مقالة منهجية

عزل وتطبيق العلاج للحويصلات خارج الخلايا المشتقة من تجمعات الخلايا الجذعية المتوسطة المجمعة ذاتيا

DOI:

10.3791/70534

⸱

أبريل 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول العزل الفعال للحويصلات خارج الخلية الكبيرة (LEVs) عن تجمعات الخلايا الجذعية المجمعة ذاتيا وتطبيقها العلاجي لتجديد عظام الفك السفلي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي وسطاء حيويين للتواصل بين الخلايا وعوامل واعدة خالية من الخلايا في الطب التجديدي. بين مجموعات ال EV الفرعية، تعد الحويصلات خارج الخلية الكبيرة (LEVs) مناسبة بشكل خاص لإصلاح الأنسجة بسبب حمولتها الغنية بالتجدد. ومع ذلك، لا تزال الطرق الموحدة والقابلة للتكرار لتوليد LEVs المشتقة من الخلايا الجذعية الوظيفية لتوصيف المراحل النهائية والتقييم العلاجي محدودة. باستخدام الإمكانات العظمية الاستثنائية للخلايا الجذعية من الحليمة القمية (SCAPs)، طورنا نموذج زراعة ثلاثي الأبعاد في ظروف منخفضة الالتصاق لتحفيز تجمعات SCAP ذاتية التجميع. يحاكي هذا النموذج التكثف الفسيولوجي للميزانشيم، مما يعزز بشكل كبير التفاعلات بين الخلايا ويعزز إفراز LEV. يتم توفير معلمات رئيسية للزراعة وملاحظات التعامل لتحسين اتساق التجميع وتعظيم إنتاج LEV مع الحفاظ على استدامة الجهاز. هنا، نقدم بروتوكولا موحدا للإنتاج الفعال لأنظمة LEV المشتقة من SCAP الوظيفية، ويشمل توليد المجمع ثلاثي الأبعاد، والعزل عبر الطرد المركزي التفاضلي، وتحليل توزيع وتركيز حجم الجسيمات النانوية (NTA)، والتوصيل العلاجي باستخدام هيدروجيل متقاطع حراريا لإصلاح عيوب عظم الفك السفلي. يسهل هذا النهج إنتاج LEV للدراسات الميكانيكية اللاحقة والتقييم قبل السريري في تجديد الجمجمة والوجه. يضمن هذا السير المحسن التحضير القابل للتكرار لمواد LEVs الحيوية النشطة ذات إنتاجية متسقة وشحنات مغنية بالمنشطات العظمية، مما يسهل البحث الأساسي ويسرع الترجمة السريرية لإعادة بناء الجمجمة والوجه بوساطة EV. في التطبيقات التمثيلية، توفر LEVs المحملة بالهيدروجيل مستودعا محليا في مواقع العيوب وتسهل التعامل مع الوضع أثناء الانغراس. بشكل جماعي، توفر هذه الطريقة منصة قابلة للتوسع لإعداد LEVs المشتقة من SCAP وتبرز الاعتبارات الرئيسية للتقارير الموحدة وتصميم الدراسات الترجمية. يدعم هذا النهج تبنيا أوسع عبر مختبرات المركبات الكهربائية الجمجمية والوجهية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية مرتبطة بالغشاء تطلقها الخلايا وتتوسط في التواصل بين الخلايا من خلال نقل الحمولة الحيوية النشطة مثل البروتينات، والميكرو RNA، والدهون 1,2,3. بين مجموعات النسيج الكهربائي الكهربائي، تتميز الحويصلات خارج الخلية الكبيرة (LEVs) بإطلاقها المباشر من غشاء الخلية وإثرائها الفطري للجزيئات المؤيدة للتجديد، مما يجعلها مناسبة جدا لإصلاح الأنسجة ومتطلبات التجدد 4,5. في الطب التجديدي، تعتبر الخلايا الكهربائية المشتقة من الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) بشكل متزايد بديلا خاليا من الخلايا القابلة للحياة للعلاج بالخلايا الكاملة 6,7,8. تلخص هذه التقنيات تأثيرات التجدد الباراكرينية لخلايا MSC الأبوية مع تجنب قيود زراعة الخلايا المباشرة، مثل انخفاض كفاءة الطعم، والمناعة الحيوية، وتباين الدفعات 7,8,9,10. من بين مصادر MSC، تظهر الخلايا الجذعية من الحليمة القمية (SCAPs) قدرة تمايز عظمية وأسنانية فائقة 11,12,13، مما يجعل الخلايا الفضائية المشتقة من SCAP جذابة بشكل خاص لإصلاح عظام الوجه وأنسجة الأسنان 8.

ومن الجدير بالذكر أن التكوين البيولوجي والوظائف للسيارات الكهربائية يتأثران بشكل عميق بالبيئة الدقيقة الخلوية14,15. تختلف الزراعة التقليدية ذات الطبقتين الأحادية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) بشكل كبير عن سياق الأنسجة الأصلي16,17، وغالبا ما تنتج أوساط كهربائية ذات قدرة تجديدية ضعيفة18. على النقيض من ذلك، تكرر التجمعات الثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) المجمعة ذاتيا من الجوانب الرئيسية للتكثف الفسيولوجي الميزنكمي، وهي مرحلة تطورية تتميز بكثافة عالية للخلايا، وتلامس مكثف بين الخلية والخلية، ومصفوفة خارج الخلية (ECM) غنية بالدعم، والتي توفر دعما هيكليا وتقدم إشارات كيميائية وميكانيكية تنظم التصاق الخلية وهجرتها وقرارات المصير 19,20,21. هذا البيئة الدقيقة ثلاثية الأبعاد الحيوية لا تعزز فقط التواصل بين الخلايا والإشارات الباراكرينية22,23، بل تعزز أيضا إفراز المركبات الكهربائية ذات العائد الأعلى وملفات الشحن الحيوية النشطةالمحسنة 24,25,26. لذا يظهر استخدام تجمعات MSC ذاتية التجميع ثلاثية الأبعاد كاستراتيجية واعدة جدا للحصول على مركبات كهربائية قوية وظيفيا لتطبيقات التجديد.18.

على الرغم من المزايا الواضحة للسيارات الكهربائية المشتقة من المجمع، إلا أن البروتوكولات الموحدة لعزلها وتوصيفها من الأنظمة ثلاثية الأبعاد لا تزال غير متطورة. منهجيات عزل المركبات الكهربائية الحالية، مثل الطرد المركزي التفاضلي، راسخة جيدا وتوفر إطارا قابلا للتوسع لإنتاج المركبات الكهربائية27. وبالمثل، تم الإبلاغ عن طرق لتوليد تجمعات MSC، غالبا ما تعتمد على التواء والتجمع الخلوي الناتج عن فيتامين C من الخلايا المزروعة ثنائية الأبعاد28. ومع ذلك، قد تختلف بنية ECM داخل هذه التجمعات المستحثة من فيتامين C عن البيئة الدقيقة المنظمة مكانيا الشبيهة بالتكثف للأنسجة الميزانشيمية الأصلية. على النقيض من ذلك، فإن التجميع الذاتي الخالي من السقالات تحت ظروف الالتصاق منخفضة يسهل تكوين تجمعات كروية مضغوطة تقارب السمات الرئيسية لتكثف الميزنكيمي19,29. حاليا، هناك تدفق عمل منهجي وقابل للتكرار لعزل وتطبيق المركبات الكهربائية من مثل هذه التجمعات ثلاثية الأبعاد منخفضة الالتصاق في SCAP. من الناحية العملية، ينخفض إنتاج LEV من ثقافات SCAP ثنائية الأبعاد التقليدية عادة في نطاق ~1011 جسيمات/مل من خلال تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، ومن المتوقع أن يزيد التجميع ثلاثي الأبعاد منخفض الالتصاق من إنتاج LEV عدة مرات مع الحفاظ على قابلية التكرار للتطبيقات اللاحقة. لسد هذه الفجوة، نستعرض هنا بروتوكولا شاملا يستفيد من الوظائف الجوهرية الجوهرية للعظم/التوليد السني في SCAPs ويحسن البيئة الدقيقة ل MSC من خلال تجميع ثلاثي الأبعاد منخفض الالتصاق. يتيح هذا البروتوكول إنتاج موثوق لعلاجات LEV عالية الجودة، مما يوفر أداة موحدة لتطوير العلاجات التجديدية الخالية من الخلايا في طب الجمجمة والوجه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة العناية والاستخدام للحيوانات في الجامعة الطبية العسكرية الرابعة، وأجريت وفقا لإرشادات ARRIVE. تمت الموافقة على جمع واستخدام العينات البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في الجامعة الطبية العسكرية الرابعة (رقم الموافقة) IRB-REV-2022187). تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المتبرعين قبل جمع العينات؛ بالنسبة للمتبرعين الذين كانوا قاصرين أو غير قادرين على تقديم الموافقة، تم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من أوصيائهم القانونيين. جميع الكواشف كانت مفلترة بالتعقيم، وأجريت إجراءات زراعة الخلايا في خزانة سلامة حيوية للحفاظ على التعقيم (انظر جدول المواد). عامل جميع المواد المشتقة من الإنسان (الأسنان، الأنسجة، الخلايا الأولية، الأوساط المعدلة، ومستحضرات EV) على أنها محتملة العداء. قم بتنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالعينات البشرية في خزانة سلامة حيوية معتمدة باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك معطف المختبر، القفازات، وحماية العين. فيما يتعلق بالسلامة البيولوجية والتخلص من النفايات، اتبع إرشادات BSL-2 المؤسسية: التعامل مع جميع المواد المشتقة من الإنسان والمواد القابلة للتخلص من النفايات الملوثة كنفايات بيولوجية خطرة من نوع BSL-2؛ قم بتطهير الأسطح/المعدات بمطهر معتمد مؤسسيا بعد الاستخدام. جمع النفايات البيولوجية السائلة في حاويات معلمة وتعطيلها باستخدام طرق معتمدة قبل التخلص منها. تخلص من القطع الحادة فورا في حاويات الحاد المعتمدة (بدون إعادة تغطية). عامل أنسجة الحيوانات والجثث وبقايا التخدير/المواد الكيميائية كنفايات بيولوجية منظمة وتخلص منها عبر الخدمات المؤسسية وفقا للوائح المعمول بها.

1. العزلة وثقافة البشر في SCAPs

ملاحظة: P/S هو مزيج مضاد حيوي نشط حيويا وقد يسبب تهيج الجلد/العين أو ردود فعل تحسسية. المقبض في خزانة السلامة البيولوجية BSL-2 عند الفتح؛ ارتداء القفازات وحماية العين؛ تجنب توليد الهباء الجوي؛ والتخلص من النفايات وفقا لإرشادات النفايات الكيميائية المؤسسية. الكولاجناز النوع الأول (محلول) هو إنزيم نشط حيويا وقد يسبب تهيج الجلد أو العين أو ردود فعل تحسسية. المقبض في خزانة السلامة البيولوجية BSL-2؛ ارتداء القفازات وحماية العين؛ تجنب الرشات وتكوين الهباء الجوي أثناء التوصيل بالماصات; وتطهير التلوث بسرعة وفقا لإجراءات المؤسسات. حماية الكولاجناز النوع الأول من الضوء أثناء التخزين والاستخدام (انظر جدول المواد).

  1. اجمع الأضراس الثالثة ذات الرؤوس غير الناضجة من متبرعين أصحاء (16–21 سنة) وشطفها جيدا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 1٪ بنسلين/ستربتوميسين (P/S) (انظر جدول المواد).
  2. قم بتقشير نسيج الحليمة القمية من قمة الجذر باستخدام ملقط عيون معقم ومقص، ثم قطعها إلى قطع صغيرة (<1 مم3).
  3. انقل جميع شظايا الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل. اهضم الشظايا بجرعة 2 ملغ/مل كولاجناز النوع الأول على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، مع هز خفيف كل 15 دقيقة.
  4. توقف الهضم بإضافة حجم متساو من الوسط الأساسي الكامل α الأدنى (α-MEM) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: وقت هضم الكولاجيناز النوع الأول غير ثابت ويعتمد على حالة هضم الأنسجة. راقب عن كثب، وأنهي الهضم عندما تصبح الأنسجة شبه متآكلة بإضافة وسط. قد يؤثر فرط الهضم على بقاء الخلايا.
  5. قم بطرد المركزي بنظام تعليق الخلية عند 100 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتانت، وأعد تعليق الحبيبة في 2 مل من α-MEM الكامل.
  6. قم بزرع تعليق الأنسجة المهضوم في طبق بيتري بقطر 10 سم وأضف 8 مل من α-MEM الكامل إلى حجم نهائي 10 مل لكل طبق.
  7. تزرع SCAPs عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂.
    ملاحظة: مراقبة الزراعة باستمرار، عادة ما تهاجر الخلايا من شظايا الأنسجة وتلتحق بالطبق بنمط شعاعي خلال 3–7 أيام. إذا كانت قدرة الأنسجة على قيد الحياة ضعيفة أو لم يلاحظ أي هجرة خلايا خلال 5 أيام، انتقل إلى α-MEM كامل مدعوم بمصل 20٪.
  8. لمرور الخلايا، تم غسل الخلايا ب 5 مل من PBS لإزالة الوسط المتبقي بمجرد وصولها إلى 80–90٪ من التقام. بعد ذلك، تم حضانتها بجرعة 2 مل من 0.25٪ تريبسين-1 ملم EDTA عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تريبسين–إيدتا هو مهيج ويمكن أن يضر الجلد أو العين. استخدم القفازات وحماية العين، وتجنب الرش وتكون الرذاذ، واشطف فورا بالكثير من الماء إذا حدث تلامس. التخلص من النفايات السائلة التي تحتوي على التربسين وفقا للإرشادات المؤسسية.
  9. عندما تصبح الخلايا مستديرة مع تقاطعات خلوية متقطعة تحت المجهر، قم بفصل الخلايا بلطف عن الطبق دون تلف هيكلي مفرط. قم بتحييد التربسين بإضافة 4 مل من α-MEM الكامل.
  10. اجمع الخلايا عن طريق التوصيل اللطيف والمتكرر إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 مل. بعد الطرد المركزي عند 100 × جرام لمدة 5 دقائق، تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في α-MEM كامل. زرع الخلايا المعلقة في أطباق زراعة طازجة أو أطباق بئر. استبدل الوسيط كل يومين.
    ملاحظة: تأكد من أن SCAPs المستخدمة في الزراعة المجمعة تقع ضمن الفقرة 5. تتراجع الجذع والقدرة على التجميع مع زيادة أعداد الممرات 30,31، مما قد يقلل من كفاءة التكوين الإجمالي والأداء الوظيفي.

2. التجميع الذاتي لمجموعات SCAP

  1. حصاد 3–5 من SCAPs عن طريق التريبسين، والطرد المركزي عند 100 × جرام لمدة 5 دقائق، وإعادة تعليقها في α-MEM مع 10٪ مصل بقري جنيني مستنفد من EV (FBS) و1٪ P/S (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: جهز FBS المستنزف من المركبات الكهربائية عن طريق تدرج الطرد المركزي FBS بحرارة 150,000 × جرام عند 4 درجات مئوية خلال الليل لإزالة المركبات الكهربائية والشوائب الأخرى32.
  2. عد الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم وزرع 1 × 10إلى 5 خلايا لكل بئر في صفائح 24 بئر منخفضة الارتباط. اضبط الحجم المتوسط إلى 500 ميكرولتر لكل بئر للحفاظ على حالة التعليق.
  3. حضن الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة، واستبدل وسط الزراعة كل 48 ساعة.
  4. مراقبة تكوين التجمعات يوميا تحت مجهر بصري مقلوب. اجمع الشوائب الكهربائية عندما يصل قطر الركام إلى 200–400 ميكرومتر ويظهر بنية مدمجة وذات حواف ناعمة.
    ملاحظة: عرف "دفعة" إنتاج واحدة بأنها LEVs معزولة من الوسط المكيف المجمع الذي تم جمعه من تجمعات SCAP التي تم زرعها في نفس اليوم من نفس ممر الخلية والحفاظ عليها تحت ظروف زراعة متطابقة خلال نافذة جمع واحدة (72 ساعة). معالجة كل دفعة بشكل مستقل من خلال الطرد المركزي. استبدل وسط الزراعة بعد 48 ساعة من البذور وأعد تعبئته بنفس حجم الوسط الطازج. لإنتاج LEV، اجمع الوسط المعدل عند 48 ساعة ومرة أخرى عند 72 ساعة بعد البذر، وجمع الوسائط المحصودة (0–48 ساعة و48–72 ساعة) كدفعة واحدة. حافظ على الوسط المكيف عند 4 درجات مئوية ومعالجته لعزل LEV.

3. عزل وتوصيف المركبات الكهربائية من تجمعات SCAP

  1. الطرد المركزي التفاضلي لعزل اللوثات المنخفضة الكبيرة
    1. اجمع وسط الزراعة الذي يحتوي على تجمعات SCAP في أنابيب طرد مركزي بحجم 15 مل.
    2. الطرد المركزي عند 800 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة التجمعات السليمة والحطام الخلوي الكبير.
    3. انقل المادة الفائقة إلى أنابيب جديدة بسعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 2500 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للقضاء على الصفائح الدموية المتبقية وشظايا الخلايا الصغيرة.
    4. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنابيب مخروطية معقمة بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي بحرارة 16,800 × جرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية إلى أنابيب LEV الحبيبية.
      ملاحظة: استخدم أنابيب مخروطية بحجم 1.5 مل لتعزيز إنتاجية LEVs.
    5. تخلص من السوبرناتانت، وأعد تعليق الحبيبة في 1 مل من PBS المعقم، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 16,800 × جرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار بزاوية ثابتة (متوافق مع جهاز طرد مركزي قياسي) لدفع الريثان المنخفض.
    6. اضبط التباطؤ/الفرامل على "بطء" أو "منخفض" (عادة مستوى الفرامل 1 أو 2) لمنع إعادة تعليق قرص LEV خلال المرحلة النهائية للتباطؤ.
    7. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة النهائية في 50 ميكرولتر من PBS المعقمة. استخدم نظام التعليق فورا (خلال 24 ساعة) أو خزنه عند 4 درجات مئوية. تجنب التجميد لتقليل فقدان النشاط الحيوي.
      ملاحظة: جهز حوالي 80 بئرا من الركام للحصول على كمية كافية من LEVs للتجارب النموذجية في المراحل اللاحقة. يوصى بعينات LEVs للتوصيف الفوري أو التطبيق العلاجي بدلا من التخزين طويل الأمد. إذا كان التخزين لفترة أطول، قم بتقسيم تعليق LEV (مثلا 5–10 ميكرولتر لكل أنبوب) لتجنب تقلبات درجة الحرارة المتكررة ودورات التجمد والذوبان. قم بتجميد القطع على الثلج الجاف وخزنها عند −80 درجة مئوية للتخزين الممتد قصير الأمد (مثلا حتى 1–3 أشهر). قم بإذابة الثلاجة مرة واحدة على الثلج واستخدمها فورا. لاحظ أن التجميد قد يقلل من النشاط البيولوجي ويمكن أن يغير توزيع استرداد/حجم الجسيمات؛ لذلك، كلما أمكن، قم بإجراء دراسات وظيفية باستخدام LEVs محضرة حديثا. لمراقبة الجودة بعد التخزين، أعد قياس تركيز الجسيمات وتوزيع حجمها باستخدام NTA، وتابع فقط إذا بقيت القيم ضمن نطاق القبول المحدد مسبقا. بالإضافة إلى ذلك، في هذا البروتوكول، يستخدم تركيز جسيمات NTA كطريقة أساسية للقياس لتجنب فقدان الحويصلات المرتبطة باختبارات البروتين مثل BCA، مما يعظم العائد للتطبيقات اللاحقة.
  2. NTA لحجم وتركيز الجسيمات
    ملاحظة: يتم إجراء تحليل NTA باستخدام محلل تتبع الجسيمات النانوية المتوفر تجاريا (انظر جدول المواد) لتقييم توزيع الحجم وتركيز الجسيمات.
    1. تخفيف 1 ميكرولتر من نظام تعليق LEVs (من القسم 3.1، الخطوة 6) في 1,499 ميكرولتر من أنابيب PBS المعقمة في أنبوب مخروطي معقم بسعة 1.5 مل وامزجه جيدا.
    2. شغل البرنامج المتوافق واملأ خلية العينة ب 10 مل من الماء فائق النقي. تأكد من أن عدد الجسيمات الخلفية هو < 10 لكل إطار لضمان نظافة النظام (انظر جدول المواد).
    3. معايرة الجهاز باستخدام محلول قياسي معد. اضبط معلمات البرنامج إلى: حساسية 70، الغالق 70، الحد الأدنى للمساحة 5، والسطوع الأدنى 20. قم بتنفيذ "المحاذاة التلقائية" لضمان تركيز الليزر. قم بضبط التخفيف القياسي حتى يصبح عدد الجسيمات المعروض في البرنامج بين 50–400 (ويفضل ~200) ثم شغل برنامج المعايرة.
      ملاحظة: جهز المحلول القياسي عن طريق إعادة تشكيل 1 ميكرولتر من خرزات المعايرة في 1 مل من الماء المقطر لصنع محلول أولي. قم بتخفيف 100 ميكرولتر من المحلول الأساسي في 25 مل من الماء المقطر (1:250,000 تخفيف الماء) وتخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
    4. شطف خلية العينة ب 5 مل من الماء المقطر قبل التحليل.
    5. اشطف القناة ب 1 مل من الماء المقطر وتأكد من أن عدد الجسيمات على واجهة الكشف هو <10.
    6. حقن 1 مل من عينة LEVs المخففة بسرعة ثابتة 0.5 مل/ثانية باستخدام حقنة معقمة بسعة 1 مل.
      تحذير: التحكم يدويا في الحقنة للحفاظ على سرعة حقن ثابتة.
    7. قم بتحليل الجسيمات وإنشاء التقارير. في البرنامج، أنشئ قياسا جديدا واختر وضع الحجم/التركيز. اضبط الاكتساب على 3 تسجيلات، 60 ثانية لكل تسجيل، عند 25 درجة مئوية باستخدام نفس معايير الكشف كما في الخطوة 3 (الحساسية 70، الغالق 70، الحد الأدنى للمساحة 5، الحد الأدنى للسطوع 20).
    8. ابدأ في الجمع وتحقق من أن عدد الجسيمات على الشاشة لا يزال ضمن 50–400 جسيم/إطار (ويفضل ~200); إذا كنت خارج هذا النطاق، توقف وضبط تخفيف العينة، ثم كرر الخطوة 6. بعد الاستحواذ، أجر التحليل للحصول على متوسط الحجم، حجم الوضع، D10/D50/D90، وتركيز الجسيمات (الجسيمات/مل). ثم تصدير نتائج مخططات توزيع الحجم .csv و.pdf (أو تنسيقات تقارير مكافئة) وحفظ ملف القياس للحفظ في السجلات.

4. التطبيق العلاجي لمتلازمات LEVs في تجديد عظام الفك السفلي

  1. تحضير الهيدروجيل المحمل ب LEV
    1. جهز مخزون Pluronic F-127 (20٪ من الاستخدام/التردد). أضف مسحوق Pluronic F-127 إلى PBS المعقم إلى تركيز نهائي 20٪ (مع الجهد الكهربائي) وتحرك على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل حتى يذوب بالكامل ويصبح متجانسا (انظر جدول المواد). حافظ على المحلول عند 4 درجات مئوية طوال فترة التحضير لتجنب التجلي المبكر.
      ملاحظة: 20٪ (بضخ) البلورونيك F-127 سائل عند 4 درجات مئوية ويخضع للترموجيلين عند ~20–25 درجة مئوية (حسب الأنبوب/الغرفة)؛ يتحول إلى هلام مستقر عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    2. تحميل LEVs في ظروف باردة. أنابيب التبريد المبدئ، رؤوس الماصات، والهيدروجيل حتى 4 درجات مئوية. امزج 50 ميكروغرام LEVs (ما يعادل LEVs من لوحين ب 24 بئر من الركام) مع 1 مل من 20٪ بلورونيك F 127 عن طريق التوصيل اللطيف ودوامة قصيرة منخفضة السرعة لضمان توزيع منتظم. حافظ على الخليط على الثلج أو عند 4 درجات مئوية حتى الانغراس.
    3. إرشادات التعامل/الاستخدام (من أجل قابلية التكرار). قم بالتحميل وتحميل الحقنة/الطرف بسرعة على الثلج. إذا ارتفع ارتفاع حرارة الخليط فوق ~20–25 درجة مئوية، تزداد اللزوجة وقد يبدأ التجل؛ في هذه الحالة، أعد إلى 4 درجات مئوية حتى تصبح المادة قابلة للتدفق بالكامل قبل الاستخدام. بعد وضع العيب، يسمح بحدوث التجلي في مكانه عند درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية).
  2. تأسيس نموذج عيب عظم الفك السفلي في الفأر
    1. قم بتخدير فئران C57Bl/6 (ذكر أو إناث) البالغة من العمر 8 أسابيع عن طريق حقن الصوديوم بنتوباربيتال داخل الصفاق (50 ملغ/كغ) (انظر جدول المواد).
      تحذير: الصوديوم البنتوباربيتال مهدئ قوي ومخدر وسام للبشر إذا تم حقنه أو ابتلاعه أو استنشاقه عن طريق الخطأ. جهز ونفذ باستخدام ممارسات آمنة للحاد (لا تعيد تدوير الإبر؛ تخلص منها فورا في حاوية الشيب)، وارتد قفازات وحماية للعين، وتجنب ملامسة الجلد، وتخزين/تسجيل الاستخدام وفقا لسياسات الأدوية الخاضعة للرقابة المؤسسية. تأكد من التخدير المناسب في الفئران بفحص عدم وجود رد فعل في القرنية وعدم وجود انسحاب للطرف عند قرص وسادة القدم. ضع مرهم حماية للعين لمنع جفاف القرنية.
    2. احلق الفراء فوق منطقة الفك السفلي الأيسر وقم بتعقيم بالتناوب باستخدام 10٪ بوفيدون-يودين و75٪ إيثانول.
      تحذير: 75٪ إيثانول قابل للاشتعال بشدة؛ استخدمه بعيدا عن مصادر الإشعال وتأكد من تهوية جيدة. قد يسبب بوفيدون-يودين تهيجا للجلد/العين أو ردود فعل تحسسية؛ ارتد القفازات، وتجنب ملامسة العينين أو الغشاء المخاطي، ونظف الانسكابات بسرعة.
    3. قم بعمل شق طولي بطول 1 سم على طول حافة الفك السفلي وقطع الأنسجة الرخوة بشكل غير مباشر لكشف زاوية الفك السفلي.
    4. قم بإنشاء عيب دائري في العظم (قطره 2 مم) باستخدام مثقاب أسنان مع ري ملحي مستمر لمنع التلف الحراري (انظر جدول المواد).
      تحذير: راقب النزيف أثناء العملية عن كثب، وتحكم في النزيف باستخدام كرات قطن صغيرة للحفاظ على حقل جراحي خال، وتقليل خطر العدوى. تجنب ملامسة الأنسجة الرخوة المحيطة بالمثقاب لمنع التشابك.
  3. زرع الهيدروجيل المحمل ب LEV
    1. قم بتحميل خليط LEV-هيدروجيل في حقنة معقمة وحقنها في عيب العظم، لضمان الحشو الكامل.
      ملاحظة: أعط ~10 ميكروغرام LEVs لكل فأرة. مطلوب لوحتان ب 24 بئر من تجمعات SCAP لإنتاج عدد كاف من LEVs لتجربة مع n = 5 فئران.
    2. بالنسبة لمجموعة الضابطة، حقن كمية متساوية من هيدروجيل بلورونيك F-127 بدون LEVs.
    3. قم بخياطة الشق بغرز قابلة للامتصاص 4-0 وإعطاء مسكنات تحت الجلد (كاربروفين، 5 ملغ/كغ) لتخفيف الألم بعد العملية (انظر جدول المواد).
      تحذير: الكاربروفين هو مضاد التهاب غير ستيرويدي نشط دوائيا وقد يكون ضارا إذا تم حقنه عن طريق الخطأ أو إذا لامس الجلد أو العينين. ارتد القفازات، تجنب الإصابات الحادة، تخلص من الإبر أو الحقن في حاوية حادة، والتخلص من الأدوية غير المستخدمة والمواد الملوثة وفقا لإجراءات النفايات الدوائية المؤسسية.
    4. ضع الفئران على بطانية لإعادة التدفئة حتى تتعافى من التخدير، ثم انقلها إلى أقفاص فردية مع إمكانية الوصول المجاني للطعام والماء.
      ملاحظة: لا تترك الفئران دون مراقبة حتى تستعيد وعيها بما يكفي للحفاظ على الاستلقاء في عظم القص. إعادة الفئران إلى السكن الجماعي فقط بعد التعافي الكامل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا لسير العمل التجريبي، تم تنفيذ خطوات رئيسية تشمل عزل SCAP، وتكوين التجميع، واستخراج LEVs، والزرع العلاجي بنجاح (الشكل 1). أظهرت الأضراس الثالثة المتأثرة سريريا من المتبرعين قمم غير ناضجة مع نسيج حليمي قمي سليم ملتصق حول فتحات قناة الجذر المفتوحة، مما يؤكد المصدر المناسب ل SCAP (الشكل 2A). عند زراعتها في المختبر، هاجرت SCAPs ذات شكل المغزل ذات العمليات الخلوية الوفيرة من نسيج الحليمة القمية وأصبحت تتجمع تدريجيا خلال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد جعل الاهتمام المتزايد بالعلاجات التجديدية الخالية من الخلايا من المستويات الكيميائية المبكرة المشتقة من الخلايا الجذعية الميزنشيمية بدائل واعدة لزراعة الخلايا الكاملة، نظرا لقدرتها على توصيل جزيئات نشطة بيولوجيا دون المخاطر المرتبطة بالطرق المعتمدة على الخلايا. ومع ذلك، فإن الترجمة السريرية للعلاجات القائمة على LEV تعثرت بسبب نقص أنظمة الزراعة ذات الصلة الفسيولوجية التي يمكنها الحفاظ الكامل على وظائف LEVs وتعزيزها. تختلف الزراعة التقليدية ذات الطبقة الأحادية ثنائية الأبعاد بشكل كبير ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFA1100600)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82471011، 82401201)، ومشروع مختبر الدولة الرئيسي لإعادة بناء وتجديد الفم والوجه والفكين (2024MS04)، ومؤسسة الصين للعلوم ما بعد الدكتوراه (BX20230485)، ومشروع التعاون والتبادل المختبري الشريك للجامعة الطبية العسكرية الرابعة (2024HB014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حقنة بسعة 1 مل مع إبرةBD300841التخدير
طبق زراعة الخلايا بطول 10 سمكورنينغ353003زراعة الخلايا
أنبوب طرد مركزي بوليسترين سعة 15 ملكورنينغ352095زراعة الخلايا
مطهر إيثانول بنسبة 75٪هاي شي هاي نوHS-750التشغيل
غرزة قابلة للامتصاص 4-0جينهوان الطبيR413التشغيل
الطرد المركزي على سطح الطاولةويغينزCE187عزل المركبات الكهربائية
حاضنة ثاني أكسيد الكربون، 150 لتر، النوع الشاملثيرموفيشر51032874زراعة الخلايا
كولاجناز النوع الأولثيرموفيشر17100017زراعة الخلايا
كرات القطندي رويال30-033التشغيل
مقص يعمل منحنيأداة JZ الجراحيةJ21040التشغيل
وحدة التوربينات المتنقلة للأسنانكافوS609Cالتشغيل
التوازن الإلكترونيتشي كهZK-DSTزراعة الخلايا
أنبوب إيبندورفإبندورف3810Xعزل المركبات الكهربائية
ملقط، جيدأداة JZ الجراحيةJD1020التشغيل
كريم إزالة الشعرفيت1.00097E+11التشغيل
كرة البر عالية السرعةدينتسبلي سيروناE0123التشغيل
قطعة اليد عالية السرعةكافوKV-1-008-1644التشغيل
المجهر المقلوبإم شوتMF53-Nزراعة الخلايا
MEM & alpha; (الحد الأدنى من الوسط الأساسي α)ثيرموفيشر12561056زراعة الخلايا
مجهر فيديو تتبع الجسيمات النانوية PMX-120مقياس الجسيماتزيتا فيو PMX120تحليل تتبع الجسيمات النانوية
البنسلين-ستريبتوميسين (P/S)ثيرموفيشر15140122زراعة الخلايا
الصوديوم البنتوباربيتالسيغما-ألدرتش57-33-0التخدير
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرموفيشر10010023زراعة الخلايا
بلورونيك F-127سيغما-ألدرتشP2443زرع EV
محلول اليود بوفيدونباكستر  PROSL500التشغيل
مصل الأبقار الجنيني المتخصص (FBS)ثيرموفيشر12664025زراعة الخلايا
كتلة الشاش المعقمةالفوز10-000-681التشغيل
الطرد المركزي الدقيق عالي السرعة على الطاولةهيتاشيCT15Eعزل المركبات الكهربائية
تمرين تريفينتثبيت البيوميت الدقيق01-9182التشغيل
تريبسين-إيدتاثيرموفيشر25200072زراعة الخلايا
لوحة 24 بئر ذات تركيب منخفض جداكورنينغ3473زراعة الخلايا
جني الخلاط الدواميالصناعات العلميةSI0425زرع EV

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res. Ther. 9, 50-63 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).
  4. Rai, A., et al. Proteomic dissection of large extracellular vesicle surfaceome unravels interactive surface platform. J. Extracell. Vesicles. 10, 1-20 (2021).
  5. Ye, T., et al. Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity. Bioact. Mater. 21, 194-208 (2023).
  6. Liang, Z., Luo, Y., Lv, Y. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles mediate BMP2 gene delivery and enhance bone regeneration. J Mater Chem B. 8, 6378-6389 (2020).
  7. Olaechea, A., et al. Preclinical Evidence for the use of oral mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in bone regenerative therapy: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 12, 791-800 (2023).
  8. Zhang, T., et al. Extracellular vesicles derived from human dental mesenchymal stem cells stimulated with low-intensity pulsed ultrasound alleviate inflammation-induced bone loss in a mouse model of periodontitis. Genes Dis. 10, 161-1625 (2023).
  9. Cai, X. Y., et al. Inflammation-triggered Gli1(+) stem cells engage with extracellular vesicles to prime aberrant neutrophils to exacerbate periodontal immunopathology. Cell Mol Immunol. 22, 371-389 (2025).
  10. Wang, Y., et al. Reciprocal regulation of mesenchymal stem cells and immune responses. Cell Stem Cell. 29, 1515-1530 (2025).
  11. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. J Tissue Eng. 29, 1-17 (2017).
  12. Yang, H., et al. Secreted frizzled-related protein 2 promotes the osteo/odontogenic differentiation and paracrine potentials of stem cells from apical papilla under inflammation and hypoxia conditions. Cell Prolif. 53, 1-11 (2020).
  13. Huang, M., Dissanayaka, W. L., Yiu, C. K. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 16, 1-20 (2025).
  14. Jaukovic, A., et al. Specificity of 3D MSC Spheroids Microenvironment: Impact on MSC Behavior and Properties. Stem Cell Rev Rep. 16, 853-875 (2020).
  15. Wang, X., et al. Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1 alpha. J Extracell Vesicles. 12, 1-20 (2023).
  16. Yuste, I., et al. Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts. Pharmacol Res. 169, 1-57 (2021).
  17. Fontana, F., et al. In Vitro 3D cultures to model the tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13, 1-16 (2021).
  18. Cook, K., Li, H. Advancing extracellular vesicle production: improving physiological relevance and yield with 3D cell culture. Nanoscale. 17, 15110-15131 (2025).
  19. Sui, B. D., et al. Mesenchymal condensation in tooth development and regeneration: a focus on translational aspects of organogenesis. Physiol Rev. 103, 1899-1964 (2023).
  20. Kobayashi, T., Kronenberg, H. M. Overview of skeletal development. Methods Mol Biol. 2230, 3-16 (2021).
  21. Naba, A. Mechanisms of assembly and remodelling of the extracellular matrix. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 865-885 (2024).
  22. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 1-16 (2021).
  23. Zhang, J., et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 13, 1-20 (2022).
  24. Yu, W., et al. Higher yield and enhanced therapeutic effects of exosomes derived from MSCs in hydrogel-assisted 3D culture system for bone regeneration. Biomater Adv. 133, 1-17 (2022).
  25. Kim, M., et al. Three-dimensional spheroid culture increases exosome secretion from mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 15, 427-436 (2018).
  26. Millan, C., et al. Extracellular vesicles from 3d engineered microtissues harbor disease-related cargo absent in EVs from 2D cultures. Adv Healthc Mater. 11, 1-17 (2022).
  27. Petit, I., Levy, A., Aberdam, D. Purification of extracellular microvesicles secreted by dermal fibroblasts. Methods Mol Biol. 2154, 63-72 (2020).
  28. Li, S., et al. Construction, characterization, and regenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates. J Vis Exp. (15), e64697(2023).
  29. Sui, B. D., et al. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods Mol Biol. 2002, 87-99 (2019).
  30. Mobasseri, R., et al. Peptide-modified nanofibrous scaffold promotes human mesenchymal stem cell proliferation and long-term passaging. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 84, 80-91 (2018).
  31. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  32. Cao, Y., et al. Isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues. J Vis Exp. 20, e63990(2022).
  33. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell Tissue Res. 347, 701-711 (2012).
  34. Li, Y., et al. Lysosome-Featured Cell Aggregate-Released Extracellular Vesicles Regulate Iron Homeostasis and Alleviate Post-Irradiation Endothelial Ferroptosis for Mandibular Regeneration. Adv Sci (Weinh). 12, 1-22 (2025).
  35. Longjohn, M. N., Christian, S. L. Characterizing Extracellular Vesicles Using Nanoparticle-Tracking Analysis. Methods Mol Biol. 2508, 353373(2022).
  36. Cantore, S., et al. Characterization of human apical papilla-derived stem cells. J Biol Regul Homeost Agents. 31, 901-910 (2017).
  37. Wang, Z., et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway. Sci Rep. 14, 19-35 (2024).
  38. Li, J., et al. TGF-beta2 and TGF-beta1 differentially regulate the odontogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Arch Oral Biol. 135, 1-15 (2022).
  39. Zhang, W., et al. Foxc2 and BMP2 Induce Osteogenic/Odontogenic Differentiation and Mineralization of Human Stem Cells from Apical Papilla. Stem Cells Int. 18, 23-36 (2018).
  40. Man, K., et al. An ECM-mimetic hydrogel to promote the therapeutic efficacy of osteoblast-derived extracellular vesicles for bone regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 10, 82-99 (2022).
  41. Ming, L., et al. Small extracellular vesicles laden oxygen-releasing thermosensitive hydrogel for enhanced antibacterial therapy against anaerobe-induced periodontitis alveolar bone defect. ACS Biomater Sci Eng. 10, 932-945 (2024).
  42. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Purification of mitochondria by sucrose step density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 14, 8-28 (2014).
  43. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 2016, 299-310 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mesenchymal Stem CellsLarge Extracellular VesiclesSCAP Derived LEVs3D Cell CultureDifferential CentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisHydrogel DeliveryCraniofacial Regeneration

مقالات ذات صلة