مقالة منهجية

إعادة برمجة خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من عينات معطف بافي المجمدة

DOI:

10.3791/70522

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح البروتوكول الحالي خطوات استكشاف أخطاء اشتقاق الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSC) من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) في عينات المرضى والتي كان من الصعب إعادة برمجتها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. هذا البروتوكول خاص بعينات الطبقة المجمدة من الطبقة البافي لكنه قد يطبق أيضا على إعادة برمجة أنابيب PBMC المنقية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) أداة قيمة لنمذجة الأمراض. يمكن إعادة برمجة الخلايا الجذعية الأخرى من الخلايا الجسدية البالغة، وتسمى الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSC). تسمح تقنية iPSC بتقييم المشاركين في الدراسات والفئات المحددة والمساهمات في مجال الطب الشخصي. يتم أخذ الدم بشكل روتيني ويتم تجميده لأغراض البحث. تتم معالجة هذه العينات إما كطبقات دموية (buffy)، أو عينة دم تحتوي على خلايا دم بيضاء وصفائح دم، أو كخلايا دموية وحيدة النواة المحيطية (PBMCs)، والتي تمثل مجموعة أكثر تنقية من خلايا الدم البيضاء بدون الحمضات أو القاعديات أو الصفائح الدموية أو خلايا الدم الحمراء. كلاهما مصدر متاح بسهولة وغير جراحي نسبيا للخلايا الجسدية القابلة لإعادة البرمجة. تفصل عدة تقارير إعادة برمجة من PBMCs، بينما يصف تقرير واحد فقط هذه العملية من معاطف بافي المجمدة. كشفت التجارب الحديثة أن بروتوكولات إعادة برمجة PBMC المتوفرة في الأدبيات ومن المصنعين لم تكن ناجحة عند تطبيقها على عينات معطف بافي المجمدة، مما استلزم التعديلات واستراتيجيات استكشاف الأخطاء الموضحة هنا. بالنسبة للعديد من الباحثين الذين يستخدمون تقنيات iPSC، من الضروري وجود بروتوكولات شاملة ذات معدل نجاح عالي، خاصة في الحالات التي قد تحتوي فيها عينات المرضى على عدد قليل من الخلايا فقط، أو يتم الحصول عليها على فترات زمنية واسعة، أو من مجموعة مشاركين محدودة، أو ذات قيمة عالية. هنا، يتم تحديد نقاط تفتيش واستراتيجيات استكشاف الأخطاء لزيادة فرصة إعادة برمجة معاطف البوفي المجمدة البشرية أو PBMCs المنقية. في النهاية، سيسمح هذا البروتوكول للباحثين بتحديد مؤشرات نجاح إعادة البرمجة ووضع استراتيجيات بديلة لتحسين فرص نجاح اشتقاق iPSC.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد تقنية الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) مصدرا سهل التوسع والمتجدد للخلايا البشرية يمكن تمييزها إلى أي نوع من الخلايا في الجسم، مما يتيح للباحثين دراسة أنواع الخلايا والأنسجة التي يصعب الحصول عليها أو يصعب الوصول إليها لدى المرضى. علاوة على ذلك، يمكن اشتقاق الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) مباشرة من الخلايا الجسدية المريضة1. وهذا يسمح بالتمييز بين أنواع الخلايا الخاصة بالمرضى، وهو أداة لا تقدر بثمن لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية. لذا، فإن الطرق الصارمة والقابلة للتكرار والناجحة لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى iPSCs أمر حاسم.

الخلايا الليفية، وخلايا البول، وخلايا الدم 2,3، ولكل منها حدودها الخاصة، من أكثر مصادر الخلايا الجسدية استخداما لاشتقاق iPSC. الخلايا الليفية، التي كانت تاريخيا الخيار الأكثر شيوعا لإعادة برمجة3، ليست سهلة الحصول عليها، وتتطلب خزعة جلدية غازية إلى حد ما. يمكن اشتقاق الخلايا القابلة لإعادة البرمجة من عينات بول، وهي سهلة الحصول عليها وغير غازية، لكن يجب أن تبدأ عملية إعادة البرمجة بعينات جديدة حتى 48 ساعة بعد الجمع4. يوفر الدم مصدرا رائعا للخلايا القابلة لإعادة البرمجة، لأنه قليل التوغل في الحصول عليه ومتاح بسهولة. هناك العديد من بروتوكولات إعادة البرمجة المتاحة من خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMCs)، وخلايا الدم ذات نواة واحدة تشمل الخلايا اللمفاوية، والخلايا الأحادية، وخلايا القاتل الطبيعية5. نظرا لأن الخلايا الخلفية للدم الخلفية أقل كثافة من غيرها من خلايا الدم، يمكن عزلها/تنقيتها من عينات دم كاملة معزولة حديثا من خلال الطرد المركزي بتدرج الكثافة5. بدلا من ذلك، عند الطرد المركزي، ينقسم الدم الكامل إلى ثلاث طبقات مميزة: البلازما، الطبقة الناعمة، وخلايا الدم الحمراء6. تحتوي معاطف بافي على PBMCs بالإضافة إلى الصفائح الدموية وبعض كريات الدم الحمراء. ومع ذلك، فإن معاطف PBMC أقل توفرا في معظم البنوك الحيوية، بينما معاطف الدم الكامل أو الفراء البافي وفيرة ومتاحة7. على الرغم من توفر طبقات البافي في البنوك الحيوية ووجود PBMCs القابلة لإعادة البرمجة في هذه العينات، إلا أن القليل جدا من البروتوكولات تفصل إعادة البرمجة من معاطف بوفيالمجمدة 8، مما يترك هذا المورد غير مستغل.

حاليا، هناك العديد من البروتوكولات المنشورة 1,8,9 والمجموعات10 المتاحة تجاريا لتبسيط إعادة البرمجة; ومع ذلك، فهي لا تبحث بشكل عميق عن كيفية تعظيم نجاح خلايا المتبرعين التي يصعب إعادة برمجتها. من المقبول عموما أن بعض الخلايا لا تعيد البرمجة أبدا، وعندما يحدث ذلك، قد يحاول العديد من الباحثين مع نوع مختلف من خلايا المتبرع أو مريض مختلف. ومع ذلك، قد لا يكون هذا خيارا مناسبا للعديد من الباحثين أو مجموعات المرضى. على عكس البروتوكولاتالمنشورة سابقا 8،9، يتضمن هذا البروتوكول دليلا يحتوي على نقاط تحقق ومعايير للتنبؤ بنجاح إعادة البرمجة، ويتخذ نهجا فريدا من خلال تنقية طبقات البوفي المجمدة باستخدام الطرد المركزي بتدرج الكثافة عند الذوبان.

