مقالة منهجية

تصنيع وتطبيق جراحي لهيدروجيلز الجيلاتين-ريبوفلافين المتشابكة ضوئيا لتعزيز إصلاح جروح القرنية في الأرانب

DOI:

10.3791/70579

⸱

أبريل 24, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, School of Medicine and Nursing, University of the Basque Country UPV/EHU, 2BEGIKER Ophthalmology Research Group, IIS Biobizkaia, 3Department of Ophthalmology, University Hospital of Cruces

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم بروتوكول قابل للتكرار لتحضير وإثراء وتطبيق هيدروجيل الجيلاتين-ريبوفلافين القابل للربط المتقاطع بالضوء الأزرق في الموقع لإصلاح جروح القرنية في الأرانب، بما في ذلك الخطوات الإجرائية للتعامل الجراحي، والرصال الجزئي، والرعاية بعد العملية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لتصنيع وإضافة وتطبيق هيلاتين جيلاتين قابل للربط المتقاطع بالضوء الأزرق في الموقع لإصلاح جروح القرنية البثوية في الأرانب. يتكون مقدمة الهيدروجيل من الجيلاتين بنسبة 5٪ (w/v) وفوسفات الريبوفلافين عند 0.01٪ (w/v)، ويتم تحضيره في ظروف معقمة ومحمية من الضوء، ومصفى بالتعقيم، وسخن قبل الاستخدام لتحقيق اللزوجة القابلة للحقن. يتم تفصيل دمج اختياري لمستخلص الغشاء الأمنيوسي البشري أو مصل الأرانب الذاتي. يتم تحفيز التجلي عند الطلب على سطح العين باستخدام الضوء الأزرق عند λ = 420–480 نانومتر لمدة إجمالية 2 دقيقة. تشمل طريقة الجسم الحي ، استئصال الكيراتيكتومي الأمامي القابل للتكرار (قطر تريفين 6.5 مم؛ عمق حوالي 187 ميكرومتر)، يليه حشوة بالهيدروجيل، وتنشيط الضوء، وتحليل جزئي للطريان الجانبي لتثبيت العلاج، ودعم شفاء الجروح، وتوحيد الرعاية بعد العملية. تظهر النتائج الممثلة في المختبر سلوكا مرنيا يشبه الهلام مع ترقق القص والتعافي السريع، ونفاذية بصرية عالية (> 90٪) بعد 500 نانومتر، مما يشير إلى ملاءمة للاستخدام القرني. في الجسم الحي، تدعم العلاجات القائمة على الهيدروجيل إغلاق الظهارة التدريجي، وتحمل العين الجيد (درجات درايز منخفضة في 3 و7 أيام)، وفقدان الهيدروجيل المرئي المعتمد على الوقت بما يتوافق مع التحلل البيولوجي واستبدال الأنسجة. يتم تسليط الضوء على خطوات حرجة ونقاط توقف لضمان قابلية التكرار، بما في ذلك التحكم في درجة الحرارة أثناء الذوبان والترشيح، والحماية من الضوء، وتحديد موقع المصباح أثناء الربط المتقاطع. يتيح البروتوكول تثبيت الهيدروجيل الخالي من الغرز وموضوعه بدقة ويعمل بالضوء، متوافقا مع إضافة مكملات حيوية نشطة متعددة. يوفر منصة عملية للتقييم قبل السريري للمواد الحيوية العينية من الجيل القادم ويسهل ترجمة علاجات الهيدروجيل القابلة للربط الضوئي لإصلاح جروح القرنية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القرنية بنية شفافة وعائية تمثل حوالي ثلثي قوة انكسار العين، مما يجعل سلامتها الهيكلية والوظيفية ضرورية للرؤية1. بسبب تعرضها المباشر للبيئة الخارجية، تكون القرنية عرضة جدا للصدمات والعدوى والإصابات الكيميائية والمضاعفات بعد الجراحة2،3. الفشل في استعادة سلامة الظهارة بسرعة وفعالية قد يؤدي إلى عيوب ظهارية مستمرة وتقرحات قرنية مزمنة، مما يؤدي في النهاية إلى ذوبان البثن، والثقب، والندوب، وفقدان البصر الدائم4،5. العلاجات التقليدية — بما في ذلك المزلقات، والوقاية من المضادات الحيوية، وقطرات العين المصلية الذاتية — غالبا ما تقدم فائدة جزئية فقط ولا تعزز بشكل كاف إصلاح الستروما في العيوب المتوسطة إلى الشديدة 6,7,8.

لمعالجة هذه القيود، ظهرت العلاجات القائمة على المواد الحيوية كبدائل واعدة بسبب قدرتها على حماية الجرح، ودعم إصلاح الظهارة، واستعادة الأنسجة البمثقابية 9,10,11,12,13,14. تعد الهيدروجيلامات جذابة بشكل خاص بسبب توافقها الحيوي، وشفافيتها البصرية، وسلوكها الميكانيكي القابل للتعديل، وقدرتها على دمج العوامل العلاجية. أظهرت الهيدروجيلات الطبيعية والاصطناعية، بما في ذلك الجيلاتين 15,16,17، الكولاجين 18,19، الكيتوزان20,21، البولي إيثيلين جليكول (PEG)22,23 وحمض الهيالورونيك18,24 إمكانات في تعزيز شفاء جروح القرنية. من بين هذه المواد، تعتبر الهيدروجيلات القائمة على الجيلاتين ذات قيمة خاصة بسبب تركيبها المشتق من الكولاجين وزخارف الالتصاق الخلوية الجوهرية.

توفر الهيدروجيلات القابلة للربط الضوئي ميزة إضافية من خلال تمكين التصلب عند الطلب مباشرة على سطح العين، مما يتيح وضعها بدقة وتحسين الاستقرار الميكانيكي بدون غرز. تم تكييف الربط المتقاطع بوساطة الريبوفلافين، الذي تم تطويره أصلا لعلاج الكيراتوكوسون، مؤخرا لبلمرة الهيدروجيل الضوئي بسبب توافقه الحيوي الممتاز، وسلامته العيونية، وقدرته على توليد أنواع أكسجين تفاعلية تحفز الربط المتقاطع تحت الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية25،26. الضوء الأزرق (≈445 نانومتر) مفيد بشكل خاص لتطبيقات القرنية، حيث يمكن الربط المتقاطع بكفاءة مع تجنب المخاطر المرتبطة بالأشعة فوق البنفسجية27،28،29.

تقدم هذه المقالة تصنيع وإثراء والتطبيق الجراحي لهيدروجيل قابل للربط الضوئي المتقاطع مكون من 5٪ (بدون ضبط) جيلاتين و0.01٪ (مع ضج) ريبوفلافين فوسفات (RFP). تم توفير بروتوكول مفصل لتحضير الهيدروجيل في المختبر، بما في ذلك دمج اختياري لمستخلص الغشاء الأمنيوسي البشري (HAMe) أو المصل الذاتي (AS)، بالإضافة إلى التطبيق في الجسم الحي في نموذج استئصال الكيراتومي للأرنب. يعرف مصل العين بتأثيره المضاد للالتهاب، ومضاد التليف، ومؤيد التجدد على سطح العين30، 31، 32، 33، 34، 35، بينما يوفر المصل الذاتي تركيزات شبيهة بالدموع من فيتامين A، EGF، الفيبرونكتين، وعوامل نمو أخرى ضرورية لتجديد الظهارة36، 37، 38. معا، تدعم هذه العناصر إعادة الظهارة، وتقلل الالتهاب، وربما تمنع تدهور العضلاتالحلقية 39,40.

بينما يوفر النهج الموضح بلمرة ضوئية محكمة ونشاطا حيويا قابلا للتخصيص، فإن تطبيقه حاليا يقتصر على العيوب السطحية والوسطى في العقد، ويتطلب التعرض للضوء الأزرق في خط الرؤية، مما قد يحد من الاستخدام في الأنسجة المعتمة أو المتغلغلة بعمق. من خلال دمج تحضير الهيدروجيل وتثبيته، والتعامل مع العيون، والرعاية بعد العملية، بما في ذلك الحساسية الجانبية الجزئية، تقدم هذه الورقة نهجا قابلا للتكرار يدعم إصلاح القرنية، ويسهل ترجمة تقنيات الهيدروجيل المنشط بالضوء إلى الممارسة السريرية، ويساهم في تطوير منصات موحدة لأبحاث تجديد القرنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على المشيمة البشرية من المتبرعين بموافقة مستنيرة، وفقا لإعلان هلسنكي وبموافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة كروسيس (رقم الموافقة CEIC E15/03). تمت الموافقة على جميع تجارب الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات أبحاث الحيوان في جامعة بلاد الباسك (UPV/EHU) (رقم الموافقة CEEA M20/2023/038) وامتثلت لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تم إجراء جميع الإجراءات في منشأة الحيوانات UPV/EHU (SGIker)، مع الحفاظ على تقنية التعقيم طوال الوقت (خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية عند التعامل مع المواد البيولوجية).

1. تخليق الهيدروجيل

  1. محاليل الجيلاتين-ريبوفلافين السلفية (5٪ و10٪ مع الضرب/الذهب)
    ملاحظة: اعمل تحت إضاءة خافتة أو استخدم زجاجات أو زجاجات كهرمانية ملفوفة بورق الألمنيوم لحماية المحلول من التعرض للضوء. قم بجميع الخطوات تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق طبقي عندما يكون الهيدروجيل مخصصا للاستخدام البيولوجي.
    1. وزن الكميات المطلوبة من الجيلاتين والريبوفلافين فوسفات (RFP): ل10 مل من 5٪ (بدون سعر) + 0.01٪ (بدون سعر السعر) مقدم، وزن 500 ملغ من الجيلاتين و1 ملغ من RFP. بالنسبة ل 30 مل من مخزون RFP بنسبة 10٪ (بدون سعر) + 0.02٪ (بدون سعر السعر)، وزن 3 جرام من الجيلاتين و6 ملغ من RFP.
    2. أضف الجيلاتين وRFP إلى الحجم المقابل من الماء منزوع الأيونات (≈90٪ من الحجم النهائي). حرك بلطف حتى يتبعثر المسحوق بالكامل.
    3. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 باستخدام 1 ميتار NaOH، مع إضافة القاعدة باتجاه الانخفاض أثناء مراقبة الرقم الهيدروجيني. سجل حجم NaOH المستخدم والحجم المعدل النهائي. بعد ضبط الرقم الهيدروجيني، ارفع المحاليل إلى حجمها النهائي باستخدام ماء منزوع الأيون.
    4. قم بإذابة وتوحيد المحلول عند 80 درجة مئوية تحت التحريك المغناطيسي بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تعامل مع المحاليل الساخنة (>70–80 درجة مئوية) باستخدام قفازات مقاومة للحرارة.
    5. دع المحاليل تبرد إلى 30–40 درجة مئوية وقم بترشيتها عبر مرشحات غشائية محبة للماء بحجم 0.22 ميكرومتر من البولي إيثير سلفون (PES) إلى زجاجات كهرمانية معقمة.
      ملاحظة: المحاليل اللزجة الدافئة بلطف (≈ 40–50 درجة مئوية) قبل الترشيح إذا لزم الأمر؛ تجنب ارتفاع درجة الحرارة.
    6. ضع ملصقات على الزجاجات بالتركيب والتاريخ والحروف الأولى للمشغل. خزن محاليل الهيدروجيل المصفاة على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام، مع التأكد من أن فترة التخزين لا تتجاوز أسبوعين من وقت التحضير.
  2. الهيدروجيلين الجيلاتين المكمل (الحجم النهائي: 10 مل)
    1. جهز مصل ذاتي (AS) أو مستخلص الغشاء الأمنيوسي البشري (HAMe) وفقا للإجراءات الموضحة في القسمين 4 و5. حافظ على المستخلصات معقمة ومبردة حتى الاستخدام.
    2. لكل 10 مل من الهيدروجيل المخصب، اخلط 5 مل من مخزون RFP الجيلاتين بنسبة 10٪ (بدون ضجة) + 0.02٪ (بدون ضج)، و5 مل من المستخلص البيولوجي المقابل (AS أو HAMe).
      ملاحظة: المحاليل اللزجة الدافئة بلطف (≈ 40–50 درجة مئوية) قبل الترشيح إذا لزم الأمر؛ تجنب ارتفاع درجة الحرارة.
    3. قم بترشيح المحلول الدافئ عبر فلتر غشاء محب للماء PES بحجم 0.22 ميكرومتر إلى زجاجات كهرمانية معقمة.
    4. ضع علامة وتخزين الهيدروجيلز عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تأكد من أن فترة التخزين لا تتجاوز أسبوعين من وقت التحضير.
      ملاحظة: التخلص من جميع النفايات وفقا للوائح السلامة الحيوية المؤسسية.

