يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نظام في المختبر لتطبيق قوة الشد على الخلايا الجذعية الهيكلية باستخدام نظام شد إجهاد الخلايا الدوري

47 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70570

⸱

يونيو 12, 2026

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

في هذه المقالة

ملخص

تم عزل الخلايا الجذعية العظمية العظمية للفئران (SSCs) بواسطة FACS وزراعتها في المختبر. تم إنشاء نظام تجريبي قابل للتحكم لتطبيق التحفيز الميكانيكي الدوري للشد على الخلايا الصلبة الصلبة، مما أدى إلى تقليل تعبير الجينات المرتبطة بالشيخوخة الخلوية، وتحديدا p16 وp21.

الملخص

العظم هو عضو رئيسي حساس للميكانيكية يستجيب باستمرار للإشارات الفيزيائية في الجسم. على الرغم من أن التحفيز الميكانيكي يلعب أدوارا مهمة في تطور الهيكل العظمي، والتوازن الداخلي، وإصلاح الإصابات، إلا أن الاستجابات المحددة للخلايا الجذعية الهيكلية (SSCs) للضغط الميكانيكي لا تزال غير مفهومة بشكل كامل. لمعالجة هذا السؤال، أنشأنا نموذجا في المختبر لعزل الخلايا الصلبة المحيطة للفأر وتطبيق التحفيز الميكانيكي. تم الحصول على خلايا الفتحة المحيطة للفأر أولا عن طريق الهضم الإنزيمي، وتم عزل الخلايا الصلبة بعد ذلك بواسطة فرز الخلايا النشطة بالفلورة (FACS) بناء على علامات سطحية محددة. بعد التعلق بالزراعة، خضعت SSCs لتحفيز ميكانيكي الشد باستخدام نظام إجهاد وتوتر خلوي دوري. يتيح هذا النظام التطبيق القابل للتكرار لقوة الشد على الخلايا المزروعة ويوفر منصة لتحليل استجابات SSC للمدخلات الميكانيكية. باستخدام هذا النهج، وجدنا أن تعبير جينات الشيخوخة الخلوية p16 و p21 انخفض بشكل ملحوظ في الخلايا الصلبة بعد التحفيز الميكانيكي. تشير هذه النتائج إلى أن تحفيز الشد قد يؤثر على التغيرات المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا الصلبة العصبية تحت ظروف المختبر . بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول منصة مفيدة ومناسبة لدراسة سلوك SSC تحت التحفيز الميكانيكي ولدراسة كيفية تأثير الإشارات الميكانيكية على وظيفة SSC.

المقدمة

باعتباره أكبر وأهم عضو داعم في جسم الإنسان، فإن الجهاز الهيكلي لا يوفر فقط مواقع الارتباط وحماية للأعضاء الأخرى، بل يعمل أيضا كأساس للوظيفة الحركية. لذلك، يتعرض الجهاز العظمي باستمرار لمحفزات ميكانيكية متنوعة من البيئات الداخلية والخارجية. إشارات التحفيز الميكانيكي لا تقل أهمية لتطور العظام والحفاظ على وظيفتها. في وقت مبكر من عام 1893، اقترح وجود علاقة إيجابية معينة بين كثافة العظام والقوة الميكانيكية التي تحملها العظام، وهو قانون وولف1. في السنوات الأخيرة، أظهرت بعض الدراسات أهمية الجهاز العظمي الحامل للقوى الميكانيكية في التطور الطبيعي للعظام 2,3,4,5. تعتمد استجابة الجهاز العظمي للقوة الميكانيكية جزئيا على المكونات الخلويةفي العظم. تشكل الخلايا العظمية 85٪ إلى 90٪ من المكونات الخلوية في الجهاز الهيكلي. نظرا لتوزيعها الواسع وشكل الخلايا التغصنية الفريد، تعد الخلايا العظمية حاليا أكثر أنواع الخلايا الهيكلية دراسة من حيث الاستجابة الميكانيكية 7,8. بالإضافة إلى القدرة المعترف بها على نطاق واسع للخلايا العظمية على الاستجابة للقوة الميكانيكية، تلعب الخلايا الهيكلية الأولية دورا لا غنى عنه أيضا. وجد أن استجابة الخلايا السلفية للسماح الدهينية للإشارات الميكانيكية تنظم تحول مصيرها، مما يؤثر على إصلاح تلف الأنسجة9.

الخلايا الجذعية الهيكلية (SSCs) هي نوع من الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة ذات القدرة على التجديد الذاتي، والتي يمكن أن تتمايز إلى أنواع خلايا عظمية ناضجة ضرورية لنمو العظام وصيانتها وإصلاحها. في عام 2015، تم تحديد جينات العلامات السطحية لناقلات SSC للفئران10. لاحقا، أظهرت العديد من الدراسات أيضا أن خلايا SSC تلعب دورا مهما جدا في جوانب مختلفة مثل تطور العظام، والحفاظ على التوازن الداخلي، وإصلاح إصابات العظام11,12. نظرا لخاصية استجابة الجهاز العظمي للقوى الميكانيكية، يمكننا اعتبار إشارات القوة الميكانيكية عاملا لا غنى عنه في تنظيم وظيفة الخلايا الجذعية الهيكلية. لدراسة التغيرات السلوكية للحروف الميكانيكية تحت التحفيز الميكانيكي، نحتاج إلى إنشاء نظام تجريبي مناسب لتطبيق القوة الميكانيكية في المختبر.

تشمل الطرق الرئيسية للتحفيز الميكانيكي في المختبر للخلايا إجهاد القص السائل، الإجهاد الضغطي، قوة الشد، الضغط الهيدروستاتيكي، صلابة المصفوفة وطوبولوجيا المصفوفة6،13. استنادا إلى جينات العلامات السطحية لناقلات السويت السوكي للفئران، حصلنا على SSCs في البيريوستيل من الفأر عن طريق فرز التدفق الخلوي، حيث أن SSCs المشاركة في إصلاح الكسور تنشأ بشكل رئيسي من الشاحاحة14. لاحقا، تم تطبيق قوة شد مناسبة على القطع السحابية من خلال نظام شد خلوي دوري. بعد تحفيز قوة الشد، يمكن الحصول على عينات خلايا، ويمكن إجراء تحليلات متعددة الأوميكس، بما في ذلك تسلسل النسخ النصي، وتسلسل البروتيوم، وتسلسل ATAC-seq. لذلك، يوفر تأسيس هذا البروتوكول أساسا قويا لدراسة استجابات SSC للتحفيز الميكانيكي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران في هذا البروتوكول من قبل لجنة العناية والاستخدام للحيوانات في معهد شنغهاي للكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الخلوي، الأكاديمية الصينية للعلوم (SIBCB-S350-2312-41).

1. عزل خلايا البيريوستيل في الفئران

  1. ضع فئران عمرها من 4 إلى 6 أسابيع في صندوق قتل رحيم بثاني أكسيد الكربون وعرضها لثاني أكسيد الكربون بشكل مستمر لمدة 3 دقائق حتى يتوقف التنفس.
  2. عقم سطح أجسام الفئران بنسبة 75٪ كحول. استخدم مقص العيون لفصل الأطراف الخلفية. ثم استخدم الملقط المدبب والمقص العيني لإزالة العضلات الهيكلية من الأطراف الخلفية، لضمان بقاء مناطق مفاصل عظم الفخذ والساق سليمة.
  3. حفظ العظام المعزولة في PBS المبرد، ثم غطى كلا طرفي العظام بأغروز منخفض الذوبان (5-10٪ في مخزن TAE).
  4. هضم عظم الفخذ والساق في الحد الأدنى من الوسط الأساسي ألفا (α-MEM) الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجناز، 2 ملغ/مل ديسباس II، و0.1 ملغ/مل DNase I عند 37°C و0.3 × جرام لمدة 30 دقيقة مرتين. اجمع الخلايا المهضومة في وسط الزراعة (α-MEM + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)).
  5. قم بترشيح تعليق الخلية عبر مصفاة خلية بحجم 40 ميكرومتر ثم استخدم الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة السوبرناتان.
  6. أعد تعليق ترسيب الخلية باستخدام مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة دقيقتين وأنهي التفاعل باستخدام مخزن تدفق الخلايا الخلوية (PBS + 2٪ FBS).
  7. قم بعمل الطرد المركزي على الخلايا على حرارة 500 × جرام لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا باستخدام مخزن تدفق الخلايا الخلوي عند 1 × 107 خلايا/مل لفرز الخلايا.

2. فرز الخلايا المنشطة بالفلورة

  1. صبغ تعليق الخلية بالأجسام المضادة التالية كما يلي: مضاد الفأر المترافق-PerCP/Cy5.5 CD45، مضاد الفأر المقترن ب PerCP/Cy5.5 CD31، مضاد الفأر المقترن ب PerCP/Cy5.5 Ter119، مضاد الفأر 6C3/Ly-51 متصل ب FITC، مضاد فأر مقترق 605 ب Brilliant Violet 605 CD90.2، مضاد فأر مترافق PE/Cy7 CD105، مضاد الفأر المقترن ب APC CD200.
  2. قم بتخفيف الأجسام المضادة أعلاه بنسبة 1:500 وحضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء.
  3. اغسل الخلايا باستخدام مخزن تدفق الخلايا الخلوي، وقم بفرز الخلايا باستخدام جهاز فرز الخلايا المنشط بالفلورة للحصول على أقراص CD45- CD31- Ter119- CD90.2- 6C3- CD105- CD200+ SSCs. اجمع SSCs المصنفة باستخدام وسط الزراعة. تحليل البيانات المكتسبة باستخدام برنامج FlowJo v10.8.1.
  4. قم بتوسيع الأقراص الصلبة الموزعة في أطباق الزراعة باستخدام وسط التمدد في حاضنة خلايا بنسبة 5٪CO2 . يمكن إجراء مقطع واحد قبل التحفيز الميكانيكي.
    ملاحظة: يمكن الحصول على حوالي 1 ×10 5 من الفئران المحيطية من كل زوج من الفئران عمرها 6 أسابيع.

3. التحفيز الميكانيكي لأقراص SSC

  1. قم بتخفيف الكولاجين من النوع الأول من ذيل الفئران في حمض الأسيتيك المعقم 0.02 ملم إلى تركيز نهائي يبلغ 0.15 ملغ/مل. يمكن إعادة استخدام هذا المحلول ثلاث مرات ويجب الحفاظ عليه عند 4 درجات مئوية.
  2. أضف 1.5 مل من كولاجين ذيل الجرذ المخفف من النوع الأول إلى كل بئر من صفيحة الزراعة ذات القاع المرن ذو الستة آبار. بعد تغطية الألواح لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة، استنشق الكولاجين الزائد واغسل الألواح مرة واحدة باستخدام PBS لاستخدامها لاحقا.
  3. ملاحظة: للاستخدام الفوري، يجب شطف الطبق ب PBS لإزالة أي حمض متبق. قبل التخزين عند 4 درجات مئوية، يجب تجفيف الطبق بالكامل مع إزالة الغطاء.
  4. هضم الخلايا الصلبة السحابية المحيطة المخروطة، واستخدمها الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق، وإعادة تعليق ترسيب الخلية في وسط الزراعة لتحقيق كثافة خلوية تبلغ 1 ×10 5 خلايا/مل، وأضف 2 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة الزراعة ذات القاع المرن المكون من 6 آبار، ووضعها في حاضنة الخلية.
  5. بعد 24 ساعة من زرع الخلايا، ضع لوح الزراعة ذو القاع المرن في القاعدة الممدودة، واحتفظ بصفيحة زراعة خلية أخرى ذات قاع مرن كمجموعة تحكم دون تحفيز ميكانيكي للقوة.
  6. اضبط المعلمات في برنامج FX-6000 الإصدار 1.0 كما يلي: قوة التمدد 8٪، التردد 0.1 هرتز، شكل الموجة كموجة مربعة، دورة عمل الموجة 80٪، ومدة التمدد لمدة 12 ساعة.
    ملاحظة: هناك أربعة مواقع على لوحة القاعدة المشدودة لوضع صفيحة زراعة مرنة ذات قاع مرن ب 6 آبار. إذا كانت الخلايا المطلوبة للتجربة أقل من 4، يجب ملء الأماكن الفارغة بألواح زراعة جديدة ذات 6 آبار مرنة قاعية. بعد تطبيق التحفيز الميكانيكي المناسب، يمكن للحواجز الصلبة السوبرالية الخضوع لاختبارات وظيفية مثل تمايز أو تكاثر الخلايا، أو يمكن استخراج عينات لتسلسل الوسائط المتعددة.

4. PCR الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)

  1. بعد الانتهاء من التحفيز الميكانيكي للخلايا، تخلص من وسط الزراعة، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS، استخرج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مادة TRIzol، وقم بإجراء النسخ العكسي للRNA.
    ملاحظة: بعد الانتهاء من استخراج الحمض النووي الريبي، يمكن تخزينه عند -80 درجة مئوية. يمكن أيضا تخزين الحمض النووي المحصل من النسخ العكسي على -20 درجة مئوية للاختبارات لاحقا.
  2. قم بإجراء RT-qPCR باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي. كانت مجموعات التمهيد المستخدمة كما يلي:
    HPRT: الأمام 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCAAAA-3',
    HPRT: العكس 5'-AGGGCATATCCAACAACAACTT-3',
    ص16: الأمام 5'-GGTCACACGACTGGGGGATT-3',
    ص16: الوجه الخلفي 5'-GCACCGTAGTTGAGCAGAGAG-3',
    ص21: الأمام 5'-GCCTGGTTCCTTGCCACTTTCT-3',
    ص21: العكس 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. تأثيرات العلاج قصير الأمد للإجهاد الميكانيكي

  1. اضبط المعلمات في برنامج FX-6000 الإصدار 1.0 كما يلي: قوة التمدد 8٪، التردد 0.1 هرتز، شكل الموجة كموجة مربعة، دورة عمل الموجة 80٪. يتم تحلل الخلايا باستخدام محلول تحلل RIPA I (مع كوكتيل مثبط الفوسفاتاز وكوكتيل مثبط البروتياز) بعد 10 دقائق و60 دقيقة من تحفيز التوتر الميكانيكي.
  2. قم بعمل البقعة الغربية باستخدام Erk وP-Erk Antibody المضاد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد تطبيق هذا البروتوكول، تم تطبيق قوة الشد بنجاح على حقول الطيور السحابية المحيطة للفئران. أولا، تم الحصول على SSCs من العباقرة الشهقانية للفئران عن طريق قياس تدفق الخلية. أظهرت نتائج قياس تدفق الخلايا أن نسبة الخلايا الصلبة في الشغاضى شكلت ما يقرب من 30٪ من نخاع العشاء (CD45-، CD31-، Ter119-) CD90.2-6C3- (الشكل 1)، وهو أعلى بكثير من ذلك في نخاع العظم. نظرا للدور الكبير لخلايا SSC العضلية الساحقة في تطور العظام وإ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في السنوات الأخيرة، تم اكتشاف جينات علامات الخلايا الجذعية الهيكلية من أجزاء مختلفة من العظام بشكل مستمر 11,12,17. ومع ذلك، لا يزال البحث في التنظيم المباشر لوظيفة SSCs بحاجة إلى تعميق، خاصة في جانب تنظيم التحفيز الميكانيكي. حتى الآن، استند البحث حول التأثيرات التنظيمية الميكانيكية للخلايا الجذعية الهيكلية/الخلايا الأولية بشكل رئيسي على بناء نماذج فئران بيزو1 الق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر المنشأة الأساسية لقياس تدفق الخلايا ومنشأة نواة الحيوانات في معهد شنغهاي للكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الخلوي، الأكاديمية الصينية للعلوم. وقد دعم العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32471190، 82502903) وبرنامج الخبراء الأجانب في مقاطعة هاينان (506068033010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
α-MEMCorning10-022-CVعزل الخلايا الظهارية
APC anti-mouse CD200BioLegend123809فرز خلايا النخاع الشوكي
BioFlex 6-Well Culture Plate FlexcellBF-3001Aزراعة الخلايا
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317فرز خلايا النخاع الشوكي
CollagenaseSigmaC0130عزل الخلايا الظهارية
Dispase IISigmaD4693عزل الخلايا الظهارية
DNase ISigmaDN25عزل الخلايا الظهارية
Fetal Bovine SerumGibcoA5356701فرز خلايا النخاع الشوكي
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305فرز خلايا النخاع الشوكي
 Flexcell Tension System FlexcellFlexercell FX-6000 توتر الخلايا
Flow Cytometry SorterBDBD FACSAria Fusionفرز خلايا النخاع الشوكي
MesenCult Expansion Kit (Mouse)Stem cell05513زراعة الخلايا
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409فرز خلايا النخاع الشوكي
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522فرز خلايا النخاع الشوكي
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132فرز خلايا النخاع الشوكي
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228فرز خلايا النخاع الشوكي
 PrimeScript RT Reagent KitTaKaRaRR037ART-qPCR
Rat tail type I collagenCorning354236زراعة الخلايا
real-time PCR systemThermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 red blood cell lysis buffer Beyotime C3702عزل الخلايا الظهارية
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail IIMCEHY-K0022WesterBlot
 RIPA Lysis Buffer ISangon BiotechNO. C500005WesterBlot
Protease Inhibitor Cocktail MCEHY-K0010WesterBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling Technology9102WesterBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology4370WesterBlot

المراجع

  1. Wolff, J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 19, 1222-1224 (1893).
  2. Li, X., et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. eLife. 8, 49631(2019).
  3. Sun, W., et al. The mechanosensitive Piezo1 channel is required for bone formation. eLife. 8, 47454(2019).
  4. Wang, L., et al. Mechanical sensing protein PIEZO1 regulates bone homeostasis via osteoblast-osteoclast crosstalk. Nat Commun. 11, 282(2020).
  5. Zhou, T., et al. Piezo1/2 mediate mechanotransduction essential for bone formation through concerted activation of NFAT-YAP1-ß-catenin. eLife. 9, 52779(2020).
  6. Wang, L., et al. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 10, 16(2022).
  7. Qin, L., Liu, W., Cao, H., Xiao, G. Molecular mechanosensors in osteocytes. Bone Res. 8, 23(2020).
  8. Uda, Y., et al. Osteocyte Mechanobiology. Curr Osteoporos Rep. 15, 318-325 (2017).
  9. Wang, L., et al. Piezo1 balances the osteogenic-tenogenic plasticity of periosteal progenitor cells through the YAP pathway. Cell Rep. 44, 115630(2025).
  10. Chan, C. K., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160, 285-298 (2015).
  11. Feng, H., et al. Skeletal stem cells: origins, definitions, and functions in bone development and disease. Life Med. 1, 276-293 (2022).
  12. Yuan, G., et al. Skeletal stem cells in bone development, homeostasis, and disease. Protein Cell. 15, 559-574 (2024).
  13. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Cell Mol Med. 17, 823-832 (2013).
  14. Jeffery, E. C., et al. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells make distinct contributions to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29, 1547-1561 (2022).
  15. Liu, Y. L., et al. Fibrous periosteum repairs bone fractures and maintains the healed bone throughout mouse adulthood. Dev Cell. 59, 1192-1209 (2024).
  16. Hu, H., et al. ZKSCAN3 counteracts cellular senescence by stabilizing heterochromatin. Nucleic Acids Res. 48, 6001-6018 (2020).
  17. Li, Q., Xu, R., Lei, K., Yuan, Q. Insights into skeletal stem cells. Bone Res. 10, 61(2022).
  18. Shen, B., et al. A mechanosensitive peri-arteriolar niche for osteogenesis and lymphopoiesis. Nature. 591, 438-444 (2021).
  19. Yu, H. S., et al. Impact of mechanical stretch on the cell behaviors of bone and surrounding tissues. J Tissue Eng. 7, 2041731415618342(2016).
  20. Chang, X., Xu, S., Zhang, H. Regulation of bone health through physical exercise: Mechanisms and types. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1029475(2022).
  21. Ma, Q., et al. Significance of mechanical loading in bone fracture healing, bone regeneration, and vascularization. J Tissue Eng. 14, 20417314231172573(2023).
  22. Sakurai, M., Ishitsuka, K., Becker, H. J., Yamazaki, S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells and clinical applications. Cancer Sci. 115, 698-705 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.