مقالة منهجية

تقييم الكريات ثلاثية الأبعاد لدراسات ترنسدكشن الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAV)

81 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70517

⸱

أغسطس 14, 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

في هذه المقالة

ملخص

تعمل أنظمة زراعة الكريات ثلاثية الأبعاد على تحسين النماذج التقليدية ثنائية الأبعاد المستخدمة في تطوير العلاج الجيني بواسطة AAV. تتيح هذه المنهجية الكشف الحساس عن ترنسدكشن AAV عند الجرعات المنخفضة، وتعزز الملاءمة الفسيولوجية، وتوفر مراقبة قوية طويلة الأمد. وتدعم هذه المنصة تقييم الفعالية، والفحص عالي الإنتاجية، وتحسين الناقل عبر خطوط خلوية وأنماط مصلية متنوعة من AAV.

الملخص

تُعد الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAVs) ناقلات قوية تُستخدم لإيصال الجينات في منتجات العلاج الجيني. ويتطلب تطويرها أنظمة in vitro  يمكنها الكشف بموثوقية عن الاختلافات في تصميم الناقل، وأداء النمط المصلي، وقوة العناصر التنظيمية، وحركية التعبير الجيني. كما يجب أن تدعم هذه الأنظمة تطبيقات مثل تقييم الفعالية وتحسين الناقل. نصف هنا منصة كروية ثلاثية الأبعاد ومبسطة تم تحسينها لتقييم فعالية AAV، وحركية التعبير عن الجين المنقول، وكفاءة التنبيغ الخاصة بالنمط المصلي عبر خطوط خلوية متنوعة. يتم توليد كرويات متجانسة باستخدام أطباق ذات قدرة ارتباط منخفضة للغاية، ويتم الحفاظ عليها في ظروف تدعم البنية المستقرة والتصوير طويل الأمد. وبعد التنبيغ بواسطة AAV، يتم رصد القراءات الفلورية أو المضيئة في الوقت الفعلي باستخدام أنظمة تصوير الخلايا الحية. وهذا يتيح التقييم الكمي لإشارة المراسل، والاستجابة للجرعة، ونشاط العناصر التنظيمية، ووقت البدء من خلال التصوير الحركي المستمر. وتميز هذه المنصة بفعالية بين تصميمات جينوم الناقل القوية والضعيفة وبين الأنماط المصلية المتعددة لـ AAV. وتظهر هذه الطريقة أداءً قوياً في كل من الخطوط الخلوية بطيئة وسريعة الانقسام. وتثبت هذه النتائج فائدتها كنظام قابل للتوسع وذي صلة فسيولوجية للتقييم والتطوير قبل السريري للعلاج الجيني.

المقدمة

أصبحت ناقلات AAV أحد أنظمة توصيل الجينات المفضلة للتطبيقات in vivo نظراً لملف سلامتها وقدرتها على تحقيق تعبير جيني مستمر1. ويظهر العلاج الجيني باستخدام AAV نجاحاً في علاج العديد من مؤشرات الأمراض النادرة، مع وجود مئات المنتجات في مراحل التطوير2. علاوة على ذلك، تشمل التطبيقات الناشئة التوصيل in vivo لمكونات تحرير الجينوم مثل Cas9، مع إمكانات كبيرة للمساعدة في علاج الحالات التي يصعب علاجها3. وتشمل تحديات التطوير الرئيسية تكاليف التصنيع المرتفعة والقدرة التنبؤية المحدودة للمقاييس in vitro الحالية في تحديد جودة المنتج والفعالية السريرية4.

يواجه التقدم في العلاجات القائمة على الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAV) عائقاً أساسياً يتمثل في نقص فحوصات النشاط القياسية والتنبؤية التي يمكنها التنبؤ بدقة بالأداء السريري4,5. وتعد هذه الفحوصات مكوناً حاسماً في مسار التطوير، حيث تُستخدم لأغراض متعددة، بما في ذلك فحص مكتبات النواقل المهندسة، وتحسين تعديلات القفيصة لتعزيز الاستهداف، وتقييم الانتحاء النسيجي النوعي. كما تعمل هذه الفحوصات على توصيف تأثير التسلسلات التنظيمية على تعبير الجين المنقول6. وإلى جانب اختيار المرشحات، تدعم فحوصات ترنسدكشن AAV أيضاً الرقابة الحرجة على جودة التصنيع من خلال فحوصات القوة المستخدمة لإفراج التشغيلات، ودراسات مقارنة التشغيلات، وتقييمات الاستقرار6,7.

يكمن التحدي العلمي في تطوير مقايسات تستوعب تعقيد التفاعلات بين الناقل والمضيف مع الحفاظ على الجدوى العملية للاستخدام الروتيني7,8. وتشمل النهج الحالية استخدام خطوط خلوية مخلدة تمثل العضو المستهدف في مزارع أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد التقليدية. تفتقر ظروف الزراعة هذه إلى الصلة الفسيولوجية وتتطلب جرعات دوائية عالية، مما يخلق فجوة كبيرة بين التنبؤات المختبرية وقابلية التطبيق السريري. وتمثل خطوط الخلايا المهندسة حديثاً، مثل الأنظمة التي تزيد من تعبير AAVR أو الأنظمة المنشطة بواسطة CRISPR، تقدماً مهماً، إلا أنها تفشل في محاكاة البنية ثلاثية الأبعاد وتفاعلات المصفوفة خارج الخلوية التي تميز الأنسجة الأصلية9,10,11. ومن شأن نماذج الجيل القادم التي تحاكي البيئات الدقيقة in vivo بشكل أفضل أن تجسر هذه الفجوة الانتقالية12,13,14.

لقد قمنا مؤخراً بتطوير نظام كروي ثلاثي الأبعاد (3D spheroid system) محسّن لعملية ترنسدكشن AAV بهدف تحسين إمكانية ترجمة مقايسات ترنسدكشن AAV إلى تطبيقات عملية. ويعزز هذا النظام بشكل كبير كفاءة ترنسدكشن AAV عبر خطوط خلوية وأنماط مصلية متعددة من AAV مقارنة بالمقايسات ثنائية الأبعاد (2D) التي تُعد المعيار الذهبي. وبالإضافة إلى تحسين الحساسية والحفاظ على المنتج المستخدم في المقايسة، تعمل هذه النماذج على تطوير الطبقات أحادية الخلية ثنائية الأبعاد من خلال توفير تفاعلات خلوية-خلوية واقعية تختلف باختلاف الموقع الخلوي داخل الكروية. كما أنها تتيح إجراء استقصاءات ذات مغزى حول تغلغل الدواء بما يحاكي ظروف الأعضاء الفعلية11,15,16. علاوة على ذلك، يوفر نهج الكرويات هذا مزايا عملية مقارنة بأنظمة العضويات (organoids) أو أنظمة الزراعة المشتركة الأكثر تعقيداً، حيث يستخدم معدات مختبرية قياسية ويتجنب متطلبات الأوساط المتخصصة أو السقالات. وتضمن هذه البساطة إمكانية التكرار والقابلية للتوسع، مما يجعله مناسباً تماماً لسير عمل اختبارات العلاج الجيني الروتينية وتطوير النواقل17.

تُعد منصة الكرويات ثلاثية الأبعاد (3D spheroid) هذه مناسبة بشكل خاص للتطبيقات التي تتطلب كشفاً حساساً لنقل AAV بجرعات منخفضة والتقييم المقارن لتصاميم الجينوم الناقل. كما أنها تدعم تقييم الانتحاء المعتمد على النمط المصلي. وتوفر هذه المنصة ميزة خاصة لخطوط الخلايا ذات كفاءة النقل المنخفضة نسبياً والتي تتطلب جرعات عالية من AAV في المزارع التقليدية ثنائية الأبعاد (2D). وفي هذه السياقات، تُعتبر الحساسية المعززة والملاءمة الفسيولوجية المحسنة للمنصة ثلاثية الأبعاد أمراً بالغ الأهمية. ومع ذلك، قد يكون هذا النظام أقل ملاءمة للدراسات التي تتطلب مكونات مناعية، أو توصيلاً وعائياً، أو تعقيداً نسيجياً كاملاً؛ وذلك لأن الكرويات لا تحاكي البيئة in vivo بشكل كامل.

وبناءً على ذلك، نقدم بروتوكولاً بسيطاً لتكوين الكريات ثلاثية الأبعاد (3D spheroid) تم تحسينه لاختبارات ترنسدكشن AAV، مع وجود قراءتين حرجتين ومتكاملتين: كفاءة الترنسدكشن (المعرفة هنا على أنها إجمالي إشارة المراسل لكل كرية) وحركية الترنسدكشن. وتوفر هذه الطريقة منصة فعالة من حيث التكلفة، وذات صلة فسيولوجية، وغنية بالمعلومات لتقييم فاعلية AAV، وتصميم الناقلات، واختبارات التحييد.

البروتوكول

استخدمت هذه الدراسة خطوط خلايا بشرية معروفة (HEK293T و HeLa و Huh7 و HEP3B و HEPG2 و A375) تم الحصول عليها من مصادر تجارية أو مصادر منشورة سابقاً. لم يتم استخدام أي عينات بشرية أو حيوانية أولية، وبالتالي لم تكن هناك حاجة للحصول على موافقة أخلاقية.

1. إعداد التجربة المعقمة والتجهيز الأولي لخزانة التدفق الصفحي

  1. قم بتنشيط كابينة السلامة البيولوجية.
  2. قم بتشغيل كابينة السلامة الميكروبيولوجية ذات التدفق الصفائحي من الفئة الثانية (Class II) قبل 15 min من البدء للسماح بوقت كافٍ لاستقرار تدفق الهواء.
  3. رش جميع الأسطح الداخلية للغطاء باستخدام ethanol بتركيز 70% (v/v).
  4. قم بتحضير محلول تطهير من المبيض بتركيز 5% (v/v) في دورق زجاجي سعة 500 mL للتخلص من الطافي الخلوي والبقايا الخلوية.
  5. قم بتنظيف المعدات عن طريق تطهير جميع الماصات الدقيقة وصناديق الرؤوس بدقة باستخدام ethanol بتركيز 70% (v/v).

2. تحضير أوساط زراعة الخلايا

  1. قم بتحضير 500 mL من وسط Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) الأساسي عالي الجلوكوز.
  2. أضف إلى الوسط الأساسي 10 mL من مصل جنين البقر (FBS) المثبط حرارياً، و1 mL من محلول penicillin/streptomycin (بتركيز 100 units/mL من penicillin و100 µg/mL من streptomycin)، و5 mL من L-glutamine بتركيز 2 mM.
    ملاحظة: يجب الحفاظ على التقنيات العقيم طوال جميع الإجراءات. كما يتطلب كل اختبار تحضير وسط جديد. يرجى الرجوع إلى جدول المواد لمعرفة مواصفات المعدات المحددة.

3. تحضير الكريات

  1. قم بتحضير وسط DMEM الكامل كما هو موضح أعلاه.
  2. قم بتدفئة وسط الزرع في حمام مائي عند 37 °C لمدة 10-15 دقيقة.
  3. أخرج الخطوط الخلوية المطلوبة من خزان النيتروجين السائل.
  4. قم بإذابة الخلايا المجمدة مسبقاً من أنواع HEK293T وHuh7 وHEP3B وHEPG2 وA375 وHeLa بسرعة عن طريق وضعها في حمام مائي عند 37 °C.
  5. أخرج الخلايا فوراً من الحمام المائي بمجرد ذوبان آخر بلورة ثلج.
  6. خفف 1 mL من الخلايا المذابة في 9 mL من وسط DMEM الكامل.
    ملاحظة: يتم الحفاظ على جميع الخطوط الخلوية المستخدمة في هذا البروتوكول في نفس أوساط DMEM وظروف الزرع.
  7. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 350 × g. لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. تخلص من السائل الطافي.
  9. أعد تعليق الراسب في 5 mL من وسط DMEM الكامل.
  10. ازرع الخلايا في دورق زرع خلايا T75.
  11. ضع الدوارق المزروعة في حاضنة زرع خلايا مضبوطة عند 37 °C، و5% CO2، ورطوبة 95%.

4. مراقبة نمو الخلايا

  1. أضف 15 mL من الوسط الزرعي كل 3 أيام.
  2. قم بتمرير خلايا HEK293T و Huh7 و HEP3B و HEPG2 و A375 و HeLa عند وصولها إلى 70% من درجة التلاقي (confluency)، ثم اسحب وسط DMEM الكامل من دوارق T75. 
  3. اغسل الخلايا بإضافة 5 mL من PBS إلى دوارق T75 التي تحتوي على الخلايا. 
  4. اسحب كمية 5 mL من PBS بعد 30 s من إضافتها إلى دوارق T75. 
  5. كرر خطوة الغسل هذه مرة أخرى.  
  6. قم بهضم الخلايا باستخدام 5 mL من trypsin-EDTA بتركيز 0.05% لمدة 5 min. 
  7. حضّن الدوارق في حضانة عند 37 °C لمدة 5 min للسماح بانفصال الخلايا التام. 
  8. أضف 5 mL من وسط DMEM الكامل لمعادلة التربسين (trypsin). 
  9. قم بطرد مركزي للخلايا عند 350 × g. لمدة 5 min لإزالة التربسين. 
  10. أعد تعليق كتلة الخلايا في 5 mL من DMEM. 
  11. قسّم الخلايا بنسبة تخفيف 1:10 لعملية تمرير الخلايا الروتينية. 
    ملاحظة: يُوصى بتمرير الخلايا مرتين قبل إجراء التجارب للسماح للخلايا بالوصول إلى الطور اللوغاريتمي وتصبح نشطة أيضياً. 
  12. استمر في التحضين تحت هذه الظروف المضبوطة حتى تصل الخلايا إلى 70% من درجة التلاقي، ثم باشر بالإجراءات التجريبية اللاحقة.
    ملاحظة: يجب مراقبة شكل الخلايا وأنماط نموها بانتظام. تأكد من وضع الدوارق بشكل صحيح لضمان التبادل الغازي الأمثل. وتعد الشروط المعقمة ضرورية طوال فترة التحضين.

5. حصاد الخلايا والتحضير الأولي للخلايا

  1. إزالة وسط الزرع عن طريق سحب وسط الزرع الموجود من دوارق T75.
  2. غسل خلايا HEK293T وHuh7 وHEP3B وA375 و HEPG2 وHeLa ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة بقايا الوسط والحطام الخلوي.
  3. إضافة 5 mL من محلول trypsin بتركيز 1× مُدفأ مسبقاً إلى هذه الخلايا لفصل الخلايا الملتصقة عن سطح الدورق.
    ملاحظة: تأكد من تدفئة trypsin مسبقاً للحفاظ على النشاط الإنزيمي الأمثل. توضع الدوارق في حاضنة عند 37 °C لمدة 5 min للسماح بانفصال الخلايا تماماً. راقب وقت عملية الهضم بالتربسين (trypsinization) بدقة لمنع الهضم المفرط.
  4. إضافة 5 mL من وسط زرع كامل لإبطال مفعول إنزيم trypsin.
  5. سحب الخليط وإعادة إطلاقه بواسطة الماصة لضمان تجانس المحلول.
  6. جمع كل معلق خلوي عن طريق نقل معلق الخلايا بالكامل إلى أنابيب طرد مركزي مُعلمة بشكل فردي.
    ملاحظة: يجب التعامل مع الخلايا برفق أثناء إعادة التعليق للحفاظ على حيويتها.
  7. طرد الخلايا مركزياً بالدوران بسرعة 350 × g. لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا.
  8. التخلص من supernatant وإعادة تعليق الراسب الخلوي برفق في 5 mL من وسط زرع جديد.

6. عد الخلايا وتقييم حيويتها باستخدام عداد الخلايا

  1. قم بتجانس المعلق عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة لضمان توزيع الخلايا بشكل موحد في أنبوب الطرد المركزي.
  2. جهز أنابيب العد لخلايا HEK293T و Huh7 و HEP3B و HEPG2 و A375 و HeLa.
  3. جهز تخفيفاً بنسبة 1:10 للعينة في وسط زراعة DMEM كاملاً. على سبيل المثال، أضف 40 µL من معلق الخلايا إلى 360 µL من وسط DMEM الكامل.
  4. قم بسحب وضخ الخليط بلطف باستخدام الماصة أربع مرات لضمان تجانس التخفيف.
  5. سجل العينة في سجل الدخول، وحدد نوع الخلايا المستخدمة، ونسبة التخفيف، واسم العينة.
  6. ضع العينة في جهاز عد الخلايا وضع الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا المخفف في الرقم المخصص له.
    ملاحظة: جهاز عد الخلايا هو عداد خلايا آلي يقوم بسحب عينات الخلايا وخلطها مع صبغة trypan blue، مما يقلل من التباين بين المشغلين.
  7. اترك معلق الخلايا ليستقر لمدة 1 min قبل عد العينة.
  8. أعد تعليق الخلايا بشكل متساوٍ قبل العد للحصول على نتائج دقيقة.
  9. احسب العدد الإجمالي للخلايا.
  10. استخدم تركيز الخلايا الحية الإجمالي لتحديد عدد الخلايا المراد استزراعها في التجارب.
  11. استخدم الخلايا الحية التي تزيد حيويتها عن > 90%.
  12. ميز بين الخلايا الحية (غير المصبوغة) والخلايا غير الحية (المصبوغة باللون الأزرق).
    ملاحظة: يجب الحفاظ على معايير عد ثابتة في جميع العينات.

7. استزراع الكريات وتحسين حجمها

  1. قم بسحب معلق الخلايا وإطلاقه بالمصّة لضمان تجانس المحلول.
  2. قم باستزراع كثافات خلوية مختلفة من خلايا HEK293T أو Huh7 أو HEP3B أو HEPG2 أو HeLa.
  3. ابدأ باستزراع 1 x 104 من الخلايا في 200 µL في طبق 96 بئراً مستديرة القاع ذات التزاماً منخفضاً للغاية (ULA).
  4. قم بإجراء تخفيف تسلسلي لتركيز 1 x 104 خلايا / بئر بنسبة تخفيف بمقدار ضعفين حتى تصل إلى الكثافة الخلوية المطلوبة للتجارب.
  5. أضف حجماً واحداً من الوسط الكامل إلى جميع الصفوف (1B-1H) باستثناء الصف العلوي.
  6. أضف حجمين من تركيز 1 x 104 خلايا / بئر في الصف 1A (الصف العلوي).
  7. قم بتخفيف الصف 1A تسلسلياً عن طريق إضافة حجم واحد من الصف 1A إلى الصف 1B وهكذا. راجع مثال المخطط التجريبي أدناه في Supplementary Figure 1.
    ملاحظة- تأكد من إعادة التعليق بشكل متساوٍ عن طريق النقر بلطف على جوانب الطبق.
  8. قم بتدوير طبق ULA في جهاز طرد مركزي عند 350 × g لمدة 5 min لسحب الخلايا إلى المركز وتعزيز التلامس بين الخلايا.
    ملاحظة: في حالة استخدام خطوط خلوية غير تلك المذكورة هنا، قد تكون هناك حاجة لتحسين المعايير، حيث تظهر خطوط خلوية مختلفة معدلات نمو وتكوين كرويات متفاوتة.
  9. تجنب تحريك الأطباق خلال أول 24–48 h للسماح بالتكوين الأولي للكرويات. اترك الكرويات تنضج لمدة 3 days لتصل إلى قطر يبلغ ~400 µm.
  10. تحقق من تماثل حجم الكرويات. تأكد من إعادة تعليق الخلايا بشكل موحد ومن عدم وجود التواء في الأطباق.
    ملاحظة: لا تستخدم الأطباق التي تحتوي على كرويات ذات أحجام غير متسقة. تأكد من أن الكرويات موحدة القطر نسبياً داخل كل بئر.
  11. راقب مورفولوجيا الكرويات.
    ملاحظة: تظهر الكرويات جيدة التكوين بشكل مستدير وبحواف محددة.
  12. قم بإعداد كرويات ناضجة تظهر التصاقاً خلوياً وثيقاً، وليس تجمعات خلوية مفككة.
  13. قم بزيادة كثافة الاستزراع أو تمديد وقت التكوين. إذا لم تكن الكرويات متراصة، فقم بزيادة كثافة الاستزراع أو تمديد وقت التكوين.
  14. قلل من تكوين تجمعات صغيرة متعددة عن طريق خفض كثافة الاستزراع أو بتمديد خطوة الطرد المركزي.

8. مراقبة الكريات الخلوية الحية في الوقت الفعلي

  1. بمجرد ترسيب معلقات الخلايا بالطرد المركزي، انقل الطبق إلى حاضنة عند 37 °C (5% CO2، ورطوبة 95%)، تحتوي على جهاز تصوير للخلايا الحية لإجراء تصوير مؤتمت للخلايا الحية.
  2. اضبط معايير تصوير الخلايا الحية للكريات وفقاً لمتطلبات التجربة:
    ملاحظة: تم استخدام المعايير التالية لجميع الخطوط الخلوية التي تم اختبارها.
  3. سجل الدخول إلى برنامج الحصول على الصور.
  4. اختر الأوامر التالية: |Schedule To Acquire | Launch Add Vessel | Scan On Schedule | Create Vessel: New.
  5. |Select Scan Type|: Spheroid. |Select the channels of interest|: Phase + Brightfield (لمتابعة نمو الكريات)، Green/Red (لمتابعة تحول AAV، بزمن الحصول على الصور 300 ms أو 400 ms على التوالي).
  6. اختر قوة التكبير المطلوبة: 10x.
  7. حدد نموذج الطبق وموضعه في الدرج.
  8. حدد مواقع الآبار المراد تصويرها، وعدد الصور المطلوبة لكل بئر.
  9. أدخل وصف التجربة: الاسم، ونوع الخلايا، وعدد الخلايا.
  10. فيما يخص إعداد التحليل، اختر Defer Analysis Until Later.
  11. انقر بزر الفأرة الأيمن على الجدول الزمني واختر خيار Set Selected Scan Group Interval.
  12. اضبط إضافة عمليات مسح كل 6 h و المسح بشكل غير محدود. حدد وقت البدء المطلوب (بعد ساعة واحدة على الأقل من الحضن في جهاز التصوير المؤتمت).
  13. تحقق يومياً من نمو الكريات عن طريق تسجيل الدخول إلى برنامج التصوير.
  14. اختر خيار View Recent Scans وانقر نقراً مزدوجاً على التجربة المطلوبة. |اختر Brightfield من لوحة قنوات الصور| ثم استخدم أداة ميزات  |Measure image|  لقياس قطر الكريات.
    ملاحظة: قد يلزم تحديد توقيت النضج الأمثل لإنتاج كريات مدمجة من الخلايا المعنية.
  15. أخرج الطبق في اليوم الذي يتم فيه تكوين الكريات بشكل أمثل واستخدمه لعملية تحول AAV.

9. نقل جينات AAV

  1. قم بشراء أو تصنيع الأنماط المصلية AAV3 والجينات المنقولة المطلوبة.
  2. قم بتحضير وسط DMEM مدعم بـ 2% FBS لعمليات ترنسدكشن AAV عن طريق إضافة 10 mL من FBS إلى 490 mL من وسط DMEM.
    ملاحظة: بالنسبة لفحص الكابسيدات أو العناصر التنظيمية الجينومية، يكون الجين المنقول GFP فعالاً للغاية، كما هو موضح في قسم النتائج الممثلة. قم بتخفيف AAV المطلوب في وسط DMEM مدعم بـ 2% FBS، بدون مضادات حيوية.
  3. قم بالتخفيف في طبق دائري مخصص مكون من 96 بئراً لإجراء التخفيفات المتسلسلة.
  4. قم بإجراء تخفيفات بنسبة 1:10 بدءاً من MOI الابتدائي لمعايرة AAV1 وAAV2 وAAV5 وAAV8 وAAV9.
  5. راجع مثال المخطط التجريبي أدناه في Supplementary Figure 2. احسب MOI اللازم لترنسدكشن AAV، كما هو موضح في قسم المناقشة.
  6. أضف 33 µL من مخزون AAV إلى 297 µL من الوسط للحصول على إجمالي 330 µL بتركيز MOI 1 × 106.
  7. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة بمقدار 10 أضعاف، بدءاً من MOI قدره 1 × 106 عن طريق إضافة 33 µL إلى 297 µL من وسط DMEM المدعم بـ 2% FBS.
    ملاحظة: يوصى بتجنب قيم MOI العالية لمنع انخفاض حيوية الخلايا. قد تكون هناك حاجة لتحسين الظروف التجريبية لكل نوع من الخلايا وكل نمط مصلي من AAV، حيث يمكن أن تؤثر هذه العوامل بشكل كبير على MOI الأمثل. ليست كل الجينومات الفيروسية معدية؛ وقد تختلف العيارات الوظيفية عن قيمة vg/mL.

10. تحديد جرعة AAV

  1. شفط جميع الأوساط من لوحة الكريات الجاهزة مسبقاً باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  2. إضافة 100 µL من MOI المطلوب عن طريق نقل هذا الحجم من لوحة التخفيف إلى لوحة المعالجة باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  3. إعادة الأطباق إلى جهاز التصوير وبدء مراقبة عملية التنحي (transduction) عن طريق تتبع شدة الفلورة الخضراء على مدار 72 h.
  4. إضافة 100 µL من وسط DMEM الكامل لكل بئر كل 3 أيام لتعويض العناصر الغذائية، في حال استمرت المراقبة لأكثر من 3 أيام.

11. التصوير الحي للخلايا، ومراقبة نقل الجينات، وتحليل البيانات

  1. أعد الطبق إلى الجهاز بعد إضافة AAV و MOI المطلوبين إلى مجموعة المعالجة.
  2. ابدأ بتسجيل كفاءة ترانسدكشن (transduction efficiency) كل 6 h.
    ملاحظة: يستغرق الأمر عادةً ما بين 3 و 5 أيام لتحقيق التعبير الأمثل لـ GFP. ويعتمد ذلك على المروج (promoter) وتكوين الجينوم المستخدم.
  3. حلل البيانات عن طريق إنشاء تعريف تحليل خاص بالخلايا والجينات المراسلة (reporter genes) المستهدفة.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن الاحتفاظ بالطبق في حاضنة قياسية عند 37 °C وتقييم كفاءة الترانسدكشن باستخدام qPCR، أو لطخة ويسترن (western blotting)، أو ELISA.
  4. حدد معاملات التحليل من خلال إجراء تحليل المجال المضيء (Brightfield Analysis) للكشف عن الكريات الأولية (primary spheroids).
  5. قم بتحسين معاملات التجزئة (Segmentation Parameters) كما يلي:
    1. نوع التحليل: "Spheroid Brightfield."
    2. طريقة التجزئة: "Adaptive Threshold."
    3. نطاق العتبة: 0.3–0.8 (يوصى بالضبط التلقائي في البداية)
    4. مرشح Top-hat: 200–500 µm (لإزالة الإضاءة غير المنتظمة)
  6. قم بتحسين معاملات المجال المضيء كما يلي:
    1. قم بتحميل صور ممثلة من نقاط زمنية مختلفة.
    2. اختبر نطاق العتبة (0.2–0.9) للعثور على الكشف الأمثل.
    3. اضبط مرشحات الحجم بناءً على نطاق حجم الكريات المتوقع.
    4. تحقق من صحة التجزئة عن طريق فحص التراكب البصري.
  7. قم بتحسين القناة الخضراء (Green Channel) لتقييم ترانسدكشن AAV كما يلي:
    1. حدد مستويات الخلفية للآبار غير المعالجة (MOI=0).
    2. اضبط العتبة لتكون أعلى من ضوضاء الخلفية بمقدار 2–3×.
    3. اختبر ذلك باستخدام العينة المعالجة بأعلى MOI.
  8. قم بتحسين وقت التعريض لتجنب التشبع مع الحفاظ على الإشارة
    ملاحظة: بالنسبة لعمليات ترانسدكشن AAV، سجل إجمالي إشارة الفلورة لكل كرية كمقياس لكفاءة الترانسدكشن.

12. تحليل البيانات

  1. اختر المعايير الصحيحة، مع ضبط المرشحات والأقنعة، بحيث يتم تحديد الخلايا في الصورة وليس ضجيج الخلفية.
  2. اختر صورة ممثلة لتدريب البرنامج.
  3. طبق المعايير المُحسّنة على جميع الصور في الدراسة.
  4. استخرج البيانات إما كقيم فردية أو مجمعة وانقلها إلى نظام تحليل إحصائي لعرض البيانات بشكل أكبر.

13. حساب وقت البدء

  1. احسب الوقت المستغرق للكشف عن أول إشارة GFP لكل MOI.
  2. أجرِ الاستكمال لمتوسط الآبار غير المعالجة (MOI = 0) + 3 انحرافات معيارية (SD).
  3. انسخ شدة الفلورة الخضراء لكل كروية في كل نقطة زمنية من برنامج تصوير الخلايا الحية إلى برنامج إحصائي.
  4. احسب متوسط المكررات.
  5. احسب متوسط وإحصائيات الانحراف المعياري (SD) للإشارات في جميع الآبار التي تحتوي على كرويات غير معالجة (MOI = 0).
  6. استخدم ملاءمة المنحنى السيني غير المتماثل، 5PL، لاستكمال وقت البدء لكل MOI.
  7. على سبيل المثال، استُخدمت قيم الاستكمال التالية في الجدول 1:
    1. بالنسبة لـ scGFP: 254,955 (المتوسط) + 3 × 288,055 (SD) = 1,412,120 (إشارة الاستكمال)
    2. بالنسبة لـ ssGFP: 2,417,941 (المتوسط) + 3 × 26,093  (SD) =  3,200,746 (إشارة الاستكمال)

14. قياس الفلورة باستخدام قارئ أطباق يتمتع بقدرات قياس الفلورة.

  1. قم بتشغيل برنامج قارئ الأطباق الفلوري على جهاز الكمبيوتر المتصل بقارئ الأطباق.
  2. تنقل إلى ملف > فتح البروتوكول، واختر نوع الطبق (على سبيل المثال، طبق 96 بئراً، أو طبق 384 بئراً)، وتأكد من اختيار المخطط الصحيح للآبار. 
  3. اضبط وقت التكامل للكشف الفلوري، والذي يحدد المدة التي يقوم خلالها القارئ بجمع الفلورية من كل بئر.
  4. ضبط يرجى تزويدي بالنص المصدر الذي ترغب في ترجمته. كسب أو الحساسية الإعدادات
    إذا الـ مقايسة يتطلب أعلى أو أدنى إشارة كشف.
  5. اضبط معلمات الفلورة لبروتين GFP كما يلي: الإثارة: 485 نانومتر، والانبعاث: 528 نانومتر.
  6. انقر فوق "Run" في البرنامج لبدء القياس.
  7. قياس الفلورة من كل واحد حسناً.
    ملاحظة- بعد انتهاء التشغيل، يعرض البرنامج قيم الفلورة الخام، والتي يمكن استخدامها لإنشاء رسوم بيانية عن طريق حساب المتوسطات وطرح الخلفية.
  8. تصدير النتائج في الـ مفضل تنسيق لـ إضافي تحليل أو إعداد التقارير.
    ملاحظة: إذا تم تعديل بروتوكول العينة، استخدم الملف > استخدم "حفظ باسم" (Save As) لإنشاء نسخة فريدة، مع الاحتفاظ بالأصل لاستخدامه في المستقبل.

15. ترنسدكشن الجين المنقول المضيء

  1. اتبع بروتوكول الاستزراع وجرعات AAV نفسه كما هو مفصل أعلاه.
  2. أضف 100µL من AAV1 وAAV2 وAAV5 وAAV8 وAAV9 التي تحمل جين nano luciferase منتقل بتركيزات MOIs مختلفة تتراوح من 0–106 إلى 100 µL من كرويات HeLa المستزرعة مسبقاً في أطباق ULA.
  3. حضّن الأطباق في حاضنة عادية عند 37 °C وقيم كفاءة التنحيّل بعد 3 أيام من عملية التنحيّل.

16. تحضير مثبط التألق الخارجي والركيزة المضيئة للكشف عن مقايسة الخلايا الحية

  1. أخرج أطباق المقايسة من المحضنة في اليوم الثالث (نقطة النهاية).
  2. أضف مثبط التألق الضوئي خارج الخلية والركيزة مباشرة إلى الخلايا.
    ملاحظة: لا يلزم إزالة الوسط الزراعي.
  3. أخرج المثبط خارج الخلوي من التخزين عند درجة حرارة −20 °C واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لتجميع السائل من الغطاء وجوانب الأنبوب.
  5. قم بتحضير الكمية المطلوبة من مثبط التألق الضوئي خارج الخلوي المعاد تشكيله بتركيز 15X عن طريق دمج حجم 1  من المثبط خارج الخلوي مع 14  حجماً من وسط DMEM الكامل.
    1. على سبيل المثال، إذا كانت التجربة تتطلب 1.0 mL من الكاشف، أضف 67 µL من المثبط إلى 933 µL  من DMEM. بالنسبة لطبق واحد، حضر 1 mL من DMEM، وأضف 67 µL من المثبط.
  6. انقل المثبط الذي تم تحضيره في الخطوة 16.5 إلى خزان كاشف معقم.
  7. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 10 µL من المثبط في الآبار التي تم نقل AAV إليها.
  8. أخرج ركيزة الخلايا الحية من التخزين عند درجة حرارة −20°C وامزجها.
  9. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لتجميع السائل من الغطاء وجوانب الأنبوب.
  10. حضر الكمية المطلوبة من كاشف الخلايا الحية المعاد تشكيله بتركيز 3.6X.
  11. حضر 4 mL من DMEM وأضف 144 µL من الركيزة لطبق واحد.
  12. انقل الركيزة التي تم تحضيرها في الخطوة 16.11 إلى خزان كاشف معقم.
  13. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 50 µL من الركيزة في نفس الآبار التي تم نقل AAV إليها.
    ملاحظة: قد يلزم ضبط حجم الكواشف إذا تم تشغيل أطباق مقايسة متعددة في وقت واحد.
  14. رج الطبق بسرعة 300 rpm لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة.
  15. اقرأ الطبق باستخدام جهاز نظام التصوير in vivo خلال ساعتين من إضافة كواشف الكشف عن التألق الضوئي.
    ملاحظة: ستنخفض شدة التألق الضوئي تدريجياً على مدار ساعتين.

17. التصوير بالتلألؤ البيولوجي

  1. قم بتشغيل نظام التصوير بالتلألؤ البيولوجي قبل التصوير بـ 30 دقيقة على الأقل للسماح بتبريد كاميرا CCD (عند -90 °C).
  2. تأكد من أن الأطباق جاهزة للتصوير (على سبيل المثال، إضافة ركيزة تصوير الخلايا الحية لقراءة التلألؤ البيولوجي).
  3. قم بإزالة غطاء الطبق لتجنب انعكاس الضوء وتشتته.
  4. نظف الجزء السفلي من الطبق في حال كان التصوير سيتم من الأسفل.
  5. ضع الطبق في غرفة التصوير على المنصة.
  6. ضع الطبق في المركز تحت الكاميرا.
  7. اضبط معايير التصوير للتلألؤ:  التعريض التلقائي أو ضبط وقت التعريض (عادةً من 1–60 s)، وتجميع البكسلات (يوصى بالخيار المتوسط)، وفتحة العدسة f/stop (القيمة 1 لتحقيق أقصى قدر من الحساسية).
  8. التقط صورة كمرجع تشريحي.
  9. التقط صورة التلألؤ.

18. تحليل بيانات التصوير بالتلألؤ البيولوجي

  1. استخدم أدوات تحديد منطقة الاهتمام (ROI) لرسم دوائر حول الآبار أو المناطق المراد دراستها.
  2. تأكد من توحيد حجم منطقة الاهتمام (ROI) عبر جميع العينات لضمان دقة المقارنة.
  3. قم بقياس التدفق الكلي (فوتون/ثانية) للتألق الحيوي.
  4. قم بقياس كفاءة الإشعاع.
  5. صدّر البيانات إلى جدول بيانات لإجراء التحليل الإحصائي.
  6. احفظ ملفات الصور ونتائج التحليل.
  7. صدّر الصور بصيغة TIFF أو JPEG لاستخدامها في العروض التقديمية.

النتائج

نوضح هنا أنه يمكن استخدام الكريات ثلاثية الأبعاد (3D spheroids) كأداة لتقييم ترنسدكشن AAV، والتمييز بين تصميمات جينوم الناقل مثل ذاتية التكامل (sc) وأحادية السلسلة (ss)، وتقييم حركية الترنسدكشن. يظهر عرض عام لهذه العملية في الشكل 1. باختصار، يتم أولاً تكثير الخلايا في مزارع ثنائية الأبعاد (2D) وزرعها في أطباق ذات التزام فائق الانخفاض (ULA) لتكوين كريات متراصة (الشكل 1A). بعد ذلك، يتم طرد الأطباق مركزياً لتعزيز التجمع (الشكل 1B) ونقلها إلى نظام تصوير الخلايا الحية للمراقبة الآنية لتكوين الكريات (الشكل 1C). وفي اليوم الثالث، يتم إجراء الترنسدكشن للكريات باستخدام AAV بمضاعفات عدوى (MOIs) متفاوتة (الشكل 1D). يتم تتبع حركية الترنسدكشن طولياً باستخدام تصوير الخلايا الحية (الشكل 1E)، ويتم إجراء تحليل نقطة النهاية باستخدام قراءات الفلورة أو التألق الحيوي المعتمدة على الأطباق (الشكل 1F).

الشكل 2 يظهر المورفولوجيا الخاصة بالكرويات من 6 خطوط خلوية مختلفة، مما يوضح نطاقاً من الكثافات والاستدارة والشكل. تم إنماء جميع الخطوط الخلوية في وسط DMEM كامل لعدة ممرات قبل استخدامها في أي تجربة. وبمجرد وصول الخلايا إلى طور النمو اللوغاريتمي، تم حصاد خلايا HEP3B وHEK293T وA375 وHeLa وHEPG2 وHuh7 وتخفيفها تسلسلياً في أطباق ذات قاع مستدير ذات التصاق منخفض للغاية (ULA)، بدءاً من كثافة خلوية تبلغ 10,000 خلية لكل بئر، مع تخفيف تسلسلي بمقدار ضعفين (مخطط الطبق مدرج في ملحق الشكل 1 وتظهر النتائج التمثيلية في الشكل التكميلي 2). يمكن أن يكون حجم الكريات صغيرًا ليصل إلى 50 µm مع الحفاظ على بنية الكرويات وقابلية ممتازة للنقل الجيني. وبعد استزراع الخلايا، تم تدوير طبق ULA ذو القاع المستدير بسرعة 350 × غ. لمدة 5 دقائق، مما سمح للخلايا بالتجمع في مركز البئر والتجمع ذاتياً لتكوين كرويات. وتعد هذه الخطوة مفيدة بشكل خاص للخلايا التي لا تتجمع بشكل طبيعي. ويمكن تمديد فترة الطرد المركزي من 5 إلى 15 دقيقة للخلايا شديدة المقاومة، مثل الخلايا اللمفاوية. وتظهر الكرويات جيدة التكوين نمطاً ظاهرياً مستديراً ومتراصاً، كما هو ملاحظ في خلايا HEK293T وHuh7، بينما تكون الكرويات ضعيفة التكوين متجمعة بشكل مفكك وعرضة للتفكك أثناء تغيير الوسط الغذائي.

بعد ذلك، يتم نقل الطبق إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 °C مجهزة بجهاز لمراقبة الخلايا الحية. وتتم مراقبة الأطباق يومياً بفواصل زمنية مدتها 6 h لتقييم تكوين الكرويات (spheroids) لكل من الخطوط الخلوية المذكورة هنا. تتطلب معظم الخطوط الخلوية 3 أيام للتجميع الذاتي في شكل كروية. وكما هو موضح في الشكل 2، أظهر كل خط خلوي سمات مورفولوجية مميزة ومستويات متفاوتة من التراص بعد 3 أيام من الاستزراع. شكلت الخطوط الخلوية الكبدية (Huh7 و HEPG2 و HEP3B) كرويات أكثر تراصاً وكثافة من الخطوط الخلوية الأخرى. أما HEK293T فقد شكلت مظهراً كروياً مستديراً جداً مع نواة نخرية مميزة، بينما شكلت A375 تجمعاً خلوياً غير منتظم الشكل (وُصف سابقاً بأنه كروية مشوهة)18,19. ويُعتقد أن هذه الاختلافات في المورفولوجيا هي مؤشرات على الحالات الفيزيولوجية المرضية للمرض، مما يدعم بشكل أكبر فائدة النماذج ثلاثية الأبعاد (3D) مقارنة بأنظمة الزرع ثنائية الأبعاد (2D)18,19. إن بروتوكول تجميع الكرويات قابل للتكرار بدرجة عالية عبر الخطوط الخلوية الستة المختبرة وقد تم تطبيقه على جميع عمليات التنبيغ (transductions) الموضحة هنا.

بعد تحسين تركيز الخلايا، ووقت تكوين الكرويات، وحالة الفلورة الذاتية الخضراء/الحمراء (الموضحة في الشكل التكميلي 3)، انتقلنا لاختبار ترانسدكشن AAV في الكرويات باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية وقارئ أطباق (يظهر مثال لتخطيط الطبق الخاص بمعايرة AAV في الشكل التكميلي 4). يوضح الشكل 3 بروتوكول الكرويات المُحسن والمطبق على أربعة خطوط خلوية مختلفة (HEK293T وHuh7 وHEP3B وHEPG2). وفي اليوم الثالث من تكوين الكرويات، تم إجراء الترانسدكشن للكرويات باستخدام ناقلين من AAV2 يحملان تصميمات متميزة لجينوم الناقل، وموسومين بـ GFP، بمضاعفات عدوى (MOIs) مختلفة. يمثل هذان التصميمان لجين AAV متغيرات GFP عالية الفعالية (scGFP) ومنخفضة الفعالية (ssGFP). وبمجرد إجراء الترانسدكشن للخلايا، وُضعت الأطباق في نظام تصوير الخلايا الحية للمراقبة الآنية لترانسدكشن AAV. وعند نقطة زمنية تبلغ 72 h، تم الكشف عن شدة الفلورة الخضراء باستخدام برنامج تصوير الخلايا الحية. في الشكل 3، تمثل الخطوط الزرقاء جينومات sc-GFP، بينما تمثل الخطوط الحمراء جينومات ss-GFP. أظهرت الكرويات قابلية عالية لترانسدكشن AAV، حيث تم الكشف عن ترانسدكشن قوي عند عيارات AAV منخفضة للغاية وعبر خطوط خلوية مختلفة لـ scGFP. تظهر مقاطع فيديو تمثيلية لترانسدكشن AAV في خطوط خلوية وMOIs مختلفة، تم التقاطها في الوقت الفعلي، في المقطع التكميلي 1، والمقطع التكميلي 2، والمقطع التكميلي 3، والمقطع التكميلي 4، والمقطع التكميلي 5، والمقطع التكميلي 6. من ناحية أخرى، لوحظ ترانسدكشن AAV لـ ssGFP في الكرويات بمستويات أدنى، وهو ما يعيد إنتاج الترانسدكشن الأضعف/الأبطأ المتوقع لهذا النوع من العناصر التنظيمية20,21. وهذا يثبت فائدة الكرويات ثلاثية الأبعاد (3D) لعمليات ترانسدكشن AAV القوية والضعيفة، وكذلك للتمييز بين الجينات القوية في الترانسدكشن، مثل sc-GFP، والجينات الأقل فعالية، مثل ss-GFP. وقد لاحظنا فرقاً بمقدار 100 ضعف في الفلورة النسبية بين الجينات المنقولة sc وss عند MOI قدره 106 في خلايا HEK293T، وفرقاً بمقدار 3 أضعاف في الخطوط الخلوية التي يصعب إجراء الترانسدكشن لها، مثل HEP3B.

انتقلنا بعد ذلك لاختبار ترنسدكشن (transduction) فيروس AAV من أنماط مصلية مختلفة بطريقة تعتمد على الجرعة في كل من كرويات HEK293T وكرويات Huh7. وكما هو موضح في الشكل 4، كانت الكرويات ثلاثية الأبعاد قابلة لعمليات ترنسدكشن بواسطة AAV-scGFP لأربعة أنماط مصلية مختلفة. وبعد 72 h من الترنسدكشن، تم قياس scGFP باستخدام قارئ أطباق فلوري (الشكل 4A،B) وبرنامج تصوير الخلايا الحية (الشكل 4C،D). وقد تم الكشف بنجاح عن جميع الأنماط المصلية الأربعة باستخدام هذين الجهازين. وأظهر نظام تصوير الخلايا الحية نطاقاً أعلى بين الإشارة والضوضاء مقارنة بقارئ الأطباق الفلوري، على الرغم من أن الإشارة الموحدة لم تظهر فروقاً ذات دلالة إحصائية. ووجدنا أن AAV2 امتلك أقوى كفاءة ترنسدكشن في كلا الخطين الخلويين، يليه AAV1، بينما أظهر AAV5 وAAV9 ترنسدكشن أقل بكثير.

بعد ذلك، قمنا بتقييم نقل الجينات عن طريق التألق الحيوي باستخدام بروتوكول الكريات (spheroid protocol). ولاختبار ذلك، تم تنمية خلايا HeLa في شكل كريات ثلاثية الأبعاد وفقاً للبروتوكول المُحسّن الموصوف هنا. وفي اليوم الثالث، تم نقل 5 أنماط مصلية مختلفة من الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) تشفر جيناً مراسلاً للـ nano luciferase إلى كريات HeLa. وبعد 72 ساعة من نقل AAV، عولجت الخلايا بركيزة Live Cell وحُضنت لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تم قياس التألق الحيوي وتصويره باستخدام نظام تصوير التألق الحيوي (الشكل 5A). وقد لوحظ نقل فعال لجميع الأنماط المصلية لـ AAV باستخدام هذا النظام. كما لوحظ تمييز دقيق بين كفاءة نقل الأنماط المصلية المختلفة لـ AAV، مما يشير إلى أن البروتوكول لا يقتصر على قراءات الفلورة. وبالتوافق مع الاتجاهات الملحوظة في الشكل 5، أظهر نقل AAV-nano luciferase في خلايا HeLa أن AAV2 هو النمط المصلي الأكثر قوة، كما لوحظ مع ناقلات AAV-GFP. وبالمثل، لوحظت أدنى كفاءة نقل للنمط المصلي AAV9، كما أظهرت كل من ناقلات الفلورة والتألق الحيوي (الشكل 4 و 5). ويظهر في الشكل 5B صورة نموذجية لنقل AAV-nano luciferase.

بالإضافة إلى كثافة التنقل الجيني، تتيح بروتوكولات الكريات ثلاثية الأبعاد (3D spheroid) المراقبة الحركية للتنقل الجيني. يوضح الشكل 6 نتائج تمثيلية لحركية تنقل AAV2-scGFP و AAV2-ssGFP في كريات HEK293T ثلاثية الأبعاد، عند التنقل بمضاعفات عدوى (MOIs) مختلفة (0-106) (الشكل 6A-G). وقد وجدنا أن تنقل AAV2-scGFP يمكن اكتشافه عند MOIs منخفضة تصل إلى 101، مع إمكانية اكتشاف زيادة في إشارة GFP بعد حوالي 34 h مقارنة بالخلايا غير المعالجة، وذلك باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية. وكانت إشارة AAV2-ssGFP أضعف وأبطأ بكثير من إشارة AAV2scGFP. ولمزيد من المقارنة بين سرعة التنقل، قمنا بحساب وقت البدء عندما تصبح إشارة GFP قابلة للاكتشاف. ولاحظنا أن scGFP أسرع بـ 4 مرات في المتوسط من ssGFP في نقل الجينات إلى الخلايا. وردت أوقات البدء الفردية في الجدول 1. وتظهر هذه القياسات الحركية جانباً إضافياً من كفاءة التنقل الجيني مفيداً في تحسين المقايسة.

مخطط سير عمل زراعة الخلايا؛ تكوين الكريات، والترنسدكشن، والتحليل باستخدام IncuCyte.
الشكل 1: نظرة عامة على عمليات الترنسدكشن بواسطة AAV باستخدام المزارع ثلاثية الأبعاد (3D). (أ) يتم تكثير الخلايا في زراعة ثنائية الأبعاد (2D) ثم تُزرع في أطباق ذات التصاق فائق الانخفاض (ULA) لتكوين الكريات. (ب) تُوضع الأطباق في جهاز الطرد المركزي لتعزيز التجميع، ثم تُنقل إلى (ج) نظام IncuCyte S3 للمراقبة الفورية لتكوين الكريات. (د) في اليوم الثالث، يتم إجراء الترنسدكشن للكريات باستخدام AAV بمستويات MOIs متفاوتة. (هـ) يتم تتبع حركية الترنسدكشن بشكل طولي باستخدام تصوير الخلايا الحية، و (و) يمكن إجراء تحليل نهائي باستخدام قراءات الفلورة أو التألق الحيوي القائمة على الأطباق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. 

مقارنة بين الكريات الخلوية المستزرعة؛ صورة مجهرية لستة خطوط خلوية مختلفة في إعداد التجربة.
الشكل 2: التوصيف المورفولوجي للكريات عبر خطوط خلوية متعددة. تظهر الصور التمثيلية للكريات الناتجة من خلايا HEP3B وHEK293T وA375 وHeLa وHEPG2 وHuh7 تباينًا في الحجم والمورفولوجيا والتماسك، مع توفير إمكانية تكرار عالية عبر المكررات (شريط المقياس، 50 µm). تم استزراع جميع الخطوط الخلوية بكثافة 1 x 104 cells/well لمدة 3 أيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل التعبير الجيني في الخلايا المحددة بـ GFP؛ تعددية العدوى (MOI) مقابل الفلورة، خطوط خلوية متعددة، رسم بياني، صور.
الشكل 3: مقارنة كفاءة ترنسدكشن AAV بين النواقل ذاتية التكامل (scGFP) والنواقل أحادية السلسلة (ssGFP) عبر خطوط خلوية مختلفة. تم تجميع كرويات ثلاثية الأبعاد (3D spheroids) من (A>) HEK293T، و(B>) Huh7، و(C>) HEP3B، و(D>) HEPG2 ذاتياً، ثم تم إجراء الترنسدكشن لها باستخدام قيم MOI مختلفة من AAV2-scGFP (باللون الأزرق) وAAV2-ssGFP (باللون الأحمر). تم قياس كثافة الفلورة الخضراء الكلية بعد 72 h من الترنسدكشن. الصور الممثلة للكرويات المعالجة بأعلى MOI لكل AAV تم التقاطها عند النقطة الزمنية 72 h باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية. تمثل أشرطة المقياس 200 µm. تمثل أشرطة الخطأ SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رسوم بيانية لشدة الفلورة لأنماط AAV المصلية في خلايا HEK293T وHuh7؛ MOI، ومتغير الوقت.
الشكل 4: تُميز عملية ترانسدكشن AAV في الكريات ثلاثية الأبعاد نشاط الأنماط المصلية المختلفة لـ AAV. تم إجراء ترانسدكشن لكريات ثلاثية الأبعاد من (A,C>) HEK293T و(B,D>) Huh7 باستخدام AAV1 وAAV2 وAAV5 وAAV9، وجين scGFP المنقول عبر مجموعة من قيم MOIs. تم قياس وحدات شدة الفلورة عند 72 h باستخدام قارئ أطباق يعتمد على الفلورة (A,B>) ونظام تصوير الخلايا الحية (C,D>). تمثل أشرطة الخطأ SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رسم بياني وخريطة حرارية لكفاءة ترنسدكشن AAV؛ تعدد العدوى (MOI) مقابل التدفق الكلي؛ تحليل الناقل الفيروسي.
الشكل 5: ترنسدكشن AAV في كرويات ثلاثية الأبعاد مع مراسلين لومينيسنتيين. تم إجراء ترنسدكشن لكرويات HeLa باستخدام AAV1 وAAV2 وAAV5 وAAV8 وAAV9 التي تشفر جين مراسل نانولوسيفيريز عند مستويات MOIs متزايدة. تم تصوير وقياس اللومينيسينس باستخدام قراءة نقطة النهاية (Endpoint readout) بواسطة نظام تصوير اللومينيسينس بعد 72 ساعة من الترنسدكشن. (أ) قيم التدفق الكلي (Total Flux). (ب) قراءة نقطية النهاية تمثيلية مع صور لومينيسينس لأطباق الكرويات توضح توزيع الإشارة عبر مستويات MOIs والأنماط المصلية. تم تشغيل كل ناقل AAV في مكررين أفقيين. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل التعبير الجيني؛ رسوم بيانية لـ MOI مقابل الوقت؛ شدة فلورية sgGFP؛ النتائج التجريبية.
الشكل 6: تقييم حركية ترنسدكشن في الكريات ثلاثية الأبعاد (3D Spheroids). تم إجراء ترنسدكشن لكريات HEK293T باستخدام AAV2-scGFP (باللون الأزرق) وAAV2-ssGFP (باللون الأحمر) عبر نطاق مكون من 7 قيم لـ MOI (A–G). وتم قياس إجمالي الشدة الخضراء على مدار فترة 72 h، بفواصل زمنية قدرها 6 h، باستخدام نظام Monitor spheroid formation/growth. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تعددية العدوىscGFP (ساعات)ssGFP (ساعات)
1>٧٢ ساعة>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

الجدول 1: وقت بدء اكتشاف GFP.

الشكل التكميلي 1: مخطط الطبق لمعايرة الكريات. (A) مخطط تمثيلي للطبق يوضح نظام التخفيف لكريات HEK293T و Huh7 و HEP3B و HEPG2، والتي تم إنشاؤها من كثافات استزراع أولية تتراوح من 10,000 إلى 78 خلية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تكوين الكريات عبر مجموعة من كثافات الاستزراع. صور مجهرية تمثيلية لكريات HEK293T و Huh7 تم إنتاجها من كثافات استزراع أولية تتراوح بين 10,000 إلى 78 خلية في اليوم 3. يمثل شريط المقياس 50 µm.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: معلومات خطوط الخلايا لتكوين الكريات ثلاثية الأبعاد (3D Spheroid).يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: مخطط توزيع الطبق للتخفيفات التسلسلية لـ AAV. (A) مخطط توزيع نموذجي للطبق يوضح نظام التخفيف التسلسلي لـ AAV المستخدم لـ AAV1 وAAV2 وAAV5 وAAV9، بدءاً من MOI قدره 106. تظهر مجموعة التحكم السالبة في الصف H، والتي تمثل الكريات التي لم يتم معالجتها.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 1: تصوير حي ومباشر في الوقت الحقيقي لعملية ترنسدكشن AAV2-scGFP في كرويات HEK293T عند MOI 106.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 2: تصوير حي للخلايا في الوقت الحقيقي لعملية ترانسدكشن AAV2-scGFP في كرويات Huh7 عند MOI 106.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 3: تصوير حي للخلايا في الوقت الحقيقي لعملية ترانسدكشن AAV2-scGFP في كرويات HEP3B عند MOI 106.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 4: تصوير حي ومباشر في الوقت الحقيقي لعملية ترنسدكشن AAV2-scGFP في كرويات HEK293T عند MOI 106، كجزء من دراسة حول الاعتماد على الجرعة.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 5: تصوير حي للخلايا في الوقت الحقيقي لعملية ترانسدكشن AAV2-scGFP في كرويات HEK293T عند MOI 104.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 6: تصوير حي للخلايا في الوقت الفعلي لعملية تحول AAV2-scGFP في كرويات HEK293T عند MOI 101.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: حساب تعددية العدوى (MOI) اللازمة لنقل AAV.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

نقدم هنا منصة in vitro ثلاثية الأبعاد مبسطة لتطوير ناقلات AAV واختبار فعاليتها. تعتمد هذه المنصة على تعزيز عملية ترنسدكشن (transduction)، وحساسية عالية، وقدرة تنبؤية انتقالية أفضل باستخدام زراعة خلوية ثلاثية الأبعاد تحاكي بنية الأنسجة البشرية بشكل أوثق. وقد نجح هذا النظام في التمييز بين كفاءة الترنسدكشن عبر الأنماط المصلية لـ AAV والعناصر التنظيمية، بما في ذلك الناقلات أحادية السلسلة والناقلات ذاتية التكامل، في خطوط خلوية متعددة. ونشير إلى أنه، على عكس المقايسات التقليدية ثنائية الأبعاد، حيث تُعرَّف كفاءة الترنسدكشن غالباً على أنها النسبة المئوية للخلايا الموجبة للجين المنقول، فإن نظام الكريات ثلاثي الأبعاد لا يسمح بسهولة بالقياس الكمي بدقة الخلية الواحدة. بناءً على ذلك، تُعرَّف كفاءة الترنسدكشن في هذه الدراسة على أنها شدة إشارة المراسل الإجمالية (الفلورية أو اللومينية)، والتي تعكس المساهمات المشتركة لنسبة الخلايا التي خضعت للترنسدكشن ومستوى تعبير الجين المنقول في كل خلية. وتؤدي الحساسية العالية للكريات إلى تقليل الحاجة إلى كميات كبيرة من المنتج بشكل كبير، مما يجعلها فعالة من حيث التكلفة، ومتعددة الاستخدامات، وذات صلة فسيولوجية بأبحاث وتطوير AAV.

يعالج هذا النهج التحديات الرئيسية المرتبطة بمقايسات المزارع الخلوية التقليدية ثنائية الأبعاد (2D)، والتي تعتمد على الالتصاق بأسطح اصطناعية وتفتقر إلى التنظيم الخلوي، مما قد يؤدي إلى تنبؤات ضعيفة بأداء الناقل في السياقات السريرية. ويحاكي نظام الكريات ثلاثي الأبعاد (3D spheroid system) بنية الأنسجة وأنماط توزيع الدواء بشكل أفضل، مما يوفر بيانات حول سلوك الناقل تتطابق بشكل أوثق مع الظروف البيولوجية الحقيقية22,23. يستخدم البروتوكول أطباقاً بسيطة ذات قدرة فائقة على منع الالتصاق، مما يجعل من السهل تكرار العملية في المختبرات القياسية.

يمكن استخدام هذا النظام القابل للتكيف في اختبارات تحييد AAV، ودراسة اختراق AAV، وتطوير تجارب زراعة مشتركة أكثر تعقيداً لبحث تأثيرات البيئات الخلوية المختلفة على ترانسدكشن AAV. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لمنصات فحص العقاقير والنواقل عالية الإنتاجية أن تتكامل بسهولة مع منصة الكريات (spheroid platform)، مما يتيح الأتمتة وخفض التكاليف في سير عمل اكتشاف النواقل لتطوير منتجات أكثر استهدافاً.

تتمثل الميزة العملية الرئيسية للكريات الخلوية في قدرتها على النمو المستمر لأسابيع دون الحاجة إلى تمرير الخلايا، مما يتيح إجراء دراسات ممتدة لنشاط AAV. يحافظ نظام الزرع المستقر هذا على التفاعلات الهامة بين الخلايا ومكونات المصفوفة، متجنباً بذلك الانقطاعات الناتجة عن عمليات حصاد الخلايا المتكررة المطلوبة في المزارع ثنائية الأبعاد24. كما تدعم البيئة الخلوية المحفوظة التنظيم الطبيعي للبروتينات وبنى الأغشية التي تُعد ضرورية لتقييم ارتباط AAV ودخوله إلى الخلايا25.

على الرغم من أن الكريات ثلاثية الأبعاد (3D spheroids) تظهر إمكانات كبيرة لتقييمات ترنسدكشن AAV، إلا أنها تعاني أيضاً من بعض القصور الانتقالي مقارنة بنماذج in vivo ، ويرجع ذلك أساساً إلى هيكلها المبسط مقارنة بالأنسجة الأصلية. تفتقر الكريات إلى المكونات الفسيولوجية الحرجة، بما في ذلك الأوعية الدموية لتوصيل الناقل، والخلايا المناعية لتقييم الاستمناع، والحواجز النوعية للأنسجة مثل الحاجز الدموي الدماغي، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على أداء AAV26. وتشير هذه المحدوديات إلى أن الكريات، رغم توفيرها مستوى متوسطاً من التعقيد بين المزارع التقليدية ثنائية الأبعاد ونماذج الحيوانات in vivo، تظل غير كافية لمحاكاة البيئة المجهرية الفسيولوجية المطلوبة للتقييم الشامل لـ AAV بشكل كامل.

يصف بروتوكول الكريات (spheroid) المعروض هنا نوعاً واحداً من الخلايا في المرة الواحدة. ويمكن تطوير هذا البروتوكول ليشمل 2-3 أنواع إضافية من الخلايا التي تتجمع في بنية أساسية ثلاثية الأبعاد. أما النماذج ثلاثية الأبعاد الأكثر تعقيداً، مثل العضوانيات (organoids) أو الأنظمة الموائعية الدقيقة (microfluidics)، فهي أنظمة متعددة الخلايا تحاكي التنوع الخلوي والتنظيم الخاص بأعضاء معينة، وتحتوي على 10 أنواع متميزة من الخلايا أو أكثر مرتبة في أنماط تشبه الأنسجة. ويمكن أن تشمل هذه العضوانيات ثلاثية الأبعاد المتقدمة خلايا متعددة27، ومستنبتات مدمجة في هيدروجيل، وتقنيات القطرة المعلقة، ومنصات الموائعية الدقيقة11,27,28. وبينما توفر هذه الطرق بنية نسيجية أكثر تعقيداً قد تساعد في تعميق فهمنا لبيولوجيا AAV، إلا أنها تميل إلى تطلب كواشف ومعدات أكثر تخصصاً وخبرة فنية كبيرة. ومن ناحية أخرى، فإن الكريات ثلاثية الأبعاد التي تتشكل في أطباق ذات التزام فائق الانخفاض (ultra-low attachment plates) تكون أبسط بكثير ومناسبة للعديد من المختبرات نظراً لفعاليتها من حيث التكلفة وقابليتها للتكرار.

تشمل الخطوات الحاسمة للتنفيذ الناجح لهذا البروتوكول الحفاظ على حيوية عالية للخلايا، حيث إن الخلايا المتضررة يمكن أن تعيق تكوين الكريات (spheroids) وكفاءة ترنسدكشن (transduction). كما يعد استخدام أطباق ذات التصاق فائق الانخفاض وتحسين عملية الطرد المركزي أمرين حاسمين لتحقيق تماسك الكريات. ومن الضروري أيضاً تحسين تعددية العدوى (MOI) لكل نوع من الخلايا وكل نمط مصلي لـ AAV لتجنب الإشارات الضعيفة أو التشبع. ويعد اختيار طريقة الكشف المناسبة أمراً حاسماً أيضاً، لا سيما في التحليلات الحركية، حيث يتطلب الأمر التوافق مع أنظمة تصوير الخلايا الحية المستمرة. هناك العديد من الاعتبارات التقنية المهمة للتفسير الدقيق لترنسدكشن AAV في الكريات ثلاثية الأبعاد.

قد تكون إشارة التنصيب (transduction) ضعيفة أو غائبة نتيجة انخفاض عيار الفيروس، أو عدم ملاءمة تعددية العدوى (MOI)، أو عدم كفاية وقت الحضن؛ ويمكن معالجة ذلك من خلال التحقق من عيارات الفيروس، وتحسين MOI، وتمديد وقت الحضن (عادةً من 3–5 أيام). قد تعكس إشارات الفلورة أو التلألؤ الضعيفة انخفاضاً في تعبير الجين المنقول أو محدودية تغلغل الكواشف داخل البنية ثلاثية الأبعاد، وهو ما يمكن تحسينه من خلال تحسين إعدادات التعريض أو إتاحة وقت إضافي لانتشار الركيزة. ويتمثل التحدي الرئيسي في بعض الخطوط الخلوية، مثل خلايا HeLa، في الفلورة الذاتية (autofluorescence)، والتي يمكن أن تؤدي إلى إشارة خلفية عالية وانخفاض الحساسية في المقاييس القائمة على الفلورة. ولمعالجة هذا القصور، قمنا بتطبيق نظام مراسل نانولوسيفيراز (nanoluciferase) قائم على التلألؤ، والذي يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء محسنة ويتيح كشفاً أكثر دقة للتنصيب في الخلفيات ذات الفلورة الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، قد تنشأ إشارة الخلفية من تحديد عتبة غير مناسب أو الفلورة المرتبطة بالوسط، ويجب ضبط ذلك باستخدام آبار غير معالجة (MOI = 0) لتحديد مستويات خط الأساس. وأخيراً، قد يحدث تشبع في الإشارة عند قيم MOI العالية بسبب الإدخال الفيروسي المفرط أو قيود الكاشف؛ ويمكن التخفيف من ذلك عن طريق تقليل نطاق MOI وتحسين إعدادات تعريض الكاشف للحفاظ على القياسات ضمن النطاق الديناميكي الخطي.

بشكل عام، توفر منهجية الكريات ثلاثية الأبعاد هذه نظاماً مبسطاً وقابلاً للتكرار لتقييم ترنسدكشن AAV وقوته وحركيته. ومن خلال سد الفجوة بين المقايسات التقليدية ثنائية الأبعاد والدراسات in vivo، فإنها تتيح تطويراً أكثر دقة للنواقل وتدعم التقدم في استراتيجيات العلاج الجيني ذات الصلة سريرياً.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

يتوجه المؤلفون بالشكر إلى Morten Seirup و Trish Hoang لتوفير البلازميد الخاص بإنتاج AAV nanoluciferase وكواشف الركيزة الحية. تم دعم هذا المشروع من خلال تعيين في برنامج ORISE للمشاركة البحثية في CBER، التابعة لإدارة الغذاء والدواء الأمريكية، والذي يديره معهد أوك ريدج للعلوم والتعليم بموجب اتفاقية بين الوكالات بين وزارة الطاقة الأمريكية وإدارة الغذاء والدواء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حضانة 37CThermoFisher Scientific#51025983ظروف الزرع القياسية
خلايا A375ATCCCRL-1619خط خلوي
بلازميد AAV1Addgene112862بلازميد AAV
بلازميد AAV2Addgene104963بلازميد AAV
بلازميد AAV5Addgene104964بلازميد AAV
بلازميد AAV8Addgene112864بلازميد AAV
بلازميد AAV9Addgene112865بلازميد AAV
قارئ الأطباق BioTek GEN5Agilent TechnologiesNAقراءة نهائية للتفلور أو التلألؤ الحيوي
جهاز طرد مركزيThermoFisher Scientific#TSO-MX1Rالحفاظ على معلق الكريات
محلول ملحي منظم بالفوسفات لزراعة الخلايا Corning™ (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXمحلول PBS لشطف الخلايا
وسط DMEM عالي الجلوكوز، مكمل GlutaMAX، بيروفاتThermoFisher Scientific#10569010وسط نمو كامل
مثبط NanoLuc خارج الخلوي PromegaN235Bيخمد أي إشارة Nanoluc® قادمة من البيئة خارج الخلوية  
مصل جنين البقر (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLتوفير عوامل النمو
خلايا HEK293TATCCCRL-3216خط خلوي
خلايا HeLaATCCCRM-CCL-2خط خلوي
خلايا HEP3BATCCHB-8064خط خلوي
خلايا HEPG2ATCCHB-8065خط خلوي
خلايا Huh7ABMT8973خط خلوي
مجهر مقلوب IncuCyte S3SartoriusNAمراقبة تكوين/نمو الكريات
جهاز تصوير IVIS SpectrumSpectralinvivoNAقراءة نهائية للتلألؤ الحيوي
مقايسة Nano-Glo® للخلايا الحية PromegaN2013كاشف مادة ركيزة متلألئة للكشف عن الخلايا الحية
بنسلين-ستربتومايسين (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122منع التلوث البكتيري
دوارق زراعة أنسجة T75 ذات تهويةFisher Scientific#NC0509296 دوارق لنمو الخلايا
تريبسين-EDTA (0.05%)ThermoFisher Scientific#25300120الفصل الإنزيمي للخلايا
أطباق فائقة انخفاض الالتصاقCorning#7007منع التصاق الخلايا لتعزيز تكوين الكريات

المراجع

  1. Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.
  2. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.
  3. Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.
  4. Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.
  5. Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.
  6. Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/
  7. Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products
  8. Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.
  9. Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.
  10. Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.
  11. Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.
  12. Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.
  13. Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.
  14. Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.
  15. Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.
  16. Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.
  17. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.
  18. McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.
  19. Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.
  20. Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.
  21. Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.
  22. El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.
  23. Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.
  24. Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.
  25. Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.
  26. Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.
  27. Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.
  28. Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.