Method Article

عزل وتوصيف الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من وسادات الدهون تحت الرضفة لدى مرضى التهاب المفاصل العظمي

DOI:

10.3791/70518

⸱

April 3rd, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, the First Hospital of Hebei Medical University, 2Department of Orthopedic Surgery, Hebei Medical University Third Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الملخص: يقدم هذا البروتوكول سير عمل موحد لعزل وتوصيف الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) من أنسجة وسادات الدهون تحت الرضفية لدى مرضى التهاب المفاصل العظمي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل الحويصلات خارج الخلية (EVs)، وخاصة الحويصلات خارج الخلية الصغيرة (sEVs) المعرفة بأنها حويصلات أصغر من 200 نانومتر، كوسيسات أساسية للتواصل بين الخلايا وتطلقها تقريبا جميع أنواع الخلايا إلى سوائل بيولوجية مختلفة. يرتبط وسادة الدهون تحت الرضفة (IPFP) ارتباطا وثيقا بتطور وتقدم التهاب المفاصل العظمي في الركبة. ومع ذلك، لا تزال الطرق الموحدة لعزل المركبات الكهربائية الكهربائية مباشرة من مخارج IPFP محدودة. نقدم بروتوكولا قابلا للتكرار لعزل وتوصيف ال sEVs المستمدة من أنسجة IPFP التي تم الحصول عليها من مرضى التهاب الفصول الدهنية. يتم تنظيف الوسط المكيف المجمع من زراعة الأنسجة IPFP من الخلايا والحطام بشكل تسلسلي بواسطة الطرد المركزي منخفض السرعة، يتبعه الطرد المركزي الفائق لإثراء الحويصلات ضمن نطاق حجم ال sEV. يتم توصيف الحويصلات الناتجة بناء على معلومات قليلة لدراسات توصيات الحويصلات خارج الخلية (MISEV2023) باستخدام مجموعة من علامات البروتين الممثلة عبر فئات وظيفية مختلفة: CD63 كمادة رباعية الأغشية المرتبطة، ALIX وTSG101 كبروتينات سيتوسولية تشارك في التكوين الحيوي بواسطة آلية مركب الفرز الداخلي المطلوب للنقل (ESCRT)، وكالنيكسين كبروتين مقيم في الشبكة الإندوبلازمية لمراقبة الإمكانات التلوث غير الحويصلي. ينتج هذا السير في هذا السير تحضيرات محددة جيدا للطاقة الكهربائية الكهربائية مناسبة للتطبيقات اللاحقة مثل الاختبارات الوظيفية أو التحليل البروتيومي في أبحاث التهاب المفاصل العظمي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية الصغيرة (sEVs) هي نوع فرعي غير متجانس من الحويصلات خارج الخلية، ووفقا للتصنيف التشغيلي المقترح من الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV) في الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية (MISEV2023)، تعرف على أنها حويصلات عادة أصغر من 200 نانومتر في القطر1. يتم إطلاق ال sEVs من جميع أنواع الخلايا تقريبا إلى سوائل بيولوجية وقد جذبت اهتماما متزايدا بسبب دورها الأساسي كوسيط للتواصل بين الخلايا في كل من السياقات الفسيولوجية والمرضية2،3.

غشاء ال sEVs مغذي بعدة بروتينات وظيفية. من بينها، ترتتراسبانين مثل CD63 مرتبطة بتنظيم غشاء الحويصلات والاندماج4. علاوة على ذلك، تعد البروتينات السيتوسولية المرتبطة بمركب الفرز الداخلي المطلوب للنقل (ESCRT)، مثل ALIX وTSG101، جزءا أساسيا من تكوين وفراز sEV. وبالتالي، فهي تعمل كعلامات موثوقة لتأكيد أصل الحويصلات المعزولة من الإندوسوم.

تم التعرف على وسادة الدهون تحت الرضفة (IPFP) كنسيج نشط مرتبط بالمفاصل مرتبط ارتباطا وثيقا ببدء وتقدم التهاب المفاصل العظمي (OA)7,8. في الظروف الالتهابية والتنكسية، يفترض أن ال sEVs المشتقة من IPFP تحمل وسطاء التهابيين وإشارات مرضية، مما يساهم في الالتهاب الزليلي وتدهور الغضروف9. لذا فإن توصيف ال sEVs التي تطلقها أنسجة IPFP من مرضى التهاب المفاصل الدهسي قد يوفر رؤى حاسمة حول شبكات الاتصال بين الخلايا المرتبطة بالمرض.

نظرا للاهتمام المتزايد بوحدات العزل الجزيئية العالية والنقاوة والقابلة للتكرار أمر ضروري. على الرغم من أن الطرد المركزي الفائق التفاضلي لا يزال من أكثر استراتيجيات التنقية استخداما،إلا أن البروتوكولات المحسنة للمواد الفائقة أو السوائل الحيوية لزراعة الخلايا قد لا تكون قابلة للتطبيق مباشرة على الأنسجة المشتقة من الدهون الصلبة مثل IPFP. يمكن أن تؤثر نسبة الدهون العالية، والمصفوفة خارج الخلايا الكثيفة، وظروف الهضم الإنزيمية المتغيرة على تعافي الحويصلات ونقائها.

يوفر زراعة إزالة الأنسجة نهجا فسيولوجيا ذا صلة يحافظ على البنية الخلوية الأصلية والتفاعلات بين الخلايا مع الخلية مع تقليل الاضطراب الإنزيمي المفرط، مما يمكن من جمع ال sEVs المنبعثة في ظروف شبه أصلية. ومع ذلك، فإن هناك حاليا غياب إلى سير عمل موحد مخصص لعزل المركبات الكهربائية الكهربائية عن مزارع IPFP خارج النباتات.

هنا، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل وتوصيف الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من مزارع إزالة الدهون تحت الرضفة لمرضى التهاب المفاصل العظمي باستخدام الطرد المركزي الخارجي التفريقي، مما يوفر إطارا منهجيا قابلا للتكرار للدراسات الوظيفية والانتقالية في المرحلة اللاحقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على استخدام أنسجة IPFP من مرضى التهاب المفاصل العظمي في هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول لجامعة خبي الطبية (رقم الموافقة) [2024] 018). تم جمع العينات خلال الفترة المعتمدة، وتم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من جميع المشاركين قبل جمع الأنسجة.

1. تحضير الوسط والمذاليع

  1. جهز 500 مل من وسط DMEM/F12 الكامل الخالي من الإكسوسومات عن طريق خلط 445 مل من وسط DMEM/F12 القاعدي، و50 مل من مصل الأبقار الجنيني الخالي من الإكسوسومات (10٪)، و5 مل من البنسلين/ستريبتومايسين/الأمفوتريسين B (100 U/mL، 100 ميكروغرام/مل، و0.25 ميكروغرام/مل، على التوالي). التعقيم بالفلتر باستخدام فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر.
  2. جهز محلول تشغيل ويسترن بلوت عن طريق خلط 950 مل من الماء المقطر (dH2O) مع 50 مل من محلول التدفق 20x (Tris/MOPS/SDS).
  3. تحضير مخزن نقل البقعة الغربية عن طريق خلط 800 مل من dH2O مع 100 مل من مخزن النقل 10x و100 مل من الإيثانول المطلق.
    ملاحظة: تم تحسين هذا المخزن السريع للنقل الرطب عالي التيار (400 مللي أمبير) عند درجة حرارة الغرفة. نظرا لانخفاض توليدها الحراري، لا يلزم استخدام حمام ثلج لفترات النقل التي تقل عن 45 دقيقة، وقد ثبت أن ذلك يحافظ على كفاءة نقل عالية للبروتينات ضمن نطاق 10–250 كيلو دالتون.
    تحذير: الإيثانول المطلق قابل للاشتعال. تعامل في مكان جيد التهوية وابتعد عن مصادر الحرارة.
  4. جهز مخزن الغسيل بخلط 50 مل من 20 × TBS (200 mM Tris و3 M NaCl عند pH 7.5–7.6) و2 مل Tween-20 مع 950 مل من dH2O.
  5. تحضير محلول عمل كيميائي مضيء عن طريق خلط كميات متساوية من محلول اللومينول/المحسن ومخزن بيروكسيد (حوالي 0.1 مل من محلول العمل مطلوب لكل سنتيمتر مربع من الغشاء).
    تحذير: الركائز الكيميائية المضيئة قد تكون مهيجة. ارتد قفازات وحماية للعين. التخلص من النفايات الكيميائية وفقا للوائح المؤسسات المحلية.

2. تحضير أنسجة IPFP وجمع الوسط المكيف

  1. اغسل أنسجة IPFP الطازجة (حوالي 10 جرام) ثلاث مرات مع 50 مل من PBS المبرد مسبقا في كل غسلة، عن طريق تحريك يدوي لطيف في أنبوب الطرد المركزي لإزالة الدم المتبقي تماما.
  2. قم بتقطيع نسيج IPFP إلى قطع بحجم حوالي 2 مم × 2 مم × 2 مم باستخدام مقص معقم أو مشرط.
  3. انقل قطع نسيج IPFP إلى قوارير T175. أضف 50 مل من الوسط الكامل DMEM/F12 المستنفد من الإكسوسوم. حضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة مع تحريك خفيف.
  4. اجمع الوسط الكامل DMEM/F12 (أي الوسط المكيف) في أنابيب 50 مل على الجليد. قم بالتصفية عبر مصفاة بحجم 70 ميكرومتر لإزالة بقايا الأنسجة.

3. عزل المركبات الكهربائية الكهربائية باستخدام الطرد المركزي الخارجي التفاضلي

ملاحظة: قم بجميع الخطوات التالية عند 4 درجات مئوية أو على الجليد.

  1. الطرد المركزي الأولي منخفض السرعة لإزالة حطام الأنسجة
    1. قم بطرد مركزي في الوسط المكيف بحرارة 300 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الفائقة بعناية وانقلها إلى أنابيب طرد مركزي جديدة بسعة 50 مل.
    2. قم بطرد المركزي بالطرد الدائري عند 3000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الفائقة وانقلها إلى أنابيب جديدة، مع التأكد من عدم الإزعاج بالحبيبة.
  2. الطرد المركزي والترشيح المتوسط.
    1. قم بطرد المركزي بالطرد المركزي على حرارة 10,000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    2. اجمع المادة الفائقة وتصفيتها عبر فلتر تفريغ بحجم 0.22 ميكرومتر لإزالة الحويصلات الأكبر والملوثات.
  3. أول عملية الطرد المركزي الفائق: الحبيبات بتقنية ال sEV.
    1. انقل المادة الفائقة المفلترة إلى أنابيب طرد مركزي بولي كربونات بسعة 40 مل.
    2. يتم الطرد المركزي فوق الفائق للعينات عند 110,000 × جرام لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار بزاوية ثابتة (عامل k = 70). أزل الفائق بحذر باستخدام ماصة.
    3. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من PBS المعقم المبرد مسبقا والمبرد. قم بترشيح المحلول المعلق عبر مرشح حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر لضمان إزالة أي تجمعات متبقية.
  4. الطرد المركزي الفائق الثاني: تنقية المحركات الكهربائية
    1. قم بإعادة الطرد المركزي فوق الطرد الكهربائي للتعليق عند 110,000 × g لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام الدوار بزاوية ثابتة (عامل k = 70).
    2. تخلص من السوبرناتانت بحذر، واترك حبيبة sEV في أسفل الأنبوب. أعد تعليق الحبيبة النهائية للطاقة الكهربائية في 200 ميكرولتر من PBS المعقمة.
    3. قسم نظام تعليق التردد الكهربائي إلى 20 ميكرولتر لتجنب التلف الناتج عن دورات التجمد والذوبان المتكررة. خزن الأليكوات عند -80 درجة مئوية للاستخدام الطويل.

4. توصيف المركبات الكهربائية الفضائية بواسطة تحليل البقعة الغربية

  1. حضر عينات بروتين sEV.
    1. اخلط حبيبة sEV (من الخطوة 3.5.2) مع 80–120 ميكرولتر من مخزن تحليل RIPA مع مثبطات بروتيياز.
      ملاحظة: استهدف نسبة حوالي 1 ميكرولتر من مخزن RIPA لكل 0.5–1.0 ميكروغرام من البروتين المقدر. يوصى بتركيز نهائي للبروتين لا يقل عن 1.0 ميكروغرام/ميكرولتر لضمان فصل كهربائي فعال واكتشاف إشارة عالية الجودة أثناء تحليل البقعة الغربية.
      تحذير: يحتوي مخزن RIPA على مصارف ومهيجات. استخدم معدات الحماية الشخصية.
    2. قم بتدوير الخليط لفترة وجيزة وحضن العينات على الثلج لمدة 15–30 دقيقة مع هز لطيف.
      ملاحظة: الخلط الشامل في هذه المرحلة ضروري لتعطيل كامل للغشاء وإطلاق البروتين الأمثل. قد يؤدي عدم كفاية الدوامة إلى تحلل غير كامل وتركيزات بروتينية غير متسقة عبر النسخ.
    3. قم بطرد مركزي بالليزات عند 12,000–14,000 × g لمدة 10–15 دقيقة. اجمع السوبرناتانت بعناية.
    4. حدد تركيز البروتين الكلي لتحليل sEV باستخدام اختبار بروتين بحمض البيسينكونينيك عالي الحساسية (BCA).
      ملاحظة: يوصى بإجراء اختبار BCA عالي الحساسية مقارنة بالاختبار القياسي لعينات الحويصلات خارج الخلية بسبب نطاق الكشف المنخفض (0.5–20 ميكروغرام/مل)، مما يتيح قياسا دقيقا لتركيزات البروتين المنخفضة عادة التي يتم الحصول عليها من تحضيرات sEV المنقي. قم بإجراء الفحص وفقا لبروتوكول المجموعة.
  2. تحليل البقعة الغربية.
    1. اخلط عينات البروتين مع 5 مخازن تحميل عينات SDS-PAGE.
      ملاحظة: لاكتشاف CD63، جهز العينات باستخدام مخزن تحميل غير مخفض بقوة 5x (بدون β-ميركابتوإيثانول) وحضن عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تحافظ هذه الظروف على الحوابيت التكوينية وتمنع التجمع الناتج عن الحرارة لهذا البروتين التتراسبانيني. بالنسبة لمؤشرات أخرى، بما في ذلك ALIX (بروتين X المتفاعل مع ALG-2)، وTSG101 (جين حساسية الورم 101)، وكالنيكسين، حضر عينات باستخدام مخزن تحميل مخفض 5x يحتوي على 10٪ β-ميركابتوإيثانول وتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لضمان إزالة البروتين بالكامل.
    2. تحميل العينات المحضرة (عادة 20–40 ميكروغرام من البروتين الكلي) في جل تدرج مسبقا (4٪–12٪).
    3. قم بتحميل مؤشر وزن الجزيئي البروتيني في البئر المخصص وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    4. شغل الجل في المخزن المؤقت بجهد ثابت 100 فولت.
    5. استمر في التمرير لمدة 1–1.5 ساعة، أو حتى يصل صبغة التحميل إلى أسفل الجلام.
      ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل حسب نظام الرحلان الكهربائي ونسبة الجل.
    6. انقل البروتينات من الجل إلى أغشية PVDF باستخدام نظام نقل رطب عند 400 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قد تختلف مدة النقل حسب نوع مخزن النقل المستخدم.
    7. قم بحجب الأغشية في محلول حجب خال من البروتين معد في محلول ملحي مخزن ثلاثي يحتوي على 0.2٪ Tween-20 (TBS-T) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك خفيف. تم صياغة المحلول الحاجب بدون بروتينات المصل أو البيوتين أو البروتينات المفسفرة لتقليل الارتباط غير النوع والتداخل الخلفي.
    8. حضن الغشاء بأجسام مضادة أولية محددة مخففة في مخزن تخفيف أجسام مضادة خال من المصل يحتوي على مثبتات بروتينية وإضافات حافظة للأجسام المضادة عند 4 درجات مئوية طوال الليل (12–16 ساعة) مع تحريك لطيف.
    9. اغسل الأغشية في محلول غسيل (TBST يحتوي على 0.2٪ Tween-20) تحت تحريك خفيف على جهاز هزاز.
    10. حضن الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع تحريك لطيف.
    11. اغسل الأغشية مرة أخرى في حاجز الغسيل تحت تحريك خفيف على شاكر.
    12. تصور أحزمة البروتين باستخدام الركيزة الكيميائية المضيئة.
      تحذير: يمكن أن تكون الركائز الكيميائية المضيئة تهيج الجلد والعينين. ارتد قفازات مناسبة ونظارات أمان. التخلص من الركيزة وفقا لإرشادات النفايات الخطرة المؤسسية.

5. توصيف ال sEVs بواسطة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)

  1. شغل محلل تتبع الجسيمات النانوية ووحدة مضخة الحقنة حسب تعليمات الشركة المصنعة، ودع النظام يتوازن لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل القياس.
  2. قم بإذابة عينات EV بلطف على الجليد وتخفيف العينات في محلول ملحي معقم خال من الجسيمات الخالي من الجسيمات ومخزن الفوسفات (PBS) لتحقيق تركيز أمثل للجسيمات ضمن نطاق القياس الموصى به (حوالي 1 ×10 8 إلى 1 ×10 9 جسيمات/مل).
  3. قم بتحميل 1 مل من العينة المخففة في حقنة معقمة وحقن العينة ببطء في غرفة القياس، مع التأكد من عدم إدخال فقاعات هواء.
  4. اضبط مستوى الكاميرا والتركيز لرؤية الجسيمات الفردية التي تظهر حركة براونية بوضوح.
  5. سجل ثلاثة فيديوهات بمدة 60 ثانية لكل عينة تحت ظروف تدفق ثابت باستخدام مضخة الحقنة لضمان توزيع الجسيمات بشكل متسق.
  6. حلل الفيديوهات المسجلة باستخدام برنامج NTA مع عتبة الكشف مضبوطة على 12، وحجم الضبابية على تلقائي، وأقصى مسافة قفز مضبوطة على تلقائي.
  7. توليد توزيع حجم الجسيمات وملفات تركيزها باستخدام وظيفة التحليل الآلي للبرنامج.
  8. تصدير البيانات الخام، ورسوم توزيع حجم الجسيمات، وقياسات التركيز لمزيد من التحليل الإحصائي.
  9. نظف غرفة القياس جيدا بماء معقم خال من الجسيمات متبوعا بإيثانول بنسبة 70٪، ثم اغسله مرة أخرى بماء معقم خال من الجسيمات لمنع التلوث المتبادل بين العينات.

6. توصيف المركبات الكهربائية الكهربائية بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)

  1. استخدم شبكات نحاسية مطلية بالكربون مكونة من 200 شبكة. قم بتفريغ التوهج على الشبكات لمدة 30 ثانية باستخدام نظام تفريغ توهج، إذا كان متاحا.
  2. ضع 10 ميكرولتر من نظام تعليق الطاقة الكهربائية (معلق في نظام PBS معقم ومصفى) على الشبكة وحضن لمدة 2–5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. أزل السائل الزائد عن طريق لمس حافة الشبكة بلطف بورق التصفية.
  4. اغسل الشبكة بوضع السطح المحمل بالعينات بشكل متسلسل على ثلاث قطرات منفصلة من الماء فائق النقي.
  5. ضع 10 ميكرولتر من محلول حمض الفوسفوتونديك بنسبة 2٪ (pH 7.0) على الشبكة وحضن لمدة 1–2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: حمض الفوسفوتونغستيك هو مادة حمضية تآكلية قد تسبب تهيج للجلد والعينين والجهاز التنفسي. تعامل وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات وحماية العين. التخلص من النفايات الملطخة والمواد الملوثة وفقا لإجراءات النفايات الكيميائية الخطرة المعتمدة.
  6. أزل البقعة الزائدة باستخدام ورق التصفية ودع الشبكة تجف تماما في الهواء على درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 10 دقائق.
  7. فحص الشبكات باستخدام مجهر إلكتروني ناقل يعمل بجهد متسارع 80 كيلو فولت.
  8. احصل على صور تمثيلية بتكبيرات مناسبة لتقييم شكل الحويصلات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تأكيد العزل الناجح للحويصلات خارج الخلية الصغيرة (sEVs) من أنسجة وسادة الدهون تحت الرضفية البشرية (IPFP) من خلال التوصيف متعدد الوسائط.

كشف المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) أن الحويصلات المعزولة أظهرت شكلا على شكل كوب مميز مع أغشية ثنائية الطبقة الدهنية محددة بوضوح، متوافقة مع الخصائص الهيكلية للميكروفون الدهني (الشكل 1)11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول سير عمل قابل للتكرار وعمليا لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) عن أنسجة وسادة الدهون تحت الرضفية البشرية (IPFP) باستخدام زراعة الزرع الخارجي تليها الطرد المركزي الخارق الفضائي التفاضلي. تم التحقق من صحة الحويصلات المعزولة من خلال طرق توصيف تكميلية، بما في ذلك المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، وكشف النقطة الغربية لعلامات EV المثبتة1. أكد TEM وجود حويصلات مرتبطة بالغشاء ذات شكل مميز، وأظهر NTA توزيع حجم م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد أي من المؤلفين لديهم أي تضارب مصالح ليعلنوا عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (رقم المنح 2023YFC3604905)، ووزارة المالية في خبي (رقم المنح: ZF2024132 و ZF2024143)، وبرنامج الابتكار والتنمية للتعاون الطبي في هينغروي-خبي HR2002048

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنابيب الطرد المركزي PET بسعة 40 ملهيماك (إبندورف هيماك تكنولوجيز)5720411148البولي إيثيلين تيريفثالات، 26 × 90 مم
70 وميكرو؛ مصفاة الخلايا mتكنولوجيا بكين لانجيكي560049لإزالة حطام الأنسجة
الأجسام المضادة المضادة لأليكسشنغهاي أبويز للتكنولوجيا الحيويةCY7215مؤشر sEV الإيجابي
الأجسام المضادة المضادة للكالنيكسينشنغهاي أبويز للتكنولوجيا الحيويةCY5839العلامة السلبية (تلوث الطوارئ)
الأجسام المضادة المضادة ل CD63أفينيتي بيوساينسزDF2305علامة تيتراسبانين
الأجسام المضادة المضادة ل TSG101شنغهاي أبويز للتكنولوجيا الحيويةCY5985مؤشر sEV الإيجابي
مجموعة اختبار بروتين BCAشنغهاي يامي للتكنولوجيا الحيويةZJ102لقياس كمية البروتين
قارورة زراعة الخلايا (T175)تقنية NEST الحيوية560229لزراعة نبات IPFP
أنبوب الطرد المركزي (50 مل)بيوفيل560041للخطوات الأولية منخفضة السرعة
مصل الأبقار الجنيني المستنفد من الإكسوسوماتساياغين بيوساينسزFBSNE-01061لزراعة الأنسجة
HRP Goat ضد IgGشنغهاي أبويز للتكنولوجيا الحيويةAB0101الأجسام المضادة الثانوية للضمير الأبيض
مخزن تحميل البروتين الفوري (تغيير التعديل، تقليل التعديل، 5&00;)شنغهاي يامي للتكنولوجيا الحيويةLT101لإزالة الطبيعة البروتينية
مجموعة اختبار البروتين الدقيقة BCAثيرمو ساينتفيك23235لقياس كمية البروتين
وحدة فلتر Millex-GP (0.22 وميكرو؛ m)تكنولوجيا بكين لانجيكي560360معقم، لترشيح الحويصلات
محلل تتبع الجسيمات النانويةمالفرن بلانالياليكالنانوسايت NS300لتحليل الحجم والتركيز
مخزن النقل السريع الخالي من الجليد أومني-فلاششنغهاي يامي للتكنولوجيا الحيويةPS201Sلنقل بروتين ويسترن بلوت
حمض الفوسفوتونغستيك (2٪)سيغما-ألدرتشP4006بالنسبة للتلوين السلبي TEM
مخزن تحميل البروتين (تغيير التعيين، غير المخفض، 5&00;)شنغهاي يامي للتكنولوجيا الحيويةLT103لإزالة الطبيعة البروتينية
محلول حجب سريع خال من البروتين (5&00;)شنغهاي يامي للتكنولوجيا الحيويةPS108لحجب الأغشية
مخزن تحليل RIPAشركة بكين سولاربيو للعلوم والتكنولوجيا المحدودةR0010لاستخلاص بروتين sEV
TBS(20×)شركة بكين سولاربيو للعلوم والتكنولوجيا المحدودةT1080لتحضير مخزن الغسيل
المجهر الإلكتروني الناقلهيتاشيHT7800للتوصيف الشكلي
مخزن الرحلان الكهربائي Tris/MOPS/SDSشنغهاي يامي للتكنولوجيا الحيويةPS120لفصل البروتين
توين-20شركة بكين سولاربيو للعلوم والتكنولوجيا المحدودةT8220لتحضير مخزن الغسيل
الطرد المركزي فوق الفائقهيماك (إبندورف هيماك تكنولوجيز)CP100NXنظام عزل عالي السرعة
مجموعة كشف كيميائية فائقة الحساسيةشنغهاي يامي للتكنولوجيا الحيويةSQ201لتصوير نطاق البروتين
مخزن تخفيف الأجسام المضادة العالميشنغهاي يامي للتكنولوجيا الحيويةPS119Lبالنسبة للأجسام المضادة الأولية/الثانوية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. Journal of Extracellular Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Zhao, R., et al. Adipose tissue-derived exosome maintains metabolic balance of extracellular matrix in rat nucleus pulposus cells. International Journal of Nanomedicine. 20, 2411-2425 (2025).
  4. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 4389(2021).
  5. Larios, J., Mercier, V., Roux, A., Gruenberg, J. ALIX- and ESCRT-III-dependent sorting of tetraspanins to exosomes. Journal of Cell Biology. 219 (3), e201904113(2020).
  6. Ferreira, J. V., et al. LAMP2A regulates the loading of proteins into exosomes. Science Advances. 8 (12), eabm1140(2022).
  7. Tang, S., et al. Single-cell atlas of human infrapatellar fat pad and synovium implicates APOE signaling in osteoarthritis pathology. Science Translational Medicine. 16 (731), eadf4590(2024).
  8. Peters, H., et al. Cell and transcriptomic diversity of infrapatellar fat pad during knee osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 84 (2), 351-367 (2025).
  9. Cao, Y., et al. Extracellular vesicles in infrapatellar fat pad from osteoarthritis patients impair cartilage metabolism and induce senescence. Advanced Science. 11 (3), e2303614(2024).
  10. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).
  11. Pascucci, L., Scattini, G. Imaging extracellular vesicles by transmission electron microscopy: coping with technical hurdles and morphological interpretation. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1865 (4), 129648(2021).
  12. Kowal, E. J. K., Ter-Ovanesyan, D., Regev, A., Church, G. M. Extracellular vesicle isolation and analysis by western blotting. Methods in Molecular Biology. 1660, 143-152 (2017).
  13. Han, Y., Ye, M., Ye, S., Liu, B. Comparison of lung tissue-derived extracellular vesicles using multiple dissociation methods for profiling protein biomarkers. Biotechnology Journal. 19 (9), e202400329(2024).
  14. Xue, J., Huang, D., Zhou, H., Qin, T., Liu, Y., Chen, J. Tissue-derived extracellular vesicles: comparing Ts-EVs and Te-EVs in extraction, characteristics and research trends. Cancer Cell International. 26 (1), 82(2026).
  15. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 1039(2020).
  16. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), e12238(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Extracellular VesiclesInfrapatellar Fat PadOsteoarthritis PatientsVesicle IsolationVesicle CharacterizationUltracentrifugationProtein MarkersCD63 MarkerFunctional AssaysProteomic Profiling
Video Coming Soon

Related Articles