نظام انتقاء مضاد قائم على السموم لحذف الجينات بدون علامات وطفرات الترانسبوزون عالية الكثافة Tn5 في بكتوباكتيريوم برازيليينس

Bin Xie; Minghua Xie; Utpal Handique; Yulu Zhang; Doron Teper; Lei Li; Jian Wu; Xiaofeng Zhou

doi:10.3791/70567

مقالة منهجية

نظام انتقاء مضاد قائم على السموم لحذف الجينات بدون علامات وطفرات الترانسبوزون عالية الكثافة Tn5 في بكتوباكتيريوم برازيليينس

DOI:

10.3791/70567

⸱

يونيو 9, 2026

Bin Xie^*¹^,² , Minghua Xie^*² , Utpal Handique² , Yulu Zhang³ , Doron Teper⁴ , Lei Li⁵ , Jian Wu² , Xiaofeng Zhou¹

¹State Key Laboratory of Biocontrol, School of Agriculture and Biotechnology, Sun Yat-sen University, ²Potato Engineering ' Technology Research Center, Inner Mongolia University, ³Urumqi Experimental School, ⁴Department of Plant Pathology and Weed Research, Agricultural Research Organization-Volcani Institute, ⁵Chinese Academy of Agricultural Sciences, Institute of Vegetables and Flowers

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكولا لإنشاء حذف جيني غير معلم وبناء مكتبات طفرات إدخال Tn5 على مستوى الجينوم في بكتوباكتيريوم برازيليينس، وهو ممرض نباتي مسؤول عن نبات البطاطس الأسود والتعفن الطري. يتيح هذا النهج التحليل الجيني العكسي الفعال ويسهل التوصيف الوظيفي للجينات المرتبطة بالضراوة في هذا الكائن الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بكتوباكتيريوم برازيلينس هي بكتيريا شديدة الممرضة مسؤولة عن تعفن درنات البطاطس الناعمة، والساق السوداء، وتعفن السيقان الجوية. توضيح آلياته الممرضة أمر ضروري للسيطرة على الأمراض؛ ومع ذلك، لا تزال الأدوات الجينية لهذا الكائن محدودا. تم تطوير نظام اختيار مضاد قائم على السموم لتمكين حذف الجينات بدون علامات وطفرات ترانسبوزون Tn5 عالية الكثافة. تم استخدام سم vmi480 المستخرج من بلازميد pLP12 كعلامة اختيار مضاد لبناء ناقل الانتحار pKV2. باستخدام هذا النظام، تم حذف جين recA في سلالة P. brasiliense SM بنجاح. وقد خدمت متحور recA الناتج كسلالة أبوية لبناء مكتبة إدخال Tn5 تضم أكثر من 12,000 متحول من خلال الاقتران مع سلالة المساعدة RHO3 الحاملة ل pKV2-LLtnp. في هذا البلازميد المشتق، تم استبدال سم vmi480 بترانسبوزاز Tn5 مفرط النشاط تحت سيطرة محفز لاك مواجه للخارج لتقليل التأثيرات القطبية. مكنت اختبارات التلقيح عالية الإنتاجية من تحديد الطفرات التي تعاني من نقص في الممرضية، بما في ذلك الإدخالات في نظام الإفرازات من النوع الثاني، وهو عامل رئيسي يحدد الضراوة الذي يتوسط إفراز إنزيمات مدللة جدار خلايا النبات. تدعم هذه المنصة علم الجينوم الوظيفي وتسهل التحقيق في آليات الضراوة في هذا الممرض الاقتصادي المهم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد P. brasiliense من أكثر الأنواع عدوانية ضمن جنس Pectobacterium وهو العامل المسبب للتعفن الطري للبطاطس، وتعفن الساق السوداء، وتعفن الساق الهوائية¹. تؤدي هذه الأمراض إلى فقدان يقدر بنسبة 30٪ في إنتاجية البطاطس، وهي محصول يحتل المرتبة الثالثة كمصدر غذائي مهم في العالم ومكون رئيسي^{في نظام} الإنتاج الزراعي الصيني. على الرغم من تأثيره الاقتصادي، لا تزال الآليات الجزيئية التي تحكم ممرضية P. brasiliense غير مفهومة بشكل كاف، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى نقص أدوات التلاعب الجيني الفعالة والقابلة للتكرار لهذا النوع ^3,4,5.

تعتمد الدراسات الجينومية الوظيفية في العديد من البكتيريا الممرضة النباتية على أنظمة تبادل أليلي قوية وأنظمة طفرات الترانسبوزونات؛ ومع ذلك، لا تزال الأدوات الجينية المماثلة ل P. brasiliense محدودة أو غير فعالة. على وجه الخصوص، فإن علامات الانتقاء المضادة الفعالة المتوافقة مع هذا النوع نادرة. بينما يستخدم جين sacB على نطاق واسع كمؤشر انتقاء مضاد لحذف الجينات في بكتيريا مختلفة، قد يظهر P. brasiliense تحملا عاليا يصل إلى 50٪ السكروز خلال عملية الاختيار⁵. من المرجح أن هذا التحمل يعكس نقص الحساسية تجاه السموم، ربما بسبب التحول الإنزيمي للسكروز إلى بوليمرات السكر. علاوة على ذلك، قد تؤدي تركيزات السكروز العالية إلى صدمة أسموزية^{ضارة 6}. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم بعد تأسيس طرق الطفرات واسعة النطاق الفعالة، مثل بناء مكتبة إدخال ترانسبوزون Tn5، بشكل جيد لهذا الكائن.

لمعالجة هذه القيود التقنية، تم تطوير نظام اختيار مضاد قائم على السموم، وتم إنشاء سير عمل قوي لفحص الطفرات ل P. brasiliense. مقارنة بالطرق التقليدية المعتمدة على السكروز، يقدم هذا النهج القائم على السموم مزايا واضحة، بما في ذلك صرامة الاختيار الأكبر، وتحسين التخصص في تحديد أحداث التقاطع المزدوج، والقضاء على الإجهاد الأسموزي المربك. تم تنفيذ أنظمة مماثلة تعتمد على مضادات السموم vmi480 بنجاح لتجاوز حواجز الانتقاء في النوع⁷. المنهجية المعتمدة قابلة للتطبيق بشكل كبير على التوصيف الوظيفي عالي الإنتاجية للجينات المجهولة وتوفر منصة متعددة الاستخدامات يمكن تكييفها مع أنواع أخرى من التعفن الناعم ذات الصلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد طفرة حذف recA بدون علامة في P. brasiliense

استخراج الحمض النووي الجينومي من P. brasiliense SM وبلازميد pKV2 (مشتق pLP12 مع تعديل مؤشر اختيار المضادات الحيوية ومواقع الاستنساخ المتعددة) من سلالة مانح الإشريكية القولونية باستخدام إجراءات تحضير الحمض النووي القياسية.
تحقق من جودة وتركيز الحمض النووي الجينومي والبلازميد المستخرج عبر الرحلان الكهربائي الهلام الأغاروز ومطيافية نانودروب.
خطي البلازميد pKV2 عن طريق الهضم المزدوج باستخدام EcoRI و NheI عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات. تحقق من الهضم الكامل بواسطة الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز ونقية البلازميد الخطي.
حدد حوالي 800 نقطة أساس للطاقة في أعلى وأسفل جين recA باستخدام برنامج تحليل الجينوم وتصميم أزواج البرايمر المقابلة LBF/LBR وRBF/RBR (انظر جدول المواد لجميع البادئات المستخدمة في هذه الدراسة).
تضخيم كلا الذراعين المتجانسين في ظروف دورة PCR القياسية وتنقية منتجات PCR. عادة ما ينتج PCR بسعة 50 ميكرولتر 2.5 ميكروغرام من المنتج.
ملاحظة: يمكن تعديل قيم Tm ومحتوى GC في البادئات عن طريق تعديل حدود المناطق المتماثلة.
تجميع البلازميد الانتحاري المؤتلف pKV2-recA باستخدام مجموعة تجميع الحمض النووي عن طريق ربط الأذرع المتماثلة المنقاة بالعمود الفقري للبلازميد الخطي.
تحويل خليط التجميع إلى خلايا E. coli S17-1 λpir ذات كفاءة كيميائية عن طريق الصدمة الحرارية، ثم استرجاع الخلايا في وسط LB، ووضعها على LB Agar يحتوي على الكاناميسين (LB + kan).
ملاحظة: التركيزات النهائية المستخدمة هي 50 ملغ/مل كانامايسين، 0.2٪ (بدون ضخامة/ضج) جلوكوز، 0.3٪ (مع ضغط/ضبط) أرابينوز، و0.3 ملليمولار 2,6-ديامينوبيميليك أسيد (DAP).
تحقق من صحة النسخ الإيجابية عن طريق الهضم التقييدي أو PCR في المستعمرة. (انظر جدول المواد لجميع وصفات الوسائط المستخدمة في هذه الدراسة).
استخلاص البلازميد المؤكد pKV2-recA وتحويله إلى الإشريكية القولونية WM3064 باستخدام التحول من الصدمة الحرارية (معدل التحول المتوقع >^{10 6} cfu/μg).
اختر المحولات على LB Agar التي تحتوي على كاناميسين وحمض ديامينوبيميليك (DAP).
إجراء الاقتران الوالدي الثنائي عن طريق خلط الزرعات الليلية لسلالة المتبرع (WM3064 pKV2-recA) والمستلم P. brasiliense SM بنسبة 1:1 (v/v)، وغالبا ما ينتج 10⁴ إلى^{10 6} متلافقات لكل ملليلتر من خلايا المتبرع والمتلقي.
اغسل الزراعة المختلطة مرة واحدة بماء معقم، ضع الخليط على LB Agar مع إضافة الكاناميسين وDAP، واحتضنه عند 28 درجة مئوية لمدة 48–72 ساعة.
ملاحظة: إذا لم تلاحظ أي ترانزواجن، يمكن زيادة نسبة المتبرع إلى المتلقي إلى 2:1 (v/v) لتحسين كفاءة التصريف. إذا لوحظ نمو مرتفع في الخلفية، يمكن إزالة ال DAP المتبقية بغسل الثقافة المختلطة مرتين بماء معقم.
استرجع خليط الاقتران واللوحة على أجار LB يحتوي على الكاناميسين والجلوكوز (بدون DAP) للاختيار المضاد.
اختر 6–8 مستعمرات وقم بتقليدها على كل من LB + kan و LB + kan + أرابينوز.
اختر مستعمرات تنمو على LB + kan لكنها تفشل في النمو على LB + kan + أرابينوز؛ هؤلاء هم المرشحون الأوائل للعباءة.
أكد اللقاح السلالات التي تعبر أولا إلى متوسط LB وتحتضن خلال الليل. قم بتغليف الثقافات على أجار LB يحتوي على L-أرابينوز لتحفيز إعادة التركيب المتماثل الثانية.
اختر عدة مستعمرات وقم بتقليدها على LB + أرابينوز و LB + kan. اختر مستعمرات تنمو على LB + أرابينوز ولكن ليس على LB + kan؛ هذه هي طفرات حذف recA المفترضة.
ملاحظة: إذا لم تلاحظ مستعمرات بعد حدث العبور الثاني، يجب تقييم ضرورة الجين المستهدف لنمو البكتيريا. بدلا من ذلك، يمكن تمديد المناطق المتماثلة للأعلى والأسفل إلى 1,200 وحدة حرس لتعزيز كفاءة إعادة التركيب المتماثل.
تأكيد وجود طفرات recA عن طريق PCR في المستعمرة باستخدام زوج البرايمر checkF/checkR المصمم للتضخيم عبر مناطق محفز recA ومنطقة التيرميناتور للتحقق من حذف الجين المستهدف داخل الإطار. تسلسل منتج PCR لتأكيد الحذف الدقيق داخل الإطار ل recA.
يشير الحذف الناجح إلى تقليل حجم منتج PCR، والذي يجب أن يتوافق مع طول الشظية من النوع البري ناقص الطول النوعي للجزء الجيني المحذوف.

2. بناء pKV2-LLtnp لطفرات Tn5 في P. brasiliense

تضخيم شريط ترانسبوزاز Tnp من pMCS2-LLtnp⁸ باستخدام زوج البرايمر Tnp-F/Tnp-R، وتضخيم العمود الفقري ل oriγR6K Tn5 من pKV2 باستخدام زوج البرايمر ori-F/ori-R. قم بتنقية جميع منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية DNA.
تجميع شريط Tnp المنقى وعمود أوريγR6K Tn5 باستخدام مجموعة تجميع DNA. تحويل خليط التجميع إلى خلايا كهرباء الكحول الكهرومغناطيسية S17-1 λpir بتقنية الصدمة الحرارية، ثم استعادها في وسط LB، ثم وضعها على LB Agar مع إضافة الكاناميسين (LB + kan).
تحقق من صحة النسخ الإيجابية بواسطة PCR للمستعمرة باستخدام أزواج البرايمر ori-F/ori-R وTnp-F/Tnp-R.
جهز الخلايا المؤهلة للإشريكية القولونية RHO3 عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في وسط LB وحضانة النوم طوال الليل. قم بتخفيف الثقافة بنسبة 1:100 إلى متوسط LB طازج ونم إلى OD₆₀₀ بقيمة 0.6.
قم بتبريد الثقافة على الثلج وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 0.1 مليون كاكل₂ مبرد مسبقا. أعد تعليق الحبيبة النهائية في 500 ميكرولتر من الجليسيرول المبرد مسبقا بنسبة 20٪ وتخزينه عند −80 درجة مئوية.
تحويل 10 ميكرولتر من البلازميد المؤتلف المعتمد (pKV2-LLtnp) إلى 100 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة ل RHO3 بواسطة صدمة حرارية (معدل التحول المتوقع > 10⁶ cfu/μg). حضن على الثلج لمدة 30 دقيقة، ثم استخدم صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، ثم برد على الثلج لمدة دقيقتين.
أضف 500 ميكرولتر رطل وسط واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع التحريك. يضع الطبق على LB Agar يحتوي على الكاناميسين وDAP (LB + kan + DAP) ويحتضن عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
تحقق من صحة محولات RHO3 الإيجابية بواسطة PCR المستعمرة باستخدام Tnp-F/Tnp-R.

3. بناء مكتبة الطفرات الترانسبوزونية Tn5 في P. brasiliense

ازرع P. brasiliense ΔrecA في وسط LB عند 28 درجة مئوية وننمو RHO3/pKV2-LLtnp في وسط LB مع إضافة الكانامايسين وDAP (LB + kan + DAP) عند 37 درجة مئوية. اسمح لكلا السلالتين بالوصول إلى OD₆₀₀ من 1.
اخلط 100 ميكرولتر من P. brasiliense ΔrecA مع 100 ميكرولتر من RHO3/pKV2-LLtnp، وقم بطرد المركزي بالخليط، ثم تخلص من الفائق الطبيعي، وأعد تعليق الحبيبات المغسولة في 10 ميكرولتر من وسط LB.
ضع الخليط المعلق على صفيحة أجار LB مع DAP وحضن على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 8 ساعات للسماح بالاقتران.
استرجع خليط الاقتران عن طريق شطف سطح اللوحة بوسط LB معقم بحجم 1 مل. قم بجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة، ثم تخلص من السوبرناتان، واغسل الحبيبة مرتين بطبقة LB متوسطة لإزالة DAP.
أعد تعليق الحبيبة المغسولة في وسط 300 ميكرولتر LB وألواح مخففة تسلسلية 10 مرات على LB Agar مع إضافة الكاناميسين والجلوكوز (LB + kan + جلوكوز؛ بدون DAP) لاختيار الترانزاجينات.
حضن الألواح عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. اختر خمس مستعمرات وتحقق من صحة كل منها بواسطة PCR للمستعمرة باستخدام أزواج البرايمر ori-F/ori-R وTnp-F/Tnp-R لتأكيد نجاح إدخال ترانسبوزون Tn5. تسلسل جميع المستعمرات الخمس للتحقق من إدخال Tn5 في الجينوم.
ملاحظة: قبل البناء الرسمي لمكتبة المتحولين، تم اختيار ست مستعمرات منفردة عشوائيا من لوحة التصريف. أجريت اختبارات إنقاذ البلازميدات لتحديد مواقع الإدخال، باستخدام إنزيمين تقييدين مختلفين بشكل منفصل كمجموعتين ضابطتين متوازيتين. تم الحصول على ما مجموعه 36 قراءة تسلسلية. تم التحقق من صحة حدث إدخال Tn5 واحد فقط عندما كانت المواقع الستة لكل مستعمرة متطابقة.
تقدير سعة مكتبة المتحولين بتكرار خطوة التصريف وعد أعداد المستعمرات. تأكد من أن حجم المكتبة الإجمالي يتجاوز 12,000 مستعمرة لتحقيق تغطية جينومية كافية للفحص في المرحلة اللاحقة.
ملاحظة: إذا لوحظ تردد طفرات منخفض، يجب النظر في استخدام متغير ترانسبوزاز Tn5 مفرط النشاط، مثل متحول E54K/M56A/L372P، لتعزيز كفاءة التحويل.
انقل المستعمرات الطفرية الفردية التي تم الحصول عليها في الخطوة 6 إلى صفائح بئر 96 تحتوي على 200 ميكرولتر رطل + كان لكل بئر. حضن الصفائح طوال الليل عند 28 درجة مئوية مع رجها عند 200 دورة في الدقيقة.
أضف 133 ميكرولتر من الجليسيرول المعقم بنسبة 50٪ إلى كل بئر لتحقيق تركيز نهائي يقارب 20٪. قم بإغلاق وتخزين ألواح ال 96 بئرا عند −80 درجة مئوية للحفاظ على المدى الطويل.

4. اختبارات المرض عالية الإنتاجية عبر تلقيح درنات البطاطس والأوعية

حضر درنات البطاطس (مثل Favorita) عن طريق الشطف بماء معقم، وغمره لفترة وجيزة في 75٪ إيثانول، وتجفيفه في الهواء على طاولة نظيفة. قطع الدرنات إلى أقسام بسماكة ~8 مم وضع الشرائح في أطباق بترى معقمة بحجم 90 مم. حضر على الأقل ثلاث شرائح لنسخ بيولوجية.
تلقيح 1 ميكرولتر من كل سلالة متحول على شرائح البطاطس باستخدام ماصة متعددة القنوات، وفقا لترتيب الألواح في مكتبة الطفرات التي تضم 96 بئرا. أضف P. brasiliense ΔrecA كضابط إيجابي وLB + kan كضابط سلبي.
حضن شرائح البطاطس المتلقونة على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 7–8 ساعات. سجلوا طفرات تظهر انخفاضا واضحا في النقع أو مناطق الآفات أصغر مقارنة بمجموعة ΔrecA . قم بقياس مساحة الآفة بقياس طولها وعرضها. حدد هؤلاء كمرشحين للفحص الأولي.
ملاحظة: تأكد من أن قيم OD₆₀₀لثقافات وضوابط الطفرات تم تطبيعها إلى 0.8 قبل التطعيم.
للفحص الثانوي، قم بتلقيح 5 ميكرولتر من كل مرشح على شرائح بطاطس طازجة (6 سلالات لكل شريحة، بنفس المسافة). جهز ثلاث نسخ بيولوجية لكل سلالة. حضانة عند 28 درجة مئوية لمدة 7–8 ساعات وسجل أحجام الآفات لتأكيد التوهل.
عزل السلالات التي تظهر انخفاضا مستمرا في الضراوة عن طريق تدميرها على صفائح LB + kan. حضن الصفائح عند 28 درجة مئوية طوال الليل وتخزين الطفرات المنخفضة الضراوة المثبتة عند 4 درجات مئوية للتحليل لاحقا.
للتحقق من صحة النبات الكامل، قم بتلقيح سيقان البطاطس ب 150 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى 1 × 10⁸ وحدة CFU/mL. حقن المعلقات في منطقة الساق القاعدية باستخدام حقنة معقمة. راقب تطور المرض بعد 48 ساعة. إجراء تكرارات بيولوجية على ثلاثة نباتات فردية.
تقييم شدة المرض باستخدام مقياس تصنيف مرض الساق السوداء ("مقياس ترتيبي مكون من 6 نقاط: 0، 1، 3، 5، 7، 9") وحساب مؤشر المرض كما يلي:
1. الدرجة 0: لا توجد أعراض مرض على النبات بأكمله.
2. الدرجة الأولى: لا تغطي آفات الجذع أكثر من ثلث محيط الساق، و/أو الأوراق الفردية ذابلة.
3. الدرجة 3: تغطي آفات الساق ما يزيد عن نصف محيط الساق، و/أو أقل من نصف الأوراق تظهر ذبولا خفيفا، و/أو بعض الأوراق السفلية بها آفات.
4. الدرجة 5: تغطي آفات الساق أكثر من نصف محيط الساق، و/أو أكثر من نصف الأوراق تظهر ذبولا خفيفا.
5. الدرجة 7: آفات الجذع تحيط بكامل محيط الساق، و/أو أكثر من ثلثي الأوراق ذابلة.
6. الدرجة 9: جميع أوراق النبات ذابلة أو ميتة.
تحضير مخزونات تخزين طويلة الأمد من الطفرات المخففة المؤكدة عن طريق خلط الثقافات ذات حجم متساو من الجلسرول المعقم 50٪ إلى تركيز نهائي 25٪، وتخزينه عند -80 درجة مئوية.

5. تحديد مواقع إدخال Tn5 بواسطة إنقاذ البلازميدات

ازرع متحول Tn5 محل الاهتمام واستخرج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجيني البكتيري. قم بقياس تركيز الحمض النووي لضمان مدخلات كافية للهضم في مرحلة لاحقة.
هضم 1–2 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني باستخدام EcoRI في تفاعل بسعة 100 ميكرولتر يحتوي على 10× من عازل التفاعل و5 ميكرولتر من الإنزيم، وحضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 ساعات. تحقق من اكتمال الهضم باستخدام جل الأغاروز.
ترسيب الحمض النووي المهضوم بإضافة 1/10 حجم من 3 مولار أسيتات الصوديوم و3 أحجام من الإيثانول المطلق. اخلط جيدا واحتضن عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
استخدم جهاز الطرد المركزي بقوة 13,500 x جرام لمدة 5 دقائق واغسل الحبيبات بشكل متسلسل بنسبة 75٪ إيثانول وإيثانول مطلق. جفف الحبيبة بالهواء وأعد تعليقها في 17 ميكرولتر من الماء المعقم.
يقوم بربط شظايا الحمض النووي المهضومة بإضافة 2 ميكرولتر من 10× ليكون غاز T4 و1 ميكرولتر من ليغاز T4. أضف تحكما سلبيا (بدون ليغاز) للتحقق من تحول الخلفية. حضن تفاعل الربط عند 4 درجات مئوية خلال الليل لتعزيز دوران شظايا التقييد.
تحويل 10 ميكرولتر من خليط الربط إلى إشريكية قولونية S17-1 λpir ذات كفاءة كيميائية باستخدام تحويل الصدمة الحرارية كما هو موضح سابقا. استرجع الخلايا في LB لمدة ساعة واحدة ثم وضع اللوحة على LB Agar يحتوي على الكانامايسين (LB + kan) لاختيار البلازميدات التي تحمل كاسيت Tn5.
اختر خمس مستعمرات عشوائية مقاومة للكاناميسين واستخرج حمض البلازميد باستخدام مجموعة مينيبريب القياسية للبلازميد. تحقق من بنية البلازميد عن طريق هضم 500 نانوغرام من كل بلازميد مع HindIII وحضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات. تحليل أنماط الهضم باستخدام الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز.
إذا تطابقت أحجام نطاق البلازميد مع أنماط الشظايا المتوقعة، قم بإجراء تسلسل سانجر باستخدام بادئة 5' ME الموجودة داخل نهايات Tn5.
حدد موقع إدخال Tn5 بدقة عن طريق محاذاة تسلسل الجانب 50-100 بيس أسفل منطقة Tn5 5'-ME مع جينوم P. brasiliense SM باستخدام BLAST أو برنامج تحليل الجينوم.
تأكد من أن جميع تفاعلات التسلسل الخمسة المستقلة لكل طفرة تتوافق مع نفس الإحداثي الجينومي (> 98٪ من هوية التسلسل).
إذا كان أي من تفاعلات التسلسل الخمسة مرتبطة بإحداثي جينوم مختلف، فهذا يشير إلى وجود عدة مواقع إدخال Tn5 في ذلك الطفر. في مثل هذه الحالات، قم بتحليل مستعمرات إضافية لتحديد جميع مواقع الإدخال. بدلا من ذلك، قم بإجراء الطباعة الجنوبية أو تسلسل الجينوم الكامل للحصول على رسم مواقع إدخال أكثر تحديدا.
حدد الطفرات ذات موقع إدخال واحد ومتسق عبر جميع تفاعلات التسلسل كطفرات Tn5 ذات إدخال واحد مناسبة للتحليلات الظاهرية أو الجينية في المراحل اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتجاوز عدم الاستقرار الناتج عن طفرة sucB في P. brasiliense، تم استخدام سم vmi480 من البلازميد pLP12 كعلامة انتقاء مضاد، وتم بناء ناقل الانتحار المعدل pKV2 (الشكل 1A) عن طريق استبدال شريط مقاومة المضادات الحيوية وتعديل تكوين موقع الاستنساخ. لتوليد طفرة حذف recA بدون علامات، تم استنساخ أذرع متماثلة يسار ويمينة ~800 bp من جين recA إلى pKV2، تلاها عملية اختيار من خطوتين للحصول على مؤتلفات مزدوجة التقاطع. أظهر التحقق من PCR باستخدام زوج البرايمر LBF/RBR وتسلسل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر استراتيجية التلاعب الجيني التي تم تطويرها في هذه الدراسة خيارا للجينوميات الوظيفية في P. brasiliense، وهو ممرض أساسي للتعفن الناعم في البطاطس ^9,10. من خلال دمج نظام انتقاء مضاد قائم على السموم في عمود فقري للبلازميد الانتحاري، تم توليد متحول ΔrecA بدون علامات. يقدم هذا النهج مزايا كبيرة مقارنة بالأنظمة التقليدية المعتمدة على SACB؛ بينما غالبا ما ينتج عن SACB نموا خلفية مرتفعا بسبب تحمل الس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32472504 و 32561143029 إلى X.Z.، و 32201914 إلى J.W.)، ومؤسسة البحث الأساسي الأساسي والتطبيقي في قوانغدونغ (2024A1515012708 إلى X.Z.)، ومؤسسة علوم الطبيعة في منغوليا الداخلية (2024QN03044 إلى U.H.)، وبرنامج المواهب في نهر اللؤلؤ (2021QN02N151 إلى X.Z.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Bacterial genomic DNA extraction kit	Extract bacterial genomic DNA	Tiangen	DP302-02
Diaminopimelic acid	0.3 mM في 1 لتر من الوسط	Macklin	D836611-5g
DNA assembly kit	DNA assembly	Vazyme	C116-02
DNA purification kit	DNA purification	Tiangen	DP214-02
Kanamycin	50 ملغ / مل	Aladdin	K103025-25g
Glucose	0.2٪ (وزن / حجم)	Aladdin	G116305-250mg
Tryptone	10٪ في 1 لتر من الوسط	OXOID	LP0042B
Yeast Extract	5٪ في 1 لتر من الوسط	OXOID	LP0021B
NaCl	10٪ في 1 لتر من الوسط	Biofroxx	1249KG001
Agar	15٪ في 1 لتر من الوسط	Biofroxx	8211GR500
L-arabinose	0.3٪ (وزن / حجم)	Aladdin	A106196-25g
Plasmid Miniprep kit	Extract plasmid	Tiangen	DP103-02
EcoRI	Restriction endonuclease	Yugong Biotech	EG15536
NheI	Restriction endonuclease	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	Restriction endonuclease	Yugong Biotech	EG15539
T4 DNA ligase	Linear DNA self-circularization	Yugong Biotech	EG15205
Centrifuge	RWD	M1324R
PCR Thermal Cycler	BIO-GENER	GET3XG
Digital camera	SONY	ILCE-7M4
Electrophoresis system	LY	DYY-6C
Water bath	JOANLAB	WB100-1F
Gel documentation system	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
Autoclave	Yamato	SQ510C
Shaking incubator	ZHICHU	ZQZY-AR8
Constant temperature incubator	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
UV-Vis spectrophotometer	HITACHI	U-3900
Electroporator	BIO-RAD	MicroPulser
Strains and plasmids
P. brasiliense SM	Potato pathogenic bacteria	Laboratory strain collection
E. coli S17-1 λpir	E. coli competent cells	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	E. coli competent cells	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	E. coli competent cells	Laboratory strain collection
pKV2	The modified suicide plasmid	Constructed in this study
pLP12	suicide plasmid	Laboratory strain collection
pMCS2-LLtnp	Provide the fragment carrying Tn5	Laboratory strain collection

pKV2-LLtnp	The modified plasmid carrying the Tn5 fragment.	Constructed in this study
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		Customized
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		Customized
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		Customized
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		Customized
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		Customized
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		Customized
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		Customized
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		Customized
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		Customized
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		Customized
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		Customized

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Martínez-Prada, M. D. M., Curtin, S. J., Gutiérrez-González, J. J. Potato improvement through genetic engineering. GM Crops Food. 12 (1), 479-496 (2021).
Wang, N., Reidsma, P., Pronk, A. A., de Wit, A. J. W., van Ittersum, M. K. Can potato add to China’s food self-sufficiency? The scope for increasing potato production in China. Eur J Agron. 101, 20-29 (2018).
Sun, Y., et al. Comparative genomic and transcriptome analyses of two Pectobacterium brasiliense strains revealed distinct virulence determinants and phenotypic features. Front Microbiol. 15, (2024).
Liu, Y., Filiatrault, M. J. Complete genome sequence of the necrotrophic plant-pathogenic bacterium Pectobacterium brasiliense 1692. Microbiol Resour Announc. 9 (12), e00037-20(2020).
Moleleki, L. N., Pretorius, R. G., Tanui, C. K., Mosina, G., Theron, J. A quorum sensing-defective mutant of Pectobacterium carotovorum ssp. brasiliense 1692 is attenuated in virulence and unable to occlude xylem tissue of susceptible potato plant stems. Mol Plant Pathol. 18 (1), 32-44 (2017).
Polyudova, T., Eroshenko, D., Korobov, V. The effect of sucrose-induced osmotic stress on the sensitivity of Escherichia coli to bacteriocins. Can J Microbiol. 65 (12), 895-903 (2019).
Luo, P., He, X., Liu, Q., Hu, C. Developing universal genetic tools for rapid and efficient deletion mutation in Vibrio species based on suicide T-vectors carrying a novel counterselectable marker, vmi480. PLoS One. 10 (12), e0144465(2015).
Lv, W., et al. Essential gene dynamics across distinct growth conditions in Xanthomonas citri. Hortic Res. 12 (9), uhaf160(2025).
Toth, I. K., Bell, K. S., Holeva, M. C., Birch, P. R. J. Soft rot erwiniae: from genes to genomes. Mol Plant Pathol. 4 (1), 17-30 (2003).
Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 13 (6), 614(2012).
Pineau, C., et al. Structure-function analysis of pectate lyase Pel3 reveals essential facets of protein recognition by the bacterial type II secretion system. J Biol Chem. 296, 100305(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RecA transposon

نظام انتقاء مضاد قائم على السموم لحذف الجينات بدون علامات وطفرات الترانسبوزون عالية الكثافة Tn5 في بكتوباكتيريوم برازيليينس

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة