Method Article

فك شفرة الإبيترانسكريبتوم: في سيليكو رؤى حول شبكة تنظيم m6A في سرطان الثدي

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول نهجا لإجراء تحليلات وراثية وجزيئية وتنبؤية لمنظمي تعديل m6A من خلال دمج ملفات الطفرات، وتغييرات عدد النسخ، والتعبير الجيني، والنتائج السريرية باستخدام مجموعات بيانات متاحة للجمهور من أطلس الجينوم السرطاني (TCGA)، ومشروع التعبير الجيني للأنسجة (GTEx)، ومنصات المصفوفات الدقيقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد N6-ميثيلادينوزين (m6A) أكثر تعديلات الحمض النووي الريبي الداخلية وفرة في النسخ حقيقية النواة، ويلعب دورا حاسما في أيض الحمض النووي الريبي، والتعبير الجني، وتوازن الخلايا الداخلية. لقد أصبح اختلال تنظيم منظمي m6A، بما في ذلك "الكتاب" و"الممحاة" و"القراء"، مرتبطا بشكل متزايد ببيولوجيا السرطان؛ ومع ذلك، لا تزال أدوارهم الشاملة في سرطان الثدي غير مفهومة. الهدف الأساسي من هذه المقالة حول الطرق هو تزويد مبتدئي المعلوماتية الحيوية بإطار عمل خطوة بخطوة لاستخدام مجموعات بيانات السرطان المتاحة للجمهور لإجراء تحليلات الطفرات، وتقييم تغيرات التعبير الجيني، وفحص ارتباطها ببقاء المرضى. كدراسة حالة، تم تحليل منظمات m6A في سرطان الثدي باستخدام مجموعات بيانات من أطلس جينوم السرطان (TCGA)، ومشروع تعبير الجينوم-الأنسجة (GTEx)، ومنصات المصفوفات الدقيقة. تم تحليل ملفات النسخ بشكل منهجي لإظهار سير العمل لتقييم الأهمية التنبؤية لمكونات تنظيم m6A في سرطان الثدي. باستخدام هذا الإطار التحليلي، تم تحديد أنماط مميزة للتغيرات الجينية والتعبير التفاضلي بين منظمات m6A الرئيسية. ارتبطت عدة جهات تنظيمية، منها METTL14، CBLL1، YTHDC1، HNRNPC، HNRNPA2B1، وRBMX، ببقاء أفضل على قيد الحياة على قيد الحياة من المرضى، بينما ارتبطت YWHAG بضعف البقاء العام. توفر هذه الدراسة نظرة شاملة على جينوميات الأنظمة لجينات التنظيم m6A في سرطان الثدي مع إظهار سير عمل عملي وقابل للتكرار في المعلوماتية الحيوية عبر الويب. تعزز هذه النتائج فهم تنظيم الترطيحات في سرطان الثدي وتوفر أساسا لتطوير استراتيجيات تشخيصية وعلاجية جديدة قائمة على m6A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل التعديلات الشفافة طبقة مهمة من تنظيم الجينات بعد النسخ وتساهم في عمليات خلوية متنوعة وحالات مرضية. من بين أكثر من 170 تعديلا على الحمض النووي الريبي تم تحديدها حتى الآن، يعد N6-ميثيلادينوزين (m6A) الأكثر انتشارا وتوصيفا في mRNA حقيقياتالنواة 1. يتم تركيبه بواسطة مجمعات "كاتب" مثل METTL3/METTL14، وإزالته بواسطة "ممحاة" مثل FTO وALKBH5، ويتم تفسيره بواسطة بروتينات "قارئة" مثل YTH وأعضاء عائلتي IGF2BP، حيث ينسق m6A ربط الحمض النووي الريبي (RNA)، واستقراره، ونقله، وترجمته، مما يؤثر على العمليات البيولوجية الرئيسية بما في ذلك التطور، والتمايز، واستجابة الإجهاد2،3.

