إلى دقيقتين (تحفيز تخدير بنسبة 4٪ إيزوفلوران) (الشكل 2B).
    3. أزل الحيوان من الأسطوانة بلطف. ضع الحيوان على الصندوق الذي يتم التحكم فيه بدرجة حرارة.
      السطح (حوالي 38 درجة مئوية) وتركيب قناع تنفس (GM-4؛ صيانة التخدير بنسبة 3٪ إيزوفلوران؛ عمق التخدير الاختبار مع الانعكاس بين الرقميين).
    4. احلق منطقة الجراحة على الرأس باستخدام مقص شعر مناسب (الشكل 2C). نظف المنطقة بمسحة مبللة وحقن 500 ميكرولتر من 0.25٪ بوبيفاكائين تحت الجلد (s.c.) في فروة الرأس لتخدير موضعي إضافي للسحاق السودي. انتظر على الأقل 5 دقائق قبل فتح فروة الرأس.
    5. انقل الحيوان بعناية إلى الإطار الستيريوتاكسي وثبته بقضبان الأذن بحيث يكون البريغما واللامبدا على نفس الارتفاع (تقليل الإيزوفلوران إلى 1.5–2.5٪ للحفاظ على التخدير).
    6. احم العينين ببديل للدموع (TVM Ocry-Gel).

4. زرع نظام تحفيز ستيلا

  1. قم بعمل شق جلدي بطول 2 سم في المنتصف على فروة الرأس. يسحب المراجع (الشكل 1، رقم 14 والشكل 2D) الجلد بعيدا. جهز الجمجمة عن طريق إزالة السحاق محليا باستخدام الشفرة عن طريق الخدش. أوقف النزيف المحتمل باستخدام المسحات.
  2. ضع 3٪ H2O2 باستخدام أداة تطبيق برأس قطني للتقسيس.
  3. خذ نظام التحفيز من محلول رينجر واحم أقطاب DBS باستخدام غشاء بارافيلم.
  4. أدخل زوجا غير حاد من المقص عبر الشق الجلدي الذي تم إجراؤه على الرأس وشكل جيب جلدي بطول 5 سم تحت الجلد باتجاه الرقبة والجانب.
  5. أدخل المنشط، الذي أزيلت من الصقر ونقعه في التعقيم الجلدي.
  6. ضع حوالي 500 ميكرولتر من المضاد الحيوي (10 ملغ·جم-1 حمض الفوسيديك) على جيب الجلد باستخدام أداة تطبيق من طرف القطن.
  7. احفر فتحتين بقطر 7 مم (بحجم FST#19007-07) في الجمجمة لأقطاب DBS عند AP: −0.6 مم وML: ± 2.2 مم حسب البريغما.
  8. احفر ثقبين إضافيين (9 مم؛ FST#19007-09) جانبيا على كل ثقب قطب. قم بتثبيت أربعة براغي (DIN 84 A2 M1x2) في الفتحات المحضرة (الشكل 2D).
  9. ازرع قطبين من DBS (SNEX-100) بحجم DV: 6.0 مم حسب البريغما. يرجى ملاحظة أن حامل القطب في إطار الستيريوتاكتيك الخاص بك يحدد الجانب الذي يزرع فيه القطب أولا (المسافة بين الأقطاب هي 4.4 مم).
  10. ثبت القطب برابط مثبت بأشعة فوق بنفسجية (هيليوبوند) على البرغيتين. عند زرع كلا القطبين، يتم تطبيق طبقة أخيرة تحتوي على روابط معالجة بأشعة فوق بنفسجية بينهما. وأخيرا، يتم تثبيت الأقطاب الكهربائية بتدفق الكومبوجلاس (الشكل 2E).
  11. فعل محفز مجموعة DBS مغناطيسيا بعد ثلاثة أيام على الأقل من التعافي لمدة 11 يوما متواصلة من DBS. في هذه الدراسة، استخدمنا معايير تحفيز مشابهة لتلك المستخدمة في العيادات (130 هرتز، 50 ميكروأمبير، و60 ميكروثانية).
  12. تحقق من نمط الضوء للمحفز عن طريق تمرير المغناطيس يوميا على جانب الهامستر (الشكل 2F).

5. تحضير شرائح المخيخ الحادة

  1. حضر 1 لتر من السائل الدماغي الشوكي الصناعي (ACSF) و0.5 لتر من السكروز لكل حيوان (انظر الجدولين 1 والجدول 2 للتفاصيل).
  2. استخدم محلول السكروز عند حوالي 4 درجات مئوية أثناء استخراج الدماغ والتقطيع، مع الكربوجينة المستمرة. بالإضافة إلى ذلك، حضر السكروز البارد جدا للحفاظ على درجة حرارة الأنسجة المنخفضة أثناء التشريح السريع.
  3. جهز مكان العمل باستخدام أدوات التشريح، محلول السكروز، أطباق بتري، وإعداد الاهتزاز (انظر الشكل 3A).
  4. يجب أن تتم تضحية الحيوانات خلال حوالي 15 دقيقة بعد التوقف عن DBS، ويجب أن يبدأ استخراج المخيخ فورا بعد ذلك. قطع رأس الحيوان في تخدير عميق محفز بالأيزوفلوران المتطاير. ضع الرأس في طبق بتري أعلى مملوء بالسكروز البارد كالثلج.
  5. قم بتشريح الدماغ بتجنب القطع الإنسية عبر القناة الشوكية لحماية نسيج المخيخ من التلف.
  6. انقل الدماغ إلى طبق بتري جديد مملوء بالسكروز البارد كالثلج، مع ورق ترشيح في الأسفل لمنع انزلاق المخيخ أثناء التقسيم.
  7. أولا، قم بإزالة المخيخ عبر القطع الإكليلي عبر البونات باستخدام شفرة (الشكل 3B). ثم إزالة نصفي الكرة المخيخية عبر جروح الباراساجيتال باستخدام شفرة (الشكل 3C).
  8. حضر طبق الاهتزاز بقطرة من الغراء الفائق. أزل الديدان المخيخي بعناية من طبق البتري. ضع طبقة المقطع الباراساجيتي على ورق فلتر ليجف قبل لصق هذا الجانب (الشكل 3D).
  9. ضع طبق الفيبراتوم في الصينية واملأه بما يكفي من السكروز (نصف سلس، نصف محلول) لغمر الحشرات بالكامل. لا تنس استخدام الغاز بالكربوجين (CB).
  10. قطع شرائح مخيخية باراسجيتال بسماكة 200 ميكرومتر بسرعة ثابتة 0.08 مم·ثانية-1 (الشكل 3E). خزن الشرائح في ACSF في كأس يتم تزويده بغازات مستمرة ب CB في درجة حرارة الغرفة (الشكل 3F).
  11. دع الشرائح تستعيد السيطرة في ACSF الغازي على درجة حرارة الغرفة لمدة تقارب 40 دقيقة قبل نقلها إلى HD-MEA، الذي يعمل كفترة إعادة تسخين وتثبيت قبل التسجيل. خلال هذه الفترة، حافظ على ACSF في درجة حرارة الغرفة.

6. تجهيز بئر CorePlateTM المفرد لنظام BioCAM DupleX MEA للتسجيل

  1. شغل نظام تسجيل BioCAM DupleX باستخدام برنامج Brainwave 5 (BW5) قبل بدء التجارب ب 30 دقيقة على الأقل.
  2. قبل وضع شريحة النسيج على CorePlateTM Single-Well للتسجيل، قم بتقييم مستوى الضوضاء الخلفية بإدخال البئر الواحد في إعداد التسجيل. يجب أن يكون مستوى الضوضاء الأمثل للتسجيل عالي الجودة بين 9-20 ميكروفولت.
  3. نظف الوسادات المطلية بالذهب بنسبة 100٪ إيثانول (الشكل 4A-1)، ومصفوفة الأقطاب الكهربائية بنسبة 70٪ إيثانول، وفرشاة ناعمة (الشكل 4A-2). وأخيرا، اشطف مصفوفة الأقطاب بماء MilliQ.
  4. قم بتوصيل HD-MEA/CorePlateTM بئر واحد في نظام التسجيل (الشكل 4D-1).
  5. مصب الماء تقريبا 2 مل من ACSF داخل البئر. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء على الأقطاب الكهربائية أو الأرض (الشكل 4D-2).
  6. ابدأ الاقتناء المباشر وسجل لمدة لا تقل عن 30 ثانية مع BW5.

7. تحليل السعة من الذروة إلى القمة

  1. لتحليل واجهة الضوضاء، افتح ملف *.bxr المسجل، الذي يحتوي على 30 ثانية من تسجيل الضوضاء الداخلي (الناتج عن المكونات المقاومة للأقطاب الكهربائية ودوائر المضخم).
  2. اختر "خريطة النشاط" وتحت "القياس" اختر السعة من الذروة إلى الذروة. يتم ضبط المقياس على 500 ميكروفولت، مما يسمح برؤية تباين الإشارة عبر مصفوفة الأقطاب الكهربائية (الشكل 5A).
  3. في نافذة "خريطة النشاط"، ضع مؤشر الفأرة فوق القطب المسجل لعرض قيمة السعة "متوسط المسافة الواسعة".
  4. بدلا من ذلك، يمكنك تحديد متوسط قيمة السعة عن طريق إنشاء ملف Excel (*.xlsx) تحت "تصدير الرسم البياني". ثم افتح ملف Excel ذلك واحسب القيمة المتوسطة للسعة [=المتوسط(Number1; الرقم 2;...)].

8. تحليل الضوضاء الأساسية (انحراف معياري الإشارة)

  1. حلل الضوضاء الأساسية بالنقر على "تشغيل" لإنشاء ملف *.brw. ثم اختر "خريطة النشاط" وتحت "القياس" اختر "الانحراف المعياري". يتم ضبط المقياس تلقائيا على 30 ميكروفولت، مما يسمح برؤية تباين الإشارة عبر مصفوفة الأقطاب الكهربائية (الشكل 5B).
  2. في نافذة "خريطة النشاط"، مرر مؤشر الفأرة فوق القطب المسجل لعرض الانحراف المعياري "متوسط المسافة الواسعة".
  3. بدلا من ذلك، يمكنك تحديد متوسط الانحراف المعياري باستخدام "تصدير المخطط" وإنشاء ملف *.xlsx Excel. ثم افتح ملف إكسل وحساب متوسط الانحراف المعياري [=المتوسط(الرقم 1؛ الرقم 2;...)].

9. لتقييم جودة الإشارة:

  1. حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR)
    figure-protocol-1
    SNR ≥ 5: جودة جيدة
    نسبة الضوضاء بين 2 و5: جودة متوسطة
    نسبة الضوضاء < 2: جودة سيئة

10. تحديد المواقع المقطعية في CorePlate بئر واحد لجمع البيانات

  1. بمساعدة ماصحة باستور، ضع الشريحة عند مصفوفة الأقطاب بحيث تغطي المنطقة محل الاهتمام بأقطاب تسجيل (الشكل 4 B-1). قم بإزالة المحلول من البئر (الشكل 4 B-2). التقط صورة بمجهر عمودي.
  2. ثبت النسيج باستخدام تثبيت الشريحة (الشكل 4C).
  3. باستخدام ماصة باستور بسعة 3 مل، أضف قطرة واحدة من ACSF إلى الشريحة.
  4. قم بإزالة السائل باستخدام ماصة باستور ذات حجم أصغر. أزل السائل المتبقي بقطعة ورق ملتوي (كرر ذلك 7-10 مرات) (الشكل 4C-2).
  5. للتروية أثناء التسجيل، استخدم ACSF في درجة حرارة الغرفة واضبط المعدل على 2 مل·دقيقة في الدقيقة. موقع التدفق الداخل فوق شريحة الأنسجة، والتدفق الخارج عند جدار البئر (الشكل 4D).
  6. يوصى بإضافة تأريض إضافي للتدفق الداخلي والخارج لتقليل الضوضاء الناتجة عن التروية، ويمكن تحقيقها عن طريق توصيلها بنظام التسجيل عبر سلك (الشكل 4D-1).
  7. لتقليل الاضطرابات، أطفئ المجهر وأضواء الغرفة.

11. تسجيلات نشاط الشبكة باستخدام CorePlateTM Single-Well

  1. اضبط معلمات التسجيل على تردد أخذ عينات 20,000 هرتز مع مرشح تمرير عالي عند 100 هرتز.
    1. في برنامج BrainWave 5، اذهب إلى ملف وافتح جلسة تسجيل جديدة.
    2. انقر على "المصدر".
    3. افتح: chip pilot، واختر التعديلات التالية:
      تسجيل النشاط العصبي التلقائي بمعدل أخذ العينات: 20,000 هرتز/قطب كهربائي.
      قطع فلتر عالي التمرير في العتاد: 100 هرتز.
      معدل تعويض الضوء: قصير (تحفيز مباشر للضوء).
  2. لاختيار قناة معايرة الشريحة ونوع المسار الخام.
    1. فتح: التحكم في الإشارة، واختر: عند معايرة الشريحة الداخلية، اختر قناة الإخراج: 1.1.
    2. انقر على "+" و "رسم العلامات".
    3. افتح: إعداد المخطط.
    4. اختر الآثار الخام: خام والمسامير.

12. إدخال ومحاذاة صورة المجهر على خريطة النشاط

  1. انقر على "+".
  2. "الطبقات والتعليقات" لإدراج صورة المجهر في خريطة النشاط على BW5:
  3. طبقات الذهاب إلى البئر:
    1. اختر إدارة الطبقات وصورة المخيخ.
    2. محاذاة طبقة الصورة المختارة: انقر على زر البدء.
    3. انقر على الزوايا الأربع للصورة بعد التسلسل الرقمي وقدم الطلب.

13. إعداد ضغط البيانات قبل التسجيل

  1. لضغط البيانات، انتقل إلى الصفحة الأولى من RECORDER:
    1. وضع قمرة القيادة: متقدم
    2. حفظ الخام مضغوطا: ضغط المويجات + الأحداث: ارتفاعات.
    3. شغل لمدة 10 دقائق قبل بدء التسجيل.
  2. نظف الوسادات المطلية بالذهب بالإيثانول بنسبة 100٪ بعد الانتهاء من التسجيلات. بعد ذلك، املأ البئر بالماء النقي وافركه لمدة 30 ثانية.
  3. بعد ذلك، املأ البئر بنسبة 70٪ إيثانول وامسح مصفوفة الأقطاب الكهربائية بلطف لمدة تقارب 30 ثانية. وأخيرا، املأ البئر بالماء النقي وافركه بلطف لمدة 30 ثانية (كرر هذه الخطوة مرتين أو ثلاث).
  4. حافظ على جفاف CorePlateTM في الوعاء المناسب.

14. التحليل غير المتصل للبيانات المسجلة

  1. افتح الملف المطلوب باستخدام BW5.
  2. قسم قشرة المخيخ إلى ثلاث مجموعات عن طريق اختيار الأقطاب الكهربائية وفقا لتوزيع الطبقة التشريحية (الطبقة الجزيئية، طبقة خلية بوركينجي، طبقة الخلية الحبيبية).
    ملاحظة: عدد الأقطاب الكهربائية ضمن مناطق الاهتمام (ROIs) في كل طبقة يعتمد على النشاط التلقائي المكتشف في كل طبقة وبالتالي يختلف عبر التسجيلات. عادة، تم تحليل 25-250 قطبا لكل عائد استثمار من شريحة واحدة. تم استبعاد الأقطاب الكهربائية الموجودة في مناطق تمتد عبر طبقتين تشريحيتين لتجنب الغموض في توزيع الطبقات. تم تضمين الأقطاب الكهربائية الوحيدة المنسوبة بوضوح إلى طبقة مخيخية محددة للتقييم الإضافي.
    1. الاختيار والتجميع: اذهب إلى مجموعات الوحدة.
    2. في إدارة مجموعات الوحدات، انقر على "+" لتشكيل مجموعة واحدة وتسميها.
    3. لإضافة المزيد من الأقطاب الكهربائية في المجموعة، اختر الأقطاب الكهربائية واضغط على "إضافة أو إزالة وحدات محددة".
  3. تحليل الآثار الخام باستخدام طريقة كشف الأشواك، المعروفة باكتشاف الأشواك بالتوقيت الدقيق (PTSD). يركز على اكتشاف الحدود العظمى والدنيا النسبية التي تتجاوز سعات الذروة إلى القمة عتبة محددة مسبقا، مما يضمن تحديد دقيق ودقيق للسبايك.
    1. معالجة البيانات: اذهب إلى اكتشاف Spike وضبط الوضع على متقدم.
    2. استخدم البيانات من: Raw.
    3. الخوارزمية: اضطراب ما بعد الصدمة (كشف حدود التوقيت الدقيق).
    4. عامل الانحراف المعياري: 8.0.
    5. فترة العمر القصوى: 2.0 مللي ثانية.
    6. فترة المقاومة للكشف: 1.0 مللي ثانية.
    7. تعيين الشوكة: ذروة سلبية.
    8. مدة الموجة قبل ذروتها: 1.0 مللي ثانية.
    9. مدة الموجة بعد ذروتها: 1.5 مللي ثانية.
  4. اذهب إلى فرز الأشواك واضبط الوضع على متقدم. قم بضبط المعامل التالي:
    1. مدة أخذ الموجة قبل الذروة: 0.5 مللي ثانية.
    2. مدة ما بعد ذروة الموجة: 1.0 مللي ثانية.
    3. خوارزمية استخراج الميزات: لحظات ليجندر.
    4. عدد المميزات: 3.
    5. خوارزمية التجميع: K-Means & Silhouette.
    6. الحد الأدنى لعدد الارتفاعات في كل عنقود: 20.
    7. الحد الأقصى لعدد العناصر: 3.
    8. عتبة المخطط الخارجي: 2.
  5. تصدير البيانات إلى إكسل.
    1. انقر على "رسم البيانات".
    2. اذهب إلى تصدير المخطط.
    3. اختر جدول البيانات وتصدير.

النتائج

زاد متلازمة الالتهاب العميق الشعري الشاحبة عدد الارتفاعات إلى المستويات الطبيعية في طبقات القشور بين المجموعات.

قمنا بتحليل العدد الكلي للارتفاعات في ثلاث طبقات من قشرة المخيخ — الطبقة الجزيئية (ML)، طبقة خلية بوركينجي (PL)، وطبقة الخلايا الحبيبية (GL) — عبر أربع مجموعات تجريبية: النوع البري (WT, N = 8)، dtsz (N = 8)، dtsz-Sham (N = 7)، وdtsz-DBS (N = 7)، مع تحليلات أجريت على شرائح مأخذة من هذه الحيوانات.

بينما أنتجت النسيج الخلل العضلي (dtsz) ارتفاعات أقل بكثير، زاد DBS الشاحب عدد الارتفاعات إلى مستويات مماثلة لتلك الخاصة بالأشخاص السليمين (الجدول 3). أكد اختبار كروسكال-واليس H ذلك أكثر، حيث أظهر زيادة ذات دلالة إحصائية في عدد الارتفاعات في ML لمجموعة dtsz DBS مقارنة بمجموعتي dtsz و dtsz-Sham (χ2(3) = 20.728، p = 0.001؛ الشكل 6A). كما أظهرت مجموعةdt sz-DBS زيادة مماثلة في الارتفاعات في PL (χ2(3) = 16.855، p = 0.001؛ الشكل 6B) وGL (χ2(3) = 13.164، ص. = 0.004؛ الشكل 6C)، والوصول إلى قيم مماثلة لتلك الخاصة بمجموعة WT (الجدول 3).

figure-results-1
الشكل 1. نظرة عامة على الأدوات الجراحية. تظهر الصورة صينية مرتبة تحتوي على مجموعة من الأدوات الجراحية والجراحية الدقيقة المصممة خصيصا لإجراءات زرع أقطاب كهربائية عميقة ومحفزات. يتم تنظيم الأدوات بترتيب تسلسلي للاستخدام، مما يعزز الكفاءة الإجرائية. يتم وضعها على المناديل للحفاظ على النظافة وضمان سهولة الوصول إليها أثناء العملية. يركز هذا الترتيب على الدقة، والتعقم، والجاهزية لسير العمل الجراحي المعقد. (1) مقص غير حاد/غير حاد، (2) مقص خياطة، (3) مقص حاد/حاد، (4) حامل الإبرة، (5) ملقط ربط الخياطة، (6) ملقط شظايا/منحني، (7) ملقط مسنن، (8) ملقط قياسي قصير، (9) ملقط قياسي، طويل، (10) ملعقة دقيقة، (11) قطب كهربائي معاد استخدامه، (12) براغي، (13) ملحقات مثقاب، (14) طرف/مشبك السحب (15) كتلة تجويف زجاجية يجب ملؤها بنسبة 0.9٪ NaCl وزيليوكائين. لمزيد من المعلومات، تحقق من قائمة المواد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. إعداد تجريبي لتخدير ووضع الحيوان في جهاز التجسيد المجسم لزرع أقطاب DBS والمحفز. (أ) يوضع الحيوان بلطف داخل غرفة تحفيز مخصصة لبدء التخدير. (ب) غرفة الحث متصلة بقناع تنفس لضمان إعطاء التخدير بشكل صحيح (الحث مع الإيزوفلوران بنسبة 4٪) مع الحفاظ على السلامة أثناء التعامل. (ج) بعد التخدير، ينقل الحيوان إلى لوحة تسخين مع قناع تنفس متصل (صيانة بالإيزوفلوران بنسبة 3٪) لمنع انخفاض حرارة الجسم وضمان استمرار التخدير أثناء الحلاقة. (د) يتم وضع الحيوان بعناية في الإطار المجسم. يتم عمل شق طولي، وتستخدم مشابك لسحب الجلد. تشير أربع نقاط إلى وضع البراغي. يتم إدخال براغي في المناطق المحددة، ويتم تحديد نقطتين إضافيتين لوضع الأقطاب. (ه) يتم إدخال القطب في جهاز GPi وتثبيته بالغراء قبل إزالة حامل الستيريوتاكسيك. لتحسين التثبيت، يتم وضع الأسمنت حول الأقطاب. تستخدم غرز طولية متقطعة لإغلاق موقع الجراحة، و(و) يوضع المحفز في منطقة الجانب تحت الجلد للحيوان. يبقى الحيوان حيا بعد الجراحة، والسهم يشير إلى موقع المحفز. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. رسم توضيحي لتقسيم الدماغ والتقطيع. (أ) أدوات جراحية لإجراء التشريح. (1*) طبق أجار بتري منزلي الصنع، (2*) طبق أجار بتري، (3*) مشبك يثبت أنبوب الكربوجين، (4*) فلتر ورقي، (5*) شفرة، (6*) غراء فائق، (7*) لوحة/حامل فيبراتوم، (8*) ملقط منحني، (9*) مقص، حاد/غير حاد. (ب) تحضير عينة الدماغ: بعد التشريح، يقطع الدماغ، وتشير الخطوط المتقطعة إلى اتجاه تقسيم المستوى الإكليلي. (ج) التقسيم الباراسجيتي: يقطع الدماغ على طول المستوى الباراسجيتي المحدد. (د) تثبيت الأنسجة: يتم تثبيت نسيج الدماغ الناتج على لوحة/حامل بغراء لتثبيته للتقسيم الدقيق. (ه) تقسيم الاهتزاز: يتم نقل اللوح الذي يحتوي على نسيج متصل إلى الاهتزاز، حيث يتم الحصول على شرائح فائقة الرقة (200 ميكرومتر). (و) الشرائح النهائية: تنتج شرائح دقيقة للمخيخ الباراساجيتالي، جاهزة للتسجيل الكهربائيالفيزيولوجي 35. لمزيد من المعلومات، تحقق من قائمة المواد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4. توضيح الخطوات للحصول على نشاط خلوي جيد. (أ) التنظيف: تتضمن هذه الخطوة تجهيز HD-MEA بتنظيف سطحه لضمان عدم تداخل الأوساخ مع التثبيت (لوحة التلامس، A-1) أو عملية التسجيل (المساحة المسطحة، A-2). (ب) موضع القطع: يتم وضع شريحة النسيج بعناية على HD-MEA (B-1)، لضمان المحاذاة الصحيحة للاتصال الفعال مع القطب الكهربائي (B-2). يستخدم طرف رفيع من الماصة (السهم) لإزالة ما تبقى من ACSF، مما يسمح بإدخال المرساة. (ج) تثبيت الشريحة: يتم وضع الشريحة بإحكام على HD-MEA باستخدام المرساة. في هذه الخطوة، من الضروري وضع قطرة من ACSF ثم إزالة السائل الزائد بعناية باستخدام ماصة (C-1؛ سهم) وقطعة ورق مسح دقيقة ملتوية (C-2). يضمن ذلك أن الشريحة تبقى مستقرة ومتصلة جيدا بالأقطاب الكهربائية لتسجيل دقيق. (د) التسريب: أخيرا، يتم توصيل نظام التروية وتفعيله للحفاظ على صلاحية شريحة النسيج أثناء التجربة، حيث يجب أن يكون التدفق الداخل فوق الشريحة والتدفق الخارج قريبا من الجدار (D-2). من الضروري أيضا إزالة جميع الفقاعات من الأرض لتقليل الضوضاء أثناء التسجيل (كما يشير السهم). يتم تثبيت تأريض إضافي على كل من أنابيب التدفق الداخلة والخارجة (D-1). أشرطة القشور الحمراء طولها 1.5 مم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5. مقاييس السعة والانحراف المعياري في تسجيلات HD-MEA باستخدام برنامج Brain Wave 5 (BW5) لتقييم جودة الإشارة. (أ) مقياس السعة من القمة إلى القمة المختار لاستخراج قيم سعة الأقطاب الكهربائية الجوهرية (المقياس: 500 ميكروفولت). (B) مقياس الانحراف المعياري المختار لقياس الضوضاء الأساسية عبر الأقطاب الكهربائية (المقياس: 30 ميكروفولت). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: تأثيرات DBS الشاحبة على نشاط الأشواك عبر طبقات القشرة المخيخية: (A) الطبقة الجزيئية (ML)، (B) طبقة خلايا بوركينجي (PL)، و(C) الطبقة الحبيبية (GL). تعرض مخططات بوكس-ويسكر المتوسط والوسيط مع خط عرضي وأفقي على التوالي، إلى جانب النسبة المئوية 25 و75. المجموعات المعنية هي النوع البري (WT، n = 22 شريحة)، dtsz بدون جراحة (n = 20 شريحة)، dtsz DBS غير نشط (شام، n = 20 شريحة)، وdtsz-DBS نشط (n = 20 شريحة). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار كروسكال-واليس، تلاها مقارنات دن الزوجية (*p .< 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الاسمالوزن الجزيئي [g/ mol]التركيز النهائي [mol/ l]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
الجلوكوز180.160.01
CaCl2 (خالي من الماء)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH2PO4119.980.00125
الرقم الهيدروجيني7.35 إلى 7.40 (قابل للتعديل مع HCl)
الأسمولية [موسمول/ كجم]من 290 إلى 300

الجدول 1: محلول السائل الدماغي الشوكي الصناعي (ACSF): تركيب وتركيزات الأضراس النهائية للمكونات المستخدمة في تحضير ACSF لتجارب شرائح المخيخ. تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.35–7.40 باستخدام HCl، وحافظت الأسمولية بين 290–300 mOsm·kg-1.

الاسمالوزن الجزيئي [g/mol]التركيز النهائي [mol/L]
ساكارروز342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (خالي من الماء)110.980.0005
إم جي سيإل 295.210.007
الجلوكوز180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH2PO4119.980.00125
الرقم الهيدروجيني7.35 إلى 7.40 (قابل للتعديل مع HCl)
الأسمولية [موسمول/ كجم]من 320 إلى 330

الجدول 2: محلول السكروز. تركيب وتركيزات محلول السكروز في السطح النهائي المستخدم أثناء تحضير شرائح المخيخ. تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.35–7.40، وتم الحفاظ على الأسمولالية بين 320–330 mOsm·kg-1.

المجموعات:WTDTSZ dtsz-Shamdtsz-DBS
n22202020
معامل التباين
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
GL0.480.660.610.51
عدد الأشواك
ML287240±32605163434±19998234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
GL390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

الجدول 3: ملخص مقاييس الشوكة عبر طبقات المخيخ والمجموعات التجريبية. WT – الهامستر من النوع البري، غير العضلي العضلي؛ DTSZ - هامستر DTSZ الأصلي؛ DTsz-DBS - تحفيز هامستر DTSZ بشكل مستمر لمدة 11 يوما؛ DTsz-Sham - هامستر DTsz يخضع للجراحة، مع عدم وجود DBS نشط؛ ML – طبقة جزيئية؛ PL – طبقة خلايا بوركينجي؛ GL. – طبقة خلوية حبيبية.

المناقشة

وصفنا نهجا منهجيا للتحقيق في آليات تحفيز الدماغ العميق (DBS) في الشبكة العصبية العصبية العصبية النفسية في هامستر DTsz . تشمل الخطوات الحرجة زرع الأقطاب بدقة، وتحضير سريع لقطع المخيخ، وظروف تسجيل مستقرة لتسجيل HD-MEA لضمان جمع بيانات موثوق. نعرض إجراء الجراحة، وتحضير شرائح المخيخ، وتسجيلها، وتقنيات التحليل لاستكشاف النشاط المخيخي خارج الجسم وتعديله بواسطة DBS. وفرت القياسات الكهربائية الفسيولوجية باستخدام HD-MEA تسجيلات في الوقت الحقيقي للنشاط التلقائي المخيخي بدقة زمنية ومكانية عالية36، والتي نعتبرها ضرورية لدراسة آليات تحفيز الدماغ العميق في الدماغ الشاحني في علاج خلل التوتر العضلي.

يعرف خلل التوتر العضلي حاليا كاضطراب شبكي يتميز بإنتاج حركي غير طبيعي ناتج عن تفاعلات مختلة بين العقد القاعدية، والدوائر المخيخية، والدوائر القشرية37,38. لقد ثبت أن التشوهات المخيخية تلعب دورا مهما في خلل التوتر، كما تدعمها الدراسات السريرية والتجريبية 15,22,39. علاوة على ذلك، تظهر دراسة تشريحية تتعلق بحقن فيروس داء الكلب الرجعي (RV) في قشرة المخيخ لدى قرود سيبوس أن نواة تحت المهاد للعقد القاعدية لها بروز كبير إلى القشرة المخيخية40. تؤكد هذه النتائج أهمية استكشاف الدوائر المخيخية جنبا إلى جنب مع شبكات العقد القاعدية عند دراسة الآليات العلاجية لمرض DBS 40,41,42. تعد هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تبحث في التفاعلات العصبية وتأثيرات التعديل العصبي في اضطرابات الحركة.

فيما يتعلق بالآليات الشبكية العامة لمتلازمة الديروب الشعري الشاحب، أظهرت الدراسات أن DBS للجزء الداخلي من الكتلة الشاحبة (GPi) يسبب تغييرات واسعة في نشاط الدماغ، ليس فقط داخل العقد القاعدية بل أيضا عبر مناطق مترابطة مثل شبكة القشرة-السترياتالية43، والمهاد44، والمخيخ15. تدعم هذه الملاحظات الفرضية القائلة بأن متلازمة الديموس العميق الشعري يمكن أن تعدل النشاط عبر شبكة العقد القاعدية-المخيخية، مما يساهم في فعاليته العلاجية في خلل التوتر العضلي. هذا يوضح الحاجة إلى دراسات ما قبل سريرية لدراسة آليات DBS وميزة تسجيلات HD-MEA في التقاط التغيرات الكهربائية الفسيولوجية على مستوى الشبكة. علاوة على ذلك، تدعم دراسة كوتيرا وآخرون (2025) وجود إعادة تشكيل التلميل العصبي طويل الأمد ناتجة عن GPi-DBS طويل الأمد داخل شبكة الحركة الديستونية45. أظهرت نتائج التحفيز الشاحب أن التحفيز الشاحب قلل تدريجيا من شدة خلل التوتر العضلي في هامسترdt sz ، وأن التأثير المفيد استمر بعد التوقف عن التحفيز، مما يشير إلى أن التأثيرات الناتجة عن DBS لا تقتصر على التحفيز الحاد وحده45. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات الكهربائية الفيزيولوجية الحديثة تعديلا على مستوى الشبكة لأنماط اللدونة المشبكية وأنماط الارتفاعات بعد DBS طويل الأمد، بما في ذلك زيادة النشاط المخيخي15، وزيادة المدخلات التحفيزية للخلايا العصبية الحركية المهادية، والمزيد من المدخلات التحفيزية المتجمعة إلى M1 القشريM1 46.

تشير النتائج التمثيلية إلى تأثير التحفيز العميق للدماغ (DBS) على مستوى الشبكة بأكملها، كما يتضح من تطبيع نشاط الأشواك في طبقات الخلايا الجزيئية، وخلايا بوركينجي، والخلايا الحبيبية في قشرة المخيخ لدى الهامستر العصبي (الشكل 6). بلغ النشاط المتزايد في الشوكة الملحوظة في مجموعة DBS من dtsz مستويات مماثلة للمجموعة الضابطة من النوع البري. يدعم هذا التطابيع لنشاط الشوكة الإمكانات العلاجية لمتلازمة الدماغ العميق في علاج خلل التوتر العضلي. ومن الجدير بالذكر أن مجموعةdt sz-Sham أظهرت قيم ارتفاعات متوسطة مقارنة بمجموعة WT عبر جميع طبقات المخيخ، مما يشير إلى أن زرع الأقطاب الكهربائية وحده قد يؤثر على نشاط شبكة المخيخ. هذا التفسير يتوافق مع تأثير الآفات الدقيقة الموصوف سريريا في خلل التوتر العضلي، حيث قد يؤدي زرع الأقطاب الكهربائية نفسه إلى تحسين الأعراض مؤقتا قبل بدء التحفيز47. على الرغم من أن هامستر DTsz يعيد إنتاج السمات الرئيسية لخلل التوتر العضلي العضلي النوبي النوبة المختلط، إلا أنه لا يعكس بشكل كامل التباين السريري الذي لوحظ عبر متلازمات خلل التوتر العضلي البشري. لذلك، يجب توخي الحذر عند ترجمة هذه النتائج إلى خلل التوتر العضلي البشري.

يعالج هذا العمل التحديات التقنية المتعلقة بتغليف المنشطات، وجراحة DBS، وتحضير الشرائح، وتحليل البيانات الفيزيولوجية الكهربائية واسعة النطاق. يوفر مزيج تقنية HD-MEA المبنية على CMOS منصة قوية للدراسة المخبرية للتفاعلات العصبية المعقدةللغاية 48. تساهم نتائجنا في فهم أكثر دقة للديناميكيات الفيزيولوجية المرضية التي تكمن وراء خلل التوتر العضلي، مما يوفر رؤى قيمة حول آليات علاج DBS على مستوى الشبكة. يساهم تسهيل تحليل وظيفي مفصل لمناطق دماغية محددة وتفاعلاتها في فهم أكثر تمايزا للديناميكيات الفسيولوجية المرضية في الشبكات العصبية الديستونية، ومن ناحية أخرى، يوفر فهما لآلية العلاج لعمل DBS.

في هذه الدراسة، أدت المشاكل التقنية إلى زيادة الضوضاء الخلفية وتعطيل استقرار الإشارة أثناء تسجيلات HD-MEA. تشمل الخطوات الشائعة لاستكشاف الأخطاء معالجة مصادر الضوضاء، وضمان التأريض السليم، والحفاظ على اتصال مستقر بين الأنسجة والأقطاب. في حالات مستويات الضوضاء العالية أو القياسات غير المستقرة، يجب فحص التأريض وتوصيلات الكابلات والأجهزة الكهربائية القريبة أولا. كما يمكن أن تؤثر فقاعات الهواء على مصفوفة الأقطاب الكهربائية في تلامس الأنسجة مع الأقطاب وثبات التسجيل ويجب إزالتها بعناية (الشكل 4). علاوة على ذلك، يجب ضمان نقل البيانات المستقر من المضخم إلى الكمبيوتر عبر كابل USB-C إلى USB-C عالي الجودة. يجب استبعاد الأقطاب ذات الضوضاء المستمرة من التحليل الإضافي. بينما يسمح تسجيل الإشارات خارج الخلية باستخدام HD-MEA بدقة مكانية عالية لنشاط الشبكة، ومع الصورة المجهرية المتراكبة، التعيين للطبقات الفردية من قشرة المخيخ، لا يمكن استبعاد أن النشاط خارج الخلوي المكتشف تم تولده عن طريق عبور المحاور العصبية من طبقة غير الطبقة المخصصة. علاوة على ذلك، أجريت تحليلات إحصائية على مستوى الشريحة، حيث كانت كل شريحة تمثل تسجيلا كهربائيا فيزيولوجيا مستقلا تحت ظروف تجريبية موحدة، رغم أن بعض الشرائح نشأت من نفس الحيوان.

خلال DBS، قد تحدث مشاكل أخرى بسبب ارتخاء الأقطاب الكهربائية أو عيب تقني في المحفز. لتقليل هذه المشاكل، تأكد من تثبيت الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح والحفاظ على ظروف تعامل معقمة طوال الإجراء. حدث هذا في 5٪ من جميع التجارب في الدراسة الحالية. لتقليل ارتخاء الأقطاب، يجب تجفيف سطح الجمجمة قبل تثبيت القطب بمادة لاصقة أو أسمنت الأسنان لتحسين الالتصاق ومنع الانزلاق. لضمان التعقيم وتجنب التلوث الميكانيكي، يجب التعامل مع المنشط، وطرف الأقطاب، وخيط الخيط الأحادي فقط باستخدام الملقط أو ملقط الدم. بالإضافة إلى ذلك، يجب تعقيم القفازات بالإيثانول وتجفيفها قبل التعامل مع الحيوان لتقليل خطر العدوى. يعد التحضير السريع لشرائح الدماغ المخيخية ضروريا لتسجيلات كهربائية فيزيولوجية عالية الجودة. ومع ذلك، هذا يعني أنه لم يكن بالإمكان التحقق من موقع أقطاب DBS المزروعة بعد الواقع. في دراسة أخرى بحثت في تأثير اختلاف معايير التحفيز على شدة خلل التوتر العضلي في هامستر sz-dt، تم استخدام نفس أقطاب التحفيز والتقنيات الجراحية. هنا، تمكنا من تأكيد الموقع الصحيح للأقطاب في 94٪ من التجارب37.

في الختام، يوفر هذا البروتوكول منصة قوية لدراسة الآليات الكهربائية الفيزيولوجية لمتلازمة الدماغ العميق العميق ويضيف رؤى قيمة حول آلية عمله. تمكن هامستر dtsz بشكل فريد من الدراسات قبل السريرية لتأثيرات DBS الشعرية على النمط العضلي الخلفي، إلى جانب التسجيل عالي الدقة خارج الجسم الحي. تدعم نتائجنا مفهوم تورط المخيخ في خلل التوتر العضلي وتبرز أهمية التحليل على مستوى الشبكة في فهم وتحسين علاجات التعديل العصبي.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تحظى هذه الدراسة بدعم من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) ضمن مركز البحث التعاوني (SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3% H2O2Caelo15301730
50 ml conical tubeGreiner Bio-OneFalcon-type conical tube
Agar Petri dishHandmade 
Anaesthesia UnitBioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA platform
Blade (5*)Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave Software 53BrainVersion 5CMOS-HD-MEA platform
Breathing maskNarishigeGM-4
Bulk Fill Flowable: Compula RefillDentsply Sirona267-0195For cement
Capsule Dispenser Gun Dentsply Sirona296-0003For cement
CarbogenAir LiquideAir Liqiuide (House system)
Cavity Block GlassAIMAIM40 mm x 40 mm
Clamp (3*)DIEFFENBACH12-1003-04stainless steel 4cm
ComputerDellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA chip
Drill accessory (13)FST19007-07Tip: 7mm
Drill accessory (13)FST19007-09Tip: 9mm
Eco wipes - wipe dispenserDr Schumacher00-915SE001 (1x1) 
Eco wipes - wipe rollsDr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
ElectrodeMicroprobesSNEX-100
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGArt-Nr. T913.3
Excavator (10)HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
Forceps (5)FST18025-10Stainless Steel 10cm
Forceps (6)AesculapBD311R9cm
Forceps (7)FST91100-12Stainless Steel 12cm
Forceps (8)FST11231-20Stainless Steel 11cm
Forceps (8*) Karl Hammacher9.160 160Wironit 10,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Heated surgical table+integrated gas exhaustBioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
Ice MachineScotsmanAF 80 AS / WS
Inflow and outflow needlesBD Microlance 1,25 x70mm
Isathal 10mg/gDechraZul.-Nr. 400216.00.00Fucidin
IsofluraneSedana medicalN001254
Mili-Q Water FilterElgaPURELAB flex 3
Needle Holder (4)FST12501-13Tungsten Carbide 13cm
OcteniseptSchülke & MayrAntiseptic solution 
Paper Filter (4*)Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
Platinum anchor3Brain3Brain
Retractor Tip (14)FST18200-102.5mm
Reused Electrode (11)MicroprobesSNEX-100For Coordinates
RingerB. Braun3570030
Scissor (1)FST14078-10Stainless Steel 10cm
Scissor (2)AesculapBC144R
Scissor (3)FST14058-09Stainless Steel 9cm
Scissor (9*)FST91401-12Stainless Steel 12cm
Screw (12)Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1x2
ShaverExactaGT415
STELLA (software defined implantable modular platform) stimulation systemnon-commercial; developement of the University of Rostockopen source (https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA)battery-driven DBS stimulator
Sterelizer 250FST18000-45
StereotaxicNarishigeModel SR-AR
Super glueUHU64212
Tear cream (Panthenol Nose Cream)Jenapharm5541249
Vibratome LaicaVT12005
Xylocain Gel 2%Aspen Pharma1138060
Weigh BoatCarl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
WeigherVoltcraftTS-5000/1
Compounds used for solutions preparation
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-Aldrich10043-52-4
D-Glucose(C6H12O6)Sigma-Aldrich50-99-7
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3
Potassium Chloride(KCl)Sigma-Aldrich7447-40-7
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich144-55-8
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-80-7
SucroseSigma-Aldrich57-50-1

المراجع

  1. Beylergil, S. B., et al. Tremor in cervical dystonia. Dystonia. , (2024).
  2. Stephen, C. D., et al. Dystonias: Clinical recognition and the role of additional diagnostic testing. Semin Neurol. , (2023).
  3. Fung, V. S. C., Jinnah, H. A., Bhatia, K., Vidailhet, M. Assessment of the patient with isolated or combined dystonia: An update on dystonia syndromes. Mov Disord. , (2013).
  4. Klepitskaya, O., Neuwelt, A. J., Nguyen, T., Leehey, M. Primary dystonia misinterpreted as Parkinson disease. Neurol Clin Pract. , (2013).
  5. Drivenes, B., et al. A child with myoclonus-dystonia (DYT11) misdiagnosed as atypical opsoclonus myoclonus syndrome. Eur J Paediatr Neurol. , (2015).
  6. Valeriani, D., Simonyan, K. A. Microstructural neural network biomarker for dystonia diagnosis identified by a DystoniaNet deep learning platform. Proc Natl Acad Sci U S A, , (2020).
  7. Albanese, A., et al. Definition and classification of dystonia. Mov Disord. , (2025).
  8. Balint, B., et al. Dystonia. Nat Rev Dis Primers. , (2018).
  9. Bohne, P., et al. Cerebellar α1D-adrenergic receptors mediate stress-induced dystonia in totteringtg/tg mice. Cell Mol Life Sci. , (2025).
  10. Gwinn-Hardy, K. A., et al. Effect of hormone variations and other factors on symptom severity in women with dystonia. Mayo Clin Proc, , (2000).
  11. Kim, J. E., et al. Cerebellar 5HT-2A receptor mediates stress-induced onset of dystonia. Sci Adv. , (2021).
  12. Vitek, J. L. Pathophysiology of dystonia: A neuronal model. Mov Disord. , (2002).
  13. Rissardo, J. P., et al. Neurobiology of dystonia: Review of genetics, animal models, and neuroimaging. Brain Sci. , (2025).
  14. Bologna, M., Berardelli, A. The cerebellum and dystonia. Handb Clin Neurol. , (2018).
  15. Kragelund, F. S., et al. Network-wide effects of pallidal deep brain stimulation normalised abnormal cerebellar cortical activity in the dystonic animal model. Neurobiol Dis. , (2025).
  16. Löscher, W., Hörstermann, D. Abnormalities in amino acid neurotransmitters in discrete brain regions of genetically dystonic hamsters. J Neurochem. , (1992).
  17. Lüttig, A., et al. Short-term stimulations of the entopeduncular nucleus induce cerebellar changes of c-Fos expression in an animal model of paroxysmal dystonia. Brain Res. , (2024).
  18. Yousef, O., et al. Subthalamic nucleus versus globus pallidus internus deep brain stimulation in the treatment of dystonia: A systematic review and meta-analysis of safety and efficacy. J Clin Neurosci. , (2025).
  19. Lin, S., et al. Globus pallidus internus versus subthalamic nucleus deep brain stimulation for isolated dystonia: A 3-year follow-up. Eur J Neurol. , (2023).
  20. Liker, M. A., et al. Stereotactic awake basal ganglia electrophysiological recording and stimulation (SABERS): A novel staged procedure for personalized targeting of deep brain stimulation in pediatric movement and neuropsychiatric disorders. J Child Neurol. , (2024).
  21. Hock, A. N., et al. A randomised double-blind controlled study of deep brain stimulation for dystonia in STN or GPi: A long-term follow-up after up to 15 years. Parkinsonism Relat Disord. , (2022).
  22. Shakkottai, V. G., et al. Current opinions and areas of consensus on the role of the cerebellum in dystonia. Cerebellum. , (2017).
  23. Neychev, V. K., et al. The basal ganglia and cerebellum interact in the expression of dystonic movement. Brain. , (2008).
  24. Fredow, G., Löscher, W. Effects of pharmacological manipulation of GABAergic neurotransmission in a new mutant hamster model of paroxysmal dystonia. Eur J Pharmacol. , (1991).
  25. Löscher, W., et al. The sz mutant hamster: A genetic model of epilepsy or of paroxysmal dystonia? Mov Disord. , (1989).
  26. Richter, A., Löscher, W. Pathophysiology of idiopathic dystonia: Findings from genetic animal models. Prog Neurobiol. , (1998).
  27. Hull, C., Regehr, W. G. The cerebellar cortex. Annu Rev Neurosci. , (2022).
  28. van der Heijden, M. E., Sillitoe, R. V. Interactions between Purkinje cells and granule cells coordinate the development of functional cerebellar circuits. Neuroscience. , (2021).
  29. Emery, B. A., et al. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. , (2023).
  30. Viswam, V., et al. Impedance spectroscopy and electrophysiological imaging of cells with a high-density CMOS microelectrode array system. IEEE Trans Biomed Circuits Syst. , (2018).
  31. Imfeld, K., et al. Large-scale, high-resolution data acquisition system for extracellular recording of electrophysiological activity. IEEE Trans Biomed Eng. , (2008).
  32. Berdondini, L., et al. Extracellular recordings from locally dense microelectrode arrays coupled to dissociated cortical cultures. J Neurosci Methods. , (2009).
  33. Busch, M., et al. Species-appropriate housing of laboratory rats. , GV-SOLAS Committee for Laboratory Animal Husbandry. (2019).
  34. Plocksties, F., et al. The software defined implantable modular platform (STELLA) for preclinical deep brain stimulation research in rodents. J Neural Eng. , (2021).
  35. Kragelund, F. S. Illustration of brain sectioning and slicing. , BioRender. (2026).
  36. Schröter, M., et al. Advances in large-scale electrophysiology with high-density microelectrode arrays. Lab Chip. , (2025).
  37. Paap, M., et al. Deep brain stimulation by optimized stimulators in a phenotypic model of dystonia: Effects of different frequencies. Neurobiol Dis. , (2021).
  38. Takada, M., et al. Two separate neuronal populations of the rat subthalamic nucleus project to the basal ganglia and pedunculopontine tegmental region. Brain Res. , (1988).
  39. Filip, P., Lungu, O. V., Bareš, M. Dystonia and the cerebellum: A new field of interest in movement disorders? Clin Neurophysiol. , (2013).
  40. Bostan, A. C., Strick, P. L. The basal ganglia and the cerebellum: Nodes in an integrated network. Nat Rev Neurosci. , (2018).
  41. Bostan, A. C., Dum, R. P., Strick, P. L. The basal ganglia communicate with the cerebellum. Proc Natl Acad Sci U S A, , (2010).
  42. Middleton, F. A., Strick, P. L. Basal ganglia and cerebellar loops: Motor and cognitive circuits. Brain Res Rev. , (2000).
  43. Heerdegen, M., et al. Mechanisms of pallidal deep brain stimulation: Alteration of cortico-striatal synaptic communication in a dystonia animal model. Neurobiol Dis. , (2021).
  44. Pralong, E., et al. Effect of deep brain stimulation of GPI on neuronal activity of the thalamic nucleus ventralis oralis in a dystonic patient. Neurophysiol Clin. , (2003).
  45. Kotyra, M., et al. Effects of longer-term pallidal stimulation on the severity of dystonia in a phenotypic animal model. Exp Neurol. , (2026).
  46. Franz, D., et al. Network-wide modulation of synaptic plasticity and spike patterns in motor circuits after pallidal deep brain stimulation in a dystonia model. Neurobiol Dis. , (2025).
  47. Cersosimo, M. G., et al. Micro lesion effect of the globus pallidus internus and outcome with deep brain stimulation in patients with Parkinson disease and dystonia. Mov Disord. , (2009).
  48. Blotter, M. L., et al. High-quality seizure-like activity from acute brain slices using a complementary metal-oxide-semiconductor high-density microelectrode array system. J Vis Exp. (211), e67065(2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة