مقالة منهجية

بروتوكول موحد لتقييم سمية الكادميوم في عضويات القولون والمستقيم البشرية عبر اختبار قابلية البقاء باستخدام اللوسيفراز

DOI:

10.3791/70531

⸱

يوليو 21, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 2College of Life Science, North China University of Science and Technology, 3Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف البروتوكول إلى تحديد عضويات القولون والمستقيم البشرية وتقييم اختبار التلألؤ الحيوي ATP القائم على اللوسيفيراز للكشف عن السمية الناتجة عن الكادميوم. يقيم جدوى الاختبار وحساسيته من خلال قياس التغيرات المعتمدة على الجرعة والوقت في قابلية العيش العضوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصنف الكادميوم (Cd) كمادة مسرطنة من المجموعة الأولى ويشكل مشكلة بيئية عالمية خطيرة. هدفت هذه الدراسة إلى إنشاء نموذج عضوي للقولون والمستقيم البشري وتقييم جدوى وحساسية اختبار التلميع الحيوي ATP القائم على اللوسيفيراز لاكتشاف الاستجابات السامة للعضويات القولونية المستقيمة (COs) للتعرض للكلوديوم. تم عزل الخلايا الجذعية من نسيج القولون والمستقيم البشري وزراعتها في مصفوفة غشاء قاعدة ثلاثية الأبعاد لتوليد COs. تمت معالجة الأعضاء بسلسلة متدرجة من تركيزات الكلاديوم لفترات تعرض مختلفة. تمت إضافة مادة حيوية مضيئة بنسبة حجم متساوية، وخلطت بلطف عن طريق التأرجح في درجة حرارة الغرفة لتعزيز التحلل واختراق الكاشف، ثم حضنتها للسماح بتفاعل التوهج الحيوي بالاستمرار. تم تسجيل التوهج في وضع التلميع على قارئ ميكرولوح متعدد الأوضاع. تم استخدام ملاءمة منحنى الجرعة-الاستجابة لحساب تركيز التثبيط نصف الأقصى وتقييم التغيرات في قابلية العيش أو القابلية النسبية. تم عزل الخلايا الجذعية الأولية بنجاح من أنسجة القولون والمستقيم البشري واستخدمت لتوليد COs. أدى التعرض للكلوديوم إلى انخفاض في النشاط الأيضي العضوي يعتمد على الجرعة والوقت اللازم؛ أسفر تحليل الجرعة-الاستجابة عن منحنيات بقاء وقيم IC50 للعضويات. توفر هذه الدراسة إرشادات منهجية ورؤى عملية لاستخدام مساعدي العمالة البشرية في دراسات سموم المعادن الثقيلة البيئية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكلوديوم هو معدن ثقيل طبيعي يصنف كمادة مسرطنة من المجموعة الأولى، وأصبح مصدر قلق بيئي عالمي1. يحدث التعرض البشري للكلوديوم بشكل أساسي عن طريق الاستنشاق وتناول الطعام الغذائي. على الرغم من أن التعرض المزمن للجرعات المنخفضة مرتبط بمجموعة من النتائج الصحية السلبية، إلا أن تقليل استخدامه وإطلاقه البيئي بشكل كبير لا يزال تحديا 2,3. تنمو الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد على ركائز مسطحة وتفتقر إلى بنية الأنسجة، وقطبية الخلية، والبيئة الدقيقة للورم. وبالتالي، فهي تمتلك قدرة محدودة على إعادة التغاير في الجسم الحي واستجابات سمية حقيقية للتعرض للكادميوم4. لا تستطيع هذه الأنظمة نمذجة التفاعلات بين الخلايا بشكل كاف، أو النمو المعتمد على المصفوفة، أو العمليات البيولوجية التي تقوم عليها تطور مقاومة الأدوية5. الأنظمة العضوية ثلاثية الأبعاد المشتقة من أنسجة المريض توفر منصة أكثر فسيولوجيا مقارنة بخطوط الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية6. تحتفظ الأعضاء بخصائص الجينوم، والتنظيم النسيجي، والحالات الوظيفية للنسيج الأولي. يتيح ذلك نمذجة أكثر دقة لنمو الأورام وتطورها وحساسيتها لسمية الكادميوم، مما يوفر مزايا واضحة لنمذجة الأمراض وأبحاث علم السموم7. تمتلك الوحدات التنظيمية بنية ثلاثية الأبعاد معقدة، وتباين خلوي، وقدرات جوهرية على التجديد الذاتي والتنظيم الذاتي8،9. يمكن لزراعة COs في فئران المتلقية أن تعزز تجديد الخلايا الجذعية المعوية ذاتيا وتعدل البيئة الدقيقة المناعية للمضيف، مما ينتج تأثيرات وقائية4. في عام 2009، أظهر ساتو وآخرون لأول مرة أن خلية جذعية معوية بالغة واحدة من Lgr5⁺ يمكنها أن تنظم نفسها وتتمايز تلقائيا لتشكيل هياكل كريبت-فلوس تشمل جميع سلالات خلايا الأمعاء10.

تشكل ظهارة الأمعاء خط الدفاع الأول ضد تسمم الأقراص المدمية بعد ابتلاعه. في الواقع، يكون التوافر البيولوجي الفموي للكلوديوم عادة أقل من 5٪. تتميز السمية المعوية الناتجة عن الكلسميوم بتعطيل الوصلات بين الخلايا، وزيادة نفاذية الخلايا الجانبية، وتحفيز الاستجابات الالتهابية. علاوة على ذلك، يعطل ال CD وظيفة المناعة المعوية ويغير تركيب وتوازن ميكروبيوتا الأمعاء11. اعتمادا على جرعة التعرض ومدة التعرض للمدة، يمكن أن يسبب الانسداد الخلوي اختلال في تنظيم دورة الخلية، مما يعزز الأنماط الظاهرية المسرطمة في بعض السياقات بينما يحفز الاستماتة المبرمجة في سياقات أخرى. يمكن للكهلود المزمنة أن يحفز بشكل غير مباشر إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، مما يسبب الإجهاد التأكسدي واختلال الأكسدة والاختزال. يمكن تعديل وظيفة المستقبلات، الكينازات، الفوسفاتازات، البروتيازات، جزيئات الالتصاق، وعوامل النسخ عبر إشارات الاختزاز (الأكسدة). كما يعكر Cd سلاسل الإشارات، مما يغير حالة تنشيط ERK1/2 وJNK (كيناز N-terminal c-Jun)، وp38 MAPK (كيناز بروتين منشط بميتوجين p38) عبر عدة أنواع خلايا12. من خلال تفعيل ERK1/2 داخل سلسلة MAPK، يمكن للكلوديوم تعزيز تكاثر الخلايا وبقائها، ومنع موت الخلايا المبرمج، والمساهمة في فرط التكاثر الشاذ13. يمكن للكلوديوم أن ينظم بشكل مباشر أو غير مباشر تعبير ونشاط البروتينات المؤثرة الرئيسية. على سبيل المثال، يقلل من تنظيم مثبط الورم p53 ويرفع من تنظيم البروتينات المضادة للاستماتة مثل Bcl-2 وBcl-xL، مما يؤدي في النهاية إلى تعطل الاستماتة المبرمجة وتوازن دورة الخلية14.

في نماذج CO المستخدمة لتقييم التأثيرات السمية للسيلوديوم، يستخدم قياس محتوى ATP على نطاق واسع لتقييم فعالية العضويات. ATP، الجزيء المركزي لاستقلاب الطاقة، يعكس مباشرة الحالة الأيضية العامة وقابلية العيش للعضويات. عند التعرض للكادميوم في COs، يسبب الكلوديوم بشكل أساسي خلل في وظيفة الميتوكوندريا، ويزيد من الإجهاد التأكسدي، ويعطل توازن الطاقة العضوية. هذه الأحداث مجتمعة تعيق إنتاج ATP وفي النهاية تقلل من قابلية العضويات. لذلك، فإن التغيرات في مستويات ATP تعمل كقراءة وظيفية قوية لتسمية الخلايا الناتجة عن الكادميوم. تشمل اختبارات السمية الخلوية التقليدية اختبارات MTT/CCK-8 اللونية، والتلوين الحي/الموت، والتحليلات القائمة على قياس تدفق الخلايا الخلوي. مقارنة بهذه الطرق، تقدم الاختبارات المعتمدة على ATP مزايا واضحة في الأنظمة العضوية ثلاثية الأبعاد. نظرا للتعقيد البنيوي والتباين المكاني الواضح للعضويات، غالبا ما تكون طرق التلوين والتصوير التقليدية محدودة بسبب نقص اختراق الأنسجة وانخفاض الدقة الكمية. على النقيض من ذلك، تعتمد اختبارات ATP على تفاعل مضيء حيوي بوساطة لوسيفيراز، مما يتيح القياس المباشر دون التأثير على البنية العضوية. يظهر قياس ATP حساسية عالية ونطاق ديناميكي واسع. يتيح ذلك الكشف عن الاستجابات البيولوجية المستمرة، بدءا من الكبت الأيضي المبكر إلى موت العضويات، مما يسهل تحليلات دقيقة للجرعة-الاستجابة عبر تركيزات مختلفة من الكادميوم. تعكس مستويات ATP بشكل شامل الحالة الوظيفية العامة للعضويات، متفوقة على الأساليب المعتمدة على التقييم الشكلية أو العلامات الجزيئية الفردية. وبالتالي، فإن هذا الاختبار مناسب بشكل خاص لفحص السمية عالي الإنتاجية، مما يوفر استقرارا وقابلية تكرار أفضل.

المبدأ الأساسي الذي يقوم عليه استخدام التلألؤ الحيوي ATP لتقييم حساسية أكسيد الكربون للتعرض للكلوديوم هو أن لوسيفيراز اليراعات يحفز أكسدة D-لوسيفيرين في وجود ATP وMg2⁺ وO₂ لإنتاج الأوكسيلوسيفيرين وإصدار فوتونات. شدة الضوء المنبعث تتناسب مع محتوى ATP القابل للقياس في العينة ضمن نطاق خطي محدد. لذلك، يعمل التلميع كبديل كمي غير مباشر للنشاط الأيضي الخلوي أو قابلية البقاء. تدمج العضويات في مصفوفة خارج الخلية وتمتلك بنية ثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات. ولاستيعاب ذلك، تتميز كواشف اختبار ATP بتركيبات وإجراءات محسنة للتحليل والمخزن المؤقت (LIS-BUFFER). تحسن هذه التحسينات اضطراب الخلايا العضوية الداخلية، وتعزز إطلاق ATP، وتثبت إشارة التوهج الحيوي15. ومن المهم أن التوهج الحيوي ATP يبلغ عن نشاط أيضي وليس عن عدد دقيق للخلايا. على سبيل المثال، يمكن لمثبطات الميتوكوندريا أن تقلل بشكل ملحوظ من مستويات ATP الخلوي على فترات قصيرة حتى مع بقاء الخلايا سليمة. وعلى العكس، قد تحافظ بعض أشكال موت الخلايا المبكرة على مستويات ATP مرتفعة نسبيا بشكل مؤقت.

