مقالة منهجية

توضيح الأساس المادي لصيغة يي تشينغجي ضد اعتلال الكلى IgA باستخدام نظام UHPLC-Q-Orbitrap HRMS المدمج مع علم الأدوية الشبكي

320 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70541

⸱

مايو 19, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول استخدام الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء مع مطيافية الكتلة عالية الدقة رباعية الأقطاب وأربيرتراب الهجين (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)، مدمجة مع علم الأدوية الشبكي والالتحام الجزيئي، للتنبؤ والتحقق من الأساس المادي لصيغة يي تشي تشينغجي (YQQJ) لعلاج اعتلال الكلى IgA (IgAN).

الملخص

تستخدم هذه الدراسة نظام UHPLC-Q-Orbitrap HRMS لتوصيف المكونات القابلة للاستخراج بالماء والممتصة بالدم في YQQJ. يتم تطبيق علم الأدوية الشبكي والربط الجزيئي بشكل إضافي للتنبؤ والتحقق من الأساس المادي الذي يقوم عليه التأثيرات العلاجية ل YQQJ ضد IgAN. تم تحليل عينات المستخلص المائي والمصل من YQQJ باستخدام UHPLC-Q-Orbitrap HRMS لتوصيف المكونات الكيميائية وتحديد المركبات الممتصة بالدم. تم تحديد المركبات بناء على قواعد بيانات مرجعية، وأدبيات منشورة، وتقييم شامل لوقت الاحتفاظ، ودقة كتلة الأيونات السابقة، وأنماط تجزئة التصلب المتعدد والتصلب المتعدد، وتوزيع النظائر. تم التنبؤ بالأهداف المحتملة للمركبات الممتصة بالدم باستخدام قواعد بيانات التنبؤ بالأهداف، بينما تم جمع الأهداف المتعلقة ب IgAN من منصات المعلوماتية الحيوية المتكاملة. تم فحص الأهداف الأساسية من خلال تحليل شبكة PPI. تم إنشاء شبكة "مركب-هدف-مسار-مرض" لتحديد المكونات الرئيسية، وأجريت عملية الربط الجزيئي لتقييم التفاعلات بين المركبات الأساسية والأهداف. تم تحديد ما مجموعه 185 مركبا في مستخلص الماء من YQQJ. من بينها، دخلت 28 مركبة مجرى الدم في أشكالها الأولية. حدد PPI 42 هدفا أساسيا مرتبطا بتأثيرات YQQJ العلاجية في IgAN. أظهرت تحليلات إثراء KEGG وGO تورطا في تكاثر الخلايا، والالتهاب، والموت المبرمج، بالإضافة إلى الإثراء في عدة مسارات رئيسية مثل PI3K-Akt وMAPK وJAK-STAT. تنبأ تحليل الالتحام الجزيئي بتفاعلات ارتباط إيجابية بين ستة أهداف حاسمة (CASP3، IGF1R، JUN، STAT3، PRKCB، وPIK3CA) وثلاثة مركبات رئيسية ممتصة في الدم—حمض ديأستيل لاسبيرولوزيديك، حمض الجينيبوزيديك، والديوسين — مع طاقات ارتباط منخفضة باستمرار، مما يشير إلى تفاعلات محتملة. يكشف هذا التحليل المتكامل أن YQQJ يمارس تأثيرات علاجية ضد IgAN من خلال مكونات متعددة وأهداف متعددة. يقترح حمض دياستيل لاسبيرولوزيديك، حمض الجينيبوزيديك، والديوسسين كمكونات نشطة رئيسية تساهم في هذه التأثيرات.

المقدمة

اعتلال الكلى IgA (IgAN) هو أحد أكثر حالات التهاب الكبيبة الأولية شيوعا في العالم. مظاهرها السريرية متجانسة للغاية، وغالبا ما تظهر على شكل دمى في بول مجهري أو كبير، وغالبا ما يصاحبها درجات متفاوتة من التهاب البول البروتيني، وارتفاع ضغط الدم، وضعف الكلى. أشارت دراسات سابقة إلى أن ما يصل إلى 40٪ من المرضى يتطورون إلى فشل كلوي خلال 20 سنة من التشخيص1؛ ومع ذلك، تشير الأدلة الحديثة إلى أن التشخيص كان أسوأ بشكل ملحوظ، حيث يصاب معظم المرضى بفشل كلوي خلال 10–15 سنة، ونسبة صغيرة فقط من يحافظون على وظائف الكلى مدى الحياة دون تقدم 2,3,4. على الرغم من أن العلاجات المستهدفة حققت تقدما سريريا مؤخرا في إدارة IgAN، إلا أن تكلفتها العالية وبطء فعاليتها نسبيا لا تزال تحديات كبيرة، ولا يزال التوازن بين الفائدة والمخاطر السريرية قيد النقاش 5,6.

يظهر الطب الصيني التقليدي (TCM) مزايا مميزة في علاج الأمراض المعقدة. يتميز بفعالية علاجية مستقرة، وانخفاض نسبيا في حدوث التفاعلات السلبية، وتأثيرات تآزرية متعددة الأهداف7. على عكس العوامل الدوائية ذات الهدف الواحد، تحتوي صيغ الطب الصيني التقليدي عادة على عدة مكونات حيوية فعالة يمكنها تعديل المسارات البيولوجية المتنوعة في الوقت نفسه. يوفر هذا النمط متعدد المكونات والأهداف ميزة علاجية محتملة في علاج الأمراض المعقدة مثل IgAN8. في نظرية الطب الصيني التقليدي، لا يحمل IgAN اسم مرض محدد لكنه يصنف عموما تحت "الورم الدموي"، "الوذمة"، "ألم الظهر"، "الرياح الكلى"، و"مرض الاستهلاك". يعتبر معظم العلماء أن السبب الأساسي له يتعلق بنقص تشي في الرئة، مما يؤدي إلى فقدان السيطرة على الطاقة الدفاعية، وبالتالي غزو الرياح والرطوبة والحرارة والسموم، مما يؤدي في النهاية إلى تلف الكلى. على الرغم من أن الكلية هي العضو الأساسي المعني، إلا أن القلب والكبد والطحال والرئتينقد تتأثر أيضا. استنادا إلى هذا الفهم، ركزت العديد من الدراسات على تحديد الأدوية العشبية والتركيبات التي تحتوي على خصائص تقوية الطاقة، وتوحيد الخارج، وتنظيف الحرارة، وإزالة السموم، ومعالجة الرطوبة للعلاج السريري ل IgAN10,11.

تركيبة يي تشي تشينغجي (YQQJ) هي وصفة تجريبية فعالة تستخدم في قسم أمراض الكلى في مستشفانا لعلاج IgAN. تتكون الصيغة من سبعة أعشاب، منها أستراجالوس ميمبرانسيوس (هوانغتشي)، لونسيرا يابونيكا ثونب. (جينيينهوا)، ريوم بالماتوم إل. (داهوانغ)، هيديوتيس ديفوسا ويلد (بايهواشيشيكاو)، ديوسكوريا نيبونيكا ماكينو (تشوانشانلونغ)، سباتولوبوس سوبيركتوس دن (جيكسويتينغ)، وبلانتاجو آسياتيكا إل. (تشيتشيانكاو). يمارس YQQJ وظائف علاجية تتمثل في تقوية الطاقة، وتوطيد السطح الخارجي، وإزالة الحرارة، وتطهير السموم، وتنشيط الدورة الدموية، وتعزيز الإدرار12. أظهرت الدراسات السريرية أن YQQJ يقلل بشكل كبير من البروتين البولي والدماء في البول لدى مرضى IgAN، ويحسن وظيفة الكلى، ويخفف من الأعراض المرتبطة بالمناعة المخاطية، مع إظهار ملف أمان إيجابي12,13.

على الرغم من أن هذه الصيغة أظهرت فعالية سريرية إيجابية، إلا أن الأساس النشط دوائيا لا يزال من الصعب توضيحه لأن صيغ الطب الصيني الصيني الصيني تحتوي على العديد من المكونات الكيميائية. يمكن أن يكشف التحليل الكيميائي المعتمد فقط على التحليل الكروماتوغرافي أو التحليل الطيفي الكتلي عن التركيب الكيميائي العام للصيغة؛ ومع ذلك، لا يمكنها تحديد أي المركبات تمتص في الدورة الدموية الجهازية وتساهم مباشرة في التأثيرات العلاجية14. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد الدراسات التقليدية على علم الأدوية الشبكي إلى حد كبير على التنبؤات القائمة على قواعد البيانات وعادة ما تقوم بفحص المركبات المرشحة باستخدام معايير مثل التوافر الحيوي الفموي وشبهها للأدوية. قد يغفل هذا النهج المركبات التي تمارس فعلا نشاطا دوائيا في الجسم الحي.

لمعالجة هذه القيود، تعتمد الدراسات الحديثة بشكل متزايد استراتيجيات تحليلية تكاملية تجمع بين الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء مع مزيج رباعي الأقطاب ومطياف الكتلة عالية الدقة (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS) في كيمياء مصل ودواء الأنظمة في أبحاث الطب الصينيالتقليدي 16,17. تحدد كيمياء الدم الدوائية المركبات التي تدخل الدورة الدموية الجهازية بعد إعطائها، مما يوفر أدلة ذات صلة دوائية لفحص المكونات النشطة الحيوية المحتملة.18. وفي الوقت نفسه، يتيح UHPLC-Q-Orbitrap HRMS اكتشافا دقيقا للغاية وتوصيفا بنيويا للمكونات الكيميائية داخل المصفوفات العشبية المعقدة19.

مقارنة بالأساليب التي تعتمد فقط على التحليل الكيميائي أو التنبؤ النظري بالأهداف، فإن سير العمل التكاملي المطبق في هذه الدراسة — الذي يشمل تحديد المكونات المعتمد على UHPLC-Q-Orbitrap HRMS، وفحص الكيمياء الدوائية في المصل، وتحليل علم الأدوية الشبكي، والتحقق من الالتحام الجزيئي — يقدم عدة مزايا منهجية. يتيح نظام UHPLC-Q-Orbitrap HRMS تحديد شامل ودقيق للمكونات الكيميائية المعقدة. تقيد الكيمياء الدوائية في المصل المركبات المرشحة إلى تلك التي تمتص فعليا في الدورة الدموية الجهازية، مما يحسن من المعقولية البيولوجية لتحليلات الشبكات اللاحقة. يتيح تحليل الأدوية الشبكية المعتمد على المركبات الممتصة تجريبيا استكشاف الآليات متعددة الأهداف على مستوى النظام ويعكس بشكل أفضل الخصائص الدوائية الشاملة لصيغ الطب الصيني التقليدي. يوفر الالتحام الجزيئي أيضا التحقق الحاسوبي الأولي للتفاعلات المتوقعة بين المركبات والهدف ويدعم ترتيب أولويات منطقية للجزيئات المرشحة للتحقق التجريبي اللاحق. بشكل جماعي، يوفر هذا سير العمل التكاملي استراتيجية موثوقة وفعالة وذات صلة فسيولوجية لتوضيح الأساس المادي والآليات للصيغ العشبية المعقدة مثل YQQJ.

يعد هذا السير مناسبا بشكل خاص لدراسة الأساس الكيميائي النشط الدوائي وآليات الصيغ العشبية المعقدة عندما يمكن الحصول على بيانات الامتصاص في الجسم من دراسات دوائية على الحيوانات أو البشر. ينطبق بشكل خاص على الصيغ ذات الفعالية السريرية المثبتة ولكن المكونات النشطة غير واضحة. ومع ذلك، يجب الاعتراف بعدة حدود. أولا، تعتمد دقة التنبؤ بالهدف على جودة واكتمال قواعد البيانات العامة. ثانيا، يركز سير العمل على المركبات النموذجية التي تم اكتشافها في الدورة ولا يأخذ في الاعتبار المستقلبات الحيوية النشطة الناتجة في الجسم الحي. ثالثا، تتطلب التنبؤات المستمدة من تحليلات علم الأدوية الشبكي مزيدا من التحقق التجريبي. على الرغم من هذه القيود، يوفر سير العمل نهجا فعالا وموثوقا لتوليد الفرضيات وتحديد الأولويات المستهدفة في الدراسات الميكانيكية لصيغ الطب الصيني التقليدي.

لذلك، تستخدم هذه الدراسة نظام UHPLC-Q-Orbitrap HRMS لتوصيف كل من مكونات المستخلص المائي والمركبات المتداولة في YQQJ بشكل منهجي، مما يخلق قاعدة بيانات شاملة نسبيا للمكونات النشطة المحتملة. استنادا إلى هذه البيانات، يتنبأ تحليل الأدوية الشبكية، إلى جانب التحقق من صحة الالتحام الجزيئي، بالمكونات الدوائية المحتملة ل YQQJ لعلاج IgAN ويوفر أساسا للتحقيقات الميكانيكية اللاحقة.

البروتوكول

جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة بالحيوانات امتثلت لإرشادات العناية واستخدام الحيوانات المخبرية الصادرة عن لجنة رعاية الحيوان في الصين. تمت الموافقة على جميع الإجراءات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) التابعة لمركز تجارب الحيوانات في مستشفى غوانغنمن.

1. إدارة الحيوانات والأدوية

  1. استخدم اثني عشر ذكرا من نوع Sprague–Dawley (SD) عمره 6 أسابيع ويزن بين 200–230 جرام.
  2. احتواء جميع الحيوانات في مركز الحيوانات التجريبية.
    ملاحظة: حافظ على درجة حرارة المنزل بين 20–26 درجة مئوية والرطوبة النسبية بين 40–70٪. استخدم دورة ضوء/ظلام 12 ساعة لكل 12 ساعة لمحاكاة الإيقاعات البيولوجية الطبيعية.
  3. تأقلم الحيوانات مع الظروف المعتادة لمدة 7 أيام مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء مجانا قبل التجربة. قسم الفئران عشوائيا إلى مجموعتين (n = 6 لكل مجموعة): مجموعة ضابطة ومجموعة معالجة بالمخدرات.
  4. راجع الجرعة المكافئة المحولة بمساحة سطح الجسم بين الإنسان والحيوان20. أعط مستخلص YQQJ المركز عبر التجويق الفموي بمعدل 24.68 مل/(كجم·يوم) للمجموعة المعالجة بالأدوية. أعط كمية متساوية من الماء المقطر للمجموعة الضابطة في نفس الوقت لضمان المعالجة المتزامنة.
  5. استمر في الإعطاء لمدة يوم واحد. قسم الجرعة اليومية الكلية إلى ثلاث دفعات متساوية (مثلا في الساعة 08:00، 13:00، و18:00) لضمان الجرعة الكاملة خلال يوم واحد.
    ملاحظة: الحيوانات تسرع لمدة 12 ساعة قبل الحصان النهائي، مع وصول مجاني إلى الماء.
  6. اجمع عينات دم بعد ساعتين و8 ساعات من الإعطاء النهائي. تخدير الفئران عن طريق حقن 1٪ من بنتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق (50 ملغ/كغ). اجمع الدم من الشريان الأبهر البطني.
  7. اترك عينات الدم في وضع مستقيم في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، ثم استخدم الطرد المركزي عند 450 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تحقق من أن المادة الفائقة (المصل) صافية وخالية من تحلل الدم. انقل المصل الفائق وخزنها عند -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

2. تحضير الحلول

  1. تحضير حلول الاختبار
    1. اجمع جميع الأعشاب الخام من YQQJ وفقا للصيغة. أضف 4 مجلدات من الماء المنقى إلى قدر النقع ونقعه لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: تم إضافة ماء منقى إلى الأعشاب بنسبة 4:1 (عروض/أبيض).
    2. اجعل الخليط يغلي، ثم استمر في الطعم لمدة 30 دقيقة على نار منخفضة. فلتر الشاش واجمع الترشيح. كرر عملية التسمية من البقايا مع 4 أحجام من الماء لمدة 30 دقيقة أخرى ثم أعد التصفية.
    3. اجمع بين المرشحين. تركز المحلول المركب باستخدام مبخر دوار مضبوط على درجة حرارة حمام ماء تبلغ 60 درجة مئوية حتى يصل تركيز 3 جرام/مل (بوزن للضبط، يعادل المواد الطبية الخام).
    4. تحقق من أن المستخلص المركز سائل داكن ولزج لا يوجد فيه أي هطول ظاهر. تخزين عند 4 درجات مئوية للاستخدام لاحقا.
  2. إعداد الحلول المرجعية
    1. وزن المركبات المرجعية التالية بدقة: حمض دي أستيل لاسبيرولوزيديك، حمض جينيبوزيديك، حمض لوغانيك، مورونيزيد، حمض الكلوروجينيك، سويروسيد، حمض بلانتاجوجوانيدينيك، راين-8-O-β-D-غلوكبيرانوسيد، جينيستين، أبيجينين-7-جلوكوزيد، ديوسميتين-7-أو-β-دي-غلوكبيرانوسيد، كاليكوسين، بروتوديوسيسين، جينيستين، ديوسميتين، سودوبروتوديوسين، فورمونينتين، 3-هيدروكسي-9,10-ديميثوكسي بتركاربان، أليمودين، راين، ديوسين.
    2. أذاب كل مركب في الميثانول، ثم ادور الخليط لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بسونيك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لضمان الذوبان الكامل.
    3. يتم تخفيف كل محلول بالميثانول للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام/مل لكل معيار.

3. تحضير العينة

  1. تحضير عينات مستخلص YQQJ
    1. أنبوب 100 ميكرولتر من مستخلص YQQJ المائي في أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل. أضف 300 ميكرولتر من الميثانول مع دوامة لمدة دقيقة واحدة. الطرد المركزي عند 1800 × جم، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تأكد من أن المادة الفائقة الناتجة صافية وخالية من الجسيمات المعلقة.
    2. خذ 100 ميكرولتر من المادة الفائقة وامزج مع 100 ميكرولتر ماء فائق نقي لتحقيق تخفيف بنسبة 1:1. الدوامة بلطف وانقلت إلى قارورة السامبلر التلقائية للتحليل.
  2. تحضير عينات مصل تحتوي على الأدوية
    1. انقل 100 ميكرولتر من المصل إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل. أضف 300 ميكرولتر من الميثانول، واستمر دوامة لمدة 10 دقائق لضمان ترسيب البروتين. الطرد المركزي عند 1800 × جرام، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. اجمع 270 ميكرولتر من المادة الفائقة وانقل إلى أنبوب نظيف. تبخر المادة الفائقة حتى تصبح جافة باستخدام مركز طرد مركزي مفرغ مضبوط على 120 × جم، 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات حتى يتكون بقايا صلبة مرئية.
    3. أعيد تشكيل البقايا بمحلول مائي بنسبة 90 ميكرولتر من 50٪ ميثانول. دوامة لمدة دقيقة واحدة لإذابة البقايا بالكامل، ثم الطرد المركزي مرة أخرى عند 1800 × جم، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. اجمع 80 ميكرولتر من المادة الشفافة النهائية وانقلها إلى قارورة سامبلر تلقائية للتحليل.

4. الظروف التحليلية

  1. الظروف الكروماتوغرافية
    1. إجراء فصل كروماتوغرافي باستخدام نظام UHPLC مزود بعمود كروماتوغرافي.
    2. استخدم الطور الثنائي المتحرك (المرحلة أ: ماء يحتوي على حمض الفورميك بنسبة 0.1٪؛ المرحلة ب: الأسيتونيتريل). طبق برنامج تدرج لإزالة التدرج كما هو موضح في الجدول 1، بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة. اضبط درجة حرارة العمود على 40 درجة مئوية وحجم الحقن إلى 6.0 ميكرولتر.
      ملاحظة: مواصفات العمود هي 2.1 مم × 100 مم، وبعد الجسيمات 1.8 ميكرومتر.
  2. حالات التصلب المتعدد
    1. تحليل العينات باستخدام مطياف كتلة رباعي الأقطاب المزود بمسبار رذاذ بالتيرة الكهربائية المسخنة (HESI).
    2. اضبط المعلمات كما يلي: جهد التأين: 3.7 كيلوفولت (الوضع الموجب) / 3.5 كيلوفولت (الوضع السالب); درجة حرارة الشعيرات الدموية: 320 درجة مئوية؛ ضغط غاز الغمد: 30 رطل لكل بوصة مربعة؛ ضغط الغاز المساعد: 10 رطل لكل بوصة مربعة؛ درجة حرارة الذوبان: 300 درجة مئوية؛ غاز الغمد والغازات المساعدة: النيتروجين؛ غاز التصادم: النيتروجين، 1.5 متور.
    3. جمع البيانات في وضع المسح الكامل/dd-MS2 . اضبط معايير المسح الكاملة كما يلي: الدقة 70000، هدف التحكم التلقائي في الكسب 1×106، أقصى زمن عزل 50 مللي ثانية، ونطاق مسح m/z 100 – 1500.
    4. اجمع بيانات dd-MS2 بمعايير الدقة 17500، هدف التحكم التلقائي في الكسب 1×105، أقصى زمن عزل 50 مللي ثانية، اختيار أعلى n (n≤10) أيونات أصلية شديدة للتجزئة مع آلية استبعاد ديناميكية، نافذة عزل m/z 2، طاقة تصادم 10 فولت، 30 فولت، 60 فولت، وعتبة شدة 1×105.

5. معالجة بيانات MS

  1. معالجة بيانات مايكروسوفت المكتسبة باستخدام برامج معالجة بيانات متخصصة. انتقل إلى وحدة استيراد البيانات وارفع ملفات البيانات الخام.
  2. نفذ وحدة اختيار القمم وقم بفك الالتفاف الذروتي لتجميع أيونات التقريب وتوليد ميزات مركبة.
  3. ابحث في قواعد بيانات المركبات المرجعية، وقواعد بيانات التنبؤ المستهدف، والأدبيات المنشورة ذات الصلة لتحديد المرشحين.
  4. تحديد المركبات باستخدام استراتيجيتين تكميليتين للتعريف استندتا إلى بيانات التصلب المتعدد عالية الدقة.
    1. التعريف بناء على مطابقة المعايير المرجعية. تحقق من المركبات بالمقارنة مع المعايير المرجعية الحقيقية. قبول التعريفات فقط عندما تستوفي جميع المعايير التالية:
      1. دقة الكتلة: يجب أن يكون خطأ الكتلة لكل من الأيونات الأولية وأيونات الشظايا ضمن ±5 جزء في المليون.
      2. التشابه الطيفي: يجب أن تكون درجة التشابه بين طيف الموجوب المتعدد/التصلب المتعدد التجريبي وطيف التصلب المتعدد/التصلب المتعدد للمعيار المرجعي ≥ 0.85.
      3. توزيع النظير: يجب أن تكون درجة مطابقة أنماط النظائر ≥ 90٪.
      4. السلوك الكروماتوغرافي: يجب أن يكون انحراف زمن الاحتفاظ بين المركب المكتشف والمعيار المرجعي < 0.2 دقيقة.
        ملاحظة: المركبات التي تستوفي جميع المعايير أعلاه مشروحة كمستوى MSI 1، مما يمثل التعريف الهيكلي المؤكد.
    2. التعرف بناء على بيانات التصلب المغناطيسي عالية الدقة والتنبؤ الطيفي في السيليكو. بالنسبة للمركبات التي لا تتوفر معايير مرجعية، قم بإجراء تحديد مفترض بناء على قياسات كتلة دقيقة وتوقعات طيفية حسابية. قبول التعليقات فقط عندما يتم استيفاء المعايير التالية:
      1. دقة الكتلة: يجب أن يكون خطأ كتلة الأيونات الأولية ضمن ±5 جزء في المليون، وخطأ كتلة أيونات الشظايا يجب أن يكون ضمن ±10 جزء في المليون.
      2. التشابه الطيفي: قارن الطيف التجريبي بين MS/MS وطيف MS/MS النظري الناتج عن بنية SMILES المركبة باستخدام خوارزمية Progenesis QI. قبول التطابقات التي تشابه جيب تمام ≥ 0.60.
      3. توزيع النظير: يجب أن تكون درجة مطابقة أنماط النظائر ≥ 90٪.
      4. التنبؤ بسلوك الكروماتوغرافي: يجب أن يكون الانحراف بين زمن الاحتفاظ التجريبي وزمن الاحتفاظ المتوقع بتعلم الآلة < 1.0 دقيقة.
        ملاحظة: تم تدريب نموذج التنبؤ بوقت الاحتفاظ باستخدام بيانات كروماتوغرافية تجريبية من أكثر من 2000 مركب مرجعي تم تحليلها تحت نفس الظروف الكروماتوغرافية. المركبات التي تستوفي هذه المعايير تصنف كمستوى MSI 2، حيث تمثل المركبات التي تم تحديدها بشكل مفترض بثقة هيكلية عالية.

6. علم الأدوية الشبكي

  1. تحديد المكونات الممتصة بالدم والأهداف المرتبطة ب IgAN
    1. استيراد المكونات النموذجية الممتصة بالدم من YQQJ إلى قواعد بيانات التنبؤ بالأهداف. اختر "الإنسان العاقل" كنوع مستهدف واحصل على أهدافه المحتملة. سجل هذه كمجموعة مستهدفة من المركبات الممتصة بالدم في YQQJ.
    2. استخدم الكلمة المفتاحية "IgA Nephropathy" لاسترجاع أهداف الأمراض المرتبطة ب IgAN من منصات المعلوماتية الحيوية المتكاملة. توحيد النتائج من مصادر متعددة لتقليل التحيز.
      ملاحظة: استخدم قاعدة بيانات بروتين لتحويل جميع الأهداف المسترجعة إلى صيغة رمز الجين لتحقيق الاتساق.
  2. بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) وتحديد الأهداف الأساسية
    1. ادمج مجموعة الأهداف من المركبات الممتصة بالدم من YQQJ مع مجموعة الهدف لمرض IgAN واستخرج تقاطعهما.
    2. رفع الأهداف المتقاطعة إلى منصة PPI21. قم بتكوين الإعدادات: اضبط الكائن الحي ك Homo sapiens، ودرجة الثقة على 0.90، وتخلص من جميع العقد المنفصلة.
    3. استيراد بيانات PPI إلى برنامج التصور22. شغل إضافة التحليل الطوبولوجي. احسب مركزية الدرجة (DC)23، مركزية المسافة (BC)24، ومركزية القرب (CC)25.
    4. فحص الأهداف العلاجية الأساسية ل YQQJ ضد IgAN عن طريق تصفية العقد ذات القيم الطوبولوجية (DC، BC، وCC) التي تتجاوز الوسيط.
  3. بناء وتحليل شبكة "YQQJ – المكونات الممتصة بالدم – الأهداف – المسارات – المرض" المتكاملة
    1. جهز ملف سمة العقدة: أنشئ جدول بيانات يحتوي على عمودين. ضع علامة على العمود الأول باسم العقدة والنوع الثاني من نوع العقدة. خصص واحدة من الفئات الخمس (الحليب الصناعي، المكون الممتص بالدم، هدف التقاطع، المسار، أو المرض) لكل عقدة.
    2. تحضير ملف تفاعل الشبكة (الحافة): أنشئ جدول بيانات يحدد الاتصالات بين العقد (مثل المكون الممتص بالدم إلى هدف التقاطع). تأكد من أن جميع أسماء العقد تتطابق مع تلك الموجودة في ملف سمة العقدة لتجنب أخطاء التعيين.
    3. استيراد وبناء الشبكة: شغل برنامج التصور الشبكي. انتقل إلى ملف > استيراد > الشبكة لتحميل ملف الحافة. في نافذة المعاينة، قم بتعيين الأعمدة ك عقدة المصدر والعقدة المستهدفة وانقر على موافق لإنشاء الرسم البياني الأولي.
    4. رسم سمات العقد وتعيين الأنماط البصرية: استيراد ملف سمة العقدة عبر ملف > استيراد > الجدول. افتح لوحة النمط وقم بتعيين عمود نوع العقدة بخصائص بصرية محددة، بما في ذلك شكل العقدة، لون التعبئة، وحجمها.
    5. تنفيذ التحليل الطوبولوجي: انتقل إلى الأدوات > الشبكة لإجراء حسابات طوبولوجية. تصفية وتحديد المركبات الفعالة الأساسية والأهداف العلاجية الرئيسية بناء على قيم الدرجات العلمية.
      ملاحظة: استخدم نفس المعلمات الطوبولوجية كما هو موضح في الخطوة 6.2 لضمان الاتساق في تحديد العقدة الأساسية.
    6. تصدير صورة الشبكة: أنهي تخطيط الشبكة. انتقل إلى ملف > تصدير > الشبكة إلى الصورة لحفظ التصور المحسن.
  4. تحليل إثراء GO ومسارات KEGG
    1. تقديم قائمة الجينات: افتح منصة التعليقات الوظيفية على الويب. انتقل إلى منطقة الخطوة 1: تقديم قائمة الجينات ورفع قائمة الجينات الأساسية المستهدفة26 التي تم تصفيتها مسبقا.
    2. اختيار الأنواع: في القوائم المنسدلة للخطوة 2: الإدخال كنوع والخطوة 3: التحليل كنوع، اختر H. sapiens. (الإنسان) لضمان إجراء التحليل ضمن السياق البيولوجي الصحيح.
    3. تكوين التحليل المخصص: اختر وضع التحليل المخصص. في فئة الإثراء، تحقق من قواعد البيانات التالية: أنطولوجيا الجينات (GO) الوظيفة الجزيئية (MF)، عملية GO البيولوجية (BP)، مكون خلوي GO (CC)، ومسار موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG).
    4. حدد عتبات الأهمية: اضبط حد قيمة P إلى < 0.01، وأقصى تخصيب إلى ≥ 1.5، والحد الأدنى للتداخل إلى ≥ 3. حافظ على جميع المعايير الأخرى في الإعدادات الافتراضية.
    5. نفذ التحليل: انقر على زر تحليل الإثراء لتقديم المهمة وانتظر حتى تكتمل الحساب.
    6. استرجاع وتصدير النتائج: الوصول إلى صفحة تقرير التحليل المولد. انقر على زر التحميل لتصدير بيانات الإثراء التفصيلية بصيغة جدول بيانات، مع الرسوم البيانية الشريطية والخرائط الحرارية المقابلة.

7. التحقق من الالتحام الجزيئي

  1. قم بتنزيل البروتينات عالية الدقة (< 2.50 أوسكوست) ثلاثية الأبعاد للأهداف الأساسية والهياكل الكيميائية ثنائية الأبعاد للمكونات الأساسية الممتصة بالدم من قواعد بيانات البيولوجيا الهيكلية27.
  2. شغل برنامج الالتحام الجزيئي واستورد الهياكل التي تم تنزيلها.
  3. نفذ خطوات المعالجة المسبقة التالية بالتسلسل: التنقل إلى تعديل > إزالة الماء لإزالة جزيئات الماء؛ اختر تعديل > إزالة الذرات غير المتجانسة للتخلص من البقايا غير القياسية.
  4. اذهب لتعديل > الهيدروجينات > أضف > بولار فقط لإضافة ذرات الهيدروجين القطبية. احفظ الهياكل المعالجة بصيغة PDBQT عبر ملف > حفظ > كتابة PDBQT.
  5. حدد موقع الإرساء باستخدام أداة Grid > Grid Box . تم تعديل أبعاد صندوق الشبكة بشكل تكيفي (20–100 أنج) لضمان تغطية كاملة لمناطق الربط المتوقعة.
  6. تهيئة معلمات الإرساء: اختر المستقبل عبر Docking > Macromolecule > تعيين Rigid Filename وافتح الليغاند عبر Docking > Ligand > Open. تم تعيين معايير الالتحام كما يلي: الإضافة = 32، نطاق الطاقة = 3 كيلو كالوري/مول، وحتى 10 أوضاع ربط تم الاحتفاظ بها. بالنسبة للبروتينات ذات الليغاندات المتبلورة معا، كان صندوق شبكة الالتحام مركزا على مركز الربط مع امتداد 8.0 أونغسترو، بينما بالنسبة للبروتينات التي لا تحتوي على روابط متبلورة، تم التنبؤ بجيوب الارتباط باستخدام DoGSiteScorer بتغطية تقارب 90٪.
  7. اختر خوارزمية لاماركيان الجينية (LGA) كاستراتيجية بحث. نفذ المحاكاة عبر الالتحام > تشغيل AutoDock.
  8. قيم الألفة المرتبطة بناء على طاقة الربط المحسوبة (درجة الإرساء)28.
    ملاحظة: تشير طاقة الارتباط المنخفضة إلى نشاط بيولوجي متوقع أقوى واستقرار هيكلي أعلى لمجمع البروتين-الرابط. عادة ما يستخدم عتبة ≤ -5.0 كيلو كالوري/مول لتحديد استقرار الارتباط المواتي.

النتائج

تحليل المكونات في مستخلص YQQJ المائي
تم إجراء تحليل المكونات لمستخلص YQQJ المائي وفقا للظروف المحددة في بروتوكول 4. تم استخدام UHPLC-Q-Orbitrap HRMS في أوضاع المسح الكامل للأيونات الإيجابية والسالبة لرسم مستخلص YQQJ المائي، ويظهر كروماتوجرام الأيونات الأساسية الذروة (BPI) المحصل عليه في الشكل 1. وبناء على ذلك، مكن قاعدة بيانات مكونات كيميائية ذاتية الإنشاء مع توصيف طيفي للمتلازمة/التصلب المتعدد من التعرف بنجاح على 185 مركبا من المستخرج المائي، مع تلخيص المعلومات التفصيلية في الجدول التكميلي 1. يتم توضيح أنماط المطابقة الطيفية والتجزئة التمثيلية للمتلازمة التصلب المتعدد والتصلب المتعددة المستخدمة لتحديد المركبات في الشكل التكميلي 1. كشفت التحليلات الإحصائية لفئات المركبات أن الفلافونويدات والتربينويدات كانت المكونات السائدة في YQQJ، حيث تمثل 94 مركبا، وهي النسبة الأكثر وفرة.

المكونات الممتصة بالدم في YQQJ
لتوضيح المواد النشطة الحيوية المباشرة في الجسم الحي، تم تحليل عينات المصل التي جمعت بعد إعطاء YQQJ. تم تضمين كروماتوجرام BPI للمصل الفارغ (الشكل 2) للمقارنة لتمييز المركبات المشتقة من الأدوية عن مكونات المصل الداخلي. استنادا إلى مؤشر ضغط الدم في المصل المحتوي على الأدوية (الشكل 3)، تم تحديد ما مجموعه 28 مكونا نموذجيا تم امتصاصه في مجرى الدم، وتشمل بشكل رئيسي الفلافونويدات والتربينويدات والستيرويدات. أكدت كروماتوغرافات الأيونات المستخرجة (EICs) من المركبات الممثلة عبر مستخلص YQQJ، والمصل الفارغ، والمصل المحتوي على الأدوية وجود مكونات مشتقة من الأدوية في الدورة الدموية (الشكل التكميلي 2). من بينها، نشأت 10 مركبات من Spatholobus suberectus Dunn، و7 من Dioscorea nipponica Makino، و7 من Astragalus membranaceus، و6 من Hedyotis diffusa Willd.، و6 من Lonicera japonica Thunb.، و4 من Plantago asiatica L.، و4 من Rheum palmatum.L.، كما هو ملخص في الجدول التكميلي 1.

التنبؤ المستهدف بالمكونات الممتصة بالدم من YQQJ المرتبطة ب IgAN
تم إدخال ما مجموعه 28 مكونات نموذجية محددة تدخل مجرى الدم في قواعد بيانات التنبؤ بالأهداف، مما أتاح 459 هدفا محتملا. وفي الوقت نفسه، تم استرجاع 2779 هدفا متعلقا ب IgAN من منصات المعلوماتية الحيوية المتكاملة. حدد تحليل التقاطعات 247 هدفا متداخلا بين YQQJ وIgAN (الشكل 4).

بناء وتحليل شبكة PPI
تم تحميل الأهداف المتقاطعة ال 247 إلى منصة PPI، وتم استخدام برنامج التصور لفحص الأهداف الأساسية بناء على ثلاثة معايير طوبولوجية: DC، BC، وCC. تم تحديد ما مجموعه 42 هدفا كعقد أساسية. يتم تلخيص سير العمل المستخدم لفحص هذه الأهداف الأساسية في الشكل التكميلي 3. في شبكة PPI، كان حجم العقد ولونها يتغيران حسب قيم المعلمات (الشكل 5)، من بينها TP53 وSRC وAKT1 وESR1 وSTAT3 من بين أفضل خمسة أهداف أساسية.

شبكة "الحليب الصناعي–المكونات الممتصة بالدم–الأهداف الأساسية–المسارات–الأمراض" في YQQJ
لكشف آليات YQQJ متعددة المكونات والأهداف بشكل منهجي ضد IgAN، تم إنشاء شبكة تفاعل "الصيغة – المكونات الممتصة بالدم – الأهداف الأساسية – المسارات – المرض" باستخدام برنامج التصور. تكونت الشبكة من 96 عقدة و459 حافة، حيث تمثل كل حافة علاقة أو تفاعلا بين عقدتين (الشكل 6).

تحليلات إثراء GO وKEGG
كشف تحليل تخصيب GO للأهداف الأساسية ال 42 عن 1162 مصطلح BP، و52 مصطلح CC، و92 MF مصطلح. يعرض الشكل 7 أفضل 10 مصطلحات GO إثراء بشكل ملحوظ في فئات BP وCC وMF. كما حدد تحليل إثراء KEGG 182 مسارا مرتبطا بهذه الأهداف الأساسية. يوضح الشكل 8 أفضل 20 مسارا تأثرا بشكل كبير ومرتبطة ارتباطا وثيقا بمسببات مرض IgAN. في هذه المخططات، تشير الألوان الحمراء الداكنة إلى دلالة إحصائية أقوى، بينما تمثل أحجام الفقاعات الأكبر أو أطوال القضبان الأكبر عددا أكبر من الأهداف المثرية داخل كل مسار.

تقييم الالتحام الجزيئي
في هذه الدراسة، استنادا إلى التحليل السابق للأهداف الرئيسية والمسارات المرتبطة ب YQQJ في علاج IgAN 29,30,31,32، تم اختيار ستة أهداف أساسية، بما في ذلك CASP3 (معرف PDB: 6X8I)، IGF1R (معرف PDB: 1JQH)، جون (معرف PDB: 8RPPP)، STAT3 (معرف PDB: 6NJS)، PRKCB (معرف PDB: 8SE3)، وPIK3CA (PDB ID: 5FI4)، كبروتينات مستقبلات للالتحام الجزيئي. بما يتوافق مع التجسس الأساسي ل TCM ل IgAN، والذي يعرف بأنه "رياح ممرضة، حرارة رطبة وسموم تغزو الكلى"، تم اختيار مكونات نشطة ممثلة ذات خصائص تطهير الحرارة وإزالة الرطوبة وإزالة السموم كأربط، وهي حمض ديأستيل لاسبيرولوزيديك وحمض الجينيبوزيديك من Hedyotis diffusa Willd.، وديوسسين من Dioscorea nipponica. ماكينو. تظهر نتائج الالتحام في الشكل 9. من بين جميع تركيبات الليغاند-المستقبلات، أظهر ديوسين طاقات ارتباط أقل بشكل ملحوظ مع جميع الأهداف المختارة، مما يشير إلى ألفة ارتباط أعلى متوقعة. باستثناء التفاعلات بين JUN وحمض دياستيل لاسبيرولوزيديك/حمض الجينيبوزيديك، أظهرت أزواج الالتحام الأخرى أيضا أنشطة ارتباط إيجابية. تظهر تشكيلات الالتحام ثلاثية الأبعاد التمثيلية في الشكل 10.

figure-results-1
الشكل 1: كروماتوغرامات الأيونات الأساسية الذروة لمستخلص YQQJ المائي. (أ) كروماتوغرام الوضع الأيوني الموجب BPI. (ب) كروماتوجرام BPI في وضع الأيونات السالب. تظهر الكروماتوغرامات الملف الكيميائي العام لمستخلص YQQJ المائي تحت ظروف UHPLC-Q-Orbitrap HRMS المعتمدة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: كروماتوغرامات الأيونات ذات الذروة الأساسية لمصل فارغ. (أ) كروماتوغرام الوضع الأيوني الموجب BPI. (ب) كروماتوجرام BPI في وضع الأيونات السالب. تمثل الكروماتوغرامات ملف خلفية المصل الداخلي المستخدم كضابط للمقارنة مع المصل المحتوي على الأدوية لتمييز المكونات المشتقة من الأدوية عن المكونات الداخلية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: كروماتوغرامات الأيونات ذات الذروة الأساسية لمصل يحتوي على YQQJ. (أ) كروماتوغرام الوضع الأيوني الموجب BPI. (ب) كروماتوجرام BPI في وضع الأيونات السالب. تمثل الكروماتوغرامات ملف المكونات الممتصة بالدم التي تم اكتشافها في المصل بعد إعطاء YQQJ. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: مخطط فين للأهداف المتداخلة بين YQQJ وIgAN. يظهر المخطط عدد الأهداف المتوقعة ل YQQJ، والأهداف المتعلقة ب IgAN، وتقاطعها، مع تسليط الضوء على الأهداف المشتركة التي قد تكون متورطة في التأثيرات العلاجية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) للأهداف الأساسية. تمثل العقد أهداف بروتينية، والحواف تمثل التفاعلات بين الأهداف. حجم العقدة وشدة اللون يتوافقان مع قيم الدرجات، مع العقد الأكبر والأعمق التي تشير إلى اتصال أعلى داخل الشبكة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: شبكة متكاملة من مكونات YQQJ، والأهداف، والمسارات، والأمراض. توضح الشبكة العلاقات بين الصيغة التركيبية، والمكونات الممتصة بالدم، والأهداف الأساسية، والمسارات، وIgAN. المثلث يمثل المرض؛ الدائرة تمثل المسارات؛ تمثل العقدة على شكل حرف V صيغة YQQJ؛ الماس يمثل الأعشاب؛ السداسي يمثل المكونات؛ يمثل المثمن النموذج الأولي لمكونات ممتصة من الدم؛ المستطيل يمثل الأهداف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: تحليل إثراء GO للأهداف الأساسية. يوضح مخطط الشريط أفضل 10 مصطلحات أنطولوجيا جينية غنية عبر فئات BP وCC وMF. يمثل المحور x مصطلحات GO، ويظهر المحور y −log10 (قيمة p)، مما يشير إلى أهمية الإثراء. الاختصارات: BP = العملية البيولوجية؛ CC = المكون الخلوي؛ MF = الوظيفة الجزيئية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-8
الشكل 8: تحليل إثراء مسار KEGG للأهداف الأساسية. يعرض مخطط الفقاعة أفضل 20 مسارا مثريا في KEGG. حجم النقطة يشير إلى عدد الجينات المثرية، وتدرج اللون يشير إلى −log10 (قيمة p)، مع الألوان الأكثر احمرارا إلى دلالة إحصائية أعلى. المحور x يوضح نسبة الجينات، ومحور y يسرد مصطلحات المسارات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-9
الشكل 9: خريطة حرارة طاقة الربط الجزيئي بالالتحام الجزيئي. تعرض خريطة الحرارة طاقات ارتباط (كيلو كالوري/مول) بين الأهداف الأساسية والمركبات الرئيسية الممتصة بالدم. تشير قيم طاقة الارتباط المنخفضة إلى توقع أقوى في الألفة بين الارتباط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-10
الشكل 10: تشكلات الالتحام الجزيئي التمثيلية. (أ) التكوين المرتبط لحمض ديأستيلاسبيرولوزيديك مع CASP3. (ب) التكوين المرتبط للديوسسين مع STAT3. (ج) تكوين الارتباط لحمض الجينيبوزيديك مع PIK3CA. تظهر الصور التفاعلات المتوقعة بين الليغاند والبروتين واتجاهات الارتباط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: التحديد الهيكلي للمركبات الممثلة بواسطة MS/MS عالي الدقة. (أ) مقارنة طيفية من الرأس إلى الذيل لحمض ديأستيلاسبيرولوزيديك بين الطيف التجريبي (الأعلى، الأحمر) وطيف قاعدة البيانات المرجعية (الأسفل، الأزرق). (ب) طيف تجزئة التصلب المتعدد/التصلب المتعدد عالي الدقة لحمض ديأستيلاسبيرولوزيديك. (ج) مقارنة طيفية من الرأس إلى الذيل لحمض الجينيبوزيديك مع قاعدة البيانات المرجعية. (د) طيف تجزئة التصلب المتعدد التجريبي لحمض الجينيبوزيديك. (ه) مقارنة طيفية من الرأس إلى الذيل بين ديوسين وقاعدة البيانات المرجعية. (و) طيف التجزئة الميكروفوني المتعدد عالي الدقة للديوسين. توضح هذه اللوحات المطابقة الطيفية المستخدمة في تحديد المركبات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: كروماتوغرافيات الأيونات المستخرجة (EICs) للمركبات الممثلة عبر العينات. (أ) EIC لحمض دياستيل لاسبيرولوزيديك. (ب) EIC لحمض الجينيبوزيديك. (ج) مهندس المهندس البحري في ديوشين. لكل لوحة، يمثل الأثر العلوي مستخلص YQQJ المائي (ZY)، والأثر الأوسط يمثل مصل التحكم الفارغ (KBX)، والأثر السفلي يمثل عينات مصل تحتوي على مكونات ممتصة بالدم بعد إعطاء YQQJ (GYX). تبرز المقارنة وجود مركبات مشتقة من الأدوية في المصل. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: سير العمل لفحص الأهداف الأساسية. يوضح المخطط التدريجي عملية تحديد الأهداف خطوة بخطوة، بما في ذلك التنبؤ بالأهداف المركبة، وجمع الأهداف المتعلقة ب IgAN، وتحليل التقاطعات، وبناء شبكة PPI، وفحص الأهداف الأساسية بناء على معايير طوبولوجية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الوقت (دقيقة)المرحلة المتنقلة
A (v٪)B (v٪)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

الجدول 1: برنامج التدرج اللوبي التابع ل UHPLC. يعرض الجدول تركيب الطور المتنقل وشروط التدرج المستخدمة للفصل الكروماتوغرافي، بما في ذلك نقاط الزمن والنسب المقابلة للمذيبات المائية (المرحلة A) والعضوية (المرحلة B).

الجدول التكميلي 1: المكونات الكيميائية المحددة لمستخلص YQQJ المائي. يسرد الجدول المركبات التي تم تحديدها بواسطة UHPLC-Q-Orbitrap HRMS، بما في ذلك المكونات الممتصة للدم (A1–A28) النموذجية، إلى جانب تصنيفها وأصلها العشبي. الاختصارات: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = ديوسكوريا نيبونيكا ماكينو; DH = الروماتوم بالماتوم L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = بلانتاجو آسياتيكا L.; JYH = لونيسيرا يابونيكا. ثنب. تشمل الفئات المركبة A = قلويدات؛ Ald = الألدهيدات؛ F = فلافونويدات; N = النيوكليوسيدات; O = آخرون؛ OA = الأحماض العضوية؛ P = الفينولات؛ PA = الأحماض الفينوليكية؛ Phe = الفينيل بروبانويدات؛ Q = الكينونيس؛ S = السكريات؛ Ste = المنشطات؛ T = التربينويدات؛ تان = تانين. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

في هذه الدراسة، تم استخدام استراتيجية متكاملة تجمع بين "تحديد UHPLC-Q-Orbitrap HRMS – تحليل الكيمياء الدوائية في المصل – التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي – التحقق من صحة الالتحام الجزيئي" لتوضيح الأساس المادي المحتمل وآليات YQQJ في علاج IgAN. على عكس الأبحاث السابقة التي اعتمدت بشكل رئيسي على التصلب المتعدد لتحليل المكونات الكيميائية للصيغ العشبية ثم التنبؤ بالآليات باستخدام علم الأدوية الشبكي وحده16، تتبع الكيمياء الدوائية في المصل سير عمل من "المكونات العشبية المعقدة – المكونات الممتصة بالدم – المواد الفعالة المباشرة في الجسم الحي – أساس المادة الدوائية". من خلال تحديد المكونات التي تدخل الدورة الجهازية بعد الإعطاء، يعتبر هذا النهج على نطاق واسع استراتيجية فعالة لتحديد الأساس الدوائي الديناميكي لصيغ الطب الصيني التقليدي.

في هذه الدراسة، حدد تحليل UHPLC-Q-Orbitrap HRMS في البداية 185 مكونا في YQQJ، من بينها تم تأكيد 28 منها كمركبات ممتصة دموية نموذجية، مما وفر أساسا كيميائيا موثوقا للدراسات الميكانيكية اللاحقة. كانت دقة هذا التحديد تعتمد على المطابقة الشاملة لوقت الاحتفاظ، والكتلة الدقيقة، ومعلومات تجزئة MS/MS14. استنادا إلى استراتيجية الكيمياء الدوائية في المصل، استخدمت هذه المركبات الممتصة بالدم كنقطة انطلاق لبناء الشبكة، مما عزز الصلة بين المكونات العشبية والفعالية الفعلية في الجسم الحي. من خلال دمج الأهداف المتقاطعة بين المركبات والمرض مع الفحص القائم على مثبطات مضخة البروتون للعقد الأساسية، تليها تحليلات إثراء GO وKEGG، تم تحديد المسارات الرئيسية للإشارات المرتبطة ب IgAN15. أشارت نتائج الالتحام الجزيئي إلى أن المكونات الرئيسية الممتصة بالدم مشتقة من Hedyotis diffusa Willd. و Dioscorea nipponica Makino.قد يتفاعل مع الأهداف الأساسية بناء على ميول ارتباط متوقعة بدلا من النشاط الوظيفي المؤكد تجريبيا. تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن حمض ديأستيلاسبيرولوزيديك، حمض الجينيبوزيديك، والديوسسين قد تكون المكونات الدوائية الديناميكية الرئيسية المحتملة ل YQQJ، في انتظار المزيد من التحقق التجريبي.

من الناحية التقنية، كان المعالجة المسبقة للعينات أمرا حاسما. نظرا لتعقيد المصل ووجود البروتينات الداخلية (مثل الهرمونات والإنزيمات)، فإن التدخل في اكتشاف المكونات الممتصة بالدم أمر لا مفر منه. في هذه الدراسة، تم تطبيق ترسيب الميثانول لإثراء المحللات وتقليل التداخل الخلفي، مما يضمن حساسية ودقة تحليل التصلب المتعدد34. فيما يتعلق بفترات أخذ عينات الدم، قد تظهر المكونات المختلفة في التركيبات العشبية امتصاصا مميزا وأنماط تحول في الجسم الحي، مما يؤثر على قابليتها للكشف في المصل. لذلك، وبناء على التجارب الأولية، تم جمع عينات المصل بعد 2 ساعة و8 ساعات من الإعطاء النهائي لتعظيم تغطية المكونات المتداولة.

تم العثور على عدة خطوات إجرائية حاسمة بشكل خاص لتنفيذ هذا سير العمل بنجاح. يعتمد التعرف الدقيق على المركبات بشكل كبير على التقييم المشترك لوقت الاحتفاظ، ودقة الكتلة عالية الدقة، وأيونات شظايا التصلب المتعدد والتصلب التشخيصي. بالإضافة إلى ذلك، فإن الفترات الزمنية المناسبة لأخذ عينات المصل ضرورية لالتقاط المكونات الممتصة بالدم والتي قد تظهر في الدورة الدموية في مراحل مختلفة بعد الاستخدام. لذلك فإن التحسين الدقيق لظروف المعالجة المبدئية للعينة وفصل الكروماتوغرافيا ضروري لضمان الكشف الموثوق عن المركبات النموذجية في المصفوفات البيولوجية المعقدة.

قد تظهر تحديات تحليلية محتملة أثناء تحضير العينات وتحليل التصلب المتعدد. على سبيل المثال، قد يؤدي ترسيب البروتين غير الكامل إلى تأثيرات مصفوفة تقلل من كفاءة التأين، في حين أن الضوضاء الخلفية الزائدة قد تقلل من حساسية الكشف. يمكن التخفيف من هذه المشاكل من خلال تحسين نسب المذيبات أثناء ترسيب البروتينات، وتحسين ظروف الفصل الكروماتوغرافي، وتعديل معلمات اكتساب التصلب المتعدد. أثناء معالجة البيانات، قد تحدث تعليقات مركبة إيجابية كاذبة عند الاعتماد فقط على مطابقة قواعد البيانات؛ لذلك، يوصى بالتحقق اليدوي من أنماط تجزئة التصاب المتعدد وسلوك الاحتفاظ بالمحتوى لتحسين موثوقية التعريف.

تم دمج عدة اعتبارات منهجية في هذا العمل. أولا، بدلا من تطبيق معايير تقليدية مثل التوافر الحيوي الفموي وشبهة الدواء، تم استخدام المكونات الممتصة تجريبيا فقط للتنبؤ بالأهداف. تجنب هذا النهج احتمال حذف المركبات الفعالة بسبب عتبات الترشيح المحددة مسبقا وأزال المكونات غير المهمة التي لا تكون متاحة حيويا في الجسم الحي، مما عزز الصلة الفسيولوجية للتنبؤ بالشبكة16. ثانيا، ركز اختيار الليغندات النشطة للالتحام تحديدا على المكونات الرئيسية المنشأة من الأعشاب التي تؤدي وظائف "إزالة رطوبة الرياح وإزالة السم الحراري" (Hedyotis diffusa Willd. و Dioscorea nipponica Makino)، مما أسس جسرا ميكانيكيا بين مفهوم الطب الطبي الصيني التقليدي ل "سم الحرارة الرطوبة الذي يغزو الكلى" والخصائص المرضية الحديثة ل IgAN. يوفر هذا دليلا أوليا يدعم نظرية الطب الصيني التقليدي في ارتباط الصيغة والنمط. ثالثا، وبالنظر إلى الفروقات المحتملة في حجم البيانات وجودتها عبر قواعد البيانات، تم دمج منصات متعددة لتوسيع التغطية المستهدفة وتقليل التحيز الذي تدخله أي قاعدة بياناتواحدة 35.

مقارنة بالاستراتيجيات التقليدية التي تطبق علم الأدوية الشبكي مباشرة على جميع المكونات الكيميائية المكتشفة، يركز سير العمل الحالي على أولوية المركبات الموجهة بالأدلة بناء على المكونات الممتصة بالدم التي تم اكتشافها تجريبيا. تقلل هذه العملية التدريجية من عدد المركبات المرشحة التي تدخل التحليل الحاسوبي وتحسن من قابلية تفسير شبكات التفاعل بين المركب-الهدف. علاوة على ذلك، وعلى عكس الدراسات الموجهة للاستيض التي تلتقط بشكل رئيسي الاضطرابات الأيضية الداخلية، تركز الاستراتيجية الحالية على المركبات النموذجية الخارجية المشتقة من الأدوية العشبية، مما يتيح نسب النشاط الدوائي بشكل مباشر إلى مكونات عشبية محددة.

من منظور منهجي عملي، يوفر هذا السير عدة مزايا لدراسة التركيبات العشبية المعقدة. يتيح دمج HRMS مع الكيمياء الدوائية في المصل التعرف الموثوق على المكونات المتاحة حيويا، بينما يخلق الجمع اللاحق بين علم الأدوية الشبكي والربط الجزيئي إطارا تحليليا هرميا يربط بين الأدلة الكيميائية والتنبؤ الميكانيكي. بالإضافة إلى ذلك، فإن تقييد بناء الشبكة على المركبات التي تم التحقق منها تجريبيا يقلل من تعقيد الشبكة ويسهل تحديد تفاعلات المركب الأساسي والهدف بشكل أوضح.

هذه الدراسة لها أيضا بعض القيود. أولا، علم الأدوية الشبكي والالتحام الجزيئي هما نهجان حسابية تنبؤية. لا يترجم الألفة القوية للارتباط بالضرورة إلى تنظيم بيولوجي في الجسم الحي، حيث أن الالتحام الجزيئي لا يأخذ في الاعتبار ديناميكيات البروتينات أو السياق الخلوي أو الإشارات اللاحقة. علاوة على ذلك، لم يتضمن بروتوكول الالتحام الحالي التحقق من إعادة الالتحام باستخدام الروابط المتبلور المشتركة أو المقارنة مع المثبطات المعروفة، مما قد يحد من تقييم دقة الإرساء. الدراسات المستقبلية التي تتضمن التحقق القائم على RMSD، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، والاختبارات التجريبية ستعزز موثوقية هذه التنبؤات. حاليا، أكمل فريقنا التحقق الميكانيكي الذي يثبت أن ديوسين يعمل عبر مسار JAK2/STAT3، مما يعزز مصداقية التنبؤ إلى حد ما ويوفر دعما تجريبيا جزئيا للأهداف الرئيسية المحددة في هذه الدراسة، رغم أن التفاعلات الأخرى بين المكونات والهدف لا تزال تتطلب تأكيدا36. ثانيا، لم يتم تضمين تأثيرات التوافق النسبي وعلاقات الجرعات بين الأعشاب في التحليل الحالي. قد تقدم الأعمال المستقبلية نماذج شبكة مرجحة بالجرعة وتأثير الجرعة لتعكس بشكل أفضل ممارسات الوصفات الطبيةالسريرية 37.

في الختام، يتيح سير العمل الحالي—تحديد المكونات الممتصة بالدم القائم على التصلب المتعدد عالي الدقة، والتحليل القائم على علم الأدوية الشبكي والمسار، والتحقق من الالتحام الجزيئي—تضييق الأساس النشط للمادة وأهداف الحركة بكفاءة من صيغة عشبية معقدة. يوفر هذا اتجاها تجريبيا واضحا للتحقق البيولوجي التابع ويسرع التحقيقات الميكانيكية لصيغ الطب الصيني التقليدي. في المستقبل، قد يتيح دمج الأيض المكاني، والنماذج العضوية، وتقنيات الوسائط المتعددة التحقق والتوسع الديناميكي والثلاثي الأبعاد للنتائج الحالية في أنظمة تعيد بشكل أوثق الظروف الفسيولوجية والمرضية، مما يوفر أدلة أكثر قوة لتوضيح الأساس العلمي لصيغ الطب الصيني التقليدي.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81973675)، ومشروع الترويج للمستشفى الطبي الصيني رفيع المستوى (المنحة رقم HLCMHPP2023039)، ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (المنحة رقم 7252259).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أوتودوك 4.2.6معهد أبحاث السكريبتات-
عمود كروماتوغرافيشركة ووترز كورب.الكمية UPLC HSS T3
الطرد المركزي المبرد عالي السرعةمختبر هيتيتش لتقنيةميكرو 220R
منصات المعلوماتية الحيوية المتكاملةوايزمان  المعهد  OF  العلم-قاعدة بيانات GeneCards (https://www.genecards.org/)
منصات المعلوماتية الحيوية المتكاملةال  Johns  هوبكنز  الجامعة  المدرسة  OF  الطب-قاعدة بيانات OMIM (https://omim.org/).
LC-MS/4 L أسيتونونتريلثيرمو فيشر العلميA955-4
LC-MS/4 لتر ميثانولثيرمو فيشر العلميA456-4
LC-MS/4 لتر مياهثيرمو فيشر العلميW6-4
حمض الفورميك LC-MS/50 ملثيرمو فيشر العلميA117-50
برنامج معالجة بيانات الطيف الكتليشركة ووترز كورب.-برنامج Progenesis QI 3.0
برنامج الالتحام الجزيئيمختبر أولسونأوتودوك 4.2.6
منصة PPIشركة قاعدة بيانات STRING-منصة STRING الإلكترونية (https://string-db.org)
قاعدة بيانات البروتينالمعهد الأوروبي للمعلوماتية الحيوية؛ المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية؛ مصدر معلومات البروتين-منصة UniProt (https://www.uniprot.org/)
مطياف الكتلة الرباعي الأوربيتيرابثيرمو فيشر العلميIQLAAEGAAPFALGMAZR
قواعد بيانات المركبات المرجعيةTCM Pro 2.0، شركة بكين هيكسين تكنولوجي المحدودة.-
المبخر الدوارشركة شنغهاي تايتان العلمية المحدودةTR-3L
قواعد بيانات علم الأحياء الهيكلي.مختبر بروكهافن الوطني-قاعدة بيانات بيانات RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)
قواعد بيانات علم الأحياء الهيكلي.المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية-قاعدة بيانات PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
قواعد بيانات التنبؤ بالأهدافمعهد SIB السويسري للمعلوماتية الحيوية-قاعدة بيانات SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch)
قواعد بيانات التنبؤ بالأهدافشنغهاي   المعهد  OF  ماتيريا  ميديكا-قاعدة بيانات TCMSP (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
إضافة التحليل الطوبولوجي--إضافة Centiscape 2.2؛ محلل الشبكة
نظام UHPLCفانكويش فليكس-
كروماتوغرافيا سائل فائق الأداءثيرمو فيشر العلميفانكويش فليكس UHPLC
المستخرج بالموجات فوق الصوتيةشركة كونشان للأدوات فوق الصوتية المحدودةKQ3200D
مركز الطرد المركزي الفراغيشركة نينغبو ساينتز للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.SCIENTZ-1LS
برامج التصور--سايتوسكيب 3.10.4
منصة تعليق وظيفي قائمة على الويب.برود  المعهد-منصة ميتاسكيب الإلكترونية (https://metascape.org)

المراجع

  1. Pattrapornpisut, P., Avila-Casado, C., Reich, H. N. IgA nephropathy: Core curriculum 2021. Am J Kidney Dis. 78 (3), 429-441 (2021).
  2. Pitcher, D., et al. Long-term outcomes in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (6), 727-738 (2023).
  3. Shen, X., et al. Long-term outcomes of IgA nephropathy in China. Nephrol Dial Transplant. 40 (6), 1137-1146 (2025).
  4. Roberts, I. S. D. Pathology of IgA nephropathy: A global perspective. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 71-74 (2024).
  5. Floege, J., Bernier-Jean, A., Barratt, J., Rovin, B. Treatment of patients with IgA nephropathy: A call for a new paradigm. Kidney Int. 107 (4), 640-651 (2025).
  6. Zhang, Y., Zhang, H. Current understanding and new insights in the treatment of IgA nephropathy. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 75-79 (2024).
  7. Kang, S. Comparative analysis of western medicine and traditional Chinese medicine. 4th Int. Conf. Social Sciences and Humanities and Arts (SSHA 2025), 2025, , 350-355 (2025).
  8. Wang, X. H., et al. Traditional Chinese medicine in treating IgA nephropathy. J Transl Intern Med. 9 (3), 161-167 (2021).
  9. Zeng, Q., Xu, J. L., Liang, Y., Yu, R. H. Etiology and treatment progress of IgA nephropathy. Med Recapitulate. 28 (1), 163-167 (2022).
  10. Guo, T., et al. Regulation of immune dysfunction in IgA nephropathy. Chin J Basic Med Tradit Chin Med. 30 (3), 552-555 (2024).
  11. Deng, Q. H., Zou, D., Zhang, S. L., Zhou, X. Regulation of mucosal immunity in IgA nephropathy. Acta Chin Med. 40 (5), 1026-1031 (2025).
  12. Zhang, S. Q., Rao, X. R., Dai, X. W. Clinical observation of Yiqi Qingjie Fang. Guangming J Chin Med. (12), 44-45 (2006).
  13. Dong, M. Y., et al. Efficacy of Yiqi Qingjie Fang combined with immunosuppressants. Chin J Integr Tradit West Med. 39 (7), 791-797 (2019).
  14. Yu, Y., Yao, C., Guo, D. A. Chemical basis of traditional Chinese medicine. Acta Pharm Sin B. 11 (6), 1469-1492 (2021).
  15. Zhou, W. X., Cheng, X. R., Zhang, Y. X. Network pharmacology: A new concept. Chin J Pharmacol Toxicol. 26 (1), 4-9 (2012).
  16. Huang, Q., et al. Active components of Eucommia ulmoides. Chin J New Drugs Clin Rem. 40 (6), 460-469 (2021).
  17. Zhang, A. H., et al. Chinmedomics approach. Engineering. 5 (1), 60-68 (2019).
  18. Wang, X., Zhang, A., Sun, H., Yan, G. Serum pharmacochemistry of TCM. Phytother Res. 31, 7-14 (2017).
  19. Liu, R., Zhao, Z., Dai, S., Che, X., Liu, W. Bioactive compound identification. J Agric Food Chem. 67 (13), 3811-3825 (2019).
  20. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experimental methodology. Chin Pharmacol Bull. (1), 19(1992).
  21. Szklarczyk, D., et al. STRING v11 database. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D607-D613 (2019).
  22. Shannon, P., et al. Cytoscape software. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  23. Jeong, H., Mason, S. P., Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Protein network centrality. Nature. 411 (6833), 41-42 (2001).
  24. Joy, M. P., Brock, A., Ingber, D. E., Huang, S. High-betweenness proteins. J Biomed Biotechnol. (2), 96-103 (2005).
  25. Wuchty, S., Stadler, P. F. Centers of complex networks. J Theor Biol. 223 (1), 45-53 (2003).
  26. Zhou, Y., et al. Metascape resource. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  27. Burley, S. K., et al. RCSB PDB resources. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D564-D574 (2025).
  28. Laskowski, R. A., Swindells, M. B. LigPlot+. J Chem Inf Model. 51 (10), 2778-2786 (2011).
  29. Cheung, C. K., et al. Pathogenesis of IgA nephropathy. Nat Rev Nephrol. 21 (1), 9-23 (2025).
  30. Zhao, L., et al. Triptolide and IgA nephropathy. Cell Prolif. 55 (9), e13278(2022).
  31. Tao, J., et al. JAK-STAT activity in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (7), 973-982 (2020).
  32. Cox, S. N., et al. Wnt/β-catenin and PI3K/AKT pathways. Kidney Int. 78 (4), 396-407 (2010).
  33. Nie, X., et al. Huagan Jian analysis. Chin Tradit Herb Drugs. 53 (2), 382-394 (2022).
  34. Wu, X. W., et al. Serum pharmacochemistry methodology. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 25 (3), 173-179 (2019).
  35. Abbasi, K., et al. Deep learning in drug target prediction. Curr Med Chem. 28 (11), 2100-2113 (2021).
  36. Zhou, L., et al. Dioscorea nipponica mechanisms. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120272(2025).
  37. Zhang, K. Y., et al. Dose–effect network pharmacology. Chin J Hosp Pharm. 43 (7), 738-747 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

KEGG
توضيح الأساس المادي لصيغة يي تشينغجي ضد اعتلال الكلى IgA باستخدام نظام UHPLC-Q-Orbitrap HRMS المدمج مع علم الأدوية الشبكي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.