استكشاف آلية حبيبات غوبن بينغتشوان في علاج الربو القصبي

ملخص

يبحث هذا البروتوكول في آلية عمل حبيبات غوبن بينغتشوان في الربو الهوائية باستخدام علم الأدوية الشبكي، والربط الجزيئي، والتحقق في الجسم الحي.

الملخص

تبحث هذه الدراسة في آلية عمل حبيبات جوبن بينغتشوان في علاج الربو القصبي باستخدام علم الأدوية الشبكي، والربط الجزيئي، والتحقق التجريبي. تم تحديد المكونات الفعالة والأهداف المقابلة باستخدام قواعد بيانات TCMSP وHERB وSymMap. تم جمع أهداف مرتبطة بالربو القصبي من GeneCards وOMIM وTTD وDrugBank وPharmGKB. تم تحديد أهداف متداخلة، وتم بناء شبكات تفاعل المكون والهدف والتفاعل بين البروتين والبروتين (PPI). تم إجراء تحليلات تخصيب الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) مع تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR). تم إجراء الالتحام الجزيئي لتقييم الألفة الارتباطية، تلاها التحقق الداخلي. تم تحديد ما مجموعه 121 مكونا نشطا و234 هدفا متعلقا بالمخدرات، مما أدى إلى 155 هدفا متداخلا. شملت الأهداف الأساسية TP53، AKT1، TNF، وIL6. أظهر تحليل KEGG إثراء كبير لمسار الإشارة PI3K–Akt، والذي تم اختياره للتحقق التجريبي. كشف الالتحام الجزيئي عن ارتباط قوي بين المكونات الأساسية وAKT1. في الفئران المصابة بالربو الناتج عن الأوضاولين، خفضت حبيبات غوبن بينغتشوان مستويات IL-4 وIL-10 في المصل، وزادت من تعبير FoxP3 في أنسجة الرئة، وزادت من مستويات رنا ربي PI3K وAKT. تشير هذه النتائج إلى أن حبيبات غوبن بينغتشوان تخفف من الربو القصبي من خلال تعديل مسار إشارات PI3K–Akt، وتنظيم السيتوكينات الالتهابية، وتعزيز وظيفة الخلايا التائية التنظيمية.

المقدمة

الربو القصبي هو مرض تنفسي مزمن غير متجانس يتميز بالتهاب مجرى الهواء، فرط استجابة مجرى الهواء، فرط إفراز المخاط، وإعادة تشكيل مجرى الهواء¹. يتضمن المرض تفاعلات معقدة بين تنشيط الخلايا المناعية، والوسطاء الالتهابيين، ومسارات الإشارات المتعددة. سريريا، يظهر الربو مع صفير متكرر، وضيق في التنفس، وضيق في الصدر، وسعال. التهاب مجرى الهواء هو آلية مركزية وراء بداية المرض وتطوره، ويتميز بزيادة إفراز السيتوكينات الالتهابية مثل IL-6، IL-4، IL-17، وTNF-α.، وتسلل الخلايا الالتهابية بما في ذلك الحمضيات والعدلات، وتغيرات هيكلية مثل تكاثر العضلات الملساء في مجرى الهواء، وتكثيف الغشاء القاعدي، وتضخم الغدة المخاطية^2˒3. تؤدي هذه العمليات المرضية في النهاية إلى انسداد مجرى الهواء وضعف تدفق الهواء.

يتم تنظيم فيزيولوجيا مرض الربو بواسطة مسارات إشارات متعددة متفاعلة بدلا من آلية واحدة. يلعب مسار الإشارة PI3K–Akt دورا رئيسيا في تعديل توازن المناعة، خصوصا محور Treg/Th17، من خلال تنظيم تعبير FoxP3. يتفاعل هذا المسار أيضا مع مسارات إشارات IL-17 وTNF لتعزيز الاستجابات الالتهابية وإعادة تشكيل مجرى الهواء، مما يساهم في تباين المرض ومقاومة العلاج ^3,4. تشير البيانات الوبائية إلى زيادة مستمرة عالميا في انتشار الربو، حيث يوجد أكثر من 358 مليون شخص مصاب حول العالم وحوالي 45.7 مليون مريض بالغ في الصين ^5,6. تعتمد استراتيجيات العلاج الحالية بشكل أساسي على محفزات β₂ المستنشقة والجلوكوكورتيكويدات؛ ومع ذلك، تستهدف هذه العلاجات آليات مرضية محدودة وقد تؤدي إلى آثار جانبية ومقاومة للجلوكوكورتيكويد لدى بعض المرضى. ارتبط اضطراب المسارات مثل PI3K–Akt. بانخفاض الاستجابة العلاجية، مما يبرز الحاجة إلى أساليب علاجية متعددة الأهداف ^7,4.

يصنف الطب الصيني التقليدي الربو تحت اسم "متلازمة شياو"، والتي ترتبط بنقص في وظائف الرئة والطحال والكلى، إلى جانب عوامل ممرضة خارجية. تم استخدام تركيبات طب الصيني الصيني الصيني على نطاق واسع في إدارة الربو بسبب خصائصها متعددة المكونات والأهداف^{المتعددة 8,9}. على عكس العوامل الدوائية ذات الهدف الواحد، تمارس مركبات الطب الصيني التقليدي تأثيرات علاجية من خلال تنسيق تنظيم مسارات بيولوجية متعددة، بما يتماشى مع الفيزيولوجيا المرضية المعقدة للربو¹⁰. يوفر علم الأدوية الشبكي نهجا على مستوى الأنظمة لتحليل التفاعلات بين مكونات الأدوية والأهداف ومسارات الأمراض، مما يمكن من تحديد المركبات الحيوية الفعالة الرئيسية والآليات الجزيئية¹¹. يكمل الالتحام الجزيئي هذا النهج من خلال تقييم الألفة بين الجزيئات الصغيرة والبروتينات المستهدفة.

حبيبات غوبن بينغتشوان هي تركيبة طبية صينية تقليدية تتكون من ثمانية مكونات عشبية، منها نبات إيفيدرا سينيكا (عشبة الإفيدرا)، ثمرة بسوراليا كوريليفوليا ، بذور البرقون الأرمينياكا (بذور المشمش)، جذر Pseudostellaria heterophylla ، فاكهة Perilla frutescens ، ورقة Eriobotrya japonica (ورقة لوكوات)، بصلة Lilium brownii ، وEpimedium brevicornum. تستخدم هذه التركيبة تقليديا لتقوية الطاقة الحيوية، ومعالجة البلغم، وتخفيف الصفير. أظهرت الدراسات السريرية السابقة فعاليته العلاجية في الربو القصبي، مع معدلات استجابة أعلى مقارنة^{بالعلاجات} التقليدية.

لتوضيح آلية العمل الأساسية، يتم تطبيق نهج متكامل يجمع بين علم الأدوية الشبكي، والالتحام الجزيئي، والتحقق التجريبي في الجسم الحي . يستخدم علم الأدوية الشبكي لتحديد المكونات النشطة والأهداف المحتملة المرتبطة بالربو القصبي. يستخدم الالتحام الجزيئي لتقييم التفاعلات بين المركبات الرئيسية والبروتينات المستهدفة. يتم إجراء التحقق التجريبي في نموذج حيواني لاحقا لتقييم التأثيرات التنظيمية على مسارات الإشارات الحرجة، وخاصة مسار PI3K–Akt. يهدف هذا النهج إلى تقديم رؤى ميكانيكية حول التأثيرات العلاجية متعددة الأهداف لحبيبات غوبن بينغتشوان ودعم تطبيقها في علاج الربو القصبي.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة لياونينغ للطب الصيني التقليدي (رقم الموافقة: 21000042023058) وتم تنفيذها وفقا للإرشادات المؤسسية. الأدوات البحثية المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. قواعد البيانات والبرمجيات

1. الوصول إلى قواعد البيانات والبرمجيات التالية: TCMSP، HERB، SymMap، PubChem، STRING، GeneCards، OMIM، TTD، DrugBank، PharmGKB، DAVID، UniProt، وCytoscape (الإصدار 3.9.1).

2. الحصول على أهداف المكونات

1. استرجاع المكونات الكيميائية من عشبة الإيفيدرا، بذور المشمش، جذر Pseudostellaria، فاكهة البيريلا، ورقة اللوكوات، أنواع الليليوم، والإيبيميديوم من قاعدة بيانات TCMSP¹³. استرجاع مركبات الصفراليا من قواعد بيانات HERB وSymMap.
2. فحص المركبات الفعالة باستخدام التوافر الحيوي الفموي (OB ≥ 30٪) والشبه الدوائي (DL ≥ 0.18) ^14,15.
3. التنبؤ بالجينات المستهدفة باستخدام TCMSP. توحيد جميع الأهداف باستخدام قاعدة بيانات UniProt باختيار Homo sapiens. إزالة الأهداف المكررة وغير الصالحة، بما في ذلك الإدخالات غير البشرية، والبروتينات غير المشروحة، والمعرفات القديمة.

3. الحصول على أهداف الربو

1. ابحث في GeneCards وOMIM وTTD وDrugBank وPharmGKB باستخدام الكلمة المفتاحية "الربو القصبي". اضبط درجة ملاءمة بطاقات الجين إلى >4. ادمج جميع الأهداف المسترجعة وأزل النسخ المكررة.

4. تحديد أهداف التقاطعات

1. استيراد أهداف الأدوية وأهداف الأمراض إلى أداة تحليل فين عبر الإنترنت. حدد الأهداف المتداخلة وسجل العدد الإجمالي للتحليل لاحقا.

5. بناء شبكة المكون–الهدف

1. استيراد أهداف التقاطعات إلى Cytoscape 3.9.1. بناء شبكة المكون والهدف. قم بضبط حجم العقدة ولونها بناء على قيم الدرجات.

6. بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI)

1. رفع أهداف التقاطع إلى قاعدة بيانات STRING. اختر الإنسان العاقل واضبط درجة الثقة على ≥0.900. تصدير الشبكة واستيرادها إلى Cytoscape.
2. احسب المعلمات الطوبولوجية (مركزية الدرجة، مركزية البين، ومركزية القرب من الدرجة). حدد الأهداف الأساسية باستخدام العتبات الوسيطة والدرجة >20.

7. تحليل إثراء GO وKEGG

1. رفع الأهداف المتداخلة إلى قاعدة بيانات DAVID أو تحليلها باستخدام clusterProfiler الخاص بحزم R.
2. إجراء تحليل إثراء الأنطولوجيا الجينية (GO) لفئات العمليات البيولوجية، ومكونات الخلية، والوظائف الجزيئية.
3. قم بتحليل إثراء مسار KEGG. تطبيق تصحيح معدل الاكتشاف الكاذب (FDR) وحدد عتبة الدلالة إلى FDR < 0.05.
4. تصور أفضل المصطلحات المطورة باستخدام مخططات الشريط أو مخططات الفقاعات.

8. الالتحام الجزيئي

1. حمل البنى ثنائية الأبعاد للمركبات الأساسية من PubChem. قم بإنشاء هياكل ثلاثية الأبعاد باستخدام ChemOffice وحفظها كملفات mol2.
2. قم بتنزيل هياكل البروتين من قاعدة بيانات RCSB PDB. قم بإزالة جزيئات الماء والروابط باستخدام PyMOL.
3. قم بإجراء الالتحام الجزيئي باستخدام AutoDock Vina. حدد معلمات صندوق الشبكة وشغل محاكاة الإرساء.
4. سجل طاقات الارتباط (كيلو كالوري/مول) وبقايا المفاتيح المتفاعلة. تصور نتائج الالتحام باستخدام منصات النمذجة الجزيئية، والتصور، والمحاكاة.

9. التحقق التجريبي

1. الحيوانات
   1. احصل على 48 ذكرا من جرذ سبراج-داولي (عمره 9 أسابيع، 220–240 جرام). الحيوانات المنزلية عند 20–25 درجة مئوية مع رطوبة تتراوح بين 55٪–60٪ في الظروف القياسية.
2. الأدوية والكواشف
   1. حضر حبيبات غوبن بينغتشوان المكونة من عشبة الإيفيدرا، البسوراليا، بذور المشمش، جذر بسيودوستيلاريا، فاكهة البيريلا، ورقة لوكوات، الليليوم، والإبيميديوم.
   2. جهز ديكساميثازون، أوفالوبمين (OVA)، هيدروكسيد الألمنيوم، مجموعات ELISA، مجموعات استخراج RNA، والأجسام المضادة كما هو مذكور في جدول المواد.
3. الآلات الموسيقية
   1. جهز معدات مختبرية قياسية، بما في ذلك قارئ الألواح الدقيقة، ونظام الرحلان الكهربائي، وميكروتوم البارافين، ونظام التصوير.
4. تجميع الحيوانات وعلاجها
   1. قسم الفئران عشوائيا إلى ست مجموعات (n = 8): مجموعة الضابط الفارغة، مجموعة النموذج، مجموعة الديكساميثازون (0.3 ملغ/كغ)، مجموعة الطب الصيني منخفض الجرعة، مجموعة الطب الصيني المتوسط الجرعة، ومجموعة الطب الصيني عالي الجرعة.
   2. في الأيام 1 و7 و14، أعط حقنا داخل الصفاق بمقدار 1 مل بجرعة 10٪ OVA + 10٪ Al(OH)₃ للفئران في مجموعة النموذج، ومجموعة الطب الصيني منخفض الجرعة، ومجموعة الطب الصيني المتوسط الجرعة، ومجموعة الطب الصيني عالي الجرعة، ومجموعة ديكساميثازون للتوعية.
   3. أعط حقنا 1 مل داخل الصفاق يحتوي على محلول ملحي فسيولوجي بنسبة 0.9٪ للفئران في مجموعة الضوابط الفارغة في الأيام 1 و7 و14.
   4. من اليوم 15 إلى 21، قم بتحفيز الاستنشاق بالنفخ مرة واحدة يوميا لمدة 20 دقيقة. أعط استنشاق OVA بنسبة 5٪ للفئران في مجموعة النموذج، مجموعة الطب الصيني منخفض الجرعة، مجموعة الطب الصيني المتوسط الجرعة، مجموعة الطب الصيني عالي الجرعة، ومجموعة الديكساميثازون.
   5. أعط استنشاق ملحي فسيولوجي بنسبة 0.9٪ للفئران في مجموعة الضابطة الفارغة من اليوم 15 إلى 21.
   6. أعط العلاجات عن طريق القاقة الفموية مرة واحدة يوميا من اليوم 22 إلى 36 وفقا لمجموعة العلاج المخصصة.
   7. راقب وزن الجسم وحالتك العامة يوميا طوال فترة التجربة. يتم تلخيص الجدول الزمني التجريبي في الجدول 1.
5. علم الأمراض النسيجي
   1. اجمع أنسجة الرئة. تصحيح، وتضمين، وقطع العينات. قم بإجراء تلوين الهيماتوكسيلين-إيوزين.
   2. قم بعمل صبغة ماسون لتقييم ترسيب الكولاجين.
6. تحليل RT-PCR
   1. استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الرئة.
   2. توحيد أنسجة الرئة المجمدة في ظروف درجات حرارة منخفضة جدا. بعد وزن العينة، انقلها بسرعة إلى هاون مبرد مسبقا يحتوي على النيتروجين السائل وطحنها إلى مسحوق.
   3. انقل العينة المطحونة إلى أنبوب طرد مركزي. أضف 1 مل من TransZol UP و0.2 مل من مادة استخراج RNA لكل 50–100 ملغ من الأنسجة. اهز الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   4. قم بطرد المركزي بالعينة عند 1000 × جرام و2–8 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. انقل الطور المائي عديم اللون إلى أنبوب طرد مركزي جديد.
   5. أضف 1 مل ترانزول UP إلى 0.5 مل إيزوبروبانول. حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
   6. قم بعمل طرد مركزي للعينة عند 1000 × جرام لمدة 10 دقائق. أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق.
   7. تخلص من المادة الفائقة وجفف الرواسب في الهواء على درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإذابة الراسب في 50–100 ميكرولتر من محلول RNA، ثم حضن لمدة 10 دقائق.
   8. تخزين العينة عند −70 درجة مئوية للحفاظ على المدى الطويل.
   9. تصنيع cDNA وإجراء PCR كمي لقياس تعبير PI3K وAKT.
7. إليسا
   1. إذابة عينات المصل عند 4 درجات مئوية. قس مستويات IL-4 و IL-10. باستخدام مجموعات ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
8. الكيمياء المناعية النسية
   1. تم تثبيت نسيج الرئة ب 4٪ بارافورمالديهايد، مدمج في البارافين، وقطع وإزالة الشمع وترطيبه.
   2. قم بسحب المستضدات، والحجب، وحضانة الأجسام المضادة. الصبغة وفقا لمجموعة الكيمياء المناعية FoxP3، محلول التلوين DAB، والتعبير الإيجابي يظهر على شكل صبغة بنية صفراء أو بنية داكنة.
   3. راقب وصور تحت المجهر، واستخدم برنامج Image J للتحليل الإحصائي الكمي لتعبير FoxP3.
9. التحليل الإحصائي
   1. اختبار طبيعة البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك وتجانس التباين باستخدام اختبار ليفين.
   2. تحليل البيانات باستخدام اختبارات ANOVA أحادية الاتجاه أو اختبارات غير معلمية حسب الحاجة. عبر عن البيانات كمتوسط ± انحراف معياري.
   3. عرف p < 0.05 على أنه ذو دلالة إحصائية. ★★p < 0.01 وP ★< 0.05 مقابل مجموعة الضابطة؛ ◆◆p < 0.01 و ◆p < 0.05 مقابل مجموعة النماذج؛ ##p < 0.01 #p < 0.05 مقابل مجموعة ديكساميثازون.

الجدول 1: الجدول الزمني التجريبي. جدول إجراءات التحسيس، التحدي، والعلاج. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

النتائج

فحص المكونات الفعالة
تم تحديد ما مجموعه 121 مكنا نشطا من قاعدة بيانات TCMSP بعد التصفية للنشاط المستهدف. شملت هذه 23 مكونة من عشبة الإيفيدرا ، 7 من بسوراليا، 19 من بذور المشمش، 8 من جذر Pseudostellaria ، 16 من فاكهة البيريلا، 18 من ورقة لوكوات، 7 من الليليوم، و23 من إبيميديوم. (الجدول 2). تم تحديد ستة عشر مكونا شائعا، منها اللوتولين، الكيرسيتين، β-سيتوستيرول، كيمبفيرول، ستيجماسترول، و(+)-كاتشين. تم الحصول ع...

المناقشة

الربو القصبي مرض شائع في قسم الجهاز التنفسي¹⁶. إنه اضطراب انسدادي في مجرى الهواء ناجم عن مسببات الحساسية وفرط استجابة مجرى التنفس.¹⁷. له معدل إصابة سريرية مرتفع، وهو عرضة للعودة، ويصعب علاجه، مما يؤثر بشكل كبير على صحة المرضى وجودة حياتهم. أفادت المبادرة العالمية للربو لعام 2025 (GINA) أن علاج الجلوكوكورتيكويد بالاستنشاق فعال للربو¹⁸؛ ومع ذلك، قد يؤدي الاستخدام طويل الأمد إلى ضعف الامتثال. بعض المرضى ينتكسون بعد تقلي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	كشف التعبير النسبي لمRNA الجينات المستهدفة
aluminum hydroxide Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	مساعد مناعي لتعزيز استجابة المستضد المناعية
BCA protein Concentration Test Kit	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 قطعة في الصندوق	تقييم الكمية الإجمالية للبروتين لتوحيد تحميل العينة
Chemiluminescence imaging system	Tanon	5200Multi	تصوير حزام WB، وجمع الصور وتحليلها من الجل والبلو
Color Pre-stained Protein Marker	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	مرجع الوزن الجزيئي للبروتين لتجارب الرحلان الكهربائي
Enhanced RNA Extraction Kit	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 قطعة في الصندوق	استخراج وتنقية إجمالي RNA من الأنسجة والخلايا
Enzyme-linked immunosorbent assay reader	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	الكشف الكمي عن السيتوكينات ومحتويات البروتين في العينات
FOXP3 primary antibody	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/قطعة	الارتباط المستهدف ببروتين FOXP3 لفحص المناعة
Gel Rapid Preparation Kit	Shanghai Yamei	PG212, 30 مجموعة	التحضير السريع لجل الفصل وجل التراص لتجارب الرحلان الكهربائي
masson Staining Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 قرص	تلطيخ محدد لألياف الكولاجين في الأنسجة ومراقبة التليف
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	مسبب الحساسية الكلاسيكي لإنشاء نماذج حيوانية للحساسية
primary Antibody Dilution solution	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	تخفيف الجسم المضاد الأساسي، والحفاظ على النشاط وتقليل الارتباط غير المحدد
Rat IL-10ELISA Kit	Andy Bio	E-30649, 96T	الكشف الكمي عن عامل IL-10 المضاد للالتهاب في الفئران
Rat IL-4ELISA Kit	Andy Bio	E-30623, 96T	الكشف الكمي عن عامل IL-4 الالتهابي لـ Th2 في الفئران
Reverse Transcription Kit	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	الترجمة العكسية لـ RNA إلى cDNA لتحليل الجينات اللاحق
Saturated Oil Red O Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 زجاجة	تلطيخ كشف محدد وكشف قطرات الدهون في الأنسجة
Shangyang Anti-Rabbit Secondary Antibody	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	الارتباط بالجسم المضاد الأساسي للأرانب لتفاعل لون WB
TBST Buffer	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / زجاجة	مخزن لتنظيف الغشاء وتخفيف الجسم المضاد في غربلة البروتين
Transfer Electrophoresis System	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	استخدمت لفصل الرحلان الكهربائي للبروتين ونقل الغشاء في غربلة البروتين
Ultra-low temperature refrigerator	Zhongke Meiling	MDF-382	حفظ بالتبريد في درجات حرارة منخفضة للمتفاعلات، عينات البروتين والأنسجة
Vertical electrophoresis tank	BIO-RAD	JY-ZY5	الفصل الرحلان الكهربائي العمودي لعينات البروتين والأحماض النووية