على الرغم من إظهار أهمية فسيولوجية متفوقة في تقييمات سمية الكادميوم (Cd)، تقدم نماذج العضوية القولونية المستقيمة عدة قيود عملية. مقارنة بخطوط الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية (2D)، فإن زراعة العضوية أكثر استهلاكا للوقت وتكلفة. علاوة على ذلك، فإن اعتمادها على المصفوفات المشتقة من الحيوانات يسبب تباينا من دفعة إلى أخرى، مما يحد من فائدتها في فحص السمية واسعة النطاق وعالية الإنتاجية. بينما تعتبر هذه النماذج مناسبة جدا لتقييم التأثيرات السمية المباشرة للمعادن الثقيلة على الظهارة المعوية، إلا أنها لا تستطيع بعد استبدال النماذج الحية بالكامل لتقييم السمية الجهازية أو العمليات المعقدة السامة السوية.

في هذه الدراسة، تم استخدام نسيج القولون والمستقيم البشري كمادة مصدر لعزل الخلايا الجذعية للقولون والمستقيم وتحديد COs في المختبر. تعرضت العضويات للكلوديوم بتركيزات مختلفة ولفترات تعرض مختلفة. ثم تم قياس التلمع باستخدام قارئ الميكرولوح متعدد الأوضاع في وضع كشف اللمعان. تم حساب وعرض قيم قابلية الخلايا أو IC50 باستخدام برنامج تشغيلي لقارئ ميكرولوح معين.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على التجربة من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الصحة المهنية في سوتشو (رقم الموافقة: SWYXLL202516) وأجريت وفقا لمعايير الأخلاقيات الطبية. قدم جميع المشاركين في هذا البحث موافقة مكتوبة مستنيرة.

1. عزل أنسجة القولون والمستقيم البشرية وتكوين أكسيد الأكسيد

  1. نقل وحفظ عينات الأنسجة
    1. قبل التجربة، قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي ببطء عند 4 درجات مئوية، وتوازن وسط الزراعة المطلوبة مع درجة حرارة الغرفة.
    2. وضع نسيج القولون والمستقيم البشري المستخرج من الإجراءات السريرية فورا في محلول حفظ الأنسجة المبرد مسبقا (2–8 درجات مئوية).
      ملاحظة: تأكد من بقاء النسيج مغمورا بالكامل أثناء النقل. انقل العينات إلى المختبر.
  2. تحت خزانة السلامة البيولوجية، ضع المنديل في طبق زراعة بحجم 6 سم للتقييم. قم بإزالة الأنسجة الدهنية الظاهرة وطبقات العضلات بعناية باستخدام المشرط والملاقط، مع الاحتفاظ بمكونات الظهارة.
  3. انقل النسيج إلى طبق بحجم 6 سم يحتوي على 3 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 300 ميكرولتر من المضادات الحيوية. اقطع الأنسجة إلى شظايا بحجم 2 مم × 5 مم.
  4. انقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل.
  5. أضف 10 مل من PBS المبرد مسبقا و200 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (التركيز النهائي ~10 ملليمتر) إلى الأنبوب.
  6. ضع الأنبوب على شاكر في درجة حرارة الغرفة وحركه بلطف عند 0.072 جرام لمدة 15 دقيقة.
  7. استخدم الملقط لنقل النسيج إلى طبق الزراعة وفحصه تحت المجهر. انتقل إلى الخطوة التالية بمجرد أن تصبح هياكل القبو مرئية أو تبدأ في الانفصال.
    ملاحظة: عندما تصبح هياكل القبو مرئية تحت المراقبة المجهرية بعد علاج EDTA، يكون الهضم قد وصل عادة إلى مستوى كاف لعزل القبو، وتبدأ القبو في الانفصال عن شظايا الأنسجة الظهارية المرتخية. عادة ما تحتفظ القبو السليمة بشكل غددي أو أنبوبي محدد جيدا مع تجويف مركزي واضح، بينما يؤدي الهضم المفرط إلى أعداد كبيرة من الخلايا المفردة المفككة والحطام النخر.
  8. توقف الهضم بمجرد ظهور العديد من القنابير السليمة وظهور شظايا الأنسجة بشكل فضفاض وشفاف، مما يسمح بعمل الماصات اللطيف بإطلاق القبوبات بسهولة.
    ملاحظة: الحضانة المطولة ل EDTA تعطل سلامة القبح، وتزيد من تراكم الحطام الخلوي، وتقلل من قدرة الخلايا الجذعية المعوية، مما يقلل من كفاءة تكوين الخلايا العضوية لاحقا.
  9. أضف 15 مل من PBS المكملة بالمضادات الحيوية لإيقاف هضم EDTA. اخلط بلطف.
  10. قم بالطرد المركزي للعينة عند حرارة 300 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  11. أزل السوبرناتانت.
  12. أضف 1 مل من وسط الخلية الكامل وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 مل.
  13. قم بعمل جهاز التعليق المركزي عند 300 × جرام لمدة 3 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت.
  14. أضف 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل وامزج جيدا.
  15. قلل من التعرض لدرجة حرارة الغرفة أثناء الخلط وحافظ على مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد لمنع التصلب المبكر.
  16. أضف 25 ميكرولتر من الخليط بشكل قطري في كل بئر من صفيحة 24 بئر لتكوين قطرة.
  17. اقلب صفيحة 24 بئر وحضنها على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة.
  18. أضف 600 ميكرولتر من وسط زراعة أول أكسيد الكربون إلى كل بئر.
  19. احصل على وسط زراعة العضويات القولونية والمستقيم ومواد التفكك من مصادر تجارية واستخدمها وفقا لتعليمات المصنعين بدقة.
  20. لتحضير وسط زراعة الخلايا الكامل، أضف 500 مل من الوسط الأساسي DMEM إلى 50 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) و5 مل من البنسلين-ستريبتومايسين. اخلط المحلول جيدا عن طريق الانقلاب اللطيف.

2. اختبار حساسية المعالجين المعرضين للكلوديوم

  1. الطلاء وزراعة COs في صفائح بئر 96
    1. تخلص من وسط الزراعة من كل بئر وأضف 500 ميكرولتر من محلول تفكك العضويات. قم بعمل الماصة بلطف لأعلى ولأسفل لتشتيت مصفوفة الغشاء القاعدي.
    2. ضع الطبق المعالج في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون للهضم، مع وقت هضم أولي 10 دقائق.
    3. اجمع محلول الهضم من كل بئر من صفيحة 24 بئرا في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل وأضف 10 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل.
    4. استخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 3 دقائق لجمع العضوي والتخلص من السوبرناتان.
    5. أضف 1 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل، وامزجه جيدا عن طريق التنبيه، وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    6. استخدم جهاز الطرد المركزي عند حرارة 300 × جرام لمدة 3 دقائق، ثم تخلص من السوبرناتانت.
    7. أضف 100 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي وامزج جيدا عن طريق التوصيل بالماصات.
    8. قم بتفكيك الأعضاء وتقدير عدد الخلايا المفردة تحت المجهر قبل زرع حوالي 3000–5000 خلية منفردة في كل بئر.
    9. الحفاظ على كثافة بذور متسقة نسبيا عبر جميع المجموعات التجريبية لضمان نمو عضوي قابل للتكرار ونتائج تجريبية.
    10. تعديل نطاق البذور بناء على التقييم المجهري بعد تفكك الأعضاء وعلى الحالات المبلغ عنها سابقا والتي تستخدم عادة في دراسات الزراعة العضوية.
    11. أضف 6 ميكرولتر من الخليط إلى مركز كل بئر من صفيحة بسعة 96 بئر. استخدم 30 بئرا إجمالا، مع ثلاث نسخ تقنية.
    12. اقلب اللوحة وحضنها عند 37 درجة مئوية في حاضنة بسعة 5٪ CO₂ لمدة 15 دقيقة.
    13. أضف 100 ميكرولتر من وسط الزراعة العضوية إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا.
    14. ابدأ معالجة الكادميوم بعد 7 أيام بالضبط من البذر.
      ملاحظة: تسمح فترة الزراعة التي تستمر 7 أيام هذه للخلايا المفردة بالتطور الكامل إلى COs سليمة هيكليا.
  2. تخفيف تركيز الأقراص المدمجة
    1. قم بإذابة 3.67 ملغ من مسحوق كلوريد الكادميوم في 2 مل من ماء فائق النقي المعقم لتحضير محلول مخزون بحجم 10 ملليمول بحجم نهائي 2 مل.
    2. تعقيم محلول الكادميوم بسعة 2 مل من 10 مللي مول عن طريق تمريره عبر مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر.
    3. أليكوت محلول الكادميوم المعقم في أنابيب طرد مركزي بسعة 1.5 مل وتخزينها عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
    4. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك معطف مختبر وقفازات واقية ونظارات أمان، طوال فترة التجربة.
    5. قم بجميع العمليات ذات الصلة داخل غطاء أبخرة كيميائي لتقليل مخاطر التعرض.
    6. تصنيف وإدارة جميع النفايات التي تحتوي على أقراص مدمجة، بما في ذلك وسائط الزراعة المكملة بالكادميوم، وأصوات الماصات، وأنابيب الطرد المركزي، وأطباق الزراعة، كنفايات كيميائية خطيرة.
    7. تخلص من هذه المواد في حاويات مخصصة لجمع السوائل المعدنية الثقيلة أو النفايات الصلبة.
    8. التخلص من جميع النفايات وفقا لإرشادات المؤسسات واللوائح البيئية المحلية بدقة.
    9. لا تعامل أبدا نفايات الأقراص المدمجة كأنها نفايات مختبرية عامة أو تصبها في الحوض.
    10. ضع علامة على غطاء صفيحة ذات 24 بئر 4، 3، 2، 1، و0.
      ملاحظة: عالج الأعضاء ب Cd بتركيزات نهائية 40 ميكرومو، 20 ميكرومولار، 10 ميكرومولار، 5 ميكرومولار، و0 ميكرومولار. تم حساب تخفيف محلول مخزون الكادميوم باستخدام الصيغة القياسية:
              C1 V1 = C2 V2
  3. لتحضير 4 مل من تركيز العمل 20 ميكرومولار، أضف 8 ميكرولتر من محلول مخزن 10 ملليمول إلى 3992 ميكرولتر من وسط الزراعة الكامل. اخلط المحلول جيدا لضمان توزيع منتظم.
    1. أضف 1.4 مل من وسط الزراعة إلى البئر المصنف 4 وأضف 700 ميكرولتر من وسط الزراعة إلى كل بئر من البئر المتبقية.
    2. أزل 5.6 ميكرولتر من وسط الزراعة من ال 4 الموسوم ببئر وأضف 5.6 ميكرولتر من محلول الكادميوم. اخلط جيدا.
    3. انقل 700 ميكرولتر من المحلول من البئر المسمى '4' إلى البئر المسمى '3' وامزجه جيدا.
    4. كرر عملية النقل والخلط من كل بئر إلى البئر التالي الأقل رقما (من '3' إلى '2'، '2' إلى '1'، ومن '1' إلى '0')، مع المزج الجيد في كل خطوة.
      ملاحظة: لا تجري أي عملية في العلامة 0 بجيد.
    5. قم بإزالة صفيحة 96 بئر من الحاضنة وتخلص من وسط الزراعة الحالي.
    6. ضع علامة على غطاء لوحة البئر 96 من اليسار إلى اليمين ب 40 ميكرومو، 20 ميكرومولار، 10 ميكرومولار، 5 ميكرومولار، و0 ميكرومولار.
    7. أضف 100 ميكرولتر من وسط الزراعة المحتوي على الكادميوم إلى كل بئر معنون مقابل.
    8. ضع الطبق في الحاضنة.

3. إضافة مادة القابلية للحياة المتوهجة

  1. قم بإزالة مادة الإضاءة من الفريزر بدرجة حرارة −20 درجة مئوية ودعه يذوب في درجة حرارة الغرفة. أضف مادة الكاشف المضيء للحياة بنسبة حجم 1:1.
  2. أضف 2.5 مل من كاشف الحيوية المتوهج إلى خزان كاشف قابل للتصرف.
  3. أضف 2.5 مل من وسط زراعة العضو القولون والمستقيم وامزج جيدا عن طريق استخدام الماصات.
  4. استخدم نظام شفط النفايات لإزالة وسط الزراعة العضوية من كل بئر في صفيحة 96 بئرا. تجنب استنشاق مصفوفة الغشاء القاعدي من الآبار.
  5. انقل 200 ميكرولتر من المحلول من خزان الكاشف القابل للتخلص مرة واحدة إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر تحتوي على COs، وامزج جيدا عن طريق الأنابيب القوية. تجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء التنبيه.
  6. حضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. حضن في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.

4. قياس مادة القابلية للحياة المتوهجة

  1. افتح البرنامج التشغيلي لقارئ الميكروبليت المحدد (الشكل الإضافي 1A).
  2. انقر اقرأ الآن (الشكل الإضافي 1B).
  3. انقر على جديد (الشكل الإضافي 1B).
  4. انقر على القراءة (الشكل الإضافي 1C).
  5. اختر التلميع (الشكل الإضافي 1D).
  6. اختر ألياف التلميع (الشكل الإضافي 1D).
  7. انقر موافق (الشكل الإضافي 1D).
  8. اختر الطبق الكامل (الشكل الإضافي 1E).
  9. انقر على مسح الجميع (الشكل الإضافي 1F).
  10. اختر المواقع المقابلة على لوحة الهدف ذات 96 بئرا، ليصبح المجموع 15 بئرا (الشكل التكميلي 1G).
  11. انقر حسنا (الشكل الإضافي 1G).
  12. ضع لوحة ال 96 بئر داخل الجهاز (الشكل التكميلي 1H).
  13. اختر استخدام غطاء (الشكل الإضافي 1I).
  14. انقر موافقا لبدء القياس (الشكل الإضافي 1I).
  15. بعد الانتهاء من القياس، انقر على التصدير لتصدير البيانات إلى إكسل (الشكل التكميلي 1J).

5. معالجة البيانات وتحليلها

  1. برنامج تحليل البيانات الإحصائية المفتوح القادر على الانحدار غير الخطي. (الشكل الإضافي 2A).
  2. اختر جدول بيانات XY (الشكل التكميلي 2A).
  3. اضبط X على الأرقام (الشكل الإضافي 2A).
  4. اضبط Y للإدخال وتكرار القيم في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب وأدخل 3 نسخ (الشكل التكميلي 2A).
  5. هنا تأتي البيانات (الشكل التكميلي 2B).
  6. تحليلات النقر (الشكل التكميلي 2C).
  7. انقر على تحليلات XY (الشكل التكميلي 2D).
  8. انقر على الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى) (الشكل التكميلي 2D).
  9. انقر موافق. (الشكل الإضافي 2D).
  10. اختيار الجرعة–الاستجابة – التثبيط (الشكل التكميلي 2E).
  11. اختر لوغاريتمية (مثبط) مقابل الاستجابة الطبيعية – ميل متغير (الشكل التكميلي 2E).
  12. انقر موافقا لتشغيل التحليل (الشكل التكميلي 2E).
  13. انقر على الملف (الشكل التكميلي 2F).
  14. انقر على التصدير (الشكل التكميلي 2F).
  15. انقر على موافق (الشكل الإضافي 2G).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأسيس ضباط الضباط البشريين
نجحنا في عزل هياكل القبو القولوني المستقيم من عينات الأنسجة، وتم ملاحظة شكل القبة النموذجي بوضوح تحت المجهر منخفض وعالي التكبير. خلال الزراعة المختبرية، توسعت السراديب المعزولة تدريجيا وأظهرت عملية نضج مورفولوجية منظمة (الشكل 1A,B). بحلول اليوم الثالث والسادس من الزراعة، تكونت عضويات القولون والمستقيم سليمة هيكليا، تظهر بشكل رئيسي هياكل كروية أو شبيهة بالبراعم المبكرة (الشكل 1C,D).

حساسية المعالجين للتعرض للكلوديوم
تم زرع COs في صفائح بئر 96 وزرعت لمدة 5 أيام إضافية، تلتها معالجة بالكادميوم بتركيزات 0، 5، 10، 20، و40 ميكرومو. بعد 72 ساعة من التعرض، أجري اختبار لمعان قائم على ATP لقياس وحدات التلميع النسبي (RLU)، وتم تحليل البيانات وتصويرها. أظهرت النتائج انخفاضا كبيرا في فعالية العضوية المعتمدة على الجرعة مع زيادة تركيزات الكادميوم (الشكل 2A). أظهرت الأكسيد الكربون المعرضون لمستويات 10 ميكرومول، 20 ميكرومولار، و40 ميكرومولار في الكادميوم انخفاضا ملحوظا في قيم RLU (الشكل 2B). لم نلاحظ سمية كبيرة في الأعضاء القولونية المستقيمة المعرضة ل 5 ميكرومولار قرص مسني. تماشيا مع بيانات القابلية للحياة، كشفت التحليلات الشكلية عن تغيرات هيكلية واضحة في عضويات القولون والمستقيم المعالجة بالكادميوم، بما في ذلك تقليل حجم العضويات، والاضطراب الشديد في بنية الظهارة، والتجزئة الهيكلية التدريجية (الشكل 2C). تشير هذه النتائج إلى أن عضويات القولون والمستقيم حساسة جدا للسمية الخلوية الناتجة عن الكادميوم.

figure-results-1
الشكل 1: عزل القبو القولونية والمستقيمية البشرية وإنشاء مزارع عضوية القولون والمستقيم. (أ) صورة تمثيلية لسراديب القولون والمستقيم المعزولة للبشر. (10×). (ب) عرض عالي التكبير لسرداب واحد (20×). (ج) صورة تمثيلية للكائنات بعد 3 أيام في الزراعة (4×). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التغيرات السامة الخلوية والشكلية الناتجة عن الكلوديوم في COs. (أ) منحنى الجرعة-الاستجابة النسبية للكبسولين المعرضين لتركيزات مختلفة من الكلوديوم. يمثل المحور x تركيزات Cd، ويشير المحور y إلى قابلية الحضور العضوية نسبيا. (ب) قيم RLU النسبية لوحدات المعالجة بعد المعالجة بتركيزات مختلفة من ال Cd. يمثل المحور X تركيزات Cd، ويمثل محور Y قيم RLU النسبية. ANOVA أحادي الاتجاه *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.0001. (ج) صور مجال ساطع تمثيلية لأكسيد الكربون غير المعالج (0 ميكرومول) ومعالج بالكاسيد عند 5 ميكرومتر، 10 ميكرومولار، 20 ميكرومولار، 40 ميكرومولار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: سير عمل مفصل مكون من 16 خطوة لاكتشاف RLU باستخدام البرنامج التشغيلي لقارئ ميكرولوح معين. (أ) أيقونة البرمجيات. (ب) واجهة إطلاق البرمجيات. (ج) قائمة الإعدادات. (د) واجهة اختيار الاختبار. (ه) قائمة تكوين ترتيب الطبق. (و) تخطيط الألواح الافتراضي. (ز) تكوين مواقع الآبار وفقا لترتيب الألواح التجريبية. (ح) تحميل الصفيحة الصغيرة. (1) يبدأ الجهاز قياس RLU. (J) تصدير البيانات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: بعد تصدير البيانات، يتم إجراء معالجة البيانات والتحليل الإحصائي باستخدام برامج تحليل البيانات الإحصائية. (أ) الشاشة الرئيسية. (ب) جدول إدخال البيانات. (ج) حوار تحليلي. (د) قائمة معلمات التحليل. (ه) قائمة التكوين للانحدار غير الخطي. (و) قائمة خيارات الملفات. (G) حوار تصدير البيانات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تضع هذه الدراسة بروتوكولا موحدا للتعرض للكادميوم واختبارات قابلية بقاء ATP باستخدام COs لتقييم تأثير الكادميوم على صلاحية العضوية العضوية. يقوم هذا البروتوكول تحديدا بتحسين تفكك الأعضاء وخطوات طلاء 96 بئر لتعزيز قابلية التكرار التجريبي واستقرار قراءات اختبار ATP اللاحقة. على الرغم من أن البروتوكول التجريبي الحالي يركز بشكل أساسي على إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد لسرطان القولون والمستقيم العضوي لتقييم سمية الأقراص المدمية، إلا أن الأبحاث المكثفة أظهرت أن زراعات الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية والنماذج العضوية ثلاثية الأبعاد تختلف بشكل كبير في استجابات الأدوية، والتفاعلات بين الخلايا والخلية، وبنية الأنسجة، والسموم. مقارنة بالطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد، تعيد الأعضاء بشكل أكثر دقة البنية المكانية، وتباين الخلية، والبيئة الدقيقة الشبيهة بالأورام في الجسم الحي، مما يوفر أهمية فسيولوجية فائقة. نظرا لغياب التفاعلات المعقدة بين الخلية والخلية والخلية الخارجية (ECM)، قد تفشل استجابة الثقافات ثنائية الأبعاد للتعرض للمعادن الثقيلة في التقاط العمليات السمية الحقيقية في الجسم الحيبدقة 16. وعلى العكس، فإن نموذج أول أكسيد الكربون الذي تم تأسيسه في هذه الدراسة يحاكي ديناميكيات النمو ثلاثية الأبعاد لأنسجة الورم بفعالية، مما يوفر منصة فسيولوجية ذات صلة عالية لتقييم السمية الناتجة عن ال Cd.

أثناء مرور الأعضاء العضوي، كان وقت الانفصال يحافظ عليه بدقة عند حوالي 10 دقائق. يمنع هذا التحسين التفكك غير الكامل، الذي يؤدي إلى تجمعات الخلايا الكبيرة جدا، مع تجنب أيضا التفكك الزائد، الذي ينتج عنه عدد كبير من الخلايا المفردة. من خلال التحكم الدقيق في مدى الانفصال، حققنا هياكل عضوية متجانسة نسبيا، مما عزز اتساق العلاجات الدوائية اللاحقة واختبارات قابلية الفعالية ل ATP.

استخدمنا نظام زراعة عالي الإنتاجية ل 96 بئرا وتوحيد حجم مصفوفة الطلاء الأرضية إلى 6 ميكرولتر لكل بئر. يقلل هذا التوحيد من التباين بين الآبار من خلال ضمان كثافة عضوية متسقة وخصائص نمو عبر جميع الآبار، مما يحسن في النهاية قابلية تكرار التجارب وقابلية مقارنة البيانات. من خلال الربط بين اختبارات التلميع في ATP وتحليلات منحنيات الجرعة-الاستجابة باستخدام برامج تحليل البيانات الإحصائية، حققنا تقييما كمويا قويا للتغيرات في قابلية العيش العضوية بعد التعرض للكلوديوم. بشكل جماعي، تؤسس هذه الدراسة بروتوكولا تجريبيا قابلا للتكرار عالي لتطبيق نماذج العضوية في علم السموم البيئي والتعرض للمعادن الثقيلة.

خلال زراعة COs، يعد الخلط الشامل لحبيبات القبو مع مصفوفة الغشاء القاعدي خطوة حاسمة لضمان تكوين COs بشكل صحيح ونمو مستقر. يجب الحفاظ على نسبة مصفوفة الغشاء القاعدي فوق 70٪ (حجم مصفوفة الغشاء القاعدي > 70٪). حجم مصفوفة الأغشية القاعدية الموصى به هو 6 ميكرولتر لكل بئر لألواح 96 بئر، 20 ميكرولتر لكل بئر لألواح 48 بئر، و25 ميكرولتر لكل بئر لألواح 24 بئر. بعد بلمرة المصفوفة، أضف الأحجام التالية إلى الآبار: 100 ميكرولتر لكل بئر لألواح 96 بئر، 300 ميكرولتر لكل بئر لألواح 48 بئرا، و500 ميكرولتر لكل بئر لألواح 24 بئرا. يجب توخي الحذر لتجنب التوصيل المباشر للوسط على قباب مصفوفة الغشاء القاعدي، لأن ذلك قد يعطل البنية ثلاثية الأبعاد. للحفاظ على الاستقرار الظاهري والوراثي، حدت هذه الدراسة من استخدام عضويات القولون والمستقيم إلى حد أقصى 4 مرات.

عندما تصل القبوبات أو القطط إلى قطر يقارب 600 ميكرومتر أو تظهر عليها الظلام وتوقف النمو، يجب إجراء الانتقال بسرعة لتمكين تحليلات الحساسية لاحقة. أثناء التفكك الإنزيمي لأكسيد الكربونات، يجب مراقبة الهضم تحت المجهر. إذا لم يتم تفكيك COs بشكل كاف إلى مجموعات خلايا صغيرة أو خلايا منفردة، فقد يتم تمديد وقت الهضم تدريجيا بناء على حجم العضوية وحالة التفكك. يجب تجنب الهضم المطول في خطوة واحدة لتقليل خطر فرط الهضم وفقدان صلاحية الخلايا.

احسب الجدوى النسبية لكل بئر باستخدام المعادلة التالية، واستخدم النسبة المئوية المتوسطة من الآبار المكررة كقيمة استجابة لكل تركيز

 figure-discussion-1

يعتمد اختبار التلألؤ الحيوي ATP على أكسدة D-لوسيفيرين المحفزة من ناز اللوسيفيراز اليراعي، مما يؤدي إلى انبعاث فوتون. نظرا لحساسيتها العالية، وتوافقها مع صوت التوصيل العالية المعتمدة على اللواح، وتوفر مجموعات تجارية موحدة، تم تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع في الفحص الأولي للسمية في نماذج العضوية17.

يجب أخذ عدة عوامل مربكة في الاعتبار. قد تثبط بعض المواد الكيميائية تفاعل الإنزيمات اللوسيفيراز مباشرة من خلال التداخل الكيميائي أو الكبت الإنزيمي، مما يؤدي إلى تفريغ الإشارة. يمكن أن يؤدي التوهج الخلفي من المصفوفة خارج الخلية ثلاثية الأبعاد، والتباينات في حجم وكثافة العضويات، وعدم التحليل الكامل، إلى حدوث تباين كبير بين الآبار وبين الدفعات. لا يمكن للتوهج القائم على ATP وحده التمييز بدقة بين طرق موت الخلايا أو توضيح الآليات السمية الأساسية18.

لتعزيز الموثوقية المنهجية، يوصى باستخدام تدابير مراقبة جودة منهجية. باستخدام مخازن تحلل موصى بها من المصنع أو تم التحقق منها سابقا، ودورات تمديد وقت التحلل، أو التفكك الميكانيكي، أو دورات التجميد-الذوبان عند الحاجة لتحسين كفاءة تحلل الخلية داخل المصفوفة. ثانيا، إجراء تجارب استرداد المؤشر المثبت ATP أثناء تحسين الاختبار لتقييم التثبيط المباشر المحتمل للتفاعل المضيء بواسطة مركبات الاختبار أو بيئة التحلل. ثالثا، تأكيد نطاق الكشف الخطي باستخدام منحنى ATP القياسي والتحكم بدقة في التوقيت بين إضافة الكواشف، والحضانة، وقراءة الألواح لتقليل التفاوت التقني. وأخيرا، أضف ضوابط فارغة، ومركبة، وعوامل سلبية في كل اختبار ودمج نسخ تقنية كافية لتقييم وتصحيح تأثيرات الحواف والتغيرات المرتبطة بالدفعات. مؤخرا، تم تطوير عدة اختبارات محسنة للفعالية بالأورجينويدات مع تحسين كيمياء التحلل واستقرار الإشارة المحسن، وقد أظهرت هذه التركيبات بشكل عام أداء متفوقا في اختبارات السمية ثلاثية الأبعاد19. باختصار، استخدمت هذه الدراسة المعالجين البشريين كنموذج مختبر لسمية المعادن الثقيلة البيئية وأنشأت اختبارا عالي الإنتاجية وحساس يعتمد على التلألؤ الحيوي ATP لتقييم قابلية العضوية للتعرض للكلوديوم. يوفر هذا العمل مرجعا تجريبيا عمليا وإرشادا منهجية لتقييم السمية في أنظمة البحث القائمة على العضويات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد ساهم جميع المؤلفين بشكل كاف في العمل ووافقوا على أن يكونوا مسؤولين عن جميع جوانبه. فريق البحث المبتكر في العلوم والتكنولوجيا في مؤسسة جيانغسو للتعليم العالي (2021)، برنامج مركز أبحاث التكنولوجيا الهندسية في كلية جيانغسو المهنية (2023)، مركز أبحاث الهندسة في مقاطعة جيانغسو لتطوير وترجمة التقنيات الرئيسية للوقاية من الأمراض المزمنة والسيطرة عليها (2024)، مشروع مركز أبحاث الهندسة في مقاطعة جيانغسو للعلاج الجزيئي المستهدف والتشخيص المرافق في الأورام (SGK2202506)، برنامج مشاريع تكنولوجيا سبل عيش شعب سوتشو (منحة رقم: SYWD2024099)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الرئيسية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو في الصين (رقم المنحة 24KJA310008)، وبرامج كلية الصحة المهنية في سوتشو (رقم المنحة szwzy202406، رقم المنحة szwzy202304، رقم المنحة szwzy202320 والمكافحة رقم szwzy202308). مشروع تشينغ-لان لمقاطعة جيانغسو في الصين (2025). مشروع البحث الأساسي التطبيقي (الطبي والصحي) للابتكار في العلوم والتكنولوجيا / مشروع البحث الأساسي التطبيقي (الطبي والصحي) في سوتشو (SYW2024185)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILCFT011150
1mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesCLUXCELL321050
96-well platesCorning Incorporated220400
BioTek Cytation 5BioTek Co., LTD16280004البرنامج التشغيلي لقاريء الألواح الدقيقة المحدد.
Cadmium chloride,10gSigma202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability AssayVazymeDD1102-01/02/03عامل القابلية الحيوية المضيء بنسبة حجم 1: 1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)Mogenel BiotechnologyMA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Mediumthermo fisher6125552
ForcepsBeyotimeFS019
Ice boxBeyotimeFBX078
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40
MatrigelMogenel Biotechnology82755الغشاء القاعدي للمصفوفة
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01Lمحلول تفكيك الأورغانويدات
Penicillin-StreptomycinBeyotimeC0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032
PipettesRUININGPipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0GraphPad Softwareالبرنامج التشغيلي لقاريء الألواح الدقيقة المحدد.
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06S

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cancer Researchcadmiumcolorectal organoidsorganoids

مقالات ذات صلة