تم الإبلاغ عن تغييرات في المكونات التنظيمية ل m6A عبر طيف واسع من الأورام الخبيثة4. في العديد من أنواع السرطان، يؤدي نشاط m6A الشاذ إلى الظهور الخبيث؛ على سبيل المثال، يعزز التعبير المرتفع ل METTL3 بدء وتقدم سرطان البروستاتا من خلال تعديل مسار القنفذ ومثيلة RNA بتقنية MYC 5,6. في البداية، تبين أن FTO متورط في تأثيرات مسرطية على سرطان الدم النخاعي الحاد، وأثبت أنه يدفع تقدم الورم في سرطانات الكبد والرئة والقولون والمستقيم 7,8,9,10. ومع ذلك، تم تحديد أدوار FTO وALKBH5 تعتمد على السياق توضح الطبيعة المزدوجة للتنظيم الذي يعبر عنه m6A، والذي يمكن أن يعزز كل من الإشارات المسرمة والقمعية للورم 11,12,13,14. كما تم العثور على قارئات M6A، بما في ذلك YTHDF1/2/3، وبروتينات الريبونوكليو النووية غير المتجانسة (hnRNPs)، وبروتينات ارتباط mRNA بعامل نمو شبيه بالأنسولين (IGF2BP1-3)، مرتبطة بتكوين السرطان 15,16,17.

في سرطان الثدي، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن منظمات m6A غالبا ما تكون غير منظمة وقد ترتبط بأنواع الأورام الفرعية، وخصائص مناعية، والنتائج السريرية18,19. تشير الدراسات الميكانيكية المتعددة إلى أن METTL3 عامل مؤيد للأورام بشكل متكرر في سرطان الثدي. يمكن لتركيب m6A بوساطة METTL3 أن يثبت أو يعزز ترجمة النسخ التي تعزز التكاثر، والانتقال الظهاري-الميزنشيمي (EMT)، والنقائل، والمقاومة الكيميائية20. كما ثبت أن METTL3 يعزز تقدم سرطان الثدي من خلال استهداف Bcl-221. تم الارتباط ب ALKBH5 بتنظيم برامج الجذع السرطانية عبر NANOG وجزيئات أخرى مرتبطة بالجذع، لكن تأثيره قد يختلف حسب سياق الورم22.

مع استمرار توسع قائمة منظمي m6A في السنوات الأخيرة، هناك حاجة إلى تحديث حول كيفية اختلاط التنظيمات الجديدة في سرطان الثدي. يوفر الجدول 1 قائمة بمنظمات m6A التي تشمل الكتاب والقراء والممحاة لتعديل m6A. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد منظمات m6A جديدة، بما في ذلك LRPPRC وYWHAG، ذات تأثيرات على تقدم السرطان 23,24,25. لذلك، تم إجراء توصيف جيني وجزيئي شامل لجميع منظمات m6A المعروفة في سرطان الثدي باستخدام أدوات يمكن استخدامها من قبل باحثين ذوي خلفية معلوماتية حيوية محدودة.

هدف هذه المقالة من Methods هو تقديم بروتوكول معلوماتية حيوية قائم على المنصة خطوة بخطوة لتحليل منظمات m6A في سرطان الثدي باستخدام موارد الجينوميات السرطانية المتاحة للجمهور. باستخدام مجموعات بيانات من أطلس جينوم السرطان (TCGA) (www.cancer.gov/tcga)، ومشروع تعبير الأنسجة الجيني (GTEx)رقم 26، والمنصات التحليلية المعتمدة على الويب مثل cBioPortal وUCSC Xena، يوضح هذا البروتوكول سير عمل قابل للتكرار لتقييم الملفات الطفرية، وتغيرات تعبير الجينات، والارتباط ببقاء المرضى. يهدف هذا النهج المرئي والمتاح إلى تسهيل اعتماد تحليل بيانات الترطيبية من قبل الباحثين الجدد في المعلوماتية الحيوية للسرطان.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: قائمة الجينات التي ترمز منظمات المثيلة m6A، المصنفة ككتاب، وقراء، وممحاة، معروضة في الجدول 1. تم تضمين جميع الجينات المدرجة في التحليلات اللاحقة للطفرات وأنماط التعبير والبقاء العام. جميع البرامج والأدوات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحديد التغيرات الجينية في منظمات m6A

  1. ادخل إلى cBioPortal لجينوميات السرطان. انتقل إلى موقع cBioportal الإلكتروني (www.cbioportal.org)27,28. من الصفحة الرئيسية، اختر علامة تبويب "الاستعلام" لبدء تحليل جديد.
  2. اختر دراسة السرطان المناسبة والدفعة.
  3. في شريط البحث "اختيار الدراسات للتصور والتحليل"، اكتب "سرطان الثدي الغازي" واختر "سرطان الثدي الغازي (TCGA، أطلس السرطان الشامل)".
  4. في الأسفل، اختر "الاستعلام حسب الجين".
    أمر حرج: تأكد من أن المجموعة المختارة (996 عينة) تتضمن بيانات الطفرات وتغيير عدد النسخ (CNA).
  5. حدد الاستعلام الجيني. في "إدخال الجينات"، أدخل رموز جين HUGO للقائمة الكاملة لمنظمي m6A قيد التحقيق.
    ملاحظة: يمكن إدخال الجينات كقائمة مفصولة بمسافات. تحت "اختيار الملفات الجينومية"، تأكد من التحقق من نوعي البيانات التاليين: الطفرات وتغييرات أرقام النسخ.
  6. تحت "اختيار مجموعة المرضى/الحالات"، اختر مجموعة العينات الافتراضية التي تتوافق مع المجموعة التي تحتوي على جميع الحالات المحددة.
  7. انقر على زر "إرسال استفسار" الأزرق.
  8. استرجاع وتفسير بيانات التغيير الجيني. عند التقديم، سيتم تحميل النتيجة في تبويب "الملخص". يوفر التصور المركزي ل "OncoPrint" نظرة فورية على التغيرات الجينية عبر جميع الجينات التي تم الاستعلام عنها في المجموعة، ويمكن تحميله.
  9. بجانب OncoPrint، ابحث عن مخطط "ملخص نوع السرطان". يوفر هذا تحليلا كميا للتغيرات عبر الأنواع الفرعية من سرطان الثدي.
  10. قم بإجراء تحليل شامل للسرطان. ارجع إلى الصفحة الرئيسية ل cBioPortal واختر "دراسات أطلس سرطان TCGA PanCancer" تحت تبويب "الاستعلام".
  11. في صندوق إدخال الجينات، أدخل نفس قائمة جينات منظم m6A.
  12. انقر على "إرسال استفسار" وفي صفحة النتائج، انتقل إلى تبويب "ملخص أنواع السرطان". هذا يوفر رؤية شاملة للسرطان.

2. تحليل النسخ المقارن لمنظمات m6A باستخدام UCSC Xena.

  1. الوصول إلى منصة UCSC Xena. انتقل إلى موقع UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. من الصفحة الرئيسية، انقر على زر "تشغيل زينا" للدخول إلى متصفح التحليل الرئيسي.
  3. في متصفح زينا، اضغط على "مجموعات البيانات".
  4. من بين مجموعات البيانات، اختر "TCGA TARGET GTEx". يحتوي هذا على بيانات RNA-Seq معالجة بشكل منتظم من الأنسجة الطبيعية لمشاريع TCGA وGTEx.
  5. في الصفحة التالية، انقر على "تصور".
  6. حدد متغير النمط الظاهري (مجموعة العينة). في "اختر المتغير الأول"، اختر "الفئة الرئيسية" في نوع البيانات الظاهري.
  7. انقر على "إلى المتغير الثاني". ثم، في نوع بيانات الجينوم، ضع علامة "تعبير الجينات" في مجموعة البيانات. أضف قائمة الجينات في مربع "إضافة جين أو موقع". انقر على "تم".
  8. تصور أنماط التعبير باستخدام خريطة حرارية.
  9. لفصل عينات الثدي (TCGA+GTEx) عن TCGA TARGET GTEx، اكتبي "Breast" واستخدمي خيار الفلتر لحفظ العينات.
  10. خريطة الحرارة الآن مرئية ويمكن تحميلها كملف PDF.
  11. توليد مخططات مربعية مقارنة للجينات الفردية. لقياس وتصور اختلافات التعبير لجين معين، استخدم "عرض كجدول بياني". باستخدام هذا الخيار، يمكن اعتبار البيانات كمخطط صندوق، ومخطط نقطي، ومخطط كمان، يقارن توزيع التعبير بين مجموعتي العينة.
  12. استخدم خيار "تحميل كملف PDF" لتحميل الرسوم البيانية.
  13. يمكن الحصول على الدلالة الإحصائية (قيمة p) بالنقر على "الإحصائيات".

3. تقييم الأهمية التنبؤية لمنظمات m6A باستخدام مخطط كابلان-ماير.

  1. الوصول إلى أداة مخطط كابلان-ماير. انتقل إلى موقع كابلان-ماير بلاتر (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. من الصفحة الرئيسية، اختر علامة التبويب "سرطان الثدي" لبدء تحليل خاص بمجموعات بيانات سرطان الثدي.
  3. قم بتكوين استعلام الجين لجين واحد.
  4. في قسم الإدخال الأساسي، حدد موقع مربع "رمز الجين".
  5. أدخل الرمز الرسمي لجين منظم m6A ليتم تحليله (مثل METTL3).
    حرج: مباشرة أسفل مربع إدخال الجينات، حدد وفعل مربع الاختيار ل "أفضل مجموعة مجسات فقط في JetSet". هذا يضمن اختيار أكثر مسبار ميكروآراي موثوقية وتحديدا تلقائيا لجينك، مما يحسن جودة البيانات وقابليتها للتكرار.
  6. حدد معايير تحليل البقاء. في قسم "البقاء"، اختر "البقاء العام (OS)" كنقطة نهاية أساسية لهذا التحليل. ستستخدم الأداة تلقائيا بيانات 1880 مريضا من سرطان الثدي عند اختيار هذا الإعداد.
  7. تأكد من أن خيار "تقسيم المرضى حسب الوسط" مضبوط على "المتوسط". وهذا سيقسم المرضى إلى مجموعتين متساويتين؛ تعبير عالي وتعبير منخفض، بناء على القيمة الوسيطة للتعبير للجين المستعلم عبر جميع العينات.
  8. يمكن استخدام "عتبة المتابعة" لاختيار فترة المتابعة. تم اختيار 180 شهرا لهذه الدراسة.
  9. توليد وتفسير مخطط كابلان-ماير.
  10. انقر على زر "رسم مخطط كابلان-ماير".
  11. سيتم تحميل نافذة جديدة، تعرض منحنى البقاء.
  12. تفسير العناصر الرئيسية في الحبكة؛ يشير المحور X إلى الوقت بالشهور، ويشير المحور Y إلى احتمال البقاء الكلي، والخطان الملونان يمثلان منحنيات البقاء للمجموعات عالية التعبير (الأحمر) ومنخفضة التعبير (سوداء). يتم عرض قيمة P في الرتبة اللوغاريتمية، مما يشير إلى الدلالة الإحصائية للفرق بين منحنيين للبقاء.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المشهد الطفري لمنظمات مثيلة m6a في سرطان الثدي

في دراسة سابقة حول التحليل الجينومي لمجموعات بيانات TCGA، تم الإبلاغ عن طفرات متكررة في عدة جينات ترمز منظمات مثيلة الحمض النوويإلى 31. في هذه الدراسة، تم استخدام cBioPortal لتحليل مجموعة بيانات "سرطان الثدي الغازي (TCGA، أطلس PanCancer Atlas)" بهدف فحص ملفات الطفرات للجينات التي تشفر كتاب وقراء وممحيات مثيلة الحمض النووي الريبي m6A. كشف هذا التحليل عن تغيرات جينية متنوعة بين مرضى سرطان الثدي، حيث تفاوتت وتيرة التغيير بشكل كبير عبر الجينات - من 0.4٪ في CNBP وRBM15B إلى 12٪ في VIRMA (الشكل 1A). كان تضخيم الجينات هو التغيير الأكثر شيوعا، بينما شملت الأحداث الإضافية حذف عميق، واستبدال قواعد، وتغييرات متزامنة متعددة. ومن الجدير بالذكر أن التغيرات في الجينات التي تنظم وظائف m6A تم اكتشافها في 476 مريضا (48٪ من المجموعة) (الشكل 1B)، مما يؤكد أهمية ديناميكيات تعديل m6A في سرطان الثدي. على الرغم من اختلاف تكرار أنواع التغييرات المختلفة، لوحظت مثل هذه الطفرات عبر جميع الأنواع الجزيئية الفرعية لسرطان الثدي (الشكل 1C). للتحقق من الصحة، تم تضمين PIK3CA وTP53 وCDH1 وGATA3 كجينات مرجعية للتحكم (الشكل 1A). ومن اللافت للنظر أن التغييرات في آلية تنظيم m6A لم تقتصر على سرطان الثدي فقط. كشف تحليل 10,967 عينة من 10,953 مريضا من 32 دراسة في أطلس سرطان TCGA عن أنماط طفرة محفوظة في مجموعة واسعة من أنواع السرطان. لقد ثبت مؤخرا أن مسار m6A يتغير كثيرا في سرطان البروستاتا (PCa) ويلعب دورا مؤيدا للأورام32. تشير هذه النتائج إلى أن الطفرات التي تؤثر على الجينات التي تشفر الكتاب والقراء والممحاة لتعديل الحمض النووي الريبي m6A هي سمة شائعة عبر عدة أنواع من السرطان (الشكل 2).