2. تطبيق الهيدروجيل في المختبر

  1. جهز تركيبات الهيدروجيل كما هو موضح في القسم 1 وابقها عند 32 درجة مئوية قبل التطبيق للحفاظ على اللزوجة الكافية.
  2. باستخدام تقنية التعقيم، يتم إدخال حجم الهيدروجيل المطلوب بأنبوب الماصة إلى البئر المستهدف أو القالب أو الطبق أو الركيزة (الشكل 1A).
  3. ضع مصباح المعالجة Led-C على بعد 2 سم فوق سطح الهيدروجيل. ابدأ الربط المتقاطع في الموقع بتعريض الهيدروجيل للضوء الأزرق (λ = 420–480 نانومتر) وخرج ضوء 850-1000 ملواط/سممربع لمدة إجمالية تبلغ دقيقتين. قدم الإضاءة بست نبضات كل منها 20 ثانية، مع إدخال 5–10 ثوان توقفات بين النبضات لمنع التسخين المحلي (الشكل 1B).
  4. تأكد من التجلي الكامل بصريا وبلمس السطح بلطف باستخدام أداة معقمة لضمان تكوين هيدروجيل صلب قابل للتلاعب (الشكل 1C,D).
  5. استخدم الهيدروجيل المتقاطعة فورا أو خزن عند 4 درجات مئوية تحت ظروف معقمة مناسبة للتطبيق في المراحل اللاحقة.
    ملاحظة: حافظ على تقنية المعقم طوال الإجراء. تجنب التعرض المباشر للجلد أو العينين لأشعة الضوء الأزرق.

3. الحصول على الغشاء الأمنيوسي البشري (HAM)

ملاحظة: استخدم المشيمة فقط من متبرعين سلبيين للمصل قدموا موافقة مستنيرة واستوفيوا المتطلبات المؤسسية والأخلاقية.

  1. أهلية المتبرع والموافقة
    1. تأكد من أن كل متبرع قد تم فحصه واختباره سلبي لفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 و2، والتهاب الكبد B وC، والزهري.
    2. احصل على موافقة مكتوبة ومستنيرة من كل متبرع قبل الجراحة.
    3. احصل على مشيمة بشرية فور الولادة القيصرية الاختيارية لمتبرعين أصحاء.
  2. الجمع والمعالجة الأولية
    1. اجمعي كل مشيمة في وعاء معقم من الفولاذ المقاوم للصدأ فور الولادة.
    2. في غرفة العمليات، شطف المشيمة بشكل مكثف بمحلول ملحي معقم لإزالة جلطات الدم. حدد الأمنيون—وهو أغشاء شفاف داخلي يبطن التجويف الأمنيوسي—وافصله بعناية عن الكوريون عن طريق تقشير لطيف نحو حافة المشيمة باستخدام ملقط معقم.
      ملاحظة: تعامل مع الأغشية بعناية لتجنب التمزق.
    3. بعد الفصل الكامل، قم بتثبيت قطع مرشح نيتروسلولوز معقمة على سطح التثبيث العضلي لتسهيل التلاعب وتوحيد تقسيمه. قسم ال HAM إلى ثلاث مناطق محددة (الشكل 2A,B): الأمنيون البعيد: مقطع بعرض 10 سم، الأمنيون الإنسي: مقطع بعرض 10 سم، الأمنيون القريب: المقطع يمتد إلى حافة المشيمة.
  3. النقل
    1. ضع كل قطعة من HAM في زجاجة معقمة، وغمرها في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 1.25 ميكروغرام/مل أمفوتيرسين B، و50 ميكروغرام/مل بنسلين-ستريبتومايسين، و50 ميكروغرام/مل نيومايسين.
    2. ضع علامة واضحة على كل زجاجة برمز المتبرع، والتاريخ، ومنطقة المنشأ (البعيدة، الوسطى، أو القريبة).
    3. نقل العينات فورا إلى المختبر في ظروف مبردة نظيفة ومعقمة (4 درجات مئوية).
      ملاحظة: نقل الأغشية في تغليف ثلاثي مغلق ومتوافق مع المادة البيولوجية رقم UN 3373 (المادة البيولوجية، الفئة B)، وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية التي تحكم الأنسجة البشرية.
  4. المعالجة المخبرية
    ملاحظة: قم بجميع الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية تحت ظروف معقمة.
    1. اقطع كل جزء من الكتلة البعيدة والوسطى والقريبة إلى مربعات من 4.0 إلى 4.5 × 4.0 إلى 4.5 سم باستخدام مقص معقم.
    2. اغمر الشظايا في DMEM المكملة بالمضادات الحيوية المذكورة سابقا وامسح بلطف بمشابك معقمة لإزالة بقايا الدم. اغسله في DMEM يحتوي على 50 ميكروغرام/مل بنسلين-ستربتوميسين لمدة 2 × 5 دقائق.
    3. اغسله في DMEM بدون مضادات حيوية لمدة 2 × 5 دقائق.
    4. غسل هذه الشظايا المختارة في محلول ملحي معقم مع فوسفات مخزن (PBS).
    5. انقل كل شظية إلى أنبوب معقم بسعة 5 مل بدون أي وسط زراعة. جمد العينات مباشرة عند -80 درجة مئوية حتى استخدام إضافي.

4. تحضير مستخلص الغشاء الأمنيوسي البشري (HAMe)

ملاحظة: قم بجميع الخطوات في ظروف معقمة وباردة لتقليل تحلل البروتين والتلوث.

  1. استرجاع الأنابيب التي تحتوي على شظايا الغشاء الأمنيوسي البشري (HAM) المخزنة عند −80 درجة مئوية. اغمر الأنابيب في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق لتصلب النسيج.
  2. انقل كل قطعة مجمدة إلى هاون مبرد مسبقا (−80 درجة مئوية) وسحقها جيدا باستخدام مدقة حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم ومتجانس.
  3. وزن العينة المطحونة فورا على لوحة توازن لتقليل الذوبان. انقل المسحوق الموزن إلى أنبوب بحجم 5 مل وأعد تعليقه في 3 مل من PBS مع مزيج مثبط بروتيز بتركيز 5 ميكرولتر/ملغ.
    ملاحظة: حافظ على جميع الأنابيب على الثلج أثناء المعالجة للحفاظ على سلامة البروتين.
  4. قم بتحويل كل عينة إلى السونيك لمدة 20 دقيقة عند سعة 90٪ باستخدام جهاز السونيكتر ومسبار قطره 1.5 مم، مع تطبيق 15 ثانية تشغيل / 15 ثانية إيقاف دورة لمنع ارتفاع درجة الحرارة.
  5. قم بالطرد المركزي بإزالة الليزاتات عند 3000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الفائقة بعناية دون إزعاج الحبيبات.
  6. ترشيح المادة الفائقة عبر مرشح غشائي محبي للماء PES بحجم 0.22 ميكرومتر باستخدام ظروف معقمة. قم بتقسيم ال HAMe المصفاة إلى أنابيب دقيقة بحجم 0.2 مل. تخزين الأليكوات عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
    ملاحظة: تأكد من أن فترة التخزين لا تتجاوز 6 أشهر من وقت التحضير.

5. استخراج المصل الذاتي المستخرج من الدم من الأرانب

ملاحظة: إجراء جميع الإجراءات الخاصة بالفحوصات داخل الجسم في الأرانب البيضاء النيوزيلندية (≈2 كجم) بموافقة لجنة أخلاقيات أبحاث الحيوانات في المؤسسة المعنية ووفقا للإرشادات المؤسسية.

  1. قم بتخدير الأرنب محليا باستخدام الليدوكائين (موضعي أو تحت الجلد) في موقع الوريد.
  2. اجمع الدم من الشريان المركزي في أنابيب جمع الدم بحجم 4.5 مل تحتوي على فاصل هلام بوليمري (الشكل 3A,B). اترك الدم يتجلط لمدة ساعتين عند التصوير التنفسي دون تحريك (الشكل 3C).
  3. قم بالطرد المركزي للعينات عند 1000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند RT. اجمع المادة الفائقة (المصل)، الذي يشكل مصل الأرنب الذاتي (AS) (الشكل 3D).
  4. قم بترشيح المصل عبر فلتر غشائي محبب للماء PES بحجم 0.22 ميكرومتر. قم بتصفية المصل في أنابيب معقمة بسعة 0.2 مل وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: تأكد من أن فترة التخزين لا تتجاوز 6 أشهر من وقت التحضير.

6. إجراء الجراحة في الجسم الحي

ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للجنة أخلاقيات أبحاث الحيوانات في المؤسسة المعنية، والامتثال لمبادئ إعلان هلسنكي وبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

  1. التحضير قبل العملية
    ملاحظة: استخدم الأرانب البيضاء النيوزيلندية (≈2 كجم) كنموذج حيواني.
    1. قبل الجراحة، أعط التخدير العام عن طريق الحقن العضلي في فخذ الحيوانات مستخدمين: الكيتامين بجرعة 1 مل/كغ (50 ملغ/مل) وزيلازين بجرعة 0.3 مل/كغ (20 ملغ/مل). تأكد من غياب رد فعل القرنية والقدم قبل المضي قدما.
    2. ضع الحيوان في وضعية ديكوبيتوس جانبي على منصة جراحية معقمة وقم بتعقيم المنطقة المحيطة بالعين بمحلول بوفيدون-يود. ضع منظار جفن على العين الجراحية للحفاظ على تعرض سطح العين المستمر أثناء الإجراء.
  2. استئصال الكيراتيكتومي الأمامي
    1. مركز تريفين فراغي بقطر 6.5 مم على قرنية الأرنب (الشكل 4A). تطبيق الشفط لتثبيت الجهاز وتدوير التريفين لثلاثة أرباع الدوران، محققا عمق تقريبي للعضلات 187 ميكرومتر.
    2. قم بإجراء استئصال القرنية البضروفية الأمامية داخل المنطقة المثقلة باستخدام شفرة هلالية، وإزالة طبقات البسكوتيل الظهارية والأمامية حتى يتم الحصول على سرير جرح أملس (الشكل 4B).
  3. تطبيق الهيدروجيل في الجسم الحي
    1. املأ عيب القرنية ب 50 ميكرولتر من تركيبة الهيدروجيل المقابلة، مسخنة مسبقا إلى 32 درجة مئوية لضمان اللزوجة المثلى (الشكل 4C).
    2. ابدأ الربط المتقاطع في الموقع عن طريق إضاءة سطح القرنية بضوء أزرق (λ= 420–480 نانومتر) لمدة دقيقتين. قدم ست نبضات مدتها 20 ثانية مع 5–10 ثوان توقفات بين النبضات للحد من التسخين المحلي (الشكل 4D).
  4. التارسورافيا الجزئية الجانبية
    1. تحديد ثلث حواف الجفن العلوية والسفلية الأنفية للسماح بالتعرض للوسط للملاحظة والعلاج.
    2. ضع الغرز الأولى (استخدم 1–2 غرز حسب طول الجفن والثبات المطلوب) (الشكل 4E).
      1. أمسك الحافة الجانبية للجفن العلوي باستخدام الملقط. مرر الإبرة عبر الخط الرمادي / هامش الجفن من جانب الجلد إلى جانب الملتحمة، مع أخذ عضة كاملة السماكة مع تجنب الاختراق العميق في صفيحة الرسغ إذا أمكن.
      2. مرر الإبرة عبر النقطة المقابلة في هامش الجفن السفلي من الجانب الملتحمي إلى جانب الجلد لإنشاء ترتيب لحواف الجفن.
      3. اربط الغرز بعقدة جراحية محكمة وعقدتين مربعتين، مع ترك العقدة على سطح الجلد موضوعة قليلا إلى الجانب الخارجي لحافة الجفن بدلا من أن تكون فوقها مباشرة.
      4. ضع غرزة ثانية تقريبا 3–4 مم في الوسط من الأولى إذا كانت هناك حاجة لمزيد من الاستقرار، باستخدام نفس الغرز على شكل حرف U كامل السماكة أو غرزة بسيطة متقطعة.
      5. قم بتقليم ذيل الغرز إلى 3–4 مم لتقليل التهيج، مع ترك طول كاف للإزالة لاحقا.
      6. تأكد من أن تثبيت الجفن يحمي القرنية المعالجة مع السماح بالوصول إلى الملتحمة/القرنية الوسطى والصدغية للفحص والعلاج بالقطرات. تأكد من أن الطرق الطرقي ليس مشدودا بشكل مفرط وأن جفون الحيوان ليست إقفارية (الشكل 4F).
  5. المراقبة والرعاية بعد العملية
    1. أعط البوبرينورفين بجرعة 0.05 ملغ/كغ عن طريق الحقن تحت الجلد قبل استئصال الكيراتيكتور، وكل 12 ساعة لمدة 72 ساعة لتوفير المسكن.
    2. ضع قطرات عين من 3 ملغ/مل توبراميسين مرتين يوميا حتى إغلاق الجرح تماما لمنع العدوى.
    3. ضع قطرة واحدة من الدموع الصناعية بحمض الهيالورونيك (HA) بنسبة 0.2٪ على جميع العيون، بما في ذلك المراقبين، أربع مرات يوميا للحفاظ على ترطيب القرنية.
    4. افحص الحصان التارسورهافي مرتين يوميا على الأقل بحثا عن علامات ارتخاء الغرز، أو العدوى، أو نخر الأنسجة الموضعي، أو توتر غير مبرر. راقب الحيوان بحثا عن السلوك الطبيعي، والتغذية، وعلامات عدم الراحة العينية.
    5. بعد 72 ساعة من الإجراء، اقطع عقدة الغرز واسحب كل غرزة بلطف باستخدام الملقط، مع الحرص على تجنب سحب الملوثات عبر سطح الملتحمة.
    6. افحص حواف الجفن للشفاء السليم وسطح القرنية للتأكد من سلامة الظهارة. استمر في علاج العين حسب الحاجة حتى يتم ملاحظة إغلاق كامل للظهارة.
    7. راقب وسجل شفاء العين والعلامات السريرية من اليوم الثالث حتى اليوم السابع، مع تقييم إغلاق الظهارة، وشفافيتها، وتكوين الأوعية الوعائية الجديدة باستخدام مجهر المصباح المشقوق وتلوين الفلورسين.
      ملاحظة: إذا ظهرت أي علامات على نقص التروية، أو انفصال الجرح، أو تهيج شديد، قم بإزالة الغرز فورا وتعامل مع العملية وفقا لذلك.
  6. تقييم تهيج العين الحاد في درايز
    1. قيد الأرنب بلطف باستخدام منشفة أو لفافة بطانية. افحص القزحية والملتحمة أولا تحت ضوء أبيض.
    2. درجة الاحمرار الملتحمي، والوذمة الكيميائية والإفرازات وفقا لمقياس دريز (انظر الجدولين 1 والجدول 2).
    3. سجل جميع معلمات دريز الستة في ورقة البيانات. احسب مؤشر تهيج العين (OII) كمجموع درجات المكونات؛ يتراوح مؤشر OII من 0 إلى 110، حيث تشير القيم الأعلى إلى تهيج أقوى.
    4. تصنيف كل عين وفقا لفئات كاي-كالاندرا بناء على OII؛ تسجيل الفئة في مجموعة البيانات.
  7. توثيق فوتوغرافي لشفاء الجروح
    1. غرس محلول فلوريسين (5 ميكرولتر) في الكيس الملتحمي السفلي.
    2. أضاء العين بضوء أزرق وقيم عتامة القرنية (الكثافة والمساحة) ومدى تلوين الفلورسين.
    3. ضبط الكاميرا مع ضبط توازن اللون الأبيض يدويا، وتعطيل التكبير البصري، ووضعها على بعد حوالي 3 سم من العين لالتقاط جميع الصور باستخدام نفس المعايير عبر الجلسات. التقط صورا بعد غرس الفلورسين، مع وبدون إضاءة ضوء أزرق لتحديد عيوب الظهارة. التقط الصور في اليوم 0 (قبل الطرقاط الطغية) ويوميا من اليوم الثالث (بعد إزالة الطرقة) حتى إغلاق الظهارة الكاملة.
    4. حلل الصور باستخدام برنامج ImageJ وقم بقياس مساحة المناطق الملونة بالفلورسين.
      ملاحظة: عادة ما يكون التوثيق الفوتوغرافي في اليومين الأول والثاني غير ممكن بسبب الجزئي في الترسرافيا. أشر إلى أن الصور من اليومين الأول والثاني مفقودة من مجموعة البيانات وبلغ عن أي أحداث سلبية (مثل احتكاك القرنية العرضي).
  8. القتل الرحيم وجمع الأنسجة
    1. في اليوم الحادي والعشرين (بعد فترة تقييم كلتا العينين)، قم بتخدير الحيوانات بعمق باستخدام الكيتامين (2 مل/كجم) وزيلازين (0.6 مل/كغ) تحت تأثير العضلات.
    2. القتل الرحيم عن طريق حقن 10 مل من كلوريد البوتاسيوم المشبع (KCl) في وريد الأذن الهامشية.
    3. تأكيد الوفاة عند بداية تيبس الموت وغياب ردود الفعل الحيوية قبل الانتقال إلى جمع الأنسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق وتوصيف الهيدروجيل
تم تصنيع الهيدروجيل وتقييمه في المختبر لتحديد خصائصه الرئولوجية والبصرية قبل وبعد الربط الضوئي المتقاطع العرضي. تم استخدام الريولوجيا القصية لتوصيف اللزوجة، والانحناء، وسلوك التدفق. أظهرت عمليات مسح التردد أن G′ بقي أعلى من G" عبر جميع الترددات المختبرة، مما يشير إلى سلوك شبيه بالصلب (الشكل 5A). كشفت عمليات مسح السعة عند 10 راديادرات ·ثانية⁻1 عن منطقة لزجة خطية واسعة (~100٪ إجهاد) مع معامل تخزين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول الحالي سير عمل قابل للتكرار لتحضير وتحميل وتطبيق هيدروجيل جيلاتين-ريبوفلافين قابل للربط الضوئي لشفاء جروح القرنية. تعد عدة خطوات في المختبر ضرورية لتحقيق جودة هلام متسقة وتستحق التركيز لأنها أكثر مصادر التباين. أولا، الحفاظ على محلول السلف عند 80 درجة مئوية أثناء التحريك يضمن الذوبان الكامل للجيلاتين وفوسفات الريبوفلافين، مما يمنع التجمعات الجسيمية التي تؤثر على وضوح البصر وتجانس الترابط المتقاطع. قبل الترشيح المعقم، يجب إعادة تسخين التركيبة إلى 40 درجة مئوية لضم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة البحثية بمنح من وزارة الصحة في حكومة الباسك (2023111027 و IT524-22). تم دعم C.R.-V. بمنحة من جامعة إقليم الباسك UPV/EHU. يتم تقدير الدعم الفني في رعاية الحيوانات وخدمة المجهر التحليلي والعالي الدقة التي تقدمها SGIker (UPV/EHU) بكل امتنان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأمفوتريسين بGibco (Thermo Fisher Scientific)15290018التركيز النهائي: 1.25 μg/mL
المصل الذاتي، أرنب (AS)معد داخلياً-معد من الدم الكامل؛ تم تصفيته عبر 0.22 μm PES
مصباح العلاج بالليزر أزرقWoodpecker Medical Instrument Coالنموذج LED.Cالطول الموجي: λ=420–480 nm; المسافة: 1–2 cm; خرج الضوء: 850-1000 mW/cm2
البوبرينورفين (Buprecare)Ecuphar578950الجرعة: 0.05 mg/kg، حقنة تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة 72 ساعة
الكاميراPanasonicLUMIX TZ35الكاميرا مجهزة ببصريات Leica
لوحة التسخين مع التقليب الرقمي CimarecThermo Fisher ScientificSP131320-33220-240 V، درجة الحرارة القصوى: 540 °C
شفرة جراحة الهلالBVI Medical373807-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)Gibco (Thermo Fisher Scientific)11966025-
أنبوب Eppendorf (0.2 مل)Merck KGaA30124707يحفظ بارداً لتحضير HAMe؛ التوزيع
أنبوب Eppendorf (5 مل)Merck KGaA30119606يحفظ بارداً لتحضير HAMe؛ التوزيع
محلول الفلوريسين NovartisColorcusi Fluotestمحلول الفلوريسين 2٪، 5 µl قطرات العين
Gibco NeomycinMerck KGaAN1142التركيز النهائي: 50 μg/mL
مسحوق الجيلاتينSigma AldrichG1890يذاب عند 80 °C؛ يتم ضبط درجة الحموضة إلى 7.0
دموع صناعية من حمض الهيالورونيك (0.2٪)Chem.-pharm. Fabrik GmbHHylo-Tear-
برنامج معالجة الصور ImageJالمعهد الوطني للصحة العقلية-تم تطويره بواسطة Wayne Rasband في فرع خدمات البحث
الكيتامين (Ketolar)Pfizer631028.1
الليدوكايينVet OneNDC 13985-222-04موضعي أو حقن تحت الجلد
البنسللين-الستربتومايسينGibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122التركيز النهائي: 50 μg/mL
فلاتر المحقنة PES، 0.22 μm0.22μm (Millex)Merck KGaASLGP033RS-
محلول ملحي فوسفات (PBS)Sigma AldrichP4417-100TAB-
مختلط مثبطات البروتيازSigma AldrichP8340يضاف عند 5 μL لكل mg من الأنسجة
محلول البوفيدون اليودMeda pharma7167204التطهير الجراحي قبل العملية
فوسفات الريبوفلافين (RFP)Sigma AldrichR0630000التركيزات: 0.01٪ w/v (النهائي)؛ 0.02٪ w/v (المخزون)
الموجات فوق الصوتيةBandelein electronicSonoplus GM mini20-
مسبار الموجات فوق الصوتيةBandelein electronicMS 1.5مسبار قطره 1.5 مم، طوله 63 مم.
خيوط ترسورافاي (غير قابلة للامتصاص)Alcon 80653080011–2 خيط حسب الحاجة
محلول عين التوبراميسين (3 مجم/مل)NovartisTobrexالجرعة: مرتين يومياً حتى الإغلاق
مثقب Hessburg-Barron، قطره 6.5 ممJedmed21-8265-
أنابيب جمع الدم Vacutainer مع فاصل جل البوليمرBD (Becton, Dickinson and Company)367704-
محلول الكسيلازينLaboratorios Calier SAXylagesicالجرعة: 5 mg/kg حقنة عضلية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meek, K., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Prog Retin Eye Res. 49, 1-16 (2015).
  2. Akowuah, P. K., Cruz, A. D. L., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An epithelial abrasion model for studying corneal wound healing. J Vis Exp. (178), e63112(2021).
  3. Mobaraki, M., et al. Corneal repair and regeneration: current concepts and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 7, 135(2019).
  4. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: a review article. Med Hypotheses Discov Innov Ophthalmol. 8 (3), 163-176 (2019).
  5. Wilson, S. E., Goshe, J. M. Prevention and treatment of persistent epithelial defects after common refractive surgery procedures. J Refract Surg. 40 (2), 117-124 (2024).
  6. Wirostko, B., Rafii, M. J., Sullivan, D. A., Morelli, J., Ding, J. Novel therapy to treat corneal epithelial defects: a hypothesis with growth hormone. Ocul Surf. 13 (3), 204-212 (2015).
  7. Zernii, E. Y., Baksheeva, V. E., Yani, E. V., Philippov, P. P., Senin, I. I. Therapeutic proteins for treatment of corneal epithelial defects. Curr Med Chem. 26 (3), 517-545 (2019).
  8. Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wu, J., Singh, V., Wilson, S. E. The corneal fibrosis response to epithelial-stromal injury. Exp Eye Res. 142, 110-118 (2016).
  9. Anitua, E., et al. Progress in the use of plasma rich in growth factors in ophthalmology: from ocular surface to ocular fundus. Expert Opin Biol Ther. 22 (1), 31-45 (2021).
  10. Meng, S., et al. A versatile hydrogel with antibacterial and sequential drug-releasing capability for the programmable healing of infectious keratitis. ACS Nano. 17 (23), 24055-24069 (2023).
  11. Rafat, M., et al. Bioengineered corneal tissue for minimally invasive vision restoration in advanced keratoconus in two clinical cohorts. Nat Biotechnol. 41 (1), 70-81 (2023).
  12. Di Girolamo, N. Biologicals and biomaterials for corneal regeneration and vision restoration in limbal stem cell deficiency. Adv Mater. 36 (42), 2401763(2024).
  13. Huang, J., et al. Biologically inspired bioactive hydrogels for scarless corneal repair. Sci Adv. 10 (51), eadt1643(2024).
  14. Brunel, L. G., et al. In situ universal orthogonal network (UNION) bioink deposition for direct delivery of corneal stromal stem cells to corneal wounds. Bioact Mater. 48, 414-430 (2025).
  15. Sani, E. S., et al. Sutureless repair of corneal injuries using naturally derived bioadhesive hydrogels. Sci Adv. 5 (3), eaav1281(2019).
  16. Sharifi, S., et al. Tuning gelatin-based hydrogel towards bioadhesive ocular tissue engineering applications. Bioact Mater. 6 (11), 3947-3961 (2021).
  17. Li, M., et al. A “T.E.S.T.” hydrogel bioadhesive assisted by corneal cross-linking for in situ sutureless corneal repair. Bioact Mater. 25, 333-346 (2023).
  18. Chen, F., Le, P., Fernandes-Cunha, G. M., Heilshorn, S. C., Myung, D. Bioorthogonally crosslinked hyaluronate collagen hydrogel for suture-free corneal defect repair. Biomaterials. 255, 120176(2020).
  19. McTiernan, C. D., et al. LiQD cornea: pro-regeneration collagen mimetics as patches and alternatives to corneal transplantation. Sci Adv. 6 (25), eaba2187(2020).
  20. Feng, L., et al. Thermo-gelling dendronized chitosans as biomimetic scaffolds for corneal tissue engineering. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (41), 49369-49379 (2021).
  21. Tang, Q., et al. Exosomes-loaded thermosensitive hydrogels for corneal epithelium and stroma regeneration. Biomaterials. 280, 121320(2022).
  22. Lee, Y. P., et al. Facile fabrication of superporous and biocompatible hydrogel scaffolds for artificial corneal periphery. Colloids Surf B Biointerfaces. 175, 26-35 (2019).
  23. He, B., et al. 3D printed biomimetic epithelium/stroma bilayer hydrogel implant for corneal regeneration. Bioact Mater. 17, 234-247 (2022).
  24. Fernandes-Cunha, G. M., et al. Supramolecular host-guest hyaluronic acid hydrogels enhance corneal wound healing through dynamic spatiotemporal effects. Ocul Surf. 23, 148-161 (2023).
  25. Wang, Q., et al. Photocurable and temperature-sensitive bioadhesive hydrogels for sutureless sealing of full-thickness corneal wounds. Small Methods. 8 (3), 2300996(2024).
  26. Brar, S., Ganesh, S., Reddy, S. S., Nagesh, B. N., Shahanand, D. A prospective, comparative, clinical study to evaluate the safety and efficacy of two different 0.1% riboflavin solutions used in collagen crosslinking treatment for patients with keratoconus. Clin Ophthalmol. 15, 2607-2617 (2021).
  27. Lee, H. J., Fernandes-Cunha, G. M., Myung, D. In situ-forming hyaluronic acid hydrogel through visible light-induced thiol-ene reaction. React Funct Polym. 131, 29-35 (2018).
  28. Fernandes-Cunha, G. M., Lee, H. J., Kumar, A., Kreymerman, A., Heilshorn, S., et al. Immobilization of growth factors to collagen surfaces using pulsed visible light. Biomacromolecules. 18 (10), 3185-3196 (2017).
  29. Schuldt, C., et al. Dose-dependent collagen cross-linking of rabbit scleral tissue by blue light and riboflavin treatment probed by dynamic shear rheology. Acta Ophthalmol. 93 (5), 328-336 (2015).
  30. Kubo, M., Sonoda, Y., Muramatsu, R., Usui, M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (7), 1539-1546 (2001).
  31. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jiménez-Martínez, M. C. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunol Investig. 40 (2), 183-196 (2011).
  32. Yazdanpanah, G., et al. A light-curable and tunable extracellular matrix hydrogel for in situ suture-free corneal repair. Adv Funct Mater. 32 (24), 2113383(2022).
  33. Niknejad, H., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A. Induction of apoptosis, stimulation of cell-cycle arrest and inhibition of angiogenesis make human amnion-derived cells promising sources for cell therapy of cancer. Cell Tissue Res. 363 (3), 599-608 (2016).
  34. Kakavand, M., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A., Niknejad, H. Blood compatibility of human amniotic membrane compared with heparin-coated ePTFE for vascular tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 11 (6), 1701-1709 (2017).
  35. Basasoro, A., et al. The influence of amniotic membrane proteins on corneal regeneration when delivered directly or using hydrogel platforms. Front Med (Lausanne). 12, 1498319(2025).
  36. Tsubota, K., Goto, E., Shimmura, S., Shimazaki, J. Treatment of persistent corneal epithelial defect by autologous serum application. Ophthalmology. 106 (10), 1984-1989 (1999).
  37. Geerling, G., MacLennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 88 (11), 1467-1474 (2004).
  38. Jeng, B. H., Dupps, W. J. Autologous serum 50% eyedrops in the treatment of persistent corneal epithelial defects. Cornea. 28 (10), 1104-1108 (2009).
  39. Romo-Valera, C., et al. In vitro evaluation of gelatin-based hydrogels as potential fillers for corneal wounds. Biomacromolecules. 26 (6), 3344-3355 (2025).
  40. Romo-Valera, C., et al. Comparison of the regenerative potential of different functionalized gelatin-based hydrogels as fillers of rabbit corneal wounds. Front Med (Lausanne). 12, 1667446(2025).
  41. Wilhelmus, K. R. The Draize eye test. Surv Ophthalmol. 45 (6), 493-515 (2001).
  42. Kay, J., Calandra, J. Interpretation of eye irritation tests. J Soc Cosmet Chem. 13 (6), 281-289 (1962).
  43. Weidinger, A., Poženel, L., Wolbank, S., Banerjee, A. Sub-regional differences of the human amniotic membrane and their potential impact on tissue regeneration application. Front Bioeng Biotechnol. 8, 613804(2021).
  44. Romo-Valera, C., Etxebarria, J., Freire, V., Durán de la Colina, J., Arluzea, J., et al. An in vitro pre-screening model to evaluate the corneal anti-inflammatory effect of human blood-derived products and amniotic membrane extracts incorporated into gelatine-based hydrogels. Experimental eye research. 260, 110617(2025).
  45. Ingraldi, A. L., Audet, R. G., Tabor, A. J. The preparation and clinical efficacy of amnion-derived membranes: a review. J Funct Biomater. 14 (10), 531(2023).
  46. Murri, M. S., et al. Amniotic membrane extract and eye drops: a review of literature and clinical application. Clin Ophthalmol. 12, 1105-1112 (2018).
  47. Shakouri-Motlagh, A., O’Connor, A. J., Kalionis, B., Heath, D. E. Improved ex vivo expansion of mesenchymal stem cells on solubilized acellular fetal membranes. J Biomed Mater Res A. 107 (1), 232-242 (2019).
  48. Acharya, M., Gour, A., Dave, A. Commentary: tarsorrhaphy. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 33-34 (2020).
  49. Dhillon, H., Bahadur, H., Raj, A. A comparative study of tarsorrhaphy and amniotic membrane transplantation in the healing of persistent corneal epithelial defects. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 29-33 (2020).
  50. Maharjan, S. S., Pant, A. R., Joshi, P., Shrestha, P., Sharma, R. Outcomes of fungal corneal ulcer with impending perforation after temporary suture tarsorrhaphy. Nepal J Ophthalmol. 14 (27), 72-81 (2022).
  51. Bamrolia, N. R., Arora, R., Yadava, U. Unusual presentation of a case of Sjogren’s syndrome with neurological and ocular manifestation. Cont Lens Anterior Eye. 35 (2), 85-88 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة