مقالة منهجية

زراعة عضوية ثنائية الأبعاد على مستخلص الغشاء الغازي أو القاعدة لدراسة التفاعلات بين المضيف والبكتيريا

1.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70512

⸱

مارس 13, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research: Hubrecht Institute, 2Oncode Institute, 3Royal Netherlands Academy of Arts and Science (KNAW), 4University Medical Center Utrecht

في هذه المقالة

ملخص

تقدم الدراسة طريقة للتحقيق في المختبر للعدوى البكتيرية باستخدام عضويات معوية مشتقة من الخلايا الجذعية في الأنسجة. يصف البروتوكول كيفية زراعة وتمييز الأعضاء في بعدين، وإصابتها بفيروس الإشريكية القولونية الغازي الملحق، وتقييم القراءات الرئيسية، بما في ذلك اختراق الحاجز الطلائي، وتصوير العدوى، واستجابة الحمض النووي الريبي الظهاري.

الملخص

توفر تقنية الأورجانويد منصة تجريبية في المختبر لدراسة فسيولوجيا الإنسان في الصحة والأمراض. مقارنة بالأنظمة الأخرى في المختبر ، مثل خطوط الخلايا المشتقة من السرطان أو النباتات، تقدم الأعضاء المشتقة من الخلايا الجذعية الأنسجة (TSC) مزايا رئيسية: يمكن توسيعها إلى أجل غير مسمى مع الحفاظ على الاستقرار الجيني، وهي قابلة لتعديل كريسبر. نظرا لأن هذه الأعضاء تولد من الخلايا الصلبة الطبيعية، فهي تحتوي على أنواع الخلايا لأنسجة منشأها. وهذا يجعل العضوية ذات قيمة خاصة في دراسة التفاعلات بين البكتيريا والخلايا البشرية المتمايزة غير الورمية. تزرع الأعضاء المعوية كطبقات أحادية مستقطبة ثنائية الأبعاد على مدخلات زراعة الخلايا مغطاة بمستخلص الغشاء القاسي (BME) أو Invasin، وهو بديل خال من الحيوانات وفعال من حيث التكلفة، ويمكن تمييزها إلى أنواع خلايا ظهارية معوية رئيسية للعدوى بالإشريكية القولونية الغازية الملتصقة الممرضة. تشمل النتائج الرئيسية للعدوى مراقبة تعبير جينات الظهارة باستخدام PCR الكمي العكسي (RT-qPCR)، وتصور تفاعلات البكتيريا والظهارة باستخدام المجهر الكونفوكلي، وقياس اختراق الحاجز الظهاري. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة الأعضاء الأخرى وأنواع البكتيريا، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات للتحقيق في تفاعلات المضيف والميكروبات في العضويات.

المقدمة

تشكل ظهارة الأمعاء خط الدفاع الأول ضد البكتيريا الممرضة الموجودة في تجويف الأمعاء. تم استخدام النماذج المختبرية لظهارة الأمعاء على نطاق واسع لدراسة كيفية تفاعل البكتيريا مع الخلايا الظهارية، وكيفية استجابة هذه الخلايا للعدوى، وكيف تخترق البكتيريا الحاجزالطلائي. تعد هذه النماذج ذات قيمة خاصة للتحقيق في مسببات الأمراض الخاصة بالإنسان في بيئة محكومة وتقليزية. تاريخيا، اعتمدت بيولوجيا العدوى في المختبر على خطوط الخلايا المشتقة من الأورام مثل خلايا Caco-2، أو على الفروع المستمدة من المريض التي تم الحفاظ عليها خارج الجسم 2,3. مؤخرا، ظهرت الأعضاء المعوية الناتجة من خلايا جذعية الأنسجة البشرية كأداة قوية تجمع بين مزايا كلا النهجين: مثل خطوط الخلايا، يمكن تمرير الأعضاء العضوية، توسيعها، حفظها بالتجميد، إذابتها، والتلاعب بها وراثيا؛ ومثل النباتات الخارجية، فهي مشتقة من خلايا جذعية غير ورمية قادرة على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الطهارية الرئيسية 4,5.

عند دمجه في مصفوفة مثل ماتريجل أو مستخلص الغشاء القاسي (BME)، عادة ما تنظم الأعضاء المعوية البشرية ذاتيا إلى هياكل كروية مستقطبة مع سطح قمي يواجه الداخل وسطح قاعدي للخارج. نظرا لأن معظم مسببات الأمراض المعوية تصل إلى الخلايا الظهارية من الجانب القمي، فقد تم تطوير عدة استراتيجيات لتعريض هذا السطح للبكتيريا في الأعضاء4. إحدى الطرق هي حقن البكتيريا مباشرة في التجويف العضوي6. وأخرى تتضمن عكس قطبية الأعضاء عن طريق إطلاقها من المصفوفة خارج الخلية، مما ينتج عضويات "الخروج من الصدر" في التعليق7. الاستراتيجية الثالثة هي تفكيك الأعضاء إلى خلايا مفردة وزرعها على إدخالات لزراعة الخلايا لتشكيل طبقات أحادية مستقطبة ثنائية الأبعاد (صفائح عضوية ثنائية الأبعاد) بحيث يواجه الجانب القمي الحجرة العلوية8. الطريقتان الأوليان لهما قيود مهمة: الحقن الدقيق يستغرق وقتا طويلا ويتطلب جهدا كبيرا، ويحد من معدل النقل، والأعضاء ذات الخروج من الواجهة تعيش لبضعة أيام فقط بدون دعم مصفوفة ولا يمكن تمييزها1. على النقيض من ذلك، تدعم صفائح العضوية ثنائية الأبعاد التجارب عالية الإنتاجية (يمكن ببساطة إضافة البكتيريا إلى الحجرة العلوية) ويمكن الحفاظ عليها لعدة أسابيع أثناء التمايز إلى أنواع خلايا الظهارة المعويةالرئيسية.

على عكس خطوط الخلايا الخالية التي تلتصق بسهولة بالأسطح البلاستيكية، تتطلب الخلايا المشتقة من العضوية طبقة صفيحية للالتصاق بكفاءة. يمكن إجراء الطلاء باستخدام BME10 المخفف، أو بدلا من ذلك باستخدام إنفاسين، وهو بروتين بكتيري يرتبط بالإنتجرينات على الخلايا العضوية11. الإنفوسين سهل الإنتاج في المختبر، وأكثر فعالية من حيث التكلفة بكثير من BME أو Matrigel، وخالي تماما من الحيوانات.

يصف هذا البروتوكول تأسيس وتمييز الأعضاء المعوية كطبقات أحادية مستقطبة ثنائية الأبعاد على إدخالات مزرعة الخلايا مغطاة بمستخلص الغشية الغازية أو القاعدي (BME). تصاب الصفائح العضوية المتمايزة لاحقا بالإشريكية الغازية اللاصقة (AIEC)، وهي سلالة ممرضة مرتبطة بمرض الأمعاء الالتهابي12. تم تحديد عدة قراءات للعدوى في الأسفل لتقييم الاستجابات الطهارية وانتقال البكتيريا. نظرا لأن AIEC يغزو الخلايا الطهارية ويخترق الظهارة المعوية - وهي آلية يعتقد أنها تساهم في ممرضيته - يتم قياس الاختراق الظهاري بقياس البكتيريا التي تصل إلى الحجرة الجانبية في مدخل زراعة الخلية بعد تأكيد سلامة الحاجز من خلال قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة/عبر البطانة (TEER)13. كما توفر إجراءات لتثبيت وتصوير طبقات أحادية المصابة لرؤية AIEC داخل وخارج الخلية، بالإضافة إلى استخراج الحمض النووي الريبي لتقييم الاستجابات النسخية الظهارية للعدوى. يمكن إجراء البروتوكول الكامل في أقل من أسبوعين ويتطلب فقط معدات مختبرية متوفرة بشكل شائع، بما في ذلك خزانة BSL-2، ومجهر كونفوكلي، وجهاز PCR كمي.

بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة، متعددة الاستخدامات، وسهلة الوصول لدراسة العدوى البكتيرية في ظهارة الأمعاء البشرية المتمايزة في المختبر. يمكن تكييفها بسهولة مع أنظمة عضوية أخرى وأنواع ميكروبية أخرى، مما يجعله مخططا مفيدا لدراسات بيولوجيا العدوى المختبرية .

البروتوكول

تم توليد الأعضاء المعوية البشرية من مواد الفضلات التي يمتلكها المرضى الذين يخضعون لجراحة سرطان القولون والمستقيم في المركز الطبي الجامعي في أوتريخت (UMCU). قدم المرضى موافقة مستنيرة لتوليد عضوياتهم، وفقا لبروتوكول UPORT Biobank للسرطان 21-042، الذي أقره لجنة الأخلاقيات المحلية للبنوك الحيوية. يوضح الشكل 1A الأقسام الثمانية من البروتوكول. تفاصيل المادة والمواد مدرجة في جدول المواد.

1. طلاء إدخال زراعة الخلايا

  1. الطلاء بالغاز
    1. قم بجميع الإجراءات داخل غطاء زراعة الأنسجة في ظروف معقمة.
    2. حضر محلول غازي بسعة 5 ميكروغرام/مل في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
    3. أضف 100 ميكرولتر من هذا المحلول إلى الحجرة العلوية لكل إدخال زراعة خلايا بوليستر مسام بحجم 3 ميكرومتر في صفيحة ب 24 بئرا.
    4. تأكد من تغطية الغشاء بالكامل.
    5. حضانه طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تجنب تكوين الفقاعات أثناء الصرف، لأن الفقاعات تمنع الطلاء المتجانس.
  2. الطلاء بمستخلص غشاء القبو (بديل)
    1. إذابة مستخلص غشاء القبو على الثلج.
    2. حضر محلول بنسبة 10٪ في DMEM البارد جدا.
      ملاحظة: حافظ على المحلول باردا لمنع البلمرة المبكرة.
    3. أضف 100 ميكرولتر من المحلول المخفف إلى الحجرة العلوية لكل إدخال لزراعة خلايا مسام بحجم 3 ميكرومتر.
    4. تأكد من تغطية سطح الغشاء بالكامل.
    5. حضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

2. زرع الخلايا العضوية

  1. تحضير الأورغانويدات
    1. إزالة وسط الزراعة من الألواح العضوية التي تحافظ عليها في ظروف التمدد (3-5 أيام بعد الانقسام).
    2. أعد تعليق الأعضاء في 1 مل من DMEM البارد جدا14.
    3. انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 4 مل من DMEM البارد جدا.
      ملاحظة: استخدم حوالي بئر كامل واحد من طبق يحتوي على 12 بئر لزرع 4 مدخلات لزراعة خلايا.
  2. عضويات الحبيبات
    1. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جرام عند 4 درجات مئوية.
    2. أزل المادة الفائقة تماما.
  3. الأعضاء المنفصلة
    1. أعد تعليق الحبيبة في 3 مل من بديل التربسين المؤتلف.
    2. تقوم بعمل البيبت لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 لتعطيل الأورجينويدات ميكانيكيا.
    3. حضانة عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة حتى يتم الحصول على خلايا منفردة أو مجموعات صغيرة (3-4 خلايا).
      ملاحظة: لا تتجاوز فترة الحضانة لمدة 20 دقيقة. استخدم البيبيت كل 5 دقائق لتسهيل الانفصال عن الواقع. أدخل رأس P10 داخل رأس P1000 إذا تطلب الأمر قوة ميكانيكية إضافية.
  4. الخلايا الغسالة
    1. أضف 5 مل من DMEM البارد جدا.
    2. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جرام عند 4 درجات مئوية.
    3. أزل السوبرناتانت.
  5. تحضير تعليق الخلية
    1. أعد تعليق الخلايا في وسط التمدد (100 ميكرولتر لكل مزرعة خلية؛ انظر الجدول 1 لتركيب وسط التمدد).
      ملاحظة: لا تدرج المضادات الحيوية. أضف مثبط رو كيناز لمنع الأنويكيس.
    2. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا أو مقياس الهيموسيتوميتر.
    3. عدل إلى حوالي 2 × 106 خلايا/مل.
  6. زرع إدخالات زراعة الخلايا
    1. أزل محلول الطلاء من الإدخالات.
    2. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (2 × 105 خلايا) إلى الحجرة العلوية.
    3. أضف 500 ميكرولتر من وسط التمدد إلى الحجرة السفلية.

3. زرع الإدخال في زراعة الخلايا والتمايز

  1. حضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونحتى يتم التقاء القارئ (حوالي 3 أيام).
    ملاحظة: قم بتحديث الوسط في كلا الحزينتين كل 4-5 أيام إذا لزم الأمر.
  2. بعد التصل، اغسل الحجزتين بمحلول DMEM مسخن مسبقا.
  3. أضف وسط تفاضل بسعة 500 ميكرولتر (الجدول 2) إلى الحجرة السفلية.
  4. أضف 100 ميكرولتر DMEM/F12 المتقدم مع HEPES وجلوتامكس (AdvDMEM++) (الجدول 3) إلى الحجرة العلوية.
  5. حضن لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  6. استبدل الوسائط في كلا القسمين كل يومين.

4. قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة/عبر البطانة (TEER)

  1. قم بتعقيم أقطاب TEER في إيثانول بنسبة 70٪ لمدة 15 دقيقة.
  2. شطف الأقطاب الكهربائية في PBS المعقمة.
  3. أدخل القطب القصير في الحجرة العلوية والقطب الطويل في الحجرة السفلية.
    ملاحظة: لا تلمس الطبقة الأحادية بطرف القطب.
  4. سجل قيم المقاومة.
  5. قس المقاومة الفارغة باستخدام إدخال خال من الخلايا يحتوي على PBS (100 ميكرولتر علوي، 500 ميكرولتر أقل).
  6. احسب TEER: TEER = (R_cell مزرعة − R_blank) × مساحة السطح (سم²)
    ملاحظة: بالنسبة لإدخالات 24 بئرا، مساحة السطح = 0.33 سم².

5. الإصابة بجهاز AIEC

  1. تحضير زراعة البكتيريا
    1. تلقيح AIEC الفلوري في 3 مل رطل متوسط15.
    2. حضن الحوض طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية مع الرج.
      تحذير: قم بجميع الإجراءات البكتيرية باستخدام غطاء BSL-2.
  2. تحضير اللقاح
    1. زرع الطرد المركزي 500 ميكرولتر لمدة 5 دقائق عند 1500 × جرام.
    2. أعد تعليق التعليق بعد 1 مل AdvDMEM++.
    3. قياس الكثافة البصرية (OD).
    4. يتم تخفيفه إلى حوالي 1 × 10⁸ CFU/mL في AdvDM++.
      ملاحظة: OD = 1 يعادل تقريبا 1 × 10⁹ CFU/mL.
  3. إصابة الطبقات الأحادية
    1. استبدل الوسائط في كلا القسمين.
    2. أضف وسط تفاضل بسعة 500 ميكرولتر إلى الحجرة السفلية.
    3. أضف 100 ميكرولتر تعليق بكتيري إلى الحجرة العلوية للحالة المصابة.
    4. أضف 100 ميكرولتر AdvDMEM++ إلى الحجرة العلوية للحالة غير المصابة.
    5. الحضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

6. تقييم اختراق الظهارة

  1. بعد 2.5 ساعة من العدوى، اجمع 100 ميكرولتر من الحجرة السفلية.
  2. مخفف في PBS وطبق على LB Agar.
  3. أضف 100 ميكرولتر وسط تفاضل جديد إلى الحجرة السفلية.
  4. يحتضن الصفائح طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  5. كرر أخذ العينات بعد 5 ساعات من العدوى.
  6. وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) في اليوم التالي.
  7. احسب وحدات CFU لكل زراعة خلية: CFUs/مدخل زراعة الخلية = المستعمرات × 5 × عامل تخفيف

7. عدوى الصورة

  1. بعد 5 ساعات من العدوى، قم بإزالة الوسط وثبتها ب 4٪ بارافورمالديهايد.
    تحذير: بارافورمالديهايد سام ومتقلب. المقبض داخل غطاء البخار أثناء ارتداء القفازات.
  2. أصلح لمدة 30 دقيقة.
  3. اغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.
  4. قم بإزالة إدخال الغشاء ووضع الخلايا المواجهة للأعلى في لوحة بئر.
  5. صبغ بالفالويدين الفلوري لمدة ساعة إلى ساعتين.
  6. اغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.
  7. صبغ النوى باستخدام DAPI لمدة 10 دقائق.
  8. اغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.
  9. قم بالتركيب على شريحة زجاجية مع وسط تثبيت ووضع غطاء منزلق.
  10. ختم بطلاء الأظافر.
  11. احصل على صور كونفوكالية لقنوات DAPI، الأكتين، والبكتيريا.
  12. احصل على مكدس z يمتد من القاعدة إلى الأسطح القمية بفواصل 1 ميكرومتر.
  13. صور مفتوحة في فيجي.
  14. اختر الصورة → Z Project → متوسط الشدة.
  15. اختر → الصورة التي تكدس → العروض المتعامدة لعرض المقاطع العرضية.

8. تحليل الاستجابة الطهارية

  1. بعد 5 ساعات من العدوى، قم بإزالة الوسط.
  2. أضف 350 ميكرولتر مخزن تحلل إلى الحجرة العلوية.
  3. تقطع بيبت إلى الخلايا ويتم نقلها إلى أنبوب خال من RNase على الجليد.
  4. قم باستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات المجموعة.
  5. قس تركيز الحمض النووي الريبي وتطبيع العينات.
  6. قم بإجراء النسخ العكسي.
  7. قم بإجراء PCR كمي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (تم توفير تسلسلات الأساس ل TNFα والجين المرجعي β-أكتين في الجدول 4).

النتائج

بعد الوصول إلى نقطة التقاء الجسم، أظهرت خلايا الأمعاء على إدخال مزرعة الخلايا نمطا يشبه الفسيفساء (الشكل 1B) دون وجود فجوات مرئية في الطبقة الأحادية. بعد التمايز، تم تقييم شد الظهارة بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) (الشكل 1C). كانت قيم TEER فوق 500 Ω·سم² متوافقة مع تكوين طبقة ظهارية أحادية مشدودة¹⁶.

زاد عدد AIEC المكتشف في الحجرة الجانبية القاعدية مع مرور الوقت، مما يعكس اختراق الحاجز الظهاري للبكتيريا (الشكل 2A,B). غياب AIEC في الحجرة السفلية يشير إلى فشل نقل البكتيريا.

يتم تلخيص سير العمل لتصوير العدوى في الشكل 3A. أظهر التصوير الكونفوكلي تكوين طبقة أحادية مستقطبة، مع نوى موضعية في القاعدة وإثراء قمة لشبكة الأكتين (الشكل 3B). كشف التكبير الأعلى عن كل من AIEC داخل الخلية وبكتيريا خارج الخلية مرتبطة بالغشاء القمي (الشكل 3C).

أظهر تحليل RT-qPCR زيادة في تعبير TNFα استجابة لعدوى AIEC (الشكل 4A,B)، مما أكد تنشيط استجابة التهابية ظهارية.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. (أ) مخططات البروتوكول. (ب) صورة حقل ساطع لخلايا عضوية معوية مزروعة وتمايزت على إدخال مزرعة خلايا مغطاة بالغاز. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (C) مقاومة كهربائية عبر الظهارة/عبر البطانة (TEER) للعضويات المعوية التي نمت وتمايزت على إدخالات زراعة الخلايا المغطاة بالغاز. كل نقطة تظهر تجربة مستقلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تقييم مخططات اختراق الظهارة (A) للبروتوكول. (ب) قياس وحدات تكوين المستعمرات (CFUs) في AIEC مع مرور الوقت في الحجرة السفلية من إدخال زراعة الخلية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تصوير العدوى. (أ) مخططات البروتوكول. (ب) تصوير كونفوكي للعضويات المعوية المصابة ب AIEC الفلوري لمدة 5 ساعات. رمادي: DAPI. الماجنتا: فالودين. سيان: AIEC. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. تعرض المشاهد المتعامدة للصورة المدمجة في الأعلى واليمين. (ج) تكبير عالي للمربع الأبيض في B. الرمادي: DAPI. الماجنتا: فالودين. سيان: AIEC. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. تعرض المشاهد المتعامدة على اليمين. يتم تسليط الضوء على AIEC داخل الخلية (*) وخارج الخلية الملحقة بالغشاء القمي لخلايا الظهارة ($). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل الاستجابة الظهارية. (أ) مخططات البروتوكول. (ب) تعبير TNFα بواسطة الأعضاء المعوية بعد 5 ساعات من الإصابة ب AIEC (الأخضر) مقابل التحكم غير المصاب (الرمادي). تم تطبيع تعبير TNFα إلى تعبير B-actin باستخدام الصيغة 2-(Cq(TNFα)-Cq(β-actin)). n=4 يتكرر. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t للطالب غير المقترن. P < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المكونالتركيز 
المحامي DMEMالنهائي 1X
هيبس1٪ v/v
غلوتامكس1٪ v/v
الحاملة البديلة0.5 نانومتر
R-spo1 UPE2٪ v/v
نوجين UPE1٪ v/v
B27 بدون فيتامين A2٪ v/v
ن-أسيتيل سيستين1.25 مللي مولار
نيكوتيناميد10 ميكرومولار
hEGF50 نانوغرام/مل
A83-01 (مثبط TGF-β)0.5 ميكرومولار
SB202190 (مثبط الصفحة 38)3 ميكرومولار
بروستاجلاندين E21 ميكرومولار
مثبط رو كيناز10 ميكرومولار

الجدول 1: وسط التمدد للعضويات المعوية البشرية. تركيب وسط التمدد المستخدم في صيانة وتكاثر العضويات المعوية البشرية.

المكونالتركيز
المحامي DMEMالنهائي 1X
هيبس1٪ v/v
غلوتامكس1٪ v/v
R-spo1 UPE2٪ v/v
نوجين UPE1٪ v/v
B27 بدون فيتامين A2٪ v/v
NAC1.25 مللي مولار
hEGF50 نانوغرام/مل

الجدول 2: وسط التمايز للعضويات المعوية البشرية. تركيب وسط التمايز المستخدم لتعزيز نضج الظهارة للطبقات العضوية الأحادية المعوية البشرية.

المكونالتركيز
المحامي DMEMالنهائي 1X
هيبس1٪ v/v
غلوتامكس1٪ v/v

الجدول 3: التحليل الطبي DMEM++ للعدوى. تركيب وسط DMEM/F12 المتقدم المكملة ب HEPES وجلوتامكس (Adv DMEM++) المستخدم أثناء اختبارات العدوى البكتيرية.

الاسمالتسلسل
TNFα FCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG
TNFα RATGGGCTACAGGCTTGTCACTC
β الأكتين FTGACGTTGACATCCGTAAG
β الأكتين Rغاتجاتجاتكت

الجدول 4: مقدمات ل qPCR ل TNFα. يعرض تسلسلات البرايمر المستخدمة في التحليل الكمي ل PCR ل TNFα باستخدام β-أكتين كجين مرجعي.

المناقشة

أسست هذه الدراسة بروتوكولا للتحقيق في العدوى البكتيرية لخلايا الظهارة المعوية البشرية باستخدام عضويات مشتقة من TSC مزروعة على إدخالات مزرعة الخلايا. المداخل ذات المسام 3 ميكرومتر مكنت من تثبيت الخلايا بشكل فعال ونقل البكتيريا، بينما المسام بحجم 0.4 ميكرومتر لا تسمح بمرور AIEC، بما يتوافق مع حجم الإشريكية القولونية البالغ حوالي 1 ميكرومتر. لم يلاحظ أي انتقال لخلايا العضويات عبر مسام بحجم 3 ميكرومتر، ويرجح أن ذلك بسبب نمطيها الظهاري وغير الجراحي.

كانت هناك عدة متغيرات تجريبية حاسمة لقابلية التكرار، بما في ذلك الارتباط الخلوي بكفاءة، وكثافة البذور المناسبة، والتقاء كامل قبل العدوى. الخلايا الظهارية المشتقة من العضوية لا تلتصق بالبلاستيك غير المطلي، مما يجعل الطلاء ضروريا. وفر BME كفاءة تثبيت عالية باستمرار. أعطى طلاء الغازات نتائج مماثلة ويمثل بديلا فعالا من حيث التكلفةرقم 11، رغم أنه يجب إنتاجه داخليا. كما تم اقتراح طلاء الكولاجين كبديل17.

تؤثر ظروف نمو البكتيريا بشكل كبير على كفاءة العدوى. تنمو سلالات الإشريكية القولونية بشكل جيد في DMEM؛ ومع ذلك، يمكن للمضادات الحيوية المتبقية أن تثبط التكاثر. في الظروف المثلى، عادة ما تظهر الثقافات المصابة عكارة أكبر مقارنة بالمواد الضابطة، ويمكن تأكيد نمو البكتيريا من خلال تغطية محتويات الحجرة القمة.

مكنت استراتيجية التصوير من تصور كل من البكتيريا داخل وخارج الخلية من خلال استهداف AIEC الذي يعبر عن فلوروفور تحت محفز مكون (مثل استخدام البلازميد pMB1-spect-PthrC-eGFP). تمكن الطرق البديلة الكشف الانتقائي عن البكتيريا داخل الخلية، بما في ذلك التلوين التفاضلي بالفلورية المناعية18 أو المبلغين المعبر عنها في مراحل محددة من الغزو19. اختبارات حماية الجنتاميسين توفر نهجا كمياإضافيا 20.

هذا النموذج مقصود للتبسيط ويركز على التفاعلات المباشرة بين البكتيريا والظهارة المعوية. يتيح ذلك التحقيق في العدوى في طبقة ظهارية أحادية متمايزة دون وجود أنواع إضافية من الخلايا في الجسم الحي. وسط التمايز يسبب بشكل أساسي تمايز الخلايا المعوية والكأس21، لكنه يمكن تعديله لتغيير تركيب الظهارة 22,23. يمكن زيادة تعقيد النظام عن طريق الزراعة المشتركة بين الخلايا المناعية أو الخلايا البثنية في الحجرة الأساسية24.

النظام لا يعيد تلخيص البنية ثلاثية الأبعاد للمخاط الشهوي. تتغلب منصات الأورغن على الشريحة بعض القيود الهيكلية25 لكنها تتطلب تعقيدا تقنيا وموارد أكبر. علاوة على ذلك، فإن النموذج مناسب بشكل أفضل للعدوى الحادة، حيث يحد نمو البكتيريا من التجارب إلى حوالي 8 ساعات. تتطلب دراسة العدوى المزمنة في المختبر26 أنظمة أكثر تعقيدا، مثل منصات الميكروفلويديك التي تتيح تبادلا مستمرا للوسط.

تم تطبيق أنظمة عدوى عضوية قائمة على الزرع الخلوي على عدة أنسجة وممرضات، بما في ذلك عضويات المعدة المصابة بهيليكوباكتر بيلوري27,28، وعضويات الأمعاء المصابة بشيجيلا29، وعضويات المجاري التنفسية المصابة بسودوموناس إيروجينوزا10، وعضويات البول المصابة بالمكورات المعوية البرية30. لذلك، يوفر هذا البروتوكول إطارا متعدد الاستخدامات للتحقيق في التفاعلات بين الظهارة والبكتيريا عبر أنظمة الأعضاء، بشرط النظر في متطلبات النمو الخاصة بالممرضات.

توفر تقنية العضوية نماذج بشرية فسيولوجية ذات صلة للتحقيق في تفاعلات المضيف والممرض في الخلايا الظهارية غير المتحولة 4,5. نظرا للعبء المتزايد للعدوى المقاومة للمضادات الحيوية وارتباطها بالأمراض الالتهابية المزمنة والسرطان، تمثل هذه الأنظمة في المختبر أدوات قيمة للأبحاث الميكانيكية والترجمية.

الإفصاحات

H.C. مخترع عدة براءات اختراع تتعلق بتقنية العضويات. الإفصاح الكامل من H.C. مقدم في https://www.uu.nl/staff/JCClevers/.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون بوابة أوترخت لتقنية العضوية (UPORT)، وخاصة أنيتا بروسالي، جوريكي ساليج، وأرنولد بيندا، بالإضافة إلى المرضى والجراحين في المركز الطبي الجامعي في أوتريخت على توفير أنسجة القولون. كما يشكر المؤلفون نيكولاس بارنيش على مشاركته سلالة AIEC LF82. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة CRUK OPTIMISTIC (C10674/A27140). تم تمويل TG من برنامج الاتحاد الأوروبي Horizon 2020 للبحث والابتكار بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوسكا-كوري 101107988. تم إنشاء المخططات باستخدام BioRender (https://www.biorender.com/).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
A83-01 (مثبط TGF-&beta)توكريس2939
الإشريكية الغازية اللاصقة LF82هدية طيبة من نيكولا بارنيتش
DMEM/F12 المتقدمإنفيتروجين12634-010
B27 بدون فيتامين Aإنفيتروجين12587010
مجموعة cDNAأنظمة حيوية تطبيقية4387406الدليل متوفر هنا: https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN
0017977_highcap_cDNA_RT_UG.pdf
عداد الخلايادي نوفيكسH2796
عداد الخلايالايكاستيلاريس
أغطية الغطاء 24 مم × 50 مممينزل-غل وأومل؛ زرBB024050S1
مستخلص غشاء قاعدة كولتريكس (BME)R& دي سيستمز، بيو-تكني3533-001-02
DAPIسيغما-ألدرتش10236276001
مشرط قابل للتخلص من السترايل N° 10سوان مورتون3033838
DMEMجيبكو11965092
فيجيفيجيفيجي مفتوحة الوصول ويمكن تحميلها من هنا: https://imagej.net/software/fiji/downloads
غلوتامكسجيبكو35050-061
hEGFبيبروتيكAF-100-15
هيبسجيبكو15630-080
إنفوسينتم تصنيعها حسب Wijnakker وآخرين. PNAS 2024
LBثيرموفيشرCM0996
LB AgarثيرموفيشرCM1116
غرفة مالاسيسKOVA87144E
شرائح المجهرسكاكرافت18901
فولتوهمميتر الخلية الملي (قياس TEER)ميركMERS00002
وسيط التركيبمختبرات فيكتورزفيكتاكيلد H-1000-10
N-أستيل سيستينسيغما-ألدرتشA9165
نيكوتيناميدسيغما-ألدرتشN0636
نوجين UPEIPA TherapeuticsN002
محلول بارافورمالديهايد 4٪سيغما-ألدرتش1.00496
فالويدين 647سيغما-ألدرتش65906-10NMOL
البلازميد pMB1-spect-PthrC-eGFPأدجين107408
البروستاجلاندين E2توكريس2296
آلة qPCRبيورادC1000-Touch
مثبط رو كينازأبمولM1817
مجموعة استخراج الحمض النووي الريبيتشياغن74534الدليل متوفر هنا: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=bf60203
F-291D-48AE-8206-86B0696B28C0&
lang=en
R-spo3 UPEIPA TherapeuticsR001
SB202190 (مثبط الصفحة 38)سيغما-ألدرتشS7076
سبيكتينوميسينسيغما-ألدرتشS9007
لوحة تعليق لزراعة العضوياتغرينر665102
SYBR أخضربيوراد170-8887الدليل متوفر هنا: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106212.pdf
التيرموسايلربيورادT100
إدخال مزرعة الخلاياترانسويلز 24 أسبوع 3 وميكرو؛ مسام م، غرينر662631
ترايتون X-100سيغما-ألدرتشT8787
TrypLEجيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك12605-010
الحاملة البديلةيو-بروتين إكسبرسالترتيب الجماهيري  https://www.life-sciences-europe.com/organisation/protein-express-immunoprecise-group-utrecht-netherlands-west-europe-2001-30404.html

المراجع

  1. McCoy, R., et al. In vitro Models for Investigating Intestinal Host-Pathogen Interactions. Adv Sci. 11 (8), 2306727(2023).
  2. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  3. Gustafsson, J. K., Ermund, A., Johansson, M. E. V., Schütte, A., Hansson, G. C., Sjövall, H. An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).
  4. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  5. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Kim, M., Fèvre, C., Lavina, M., Disson, O., Lecuit, M. Protocol for live imaging of bacteria-cell interactions in genetically modified mouse small intestinal organoids. STAR Protoc. 5 (1), 102773(2024).
  7. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nat Protoc. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  8. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunol. 7 (4), 818-828 (2014).
  9. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Dual RNA sequencing of a co-culture model of Pseudomonas aeruginosa and human 2D upper airway organoids. Sci Rep. 15 (1), 2222(2025).
  11. Wijnakker, J. J. A. P. M., et al. Integrin-activating Yersinia protein Invasin sustains long-term expansion of primary epithelial cells as 2D organoid sheets. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2420595121(2025).
  12. Darfeuille-Michaud, A., et al. Presence of adherent Escherichia coli strains in ileal mucosa of patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 115 (6), 1405-1413 (1998).
  13. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  14. Pleguezuelos-Manzano, C., Puschhof, J., van den Brink, S., Geurts, V., Beumer, J., Clevers, H. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  15. Anilionyte, O., Liang, H., Ma, X., Yang, L., Zhou, K. Short, auto-inducible promoters for well-controlled protein expression in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (16), 7007-7015 (2018).
  16. Chen, S., Einspanier, R., Schoen, J. Transepithelial electrical resistance (TEER): a functional parameter to monitor the quality of oviduct epithelial cells cultured on filter supports. Histochem Cell Biol. 144 (5), 509-515 (2015).
  17. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), e59357(2019).
  18. Quereda, J. J., et al. A dual microscopy-based assay to assess Listeria monocytogenes cellular entry and vacuolar escape. Appl Environ Microbiol. 82 (1), 211-217 (2016).
  19. Schulte, M., Grotheer, L., Hensel, M. Bright individuals: Applications of fluorescent protein-based reporter systems in single-cell cellular microbiology. Mol Microbiol. 121 (3), 605-617 (2024).
  20. Sharma, A., Puhar, A. Gentamicin protection assay to determine the number of intracellular bacteria during infection of human TC7 intestinal epithelial cells by Shigella flexneri. Bio-protocol. 9 (13), e3292(2019).
  21. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  22. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture conditions. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  23. He, G. -W., et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 29 (9), 1333-1345 (2022).
  24. Ding, L., et al. Toll-like receptor 9 pathway mediates Schlafen⁺-MDSC polarization during Helicobacter-induced gastric metaplasias. Gastroenterology. 163 (2), 411-425 (2022).
  25. Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nature Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Vllahu, M., et al. Inflammation promotes stomach epithelial defense by stimulating the secretion of antimicrobial peptides in the mucus. Gut Microbes. 16 (1), 2390680(2024).
  28. Aguilar, C., et al. et al.Helicobacter pylori shows tropism to gastric differentiated pit cells dependent on urea chemotaxis. Nature Commun. 13 (1), 1-14 (2022).
  29. Llanos-Chea, A., et al. Bacteriophage therapy testing against Shigella flexneri in a novel human intestinal organoid-derived infection model. J Ped Gastroenterol Nutr. 68 (4), 509-516 (2019).
  30. Horsley, H., Dharmasena, D., Malone-Lee, J., Rohn, J. L. A urine-dependent human urothelial organoid offers a potential alternative to rodent models of infection. Sci Rep. 8 (1), 1238(2018).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عضوانيات الأمعاءطلاء الإنفازينطبقة أحادية مستقطبةالحاجز الظهاريالمجهر البؤريتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقيالمقاومة الكهربائية عبر الظهارة
زراعة عضوية ثنائية الأبعاد على مستخلص الغشاء الغازي أو القاعدة لدراسة التفاعلات بين المضيف والبكتيريا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.