تبدأ العملية بسحب الدم من الأفراد المختارين وعزل إما PBMCs أو معاطف البافي. بالنسبة للتجارب الجديدة، من المرجح أن يشمل ذلك تجنيد متبرعين جدد سيخضعون لسحب دم جديد بموافقة المجلس الانتقائي ونموذج موافقة مناسب. الخطوة التالية هي توسع الخلايا الجسدية، حيث تذيب خلايا الدم المجمدة وتزرع في ظروف تعزز تكاثر الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا الخلفية الحمراء، وهي أفضل المرشحين لإعادة برمجة الخلايا الدموية11. بعد 10–14 يوما، يجب أن تكون الخلايا جاهزة لإعادة البرمجة، كما يتضح من شكل مميز لم يناقش في البروتوكولات السابقة، ثم يتم تحويلها عن طريق التطعيم بفيروس سينداي يحمل عوامل ياماناكا Oct4، Sox2، c-Myc، وKlf41. بعد التحويل، تبدأ الخلايا في التعبير عن عوامل النسخ ياماناكا وتعود إلى حالة متعددة القدرات، ويشار إليها مرة أخرى بتغير مورفولوجي واضح وتكاثر إلى مستعمرات الخلايا الجذعية. ثم يتم اختيار المستعمرات الناشئة بشكل فردي، وتوسيعها، وحفظها بالتجميد. بعد عشرة مرات، يؤكد التوصيف من خلال تأكيد تعبير علامات الجذع وإمكانية التمايز إلى الطبقات الثلاث الجرثومة صحة خط iPSC معاد برمجته بنجاح.

يعمل هذا البروتوكول بشكل أفضل مع معاطف البافي المحجوزة بالتبريد، والتي تم تخزينها لمدة < شهر، أو لخلايا PBMC المحجوزة بالتجميد التي تخزن لمدة تصل إلى سنتين مع وجود مليون خلية صالحة على الأقل عند الذوبان. ومع ذلك، قد تساعد نقاط الفحص الموصوفة في توجيه استكشاف أخطاء وإعادة برمجة أي عينة دم ذات جودة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون تفاصيل تكييف iPSCs المعاد برمجتها مع ظروف خالية من المغذيات قابلة للتطبيق على أي سير عمل لإعادة برمجة iPSC، بغض النظر عن نوع الخلية الجسدية البدائية.

هذا البروتوكول، الذي تم إنشاؤه من خلال استكشاف الأخطاء العملية، يوضح إعادة برمجة iPSCs من طبقات البافي المجمدة ويحدد مؤشرات مورفولوجية لنجاح إعادة البرمجة، مما يوفر دليلا عمليا لإعادة برمجة العينات الصعبة. في النهاية، يؤدي تطبيق هذه الاستراتيجيات إلى توفير الوقت والمال والكواشف والعينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع هذا البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري في جامعة جورجيا. أجريت جميع الدراسات البشرية وفقا لإرشادات إعلان هلسنكي الصادر عن الجمعية الطبية العالمية. استنادا إلى التقرير الذاتي، لم يعاني المتطوعون من الأمراض التالية: التليف الكيسي، مرض الانسداد الرئوي المزمن، السل، الربو، السكري أو التهابات المجاري الهوائية الحادة. تم تجنيد متطوعين تتراوح أعمارهم بين 18 و50 عاما ومن كلا الجنسين. تم استبعاد النساء الحوامل من الدراسة.

1. استخراج وحفظ معطف بافي أو PBMC

معايير القرار: إذا كانت العينات ستخزن لفترة طويلة، فمن الأفضل اختيار الخيار الثاني. إذا لم تكن المواد الكيميائية لتنقية PBMC متوفرة، أو سيتم تخزين العينات لفترة قصيرة، فإن الخيار الأول مناسب.

  1. الخيار الأول: استخراج معطف بافي
    1. قم بإجراء سحب الدم (ثقب وريد لأخذ الدم) وفقا لأفضل الممارسات12 من منظمة الصحة العالمية وأخذ 7–10 مل من الدم الكامل في أنابيب جمع الدم المغطاة بمضادات التخثر. احتفظ بالعينات على الثلج.
    2. انقل 7–10 مل من الدم الكامل إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. قم بتدوير الدم باستخدام جهاز طرد مركزي متأرجح بقوة 200 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع إيقاف الفرامل. يجب أن يتكون هذا من ثلاث طبقات مع بلازما صفراء في الأعلى، وطبقة الطبقة البيضاء الفاتحة في المنتصف، وكريات الدم الحمراء في الأسفل.
    3. اجمع البلازما باستخدام ماصة مصلية معقمة دون الإخلال بطبقة الطبقة الصوفية. تخلص من البلازما. انقل طبقة الطبقة البيضاء الفاتحة إلى أنبوب مخروطي جديد بحجم 15 مل (حوالي 1–2 مل).
      تحذير: تخلص من البلازما في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة المناسبة.
      ملاحظة: بعض التلوث البلازمي في فرو البافي جيد لأنه يساعد على التعافي بعد الذوبان.
    4. أضف DMSO إلى طبقة البوفي بحيث يكون التركيب النهائي 10٪ DMSO v/v وتجميده في التجميد (1 مل/قارورة) عند -80 درجة مئوية فورا. في اليوم التالي، انقل القوارير إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
      ملاحظة: كمثال، للحصول على 2 مل من Buffy Coat، أضف 200 ميكرولتر من DMSO، اخلط جيدا، ثم اجمع إلى قارورتين. عادة ما يؤدي ذلك إلى 1–3 قوارير مجمدة لكل عينة.
  2. الخيار الثاني: تنقية PBMC
    1. قم بإجراء سحب الدم (ثقب وريد لأخذ الدم) وفقا لأفضل الممارسات12 من منظمة الصحة العالمية وأخذ 7–10 مل من الدم الكامل في أنابيب جمع الدم المغطاة بمضادات التخثر. احتفظ بالعينات على الثلج.
    2. أضف محلول تدرج كثافة 4 مل 1 في أنبوب مخروطي جديد بحجم 15 مل. ضع بحذر طبقة 4 مل من الدم فوق محلول تدرج الكثافة 1.
    3. الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي دلو متأرجح بقوة 400 × g عند RT لمدة 30 دقيقة، مع إيقاف الفرامل. وهذا يؤدي إلى وجود بلازما في الطبقة العلوية، وPBMCs في الطبقة الوسطى، وبقية الدم في الطبقة السفلية.
    4. اجمع جزء PBMC في أنبوب مخروطي جديد بسعة 15 مل، ثم اغسله 2–3 مرات بأنبوب PBS واحد عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي متأرجح عند 350 × جرام عند RT لمدة 5 دقائق مع تشغيل الفرامل. تخلص من السوبرناتانت. لتجاوز الحفظ بالتبريد والبدء فورا في إعادة البرمجة، تابع الخطوة 2.3.4.
      تحذير: تخلص من المادة الفائقة في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة المناسبة.
    5. أعد تعليق الحبيبات في وسط حفظ التجميد (90٪ مصل و10٪ DMSO) وتجميده في التجميد (1 مل/قارورة) عند -80 درجة مئوية فورا. في اليوم التالي، انقل القوارير إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
      ملاحظة: قد يستخدم أنابيب جمع الدم العازلة من PBMC بدلا من الطرد المركزي بتدرج الكثافة لتطهير PBMC من الدم الطازج. كما يمكن الحفظ بالتجميد باستخدام وسائط تجميد بديلة متوفرة تجاريا. العائد النموذجي هو 1–4 قوارير مجمدة لكل عينة.

2. تحضير عينات لتوسع الخلايا الجسدية

  1. تحضير الإعلام
    1. تحضير وسائط التوسع (EM)9 عن طريق جمع 45 مل من قاعدة EM. أضف 127.8 ميكرولتر لحمض الأسكوربيك L-(50 ميكروغرام/مل من مخزون 100 ملليمتر) و450 ميكرولتر بنسلين-ستربتوميسين (مخزون 100x).
    2. تحضير EM + سيتوكيناتبمقدار 13 إلى 4 مل EM، أضف عامل الخلايا الجذعية 2 ميكرولتر (SCF) (50 نانوغرام/مل من مخزون 100 ميكروغرام/مل)، 2 ميكرولتر إنترلوكين-3 (IL-3) (10 نانوغرام/مل من مخزون 20 ميكروغرام/مل)، 16 ميكرولتر إريثروبويتين (EPO) (2 U/mL من مخزون 500 U/mL)، 4 ميكرولتر عامل نمو يشبه الأنسولين 1 (IGF1) (40 نانوغرام/مل من مخزون 40 ميكروغرام/مل)، و4 ميكرولتر ديكساميثازون (1 ميكرومولار من مخزون 1 ملليمولار). استخدم EM + السيتوكينات في نفس يوم التحضير.
      ملاحظة: قد تستخدم أنظمة وسائط تمدد تجارية بديلة.
  2. الخيار الأول: تنقية PBMC من معطف بافي المجمد
    معايير القرار: إذا تم اختيار الخيار الأول في الخطوة الأولى (أي استخراج معطف بافي)، فاختر الخيار 1 في الخطوة 2 (أي تنقية PBMC من طبقة البوفي المجمدة).
    1. استرجع محلول تدرج الكثافة 2 واترك الحلول تصل إلى درجة حرارة الغرفة. اخلط جيدا عن طريق قلب الزجاجة. انقل محلول تدرج كثافة 3 مل 2 بشكل معقم إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
    2. جهز أنبوبا مخروطيا آخر بسعة 15 مل يحتوي على محلول ملحي لمحلول العزل الفوسفوري من دولبيكو (DPBS) بسعة 12 مل.
    3. استرجع قارورة معطف البوفي المجمد من النيتروجين السائل. أبق على الثلاجة حتى يصبح جاهزا للذوبان. قم بإذابة العينة بلطف عن طريق التدوير في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. قم بإزالته عندما يبقى فقط كريستال ثلج صغير.
    4. بحذر (باتجاه القطر) انقل محتويات القارورة إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على DPBS. اشطف القارورة ب 1 مل من DPBS وأضفها إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الخلايا المستخرجة.
    5. الطرد المركزي باستخدام طرد مركزي دلو متحرك بقوة 200 × g عند RT لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل DPBS مع مصل أبقار جنيني بنسبة 1٪.
    6. ضع طبقة من خليط الطبقة الناعمة فوق محلول تدرج الكثافة، مع الحرص على عدم الخلط. الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 800 × g لمدة 20 دقيقة في RT مع إيقاف الفرامل.
    7. باستخدام الماصة، قم بإزالة وتخلص من طبقة البلازما العليا دون الإخلال بواجهة البلازما-التدرج. باستخدام الماصة، قم بإزالة طبقة PBMC عند الواجهة (الشكل 1A) وانقله إلى أنبوب نظيف بسعة 15 مل.
      تحذير: تخلص من الطبقات الأخرى في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة المناسبة.
    8. اغسل أنابيب PBMC ب 3 مل EM عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 10 دقائق عند RT. أزل المادة الفائقة بحذر وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل EM + سيتوكينات. صحن في بئر واحد من صحن يحتوي على 12 بئرا.
    9. ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و20٪ الدرجة المئوية.
  3. الخيار الثاني: إذابة أنابيب PBMC المجمدة
    معايير القرار: إذا تم اختيار الخيار الثاني في الخطوة الأولى (أي تنقية PBMC)، أو إذا كان هناك قلق من أن معاطف البوفي المجمدة ستكون ذات قابلية منخفضة للبقاء (أي تخزينها لأكثر من شهر) (الشكل 1B)، فاختر الخيار 2 في الخطوة 2 (أي إذابة PBMCs المجمدة).
    1. جهز أنبوبا مخروطيا بسعة 15 مل مع 12 مل DPBS.
    2. استرجع قارورة PBMCs المجمدة من النيتروجين السائل. احتفظ بالتجميد حتى يصبح جاهزا للذوبان. قم بإذابة العينة بلطف عن طريق التدوير في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. قم بإزالته عندما يبقى بلورة صغيرة فقط.
    3. انقل محتويات القارورة بحذر (باتجاه القطر) إلى الأنبوب المخروطي. تأكد من استرجاع جميع الخلايا من القارورة عن طريق شطفها ب 1 مل من DPBS.
    4. الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي متأرجح عند 200 x g عند RT لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية وإعادة تعليق الحبيبة (الشكل 1C) في 2 مل كهرومغناطيسية، ثم خذ 10 ميكرولتر لإجراء اختبار استبعاد التريبان الأزرق للتأكد من صلاحية الخلية للحصول على عددالخلية 14.
      تحذير: تخلص من المادة الفائقة في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة المناسبة.
    5. صفيحة 1.0 × 106–2.0 × 106 خلايا/مل في 2 مل EM + سيتوكينات في بئر واحد من صفيحة مكونة من 12 بئرا. ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و20٪ الدرجة المئوية.

3. توسع الخلايا الجسدية (بعد يوم واحد من الذوبان)

  1. قم بإزالة 1 مل من الوسائط المستهلكة من كل بئر بعناية. يمكن جمع الأوساط المستهلكة في بئر آخر أو أنبوب طرد مركزي آخر وفحصها للتأكد من عدم فقدان أي خلايا.
  2. استبدل الوسائط المستهلكة ب 1 مل من السيتوكينات الكهرومغناطيسية + الطازجة.
  3. كرر الخطوات 3.1 و3.2 والتقط صورا لخلايا PBMC كل يومين حتى يلاحظ تغير كبير في الشكل، مع خلايا ساطعة ودائرية كبيرة وصغيرة الحجم (الشكل 2A، السهم البرتقالي والأزرق على التوالي)، وهي الخلايا الحمراء، نوع الخلية التي يجب إعادة برمجتها. سيستغرق هذا حوالي 10-14 يوما.
    ملاحظة: الخلايا التي لا تظهر هذه الأشكال الشكلية، والتي عادة ما تفتقر إلى الخلايا الدائرية الأكبر (الشكل 2B)، من غير المرجح أن تعيد البرمجة بنجاح وقد تكون ميتة (الشكل 2C).

4. النقل (10–14 يوما بعد الذوبان)

  1. تحضير فيروس سينداي
    1. باستخدام قيمة العيار الخاصة بالدفعة، احسب حجم كل فيروس المطلوب للانتقال بمقدار 2.0 × 105 خلايا باستخدام KOS: c-Myc: Klf4 مع تعدد العدوى (MOI) 5:5:3، كما أوصى به المصنع. يمكن العثور على المعادلة لهذه الحسابات في مستندات المنتج المقدمة من الشركة المصنعة.
    2. استرجع الفيروسات من الفريزر، واحتفظ بها في الثلاجة حتى يحين وقت الذوبان. واحدا تلو الآخر، قم بإذابة الفيروسات بلطف عن طريق الدوران في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    3. تحضير أليكوات يتم خلط الفيروسات الثلاثة فيها بالحجم المناسب لتحويل 2.0 × 105 خلايا عند MOI 5:5:3. تجميد الأليكوات عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
      تحذير: تأكد من تبييض جميع النفايات التي لامست فيروس سينداي بدقة.
      ملاحظة: توصي تعليمات الشركة المصنعة بإجراء عدد فعلي للخلايا مع حساب MOI لتحديد حجم الفيروس المضاف، لكن التقريب 2.0 ×10 5 كان ناجحا لأغراض هذا البروتوكول. يمكن أن يكون الاقتباس أكثر فعالية من حيث التكلفة ويقلل من دورات التجميد/الذوبان للفيروسات.
  2. يوم التحويل (d0)
    1. إذا لم يتم تغذية PBMCs في اليوم السابق، أزل 1 مل من الوسائط المستهلكة واستبدلها ب 1 مل من السيتوكينات الطازجة EM + الميكانيك. إذابة الفيروس على الثلج، ثم أضف مباشرة إلى البئر، ولف الوسائط.
    2. لف اللوحة بطبقة باراغليما وقم بطرد مركزها في جهاز طرد مركزي متأرجح عند 350 x g عند RT لمدة 90 دقيقة. ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2، و20٪ حرارة الأكسجين طوال الليل.
      تحذير: تأكد من تبييض جميع النفايات التي لامست فيروس سينداي بدقة.
  3. يوم واحد بعد التحويل (d1)
    1. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. اشطف جيدا ب 2 مل من EM وافحص تحت المجهر للتأكد من أن جميع الخلايا قد جمعت. الخلايا الطرد المركزي عند 300 x جرام عند RT لمدة 10 دقائق.
    2. أزل الفائق بحذر وأعد تعليقه في 2 مل EM + سيتوكينات. ضع في بئر جديد من صفيحة تحتوي على 12 بئر وأعد الطبق إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2، و20٪ درجة حرارةالأكسجين.
      تحذير: تأكد من تبييض جميع النفايات التي تلامست فيروس سينداي بدقة.

5. إعادة تغليف الخلايا المحولة إلى خلايا تغذية

  1. تحضير خلية المغذي
    1. إلى 43.5 مل من وسط إيجل المعدل (DMEM) من دولبيكو أضف 5 مل FBS (تركيز نهائي 10٪)، و0.5 مل حد أدنى لمحلول الأحماض الأمينية غير الأساسية في الوسط الأساسي (MEM-NEAA) (من مخزون 100x)، و50 ميكرولتر 2-ميركابتوإيثانول (55 ميكرومولار من مخزون 55 ملليمتر)، و0.5 مل مضاد حيوي مضاد للفطريات (من مخزون 100x).
    2. تحضير ألواح 6 آبار مغطاة بالجيلاتين بإضافة 600 ميكرولتر جيلاتين (0.1٪ من 2٪ مخزون) إلى 12 مل DPBS وتوزيع 2 مل لكل بئر. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    3. استرجاع قارورة مجمدة من الأرومات الليفية الجنينية للفئران المشعة (MEFs) وإذابتها بلطف عن طريق الدوران في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    4. أضف إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 10 مل DPBS واغسل القارورة ب 1 مل إضافي DPBS. الطرد المركزي عند 200 × g عند RT لمدة 5 دقائق.
    5. قم بإزالة الفائق بعناية وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في وسط فيبروبلاستي بحجم 1 مل. إزالة 10 ميكرولتر لإجراء اختبار استبعاد الأزرق التريبان للتأكد من صلاحية الخلية للحصول على عدد الخلية14.
    6. قم بإزالة محلول الجيلاتين من الألواح ذات ال6 آبار والصفائح المشعة MEF عند 2.5 × 104 خلايا/سم2. الحضانة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و20٪ أوسيد الأكسجين لمدة 6–48 ساعة.
      ملاحظة: يجب تجهيز صفائح خلايا التغذية قبل إعادة طلاء الخلايا المحولة. تم رصد أفضل النتائج عندما يتم حضن MEFs المشعة لمدة حوالي يومين قبل إعادة الطلاء، لكن الحضانة لمدة لا تقل عن 6 ساعات قد تكون كافية.
  2. الخلايا المحولة معاد الصفائح
    1. تحضير وسائط iPSC بسعة 90 مل DMEM/F12 مع 10 مل FBS (تركيز نهائي 10٪)، 1 مل mem-neaa (من مخزون 100x)، 1 مل L-جلوتامين (2 ململ من مخزون 200 ملميول)، 1 مل بنسلين-ستربتوميسين (من مخزون 100x)، 100 ميكرولتر 2-ميركابتوإيثانول (55 ميكرومولار من مخزون 55 ملليمتر)، و100 ميكرولتر عامل نمو الأرومات الليفية 2 (FGF2) 100 ميكرولتر (10 نانوغرام/مل من مخزون 10 ميكروغرام/مل). أضف حمض L-أسكوربيك (50 ميكروغرام/مل) طازجا في كل وجعة.
    2. في اليوم الثالث بعد التحويل، اجمع جميع الوسائط والخلايا من البئر المحولة إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مل. اشطف جيدا بكمية إضافية لا تقل عن 1 مل من الكهرومغناطيسية والطرد المركزي في جهاز طرد مركزي متأرجح عند 300 x g عند RT لمدة 10 دقائق.
    3. أعد تعليق الحبيبة في وسط iPSC بحجم 6 مل. استنشق الوسائط من 3 آبار في الصفيحة باستخدام MEFs مشعة.
    4. الخلايا المحولة إلى هذه الآبار الثلاثة من MEF المشعة (2 مل/بئر). الحضانة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و20٪ الدرجة المئوية.

6. الصيانة حتى ظهور المستعمرة

  1. في الأيام 4 و5 و6 بعد التحويل، أضف 1 مل من وسائط iPSC الطازجة إلى كل بئر كل يوم. هذا يحد من الاضطراب غير الضروري للخلايا المعاد برمجتها حديثا أثناء استقرارها على المغذيات، كما يوفر لها مغذيات طازجة.
  2. في اليوم السابع بعد التحويل، أزل جميع الوسائط القديمة واستبدلها ب 2 مل من وسائط iPSC الجديدة لكل بئر. استمر في التغذية بوسائط iPSC كل يومين حتى تبدأ المستعمرات في الظهور.
  3. حضر hES media 78 مل DMEM/F12 مع مكمل مجاني FBS بسعة 20 مل (20٪)، 1 مل mem-neaa (100x)، 1 مل L-جلوتامين (2 ملليمول من مخزون 200 ملليمتر)، 1 مل بنسلين-ستريبتوميسين (100x)، 100 ميكرولتر 2-ميركابتوإيثانول (55 ميكرومولار من مخزون 55 ملليم)، و100 ميكرولتر FGF2 (10 نانوغرام/مل من مخزون 10 ميكروغرام/مل). أضف حمض L-أسكوربيك (50 ميكروغرام/مل) طازجا في كل وجعة.
  4. بمجرد أن تبدأ مستعمرات صغيرة في الظهور، استمر في الحفاظ على الخلايا المحولة عن طريق التغذية كل يومين بوسط hES (الشكل 3A).
    ملاحظة: تبدأ المستعمرات في الظهور في وقت مبكر يصل إلى 7 أيام بعد التحويل. إذا لم تظهر مستعمرات بحلول ثلاثة أسابيع من التحويل، فمن غير المرجح أن تظهر مستعمرات أبدا.

7. اختر المستعمرات بمجرد أن تكبر إلى حجم أكبر (الشكل 3B)

ملاحظة: أحيانا تخضع الخلايا المحولة لتغير شكلي لا يؤدي إلى مستعمرة شبيهة بالخلايا الجذعية (الشكل 3C). لا يعتبر هذا مستعمرة قد تؤدي إلى خط iPSC ناجح.

ملاحظة: من ظهور المستعمرات، ستحتاج خطوط iPSC إلى التكيف مع ظروف الزراعة المفضلة للمختبر لزراعة hPSC. سيظهر هذا البروتوكول كيف تم تكييف خطوط iPSC لتناسب ظروف خالية من المغذيات، وزراعتها على ألواح مغطاة بالفيترونكتين (VTN)، وتغذيتها بوسائط hPSC معرفة كيميائيا ومتاحة تجاريا. إذا لم تتكيف المستعمرات جيدا مع الظروف الجديدة، فقد تحتاج إلى انتقال أكثر لطفا، مثل أن يتم التقاطها على الخلايا المغذية التي تحتوي على وسط hES.

  1. جهز الألواح المطلية ب VTN عن طريق إذابة وخلط VTN جيدا. لصفيحة تحتوي على 24 بئر، حضر 12 مل من DPBS مع 120 ميكرولتر VTN (5 ميكروغرام/مل من مخزون 500 ميكروغرام/مل) ووزع 0.5 مل VTN محلول/بئر. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
  2. حضر وسط hPSC عن طريق إذابة زجاجة واحدة من مكمل hPSC عند 4 درجات مئوية طوال الليل. بعد إذابة الماء، أضف 10 مل من مكمل hPSC إلى زجاجة واحدة بحجم 500 مل من الوسط القاعدي hPSC.
  3. جهز الألواح للانتقاء عن طريق إزالة محلول VTN من آبار صفيحة 24 بئر وإضافة وسائط hPSC بسعة 0.5 ميل مع 0.5 ميكرولتر Y-27632 (10 ميكرومتر من مخزون 10 مللي مول) لكل بئر.
  4. أحضر الطبق الجديد، والبئر السادس الذي يحتوي على الخلايا/المستعمرات المحولة، وإبر الحقن المعقمة، وماصة p200 وأرؤوس إلى مجهر تشريح في ظروف معقمة.
  5. ضع الصفيحة التي تحتوي على الخلايا المحولة والمستعمرات المنتشرة على المجهر التشريحي واستخدم المجهر لتحديد مستعمرة واحدة لاختيارها. ارفع غطاء اللوحة لكشف البئر.
  6. افتح الحقنة معقم واكشف الإبرة. بتوجيه المجهر، استخدم رأس الإبرة لفصل المستعمرة عن أي خلايا تغذية محيطة عن طريق تتبع حدود المستعمرة بالإبرة.
  7. استخدم رأس الإبرة لقطع المستعمرة إلى عدة قطع متساوية الحجم. إذا لم تكن قطع المستعمرة قد انفصلت بالفعل عن اللوحة، استخدم جانب الإبرة لسحب أو كشطها من اللوح حتى تطفو.
    تحذير: تخلص من الإبرة في الحاوية المناسبة للأدوات الحادة.
  8. مع p200، استخدم المجهر لإعادة تحديد مكان المستعمرة المختارة. استنشق المستعمرة العائمة باستخدام الماصة وانقل إلى بئر من الصفيحة المعدة 24 بئرا. حاول إدخال المستعمرة بأكملها إلى البئر دون الحصول على مستعمرات أخرى أو خلايا مغذية.
  9. ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و20٪ الدرجة المئوية.
  10. أطعم المستعمرات المختارة ب 1 مل من وسط hPSC يوميا حتى تلتقي القارئة.
    ملاحظة: لدى المستعمرات القدرة على أن تكون متميزة جينيا عن بعضها البعض. يجب أن يحتوي كل بئر من صفيحة 24 بئر على مستعمرة واحدة فقط تم اختيارها. كل مستعمرة يتم اختيارها تعطى معرفا مميزا، ومن هنا فصاعدا تعامل كخط خلية مختلف عن المستعمرات الأخرى المختارة. لجولة إعادة برمجة صارمة، اختر على الأقل 24 مستعمرة ووسع وقم بتوصيف 3 على الأقل.

8. التوسع

  1. صيانة hPSC
    1. تكون المستعمرات المختارة جاهزة للانقسام عندما تكون كبيرة ومستديرة بحواف متوهجة (الشكل 4A). المستعمرات تنقسم إلى عدة قطع عند جمعها. إذا كان هناك عدة مستعمرات في بئر واحد، قم بتقسيمها قبل أن تكبر بما يكفي لتلامس بعضها البعض وتبدأ في التفريق.
    2. جهز صفيحة ذات 6 آبار مغلفة ب VTN: لصفيحة ذات 6 آبار، حضر 12 مل من DPBS مع 120 ميكرولتر VTN (5 ميكروغرام/مل من مخزون 500 ميكروغرام/مل) ووزع 1 مل VTN محلول/بئر. يتم حضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. يمكن استبدال محلول VTN ب DPBS وتخزينه عند حرارة 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة شهر . في الآبار التي سيتم تقسيمها إلى أنابيب DPBS بسحب واستبدالها بمتوسط 1 مل hPSC.
    3. استنشق الوسط من البئر ليتم تقسيمه، ثم اشطفه مرة واحدة ب 1 مل DPBS. استنشاق DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5 مللي مولار EDTA لتفكيك المحلول (معد في 500 مل DPBS مع 0.9 جرام NaCl ومعقم بالفلتر)15. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة دقيقتين، حتى تبدأ المستعمرات في الارتخاء، وتبدأ الخلايا داخل كل مستعمرة في التجمع والانفصال عن بعضها البعض.
    4. أزل اللوحة من الحاضنة، واسحب مخزن تفكك EDTA. باستخدام ماصة p1000، اجمع الخلايا التي تحتوي على وسط hPSC بقوة 1 مل عن طريق التوصيل بلطف للأعلى والأسفل حتى تنفصل المستعمرات بالكامل وتتكسر قليلا. انقل 1 مل من الوسط والخلايا إلى الحوض الجديد ذو الستة بئر يحتوي على 1 مل من وسط hPSC الطازج. يتم هذا التقسيم الأول بنسبة تقسيم 1:1، حيث يتم نقل جميع الخلايا من اللوح الأصلي إلى اللوح الجديد.
    5. ضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و20٪ أوكسيد. قم بتغذية iPSCs يوميا حتى يلتقي البئر ويصبح جاهزا للانفصال.
      ملاحظة: يمكن التخفيف من سوء شكل الخلايا الجذعية (الشكل 4B) عن طريق تعديل بروتوكول التقسيم مثل التقسيم المبكر، أو استخدام وقت حضانة EDTA أقل، أو تعديل نسبة الانقسام.
    6. وسعها إلى طبق بحجم 10 سم.
      1. بمجرد التقاء الخلايا في كل بئر من صفائح الستة آبار، غط طبقا بحجم 10 سم ب VTN (7 مل DPBS مع 70 ميكرولتر VTN (5 ميكروغرام/مل من مخزون 500 ميكروغرام/مل)، يحتضن لمدة ساعة واحدة عند RT).
      2. كرر بروتوكول التقسيم، هذه المرة من الحوض السادس إلى طبق زراعة الأنسجة بحجم 10 سم (نسبة الانقسام 1:1). استخدم 7–10 مل من وسط hPSC لكل طبق بحجم 10 سم.
      3. بمجرد أن تلتقي الخلايا في الطبق بحجم 10 سم، كرر عملية الانقسام هذه (المرور). في كل مقطع، لاحظ رقم المقطع. تعتمد نسبة الانقسام على شكل الخلية والكثافة. النسبة النموذجية هي 1:10، حيث يتم نقل عشر الخلايا من اللوح الأصلي إلى اللوح الجديد.
  2. التجميد وتجهيزات المخزون
    1. بعد حوالي 3 مرات، قم بالتوسيع إلى أربعة أطباق زراعة أنسجة بحجم 10 سم لتخزين المرات المبكرة. بمجرد أن تلتقي الخلايا في أطباق 10 سم، تكون جاهزة للتجميد.
    2. حضر التجميد وضعه في الفريزر لتبرد. تأكد من أن الملصق يتضمن خط الخلية، والنسخة، ورقم الممر، وتاريخ التجميد.
    3. حضر وسط تجميد: 90٪ hPSC متوسط و10٪ DMSO، ستحتاج إلى 1 مل لكل قارورة (3 قوارير مجمدة لكل طبق 10 سم).
    4. نفذ بروتوكول التقسيم كالمعتاد، باستخدام مخزن تفكيك EDTA بسعة 4 مل 0.5 مللي مول لكل طبق بحجم 10 سم.
    5. بعد حضانة EDTA، استنشق EDTA. أضف بلطف 10 مل من الوسط الهوائي إلى الطبق.
    6. اغسل الخلايا من الطبق بلطف عن طريق رش الوسط بالماصة. الخلايا ستخرج بسهولة من أرضية الطبق وتمتزج في الوسط. استخدم الماصة فقط من 2 إلى 5 مرات لتفكيك المستعمرات بلطف مع تجنب التفكك إلى خلايا مفردة.
    7. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 x g عند RT. استنشاق السوبرناتينت وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في وسط تجمد.
    8. عزل وتجميد المحرك فورا عند -80 درجة مئوية. انقل القوارير المجمدة إلى خزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
    9. جمد المزيد من المخزونات بنفس الطريقة بعد الانتهاء من التوصيف.

9. توصيف iPSCs:

  1. تعبير علامات الجذع. بعد التوسع لمدة لا تقل عن 10 مرات، عندما تكون المستعمرات في بئر 24 جاهزة للتقسيم، قم بتثبيتها ب 4٪ بارافورمالديهايد وصبغها بواسطة الكيمياء المناعية النسيجية لعلامة الجذع NANOG. سيستغرق الأمر ما لا يقل عن 10 ممرات لتكون المستعمرات سلبية لفيروس سينداي (SeV)، ويمكن تأكيد ذلك بواسطة التألق المناعي (الشكل 4C).
  2. اختبار القدرة متعددة القدرات: ثلاثة تماميزات في الطبقات الجرثومية. يتم تأكيد تعدد القدرات في iPSC من خلال التمايز الناجح إلى كل من الطبقات الجرثومية الثلاث. يبدأ كل تمايز من طبق متلاقى بقطر 10 سم يظهر شكل hPSC جيد (الشكل 4A).
    1. إكتوديرم16
      1. اليوم الذي يسبق بدء التمايز (اليوم الأول): بذور iPSCs على ألواح 24 بئر مغطاة بالمصفوفة بكثافة 2.6 × 105 خلايا/سم2 في وسط hPSC مع Y-27632 (تركيز نهائي 10 ميكرومول) وXAV-939 (تركيز نهائي 2 ميكرومول).
      2. اليوم 0–اليوم 1: تغذية بقاعدة تمايز 1 مل/بئر مع LDN (تركيز نهائي 100 نانومل)، SB (تركيز نهائي 10 ميكرومول)، وXAV (تركيز نهائي 2 ميكرومول).
      3. اليوم الثاني – اليوم السابع: تغذية بقاعدة تمايز 1 مل/بئر مع LDN (تركيز نهائي 100 نانومل) وSB (تركيز نهائي 10 ميكرومول). من d3، أطعم كل يومين.
      4. اليوم الثامن: تم تثبيته ب 4٪ بارافورمالديهايد وصبغة بواسطة الكيمياء المناعية لمؤشر الأديم الخارجيPAX6 17 وتأكيد فقدان مؤشر تعددية القدرات NANOG (الشكل 4D).
    2. الأديم المتوسط18:
      1. اليوم الذي يسبق بدء التمايز (اليوم -1): زرع iPSCs على ألواح 24 بئر مغطاة بالمصفوفة بكثافة 2.5 × 105 خلايا/سم2 في وسط hPSC مع Y-27632 (تركيز نهائي 10 ميكرومول).
      2. اليوم 0: تغذية ب DMEM/F12 بحمض L-أسكوربيك (تركيز نهائي 64 ميكروغرام/مل)، سيلينيت الصوديوم (تركيز نهائي 13.6 نانوغرام/مل)، هولوترانسفيرين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، مركز دهون محدد كيميائيا (100x)، وCHIR (تركيز نهائي 5 ميكرومتر).
      3. اليوم الأول: تغذية ب DMEM/F12 بحمض L-أسكوربيك (تركيز نهائي 64 ميكروغرام/مل)، سيلينيت الصوديوم (تركيز نهائي 13.6 نانوغرام/مل)، هولوترانسفيرين (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل)، مركز الدهون المعرف كيميائيا (100x)، والهيبارين (تركيز نهائي 0.6 يوغار/مل).
      4. اليوم الثاني: تثبيتها ب 4٪ بارافورمالديهايد وصبغة بواسطة الكيمياء المناعية لبراتشوري-تي19 وتأكيد فقدان علامة تعددية القدرات NANOG (الشكل 4E).
    3. بطانة الأديم20
      1. اليوم الذي يسبق بدء التمايز (اليوم -1): زرع iPSCs على ألواح 24 بئر مغطاة بالمصفوفة بكثافة 1.0 × 105 خلايا/سم2 في وسط hPSC مع Y-27632 (تركيز نهائي 10 ميكرومولار).
      2. اليوم 0–اليوم 4: عند d0، اغسل ب DPBS وأطعم ب RPMI مع بديل L-جلوتامين (100x)، FBS (تركيز نهائي 0.5٪)، وأكتيفين A (تركيز نهائي 100 نانوغرام/مل). من d0، أغذي يوميا بنفس الوسائط.
      3. اليوم 5: تم تثبيته باستخدام 4٪ بارافورمالديهايد وصبغة بواسطة الكيمياء المناعية النسيجية لمؤشر الانتباذ الداخلي SOX1721 وتأكيد فقدان مؤشر تعددية القدرات NANOG (الشكل 4F).
        ملاحظة: تم إجراء التمايزات وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا. من خلال تجربتنا، يمكن أن تكون الطلاءات المصفوفية قابلة للتبادل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تتبع نجاح هذا البروتوكول في مراحل مختلفة. يقدم الجدول 1 ملخصا للعينات التي تم تنفيذ هذا البروتوكول عليها. العينات الأولى، التي تكون إما طبقات بوفي محفوظة بالتبريد لمدة أسبوع أو PBMCs محجوزة بالتجميد، والتي تتميز بجودة عينة جيدة عند الذوبان والمظهر الشهرفي المميز بعد إعادة برمجة تمدد الخلية بنجاح 6 من 7 مرات (الجدول 1، الفئة 1). أظهرت عينتان أخريان من معطف البوفي، جمعتا ومخزنتان في ظروف مشابهة، جودة وشكل مشابهين، لكنهما أخذتا لإجراء اختبارات أخرى بدل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع تقنية iPSC بإمكانات هائلة في المجال الطبي الحيوي فيما يتعلق باكتشاف آليات الأمراض، والطب الشخصي، و"التجارب السريرية في طبق"22,23. تعد البروتوكولات الفعالة والقابلة للتكيف لإعادة برمجة iPSC من عينات الدم مفتاح إطلاق الإمكانات الكبيرة لتقنية iPSC لأنها سهلة الجمع وغالبا ما تكون متوفرة بسهولة في البنوك الحيوية. بينما توجد العديد من البروتوكولات المنشورة التي تفصل إعادة البرمجة من PBMCs المنقي، فإن هذا البروتوكول يوضح إعادة الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعلن أن البحث أجري دون علاقات تجارية أو مالية يمكن اعتبارها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تجنيد أشخاص بشريين ومنحهم موافقتهم المعتمدة على التبرع بالدم وفقا لبروتوكول IRB UGA# 2012-10769-06، وNYU# s21-01701، وEmory# 2024P008659، وEmory# 000002114. وقد تم دعم البحث المبلغ عنها في هذا المنشور من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعهد الوطني للصحة تحت رقم الجائزة 5T32GM142623 إلى ج. آرت، R01MH115174 لف. ميشوبولوس، R01NS114567 ل ن. زيلتنر. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدها ولا يعكس بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق زراعة الأنسجة القياسية بطول 10 سمفالكون353003
12 لوحة بئرفالكون353043
أنابيب مخروطية بحجم 15 ملفيشر7200886
24 لوحة بئركورنينغ7200740
محلول بارافورمالديهيد 4٪ثيرمو ساينتفيكJ19943-K2
6 ألواح بئرفيشر ساينتيفكFB012927
accuSpin1Rفيشر ساينتيفك75003449
أكتيفين أالتقنية الحيوية338-بعد الفتح
AF488-donkey & alpha; ماعزإنفيتروجينA11055
AF555-donkey & alpha; RBTإنفيتروجينA31572
AF647-donkey & alpha; mإنفيتروجينA31571
AF647-donkey & alpha; RBTإنفيتروجينA31573
مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100X)فيشر15 240 096 
بيبيهات مصلية بوليسترين بايزيكسفيشر14955233
14955234
14955235
14955236
محاقن BD Tuberculinفيشر14-826-87
أنابيب تحضير الخلايا أحادية النواة الزجاجية BD فاكوتين (CPT)فيشر ساينتيفك02-685-125أنابيب جمع الدم العازل في PBMC
BD  أنابيب جمع الدم البلاستيكية Vacutainer مع K2EDTA: إغلاق الهيموغاردفيشر ساينتيفك02-657-32أنابيب جمع الدم المغطاة بمضادات التجلط
ب-ميركابتوإيثانولفيشر21 985 023 
الهلالات البقريةسيغماG1393
ماعز الأجسام المضادة متعددة النسيلات براكيوري-تي IgGR& DAF2085
سيل دروب BFدينوفيكسسيل دروب BF
جهاز الطرد المركزي 5702إبندورفEP022628102-1EA
مركز الدهون المعرف كيميائيافيشرNC9022744
شير 99021 R& D4423
حاضنة CO2سانيوMCO-20AIC
نظام التخزين بالتجميدأنظمة بيولوجية مخصصةV-1500AB
كريوستور CS10تقنيات الخلايا الجذعية100-1061وسط تجميد بديل
مجموعة إعادة برمجة CytoTune-iPS 2.0 SendaiفيشرA16517
ديكساميثازونسيغماD2915
DMEMفيشر11965118
DMEM/F12فيشر11330057
DMSOفيشرBP231-1
DPBS 1X بدون CA MG فيشرMT21031CM
EDTAفيشرAM9262
إريثروبويتين (EPO)بيو-تكني287-TC-500
Essential 6 متوسط (E6)فيشرA1516401أساس التمايز 
Essential 8 متوسط (E8)فيشرA1517001الوسط القاعدي hPSC
مجهر إيفوس FLالترموAMF4300
مصل الأبقار الجنينيVWR45000-734
FGF الأساسي (FGF2)التقنية الحيوية233-FB/CF 
جيلتريكسفيشرA1413202طلاء المصفوفة
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية من جيبكو MEM (100X)فيشر11140050
غلوتامكسفيشر35050061بديل L-جلوتامين  
هيبارينتقنيات الخلايا الجذعية7980
تاريخ 1077سيغما10771حل تدرج الكثافة 1 
هولوترانسفيرينسيغماT0665
عامل الخلايا الجذعية البشرية (SCF)بيبروتيك300-07-100UG
عامل النمو 1 (IGF1) يشبه الأنسولينبيبروتيك100-11-100UG
إنترلوكين-3 (IL-3)بيبروتيك200-03-2UG
حمام ماء إيزوتمب 210فيشر ساينتيفك210
استبدال مصل الضربة القاضية (KSR)فيشر10828028مكمل مجاني على FBS  
حمض إل-أسكوربيكسيغماA4544-100G
LDN193189ستيمجنت04-0074
إل-جلوتامينفيشر25030081
لمفوبريتتقنيات الخلايا الجذعية7801حل تدرج الكثافة 2
ماتريجيلكورنينغCB-40234طلاء المصفوفة
الخلايا الليفية الجنينية للفئرانفيشرA34964 
ماعز نانوغ متعدد النسيلات IgGR& DAF1997-SP
أنابيب Nunc الحيوية وأنابيب التبريد لزراعة الخلايافيشر ساينتيفك12-565-163N
البنسلين/الستربتوميسينفيشر15140122
IgG متعدد النسيلات متعدد الأجسام المضادة المنقى لمضاد باكس-6الأسطورة الحيوية901301
QBSF-60 متوسط خال من المصلجودة بيولوجية160-204-101قاعدة EM
وسط تجميد زراعة خلايا الاستردادثيرمو فيشر العلمي12648010وسط تجميد بديل
rhVitronectin (VTN)فيشرA31804
RPMI 1640 متوسطفيشر11875093
SB431542R& D1614
فيروس سينداي HN الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر IgG2aإنفيتروجين14649482
صوديوم سيلينيتسيغماS5261
الماعز متعدد النسيات Sox17 من نوع الأجسام المضادة IgGR& Daf1924
مكمل التوسعة StemSpan Erythroidتقنيات الخلايا الجذعية2692ملحق الوسط التجاري البديل
StemSpan SFEM II المتوسطتقنيات الخلايا الجذعية9605وسيط التمدد التجاري البديل
فريزر فائق الحرارة المنخفضةثيرمو فيشر العلميTSX60086A
رؤوس الماصنة العالمية - مفلترةVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939التقنية الحيوية3748/10
Y-27632 ديهيدروكلوريدبيوجمز1293823

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Ray, A., et al. An overview on promising somatic cell sources utilized for the efficient generation of induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 17 (6), 1954-1974 (2021).
  3. Raab, S., Klingenstein, M., Liebau, S., Linta, L. A comparative view on human somatic cell sources for ipsc generation. Stem Cells Int. 2014, 768391(2014).
  4. Sauer, V., et al. Human urinary epithelial cells as a source of engraftable hepatocyte-like cells using stem cell technology. Cell Transplant. 25 (12), 2221-2243 (2016).
  5. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
  6. Quirynen, M., Siawasch, S. aM., Yu, J., Miron, R. J. Essential principles for blood centrifugation. Periodontol 2000. 97 (1), 43-51 (2025).
  7. Perry, J. N., Jasim, A., Hojat, A., Yong, W. H. Procurement, storage, and use of blood in biobanks. Methods Mol Biol. 1897, 89-97 (2019).
  8. Meraviglia, V., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids. J Vis Exp. (100), e52885(2015).
  9. Yang, W., et al. iPSC reprogramming from human peripheral blood using Sendai Virus mediated gene transfer. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  10. Cerneckis, J., Cai, H., Shi, Y. Induced pluripotent stem cells (ipscs): Molecular mechanisms of induction and applications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 112(2024).
  11. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  12. guidelines on drawing blood: best practices in phlebotomy. , World Health Organization. Geneva. (2010).
  13. Robb, L. Cytokine receptors and hematopoietic differentiation. Oncogene. 26 (47), 6715-6723 (2007).
  14. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3 B 1-A3 B 3 (2015).
  15. Chen, G. Splitting hESC/hiPSC lines with EDTA in feeder free conditions. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  16. Zeltner, N., Lafaille, F. G., Fattahi, F., Studer, L. Feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (87), e51609(2014).
  17. Zhang, X., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7 (1), 90-100 (2010).
  18. Lin, Y., Zou, J. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in fully chemically defined conditions. STAR Protoc. 1 (1), (2020).
  19. Technau, U. Brachyury, the blastopore and the evolution of the mesoderm. Bioessays. 23 (9), 788-794 (2001).
  20. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a psc-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  21. Kanai-Azuma, M., et al. Depletion of definitive gut endoderm in sox17-null mutant mice. Development. 129 (10), 2367-2379 (2002).
  22. Kirkeby, A., Main, H., Carpenter, M. Pluripotent stem-cell-derived therapies in clinical trial: A 2025 update. Cell Stem Cell. 32 (1), 10-37 (2025).
  23. Verma, I., Seshagiri, P. B. Current applications of human pluripotent stem cells in neuroscience research and cell transplantation therapy for neurological disorders. Stem Cell Rev Rep. 21 (4), 964-987 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

mononuclear NANOG

مقالات ذات صلة