ملفات التعبير الجيني الشاذة في سرطان الثدي

تسلط الأدلة الناشئة الضوء على اضطرابات النسخ النصي كعوامل رئيسية في تكوين الأورام، حيث يوفر التعبير الجيني الشاذ إمكانات كعلامات حيوية في سرطان الثدي. للتحقيق في ذلك، تم تحليل مستويات النسخ المكتوبة للجينات التي تنظم تعديل m6A باستخدام بيانات من TCGA ومشروع تعبير الأنسجة الجينية (GTEx) التي تمثل أنسجة الثدي الطبيعية. كما هو موضح في الشكل 3A، أظهرت الجينات المرتبطة ب m6A اضطرابا كبيرا في التنظيم في عينات سرطان الثدي. لوحظ كل من الزيادة والانخفاض في أنسجة الأورام مقارنة بالضوابط الطبيعيين. تم تقليل تنظيم METTL3 وWTAP، وكلاهما من مكونات مركب الكاتب، بين جينات أخرى، بينما تم رفع تنظيم عدة جينات أخرى، منها VIRMA وYTHDF1 وYTHDF3. يوضح الشكل 3B بشكل أكبر ملفات التعبير التفاضلي للجينات الفردية عبر مجموعات TCGA وGTEx. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن الجينات التي تشفر كتاب وقراء وممحاة مثيلة m6A تخضع لاختلال نسخ واسع في سرطان الثدي، مما يؤكد أهميتها المحتملة في تقدم المرض.

جينات آلات m6A ودورها في تشخيص المرضى

بعد ملاحظة أن التغيرات الجينية وتغيرات التعبير الجيني منتشرة بشكل كبير بين مرضى السرطان، تم التحقيق في أهمية هذه التغيرات في التعبير في سرطان الثدي. باستخدام أداة رسم كابلان-ماير (KM)رقم 30، التي تدمج مجموعات بيانات المصفوفات الدقيقة، تم تقييم البقاء الكلي (OS) في مجموعة من 1880 مريضا من سرطان الثدي وفقا لتعبير جينات منظم m6A. كشف هذا التحليل أن زيادة التعبير عن METTL14 وCBLL1 وYTHDC1 وHNRNPC و HNRNPA2B1 وRBMX كان مرتبطا بشكل كبير بتحسن البقاء العام. في المقابل، كان فرط التعبير في YWHAG مرتبطا بنتائج بقاء ضعيفة (الشكل 4). كمجموعة ضابطة، تم تضمين CCND2 وTOP2A، وهما مؤشران معروفتان بتحسن وسوء التوقعات على التوالي. لم تظهر الجينات الأخرى التي ترمز منظمات m6A علاقات ذات دلالة إحصائية مع بقاء المرضى (الشكل التكميلي). تسلط هذه النتائج الضوء على مجموعة فرعية من جينات تنظيم مثيلة m6A ذات فائدة محتملة في التنبؤ بسرطان الثدي.

figure-results-1
الشكل 1: التغيرات الجينية في كتاب وقراء وجينات الممحاة في سرطان الثدي في m6A. (أ) يتم عرض توزيع التغيرات على 996 مريضا من سرطان الثدي، حيث يمثل كل خط رمادي حالة فردية. تشير الأشرطة الملونة إلى أنواع مختلفة من التعديلات، بما في ذلك طفرات الميسسينس، والحذف العميق، والتضخيمات، والطفرات داخل الإطار، والطفرات المختصرة. الجينات الموصوفة جيدا، مثل PIK3CA، TP53، CDH1، وGATA3، مدرجة كعوامل تحكم إيجابية بسبب تكرار الطفرات المعروفة لديها. (ب) التردد العام للتغير لجينات التنظيم m6A عبر مجموعة المرضى. (ج) أنماط التغير الجيني في جينات منظم m6A بواسطة الأنواع الفرعية لسرطان الثدي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. 

figure-results-2
الشكل 2: تكرار التغيرات الجينية في الجينات التي تشفر كتاب وقراء وممحاة m6A عبر أنواع مختلفة من السرطان. يعتمد التحليل على بيانات من أطلس سرطان TCGA، الذي يضم 10,967 عينة من 10,953 مريضا عبر 32 دراسة سرطانية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. 

figure-results-3
الشكل 3: شذوذات التعبير في الجينات التي تشفر كتاب m6A والقراء والممحاة. (أ) يتم عرض الإفراط في التعبير (الأشرطة الحمراء) ونقص التعبير (الأشرطة الزرقاء) لجميع الجينات. تم استخدام بيانات من GTEx وTCGA لمقارنة عينات سرطان الثدي الطبيعية مقابل العينات السرطانية. (B) يقدم هذا الشكل مقارنة بين التعبير الجيني الفردي لدى مرضى سرطان الثدي العاديين مقابل مرضى سرطان الثدي. تستخدم زينا اختبار t الخاص بويلش لتحديد قيم p لكل جين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: ملفات تعريف التعبير لكتاب m6A والقراء والممحاة وارتباطهم بالتوقعات في سرطان الثدي. تظهر منحنيات البقاء على قيد الحياة في كابلان-ماير بقاء المرضى بشكل عام، حيث يشير المحور X إلى الوقت (الأشهر)، ويشير المحور Y إلى احتمال البقاء الكلي. تمثل الخطوط الحمراء مجموعة التعبير العالي، بينما تمثل الخطوط السوداء مجموعة التعبيرات المنخفضة. تم تصنيف المرضى بناء على متوسط مستويات التعبير الجني. تم تحديد قيم p باستخدام اختبار السجل (Log-Rank). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي: أعضاء منظمي m6A لا يظهرون ارتباطا كبيرا مع بقاء المرضى بشكل عام، كما تظهر منحنيات البقاء على قيد الحياة في كابلان-ماير. تمثل الخطوط الحمراء مجموعة التعبير العالي، بينما تمثل الخطوط السوداء مجموعة التعبيرات المنخفضة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

النوعرمز الجين
الكتابMETTL3
METTL14
ZC3H13
WTAP
RBM15
RBM15B
METTL16
CBLL1
KIAA1429/فيرما
القراءYTHDF1
YTHDF2
YTHDF3
YTHDC1
YTHDC2
HNRNPA2B1
HNRNPC
HNRNPG/RBMX
IGF2BP1
IGF2BP2
IGF2BP3
CNBP
ELAVL1
SND1
PRRC2A
PRRC2B
PRRC2C
EIF3A
FMR1
FXR1
FXR2
LRPPRC
MSI2
الممحاةALKBH5
FTO

الجدول 1: الجينات ترميز الكتاب، القراء، والممحاة في m6A. يقدم الجدول 1 نظرة عامة على العائلات الجينية الرئيسية المسؤولة عن تركيب وتحديد وإزالة تعديل m6A في الحمض النووي الريبي حقيقيات النواة.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر مقالة هذه الطريقة سير عمل شامل، متاح، ومتكامل للتحليل المنهجي متعدد الأوميكس والترجمة السريرية لأي توقيع جيني في أبحاث السرطان، كما تم إثباته هنا من خلال تحليل منظمات مثيلة الحمض النووي الريبي m6A في سرطان الثدي. من خلال دمج هذه المنصات العامة الرئيسية للمعلوماتية الحيوية، يمكن هذا النهج الباحثين من التقدم بكفاءة من اكتشاف الجينوم إلى الفرضيات ذات الصلة سريريا دون الحاجة إلى خبرة حسابية متقدمة.

القوة الأساسية لهذه المنهجية هي خط أنابيب التركيب النموذجي الذي يولد الفرضيات. يوجه البروتوكول المستخدم عبر تسلسل منطقي؛ أولا تحديد الجينات المعدلة وراثيا (باستخدام cBioPortal)، ثم تقييم اختلال تنظيم التعبير في بيئة مصححة دفعة (باستخدام UCSC Xena)، وأخيرا تقييم التأثير السريري لذلك الخلل على بقاء المرضى (باستخدام مخطط كابلان-ماير). هذا التحليل التدريجي، من الحمض النووي إلى الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي إلى النتائج السريرية، يعطي الجينات المرشحة أولوية للدراسة الإضافية. على سبيل المثال، تطبيق هذا السير على منظمي m6A حدد بكفاءة جينات مثل YWHAG (التغيير المتكرر، التنبؤ بضعف البقاء) كأهداف ذات أولوية عالية للتحقق الوظيفي.

تصميم البروتوكول لتحليل السرطان الشامل يعزز فائدته أكثر، مما يسمح للباحثين بتحديد ما إذا كان توقيع جزيئي خاص بسرطان واحد أو سمة مشتركة لتكون الأورام، كما لوحظ في التغيرات الواسعة في آليات m6A في هذه الدراسة. كشف تحليل السرطان الشامل أن الطفرات التي تؤثر على كتاب وقراء وممحاة m6A لم تقتصر على سرطان الثدي فقط، بل كانت مشتركة بين عدة أورام خبيثة. يتماشى هذا مع تراكم الأدلة التي تشير إلى أن تنظيم m6A الشاذ هو سمة مميزة لتكوين الأورام عبر أنواع مختلفة من الأورام، حيث يؤثر على عدة علامات مميزة للسرطان والعمليات الفسيولوجية، بما في ذلك ربط الحمض النووي الريبي، والاستقرار، والترجمة، ونشاط الحمض النووي الريبي غير المشفر33.

هذا النهج المنهجي قابل للتكيف بشكل كبير. أثناء إثبات ذلك باستخدام منظمات m6A، يمكن تطبيق نفس سير العمل فورا لتوصيف جينات نقاط التحقق المناعية، أو الإنزيمات الأيضية، أو توقيعات جينية جديدة من تجارب RNA-seq في أي نوع من السرطان المتاح ضمن هذه قواعد البيانات. هذا التنسيق خطوة بخطوة يقلل من العقبة أمام علماء المختبرات الرطبة لإجراء تحليلات متقدمة في السيليكو ، مما يسرع الانتقال من البيانات الجينومية إلى البصيرة البيولوجية.

في الختام، يوفر هذا البروتوكول إطارا قويا لوضع الجينات المرتبطة بالسرطان في سياقها. بالإضافة إلى تحديد المشهد الطفراتي، كشفت النتائج عن تغيرات تعبيرية ثنائية الاتجاه في منظمي m6A. يؤكد هذا الاكتشاف تعقيد الإبيترانسكريبتوم ويعزز النموذج القائم للوظيفة المعتمدة على السياق، كما يتضح من الأدوار المزدوجة المبلغ عنها لبروتينات عائلتي METTL3 وYTHDF في سرطانات مختلفة34,35. كما أظهر محور m6A دورا في تنظيم التكاثر، والانتشار، والتهرب المناعي في سرطان الثدي السلبي الثلاثي36,37. ومن المثير للاهتمام أن تحليل البقاء حدد مجموعة فرعية من منظمات m6A ذات دلالة تنبؤية. ارتبط تعبير METTL14 المرتفع وCBLL1، YTHDC1، HNRNPC، HNRNPA2B1، وRBMX بنتائج إيجابية، في حين ارتبط تعبير YWHAG بضعف البقاء العام. تدعم هذه النتائج الفائدة السريرية المحتملة لمنظمات m6A كمؤشرات حيوية تنبؤية. كما تم تحديد CBLL1 كأحد العوامل التي لديها توقعات إيجابية في دراسة سابقة38. ومع ذلك، فإن التحليل الحالي الذي شمل أعضاء محدثين من منظمي m6A حدد أعضاء إضافيين، مثل RBMX وYWHAG، ببقاء أفضل وأسوأ بشكل عام على التوالي. تؤكد الملاحظة بأن منظمين مختلفين يمكنهم التنبؤ بتوقعات سلبية أو إيجابية على الوظيفتين المزدوجة والخاصة بالسياق لتعديلات m6A في بيولوجيا السرطان. على الرغم من أن YTHDF1 و YTHDF3 يعانيان من زيادة كبيرة في الأورام، إلا أن عدم ارتباطهما مع البقاء الكلي قد يعكس التكرار الوظيفي بين القراء، أو الأدوار المعتمدة على السياق عبر الأنواع الفرعية للسرطان، أو الحاجة إلى النظر في نسبتهما أو شبكة التنظيم الصافي m6A بدلا من مستويات التعبير الفردية. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن VIRMA أظهر أعلى معدل تغير (12٪)، إلا أن تعبيره لم يرتبط بشكل كبير بالبقاء الكلي في سرطان الثدي. أحد التفسيرات المحتملة هو أن تعبير hIgh VIRMA يشير فقط إلى احتمال مرتفع لترسيب m6A، وليس ما إذا كانت القارئات اللاحقة أو mRNA المستهدفة موجودة لتحويل ذلك إلى سلوك ورمي عدواني. ومن الجدير بالذكر أنه بينما تم التعبير بشكل مفرط عن YTHDF1 وYTHDF3 في المجموعة، تم تخفيض تنظيم YTHDC1 وYTHDC2 بشكل كبير. يشير هذا النمط غير المتطابق في التعبير إلى أن التركيبة الوظيفية بين الكتاب والقراء المحددين المطلوبة لإنتاج الأورام قد لا تكون فعالة في سرطان الثدي. لذا، وعلى الرغم من تعبيره العالي، قد لا يكون VIRMA محركا رئيسيا في هذا السياق (الشكل الإضافي).

يعترف المؤلفون بوجود قيود أساسية لهذا في خط أنابيب السيليكو. التحليلات مترابطة بطبيعتها؛ تحدد الارتباطات القوية لكنها لا تؤسس سببية ميكانيكية. يمكن إثبات هذا السببية من خلال الجينوميات الوظيفية أو باستخدام مثبطات جزيئية صغيرة تستهدف مكونات مسار m6A39. ومن الجدير بالذكر أن أول مثبط ببتيد يستهدف METTL3، وهو RSM3، تم تطويره مؤخرا وأثبت إمكاناته المضادة للسرطان في نماذج سرطان البروستاتا في الجسم الحي. لذلك، يمثل هذا السير المنهجي أداة قيمة لتحديد الأهداف المرشحة وتصنيف الفئات العلاجية للمرضى الأكثر احتمالا للاستفادة من هذه التدخلات العلاجية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة أجزاء من هذا المخطوطة بمساعدة أدوات لغوية تعتمد على الذكاء الاصطناعي لتحسين الوضوح وسهولة القراءة. جميع المحتويات الجوهرية، والتفسيرات، والتحليلات، والاستنتاجات هي من نصيب المؤلفين فقط. نعلن أنه لا يوجد تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لحسن الحظ، تم الاعتراف بمنحة من جامعة الفيصل (IRG 25450) إلى RM.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalمركز ميموريال سلون-كيتيرينغ للسرطانhttps://www.cbioportal.org
التعبير الجيني عن الأنسجة (GTEx)اتحاد GTExhttps://gtexportal.org
مخطط كابلان-مايرمختبر جورفي/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
أطلس جينوم السرطان (TCGA)المعهد الوطني للسرطان (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
متصفح UCSC Xenaجامعة كاليفورنيا سانتا كروزhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles