مقالة منهجية

الوسم الأيضي للنسخ الناشئة في تكويث الأجنة المبكر لزينوبوس

DOI:

10.3791/70591

⸱

مارس 27, 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طرقا مفصلة لوضع العلامات الأيضية وتنقية النسخ الناشئة لتحليل النسخ النصية في الأجنة المبكرة لزينوبوس باستخدام 5-إيثينيل-يوريدين (5-EU).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تكوين الجنين المبكر نسخا جديدا للجينات الزيجوتية من الجينوم الزيجوي الخامد في البداية بعد الإخصاب. كان التحدي الرئيسي هو اكتشاف النسخ الجديدة بدقة وتحديد وقت تعبيرها أثناء تنشيط الجينوم الزنجوي (ZGA). هنا، نقدم إجراءات مفصلة لوضع العلامات الأيضية للنسخ الناشئة بواسطة 5-إيثينيل-يوريدين (5-EU) في أجنة Xenopus laevis المبكرة. بعد التخصيب، يتم حقن 5-EU في الأجنة ذات المرحلة الخلوية الواحدة لوضع علامات أيضية على الحمض النووي الريبي الجديد أثناء ZGA. يتم تنقية الحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئ بعد البيوتنيل عبر تفاعلات كيميائية نقرة، ويتم تحديد النسخ الناشئ باستخدام تسلسل الجيل التالي. ومن المهم أن هذه الطريقة تتمتع بحساسية عالية وخصوصية تسمح بتوصيف الجينات ذات التنشيط المنخفض. لذا، يوفر هذا النهج أداة قوية لدراسة ديناميكيات نسخ الجينات خلال التطور المبكر، ويمكن تعميمه على أنظمة أو أنسجة جنينية أخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد الإخصاب، يكون الجنين تحت سيطرة عوامل الأم الترسبة في البويضة، بينما يكون الجينوم الزيجوي صامتا نسخيا لفترة؛ يتم تفعيله لنسخ مئات إلى آلاف الجينات الضرورية للتطور اللاحق، بما في ذلك تحديد مصير الخلية وتكوين الطبقة الجرثومية 1,2,3,4,5,6. هذه الظاهرة المتمثلة في تنشيط الجينوم الزيجوي (ZGA) خلال الانتقال من الأم إلى الزيغوتي (MZT) محفوظة بشكل كبير في جميع أنواع الميتازو، رغم أن توقيت ZGA يختلف بين الأنواع 1,2,3,4,5,6. فهم كيفية تنظيم ZGA ليس مهما فقط لفهمنا للمبادئ الأساسية للتطور المبكر، بل يوفر أيضا إمكانيات لتطوير استراتيجيات جديدة لتشخيص وعلاج اضطرابات النمو وزيادة الصحة الإنجابية.

كان التحدي الرئيسي في دراسة ZGA هو الكشف بدقة عن النسخ الجديدة وتحديد وقت ظهورها أثناء تنشيط الجينوم الزنجوي (ZGA). نظرا لغيمنة نسخ الأم في الأجنةالمبكرة 7، يمكن أن تخفي المستويات العالية من هذه النسخ اكتشاف النسخ الجديدة أثناء ZGA، خصوصا للجينات ذات التنشيط المنخفض، باستخدام RNA-seq التقليدي. لتجاوز هذا التحدي، طورنا طريقة لقياس النسخ الناشئ باستخدام وسم الأيض للنسخ الناشئة باستخدام 5-إيثينيل-يوريدين (5-EU)، تليها البيوتينيل للحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئ عبر كيمياء النقر وتنقيتها للتسلسل (EU-RNA-seq)8,9,10. مقارنة بطرق التحليل النصي الناشئة الأخرى، مثل تلك التي تستخدم 4-ثيوريدين (4sU)11,12، فإن وسم 5-EU محدد جدا عبر كيمياء النقر، ويمكن استخدامه للتصوير والتسلسل، ولا يتطلب تحويلا كيميائيا. علاوة على ذلك، فإن EU-RNA-seq الناشئ حساس للغاية ويكتشف مئات الجينات، ولا يمكن اكتشاف تفعيلها بواسطة RNA-seq الضخم التقليدي8. سمح لنا هذا النهج أيضا بتحديد بداية تنشيط الجينات الزيغوطية الفردية بدقة وتحديد أنماط الزمان المكاني والزماني المميزة ل ZGA خلال بداية تكوين الأجنة8.

نصف هنا الإجراءات التفصيلية لتحضير العينات ل EU-RNA-seq لتحليل ملف النسخ الناشئ باستخدام أجنة Xenopus laevis المبكرة كنموذج. تم تعديل هذا البروتوكول من طريقة سابقة10,13 مع تحسينات طفيفة في الإجراءات، بما في ذلك الحقن الدقيق ل 5-EU في الأجنة ذات المرحلة الواحدة من الخلية، والبيوتينيل لحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئ عبر تفاعل النقر، وتنقيتها للتسلسل (الشكل 1). لضمان قابلية التكرار، اعتمادا على مراحل الأجنة المبكرة ذات الوفرة المتغيرة من النسخ الناشئة، يجب استخدام 1–10 ميكروغرام من إجمالي RNA كمدخل، رغم أنه يمكن استخدام كمية أقل. يمكن تطبيق هذا البروتوكول في أنظمة جنينية أخرى، مثل ذبابة الفاكهة14 وسمك الزرد15، وأنسجة أخرى13. تعد هذه الطريقة أداة قوية لفهمنا لنسخ الجينات والآليات التنظيمية في عمليات بيولوجية مختلفة، بما في ذلك كشف مبادئ جديدة لتكوين الأجنة المبكر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على العمل الحيواني الموضح في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة ساوث كارولينا. يجب أن تلتزم سلامة المختبرات والتخلص من النفايات باللوائح المؤسسية.

1. تحضير الكواشف والمخازن

  1. محلول MMR 20x (محلول مارك المعدل): خلط 100 ملليمول HEPES، 2 ملليمول EDTA، 2 ملليمول NaCl، 40 ملليمول KCl، 20 ملليمول MgCl2، و40 ملليمول CaCl2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 باستخدام NaOH. استخدم الأوتوكلاف ويخزن في درجة حرارة الغرفة.
  2. 3٪ فيكول (بدون حجم)/0.5x MMR: أضف ببطء 1.5 جرام من Ficoll 400 إلى 50 مل من 0.5x MMR مع التحريك بلطف باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي حتى يذوب Ficoll تماما. استخدم جهاز المعقم وأبق على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. محلول 5-إيثينيل يوريدين (5-EU): لصنع محلول 50 ملليمول، أضف 372.8 ميكرولتر من المخزن (لاحظ أن أي مخزن مؤقت متوافق مع الحقن الدقيق يمكن استخدامه، مثل 1x TBS، pH 7.6) إلى قارورة 5 ملغ. اخلط جيدا واصنع 2 ميكرولتر أليكوت. تخزين عند -80 درجة مئوية.

2. حقن دقيق ل 5-EU في أجنة خلية واحدة

  1. للحصول على أجنة زينوبوس ، اتبع البروتوكولات القياسية لإجراء التلقيح الصناعي (IVF) (على سبيل المثال، انظر Sive وآخرون، 2007). يجب أن يكون الجنين في معدل MMR 0.1x، وجاهزا للاستخدام.
  2. أضف 1 مل من 3٪ Ficoll/0.5x MMR إلى غرفة حقن دقيقة مصنوعة من شريحة زجاجية قياسية (25 مم × 75 مم). استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل 20 جنينا (أو أكثر إذا لزم الأمر) إلى مركز غرفة الحقن الدقيقة.
  3. استخدم ملقطا دقيقا لقطع طرف الإبرة الزجاجي الرفيع جدا بعناية والصق الإبرة عموديا (مع توجيه طرفها للأسفل) على طين النمذجة على جدار المقعد. استخدم ماصة P2 مع طرف المكرودر لإضافة 0.5 ميكرولتر من 50 مللي موتر 5-EU من أعلى الإبرة الزجاجية.
  4. قم بتجميع الإبرة على جهاز تحكم دقيق. استخدم ماصة P10 لإضافة 10 ميكرولتر من زيت الهالوكربون على ميكرومتر مرحلة وضعه تحت ميكروسكوب ستيريو.
  5. لمعايرة حجم الحقن، استخدم أولا القدم للضغط على الوسادة على الأرض المرتبطة بالمحقن الدقيق وحقن قطرة في زيت الهالوكربون على الميكرومتر. اعتمادا على حجم القطرة، قم بضبط الضغط ووقت الحقن على الحقن الدقيق لتحديد حجم الحقن ليكون 10 نانولتر، أي 0.27 مم قطر على الميكرومتر.
  6. استخدم ملقطا في يد واحدة للمساعدة في تثبيت الجنين، واستخدم اليد الأخرى لتثبيت المتحكم الدقيق، وحقن 10 نانولتر من 50 ملليمول EU في الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة. التركيز النهائي ل 5-EU في الجنين هو ~0.5 ملليمو.
  7. بعد الحقن الدقيق، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل الأجنة من غرفة الحقن إلى طبق زجاجي جديد يحتوي على 3٪ فيكول/0.5x MMR. احتفظ بالأجنة المحقونة في فيكول لمدة ~1 ساعة.
  8. قم بإزالة محلول Ficoll بعناية واستبدل الوسيط ب MMR 0.1x. احتفظ بالأجنة بمعدل MMR 0.1x حتى الاستخدام الإضافي. راقب تطور الأجنة باستمرار وقم بإزالة أي أجنة غير طبيعية إذا لزم الأمر.
  9. عندما تصل الأجنة إلى مراحل النمو المرغوبة، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل 10 أجنة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 مل. استخدم ماصة P200 لإزالة أي وسط متبقي في الأنبوب بعناية، وقم بتجميد الأجنة في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: لضمان الصلابة والقابلية للتكاثر، اجمع فقط الأجنة الطبيعية بناء على مظهرها مقارنة بالضابطة. إزالة واستبعاد أي أجنة غير طبيعية من التحليل الإضافي. إذا لزم الأمر، اجمع نفس عدد الأجنة بدون حقن دقيق كما هو الحال في حالات الضوابط السلبية.
  10. احتفظ بالأجنة في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

3. قياس استخراج وتركيز الحمض النووي الريبي الكلي

ملاحظة: استخدم مجموعة استخراج RNA كليا تعتمد على غشاء السيليكا لعزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الأجنة المبكرة ومجموعة قياس كمية RNA عالية الحساسية تعتمد على الفلورة لتحديد تركيزات الحمض النووي الريبي. اتبع التعليمات المقدمة من المجموعة، والخطوات التالية معدلة قليلا من الدليل. يجب أن تكون جميع المحاليل والكواشف المستخدمة في الخطوات التالية خالية من RNase.

  1. ضع العينات من الفريزر الذي يحمل -80 درجة مئوية على الثلج.
  2. أضف 700 ميكرولتر من مخزن التخزين المؤقت من مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي في كل أنبوب. استخدم ماصة P1000 لوضع الماصة صعودا وهبوطا لمدة لا تقل عن 15 مرة أو حتى تذوب جميع الأجنة.
  3. احتفظ بالعينات في الثلاجة لمدة 20 دقيقة. اخلط بلطف مرة أخرى عن طريق الحقن صعودا وهبوطا لمدة لا تقل عن 10 مرات لتوحيد الأجنة تماما.
  4. أضف 700 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى الأجنة المتجانسة. قم بعمل المبصنة للأعلى والأسفل لخلط جيد ونقل 700 ميكرولتر من الخليط إلى عمود دوراني.
  5. قم بجهاز الطرد المركزي للعمود عند 10,000 × g لمدة دقيقة واحدة. تخلص من تدفق المرور. كرر عملية الطرد المركزي حتى يكتمل باقي الخليط.
  6. أضف 350 ميكرولتر من مخزن RW1 وقم بطرد مركزي على العمود عند 10,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق المباشر.
  7. أضف بحذر 80 ميكرولتر من DNase I إلى مركز الغشاء في العمود. حضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. أضف 350 ميكرولتر من مخزن RW1 وقم بطرد مركزي على العمود بقوة 10,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق المباشر.
  9. أضف 500 ميكرولتر من RPE المخزن وقم بطرد المركزي على العمود عند 10,000 x g لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق المباشر. كرر عملية الغسل مرة أخرى.
  10. جفف العمود عن طريق الطرد المركزي مرة أخرى عند 10,000 × جرام لمدة دقيقتين.
  11. انقل العمود إلى أنبوب جديد خال من RNase. أضف بحذر 35 ميكرولتر من H2O الخالي من RNase إلى مركز الغشاء في العمود.
  12. قم بجهاز الطرد المركزي للعمود عند 10,000 × g لمدة دقيقة واحدة. اجمع الحمض النووي الريبي المخرج واحتفظ به على الثلج.
  13. لقياس تركيز الحمض النووي الريبي، قم أولا بتحضير المحلول العامل باستخدام مجموعة قياس الحمض النووي الريبي عن طريق تخفيف مادة الصبغة (مادة الحمض النووي الريبي) عند 1:200 في مخزن الحمض النووي الريبي. احسب الحجم الكلي للمحلول العامل اعتمادا على إجمالي عدد المعايير وتحضير 200 ميكرولتر لكل معيار أو عينة.
  14. قم بتركيب شريط 0.2 مل بثمانية أنابيب. لتخفيف كل معيار، أضف 10 ميكرولتر إلى 190 ميكرولتر من محلول العمل. لتخفيف كل عينة، أضف 1 ميكرولتر إلى 199 ميكرولتر من محلول العمل. اخلط جيدا.
  15. ضع شريط ال8 أنابيب في مقياس فلورومتر. اختر اختبار RNA، ومعاير مع المعايير، واقرأ تركيزات العينات.

4. بيوتينيل وتنقية الحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئ

ملاحظة: تستخدم مجموعة التقاط RNA ناشئة تعتمد على الكيمياء النقرة لتحويل وسحب الحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئ. اتبع التعليمات المقدمة من الطقم، ويتم تعديل الخطوات التالية قليلا. يمكن أن تستخدم الحمض النووي الريبي من الأجنة غير المحقونة، وكذلك الحمض النووي الريبي الأوروبي بدون بيوتينيل، كعناصر تحكم خلفية لخصوصية السحب للأسفل.

  1. بيوتينيل الحمض النووي الريبي وتنظيف
    1. لكل عينة، اخلط المكونات التالية في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل لتكوين تفاعل نقر بقوة 50 ميكرولتر: إجمالي RNA (1–10 ميكروغرام)، 1x مخزن EU، 2 ملليمولار CuSO4، 0.25 ملليمول بيوتين أزيد، 10 ملليمول مضاف 1، و12 ململ مضاف 2.
    2. حضن خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على جهاز نوتاتور.
    3. في كل تفاعل أعلاه، أضف 1 ميكرولتر من الجليكوجين، و50 ميكرولتر من أسيتات الأمونيوم 7.5 مولار، و700 ميكرولتر من الإيثانول المبرد بنسبة 100٪. قم بالبيبت لأعلى ولأسفل 5 مرات لخلطها جيدا.
    4. ضع الأنبوب في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية واحتفظ به طوال الليل.
    5. قم بجهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 13,000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أزل الفائق بعناية دون الإزعاج بالحبيبة.
    6. أضف 700 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪ وامزجه بلطف لإعادة تعليق الحبيبة. قم بطرد المركزي بالأنبوب عند 13,000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أزل الفائق بعناية دون الإزعاج بالحبيبة. كرر عملية الغسل مرة أخرى.
    7. جفف الحبيبة بالهواء لمدة 5–10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبة في 10 ميكرولتر من RNase خالي منH2O.
  2. تنقية الحمض النووي الريبي الأوروبي
    1. لسحب الحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئ، لكل عينة، يتم توزيع 5 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المطلية بالستربتافيدين في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل.
    2. أضف 9 ميكرولتر من مخزن الغسيل 2. اخلط جيدا وضع الأنبوب على رف مغناطيسي. اتركه واقفا لمدة دقيقتين. أزل السوبرناتانت. كرر الغسيل مرتين إضافيتين. أعد تعليق الخرزات في 5 ميكرولتر من محلول الغسيل 2.
    3. جهز الخليط الرئيسي التالي في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل (15 ميكرولتر لكل عينة): 12.5 ميكرولتر من مخزن ربط الحمض النووي الريبي (المكون G)، 0.2 ميكرولتر من RNase مخفف 1:10 OUT، و2.3 ميكرولتر من H2 O الخالي من RNase. أضف 15 ميكرولتر من الخليط إلى كل أنبوب يحتوي على عينة RNA.
    4. حضن لمدة 5 دقائق على كتلة حرارية عند 69 درجة مئوية. ضع الأنبوب على الثلج.
    5. أضف 5 ميكرولتر من الخرزات المغسولة مسبقا أعلاه إلى كل أنبوب يحتوي على عينة RNA. حضن لمدة 30 دقيقة على جهاز نوتاتور في درجة حرارة الغرفة.
    6. أضف 50 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1. اخلط جيدا وضع الأنبوب على رف مغناطيسي. اتركه واقفا لمدة دقيقتين. أزل السوبرناتانت. كرر الغسيل أربع مرات أخرى.
      ملاحظة: يمكن جمع المادة الفائقة بعد الغسيل الأول، والتي يفترض أنها تحتوي فقط على نسخ الأم، لقياس نسخ الأم.
    7. أضف 50 ميكرولتر من مخزن الغسيل 2. اخلط جيدا وضع الأنبوب على رف مغناطيسي. اتركه واقفا لمدة دقيقتين. أزل السوبرناتانت. كرر الغسيل أربع مرات أخرى.
    8. أعد تعليق الخرزات في 5 ميكرولتر من محلول الغسيل 2. الخرز، التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئ، جاهزة لتخليق cDNA المباشر وتحضير المكتبة.
      ملاحظة: قبل الانتقال إلى إعداد المكتبة، يمكن تقييم إثراء النسخ الناشئة من خلال قياس تعبير الجينات الفردية المعروفة باستخدام تفاعل السلسلة البوليميراز العكسي (RT-PCR).

5. تحضير وتسلسل مكتبة RNA

  1. استخدم مجموعات متوفرة تجاريا لتحضير مكتبات cDNA واتبع التعليمات المقدمة من المجموعة. استخدم مجموعة NEBNext Library Quant Kit ل Illumina لقياس المكتبات وتجميعها.
  2. قم بتجميع المكتبات وفقا لتعليمات مجموعات التسلسل من الجيل القادم الشائعة. قم بتخفيف المكتبات إلى ~1.8 بيسومول قبل تحميلها في جهاز التسلسل على سطح الطاولة لتحقيق كثافة عنقودية مثلى ~200 كلف/مم2 أثناء التسلسل. تسلسل المكتبات باستخدام تسلسل الجيل القادم الشائع. استخدم تسلسل 75 بت في نهاية مزدوجة ل~20 مليون قراءة لكل عينة.
  3. قم بقياس قراءات النسخ عن طريق محاذاة التسلسلات مع بناء جينوم Xenopus laevis 9.2 باستخدام السلمون17 وإجراء تحليل تعبير جيني تفاضلي باستخدام DESeq218. لعرض القمم في متصفح الجينوم، قم بتعيين التسلسلات إلى الجينوم باستخدام STAR19 وعرضها في عارض الجينوم التكاملي (IGV)19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت معالجة أجنة Xenopus laevis (أربع نسخ بيولوجية) في المراحل من 5 إلى 9 ساعات بعد الإخصاب (hpf) عند 22 درجة مئوية، والتي تغطي المراحل من المرحلة 5 (مع قليل من ZGA واسع النطاق) إلى المرحلة 9 (مع ارتفاع ZGA)، وفقا للبروتوكول أعلاه8. تم استخدام إجمالي الحمض النووي الريبي، والحمض النووي النووي المنقي من الاتحاد الأوروبي، والحمض النووي الريبي التدفق عبر المكتبات لإعداد المكتبات وتم ترتيبها. كما هو موضح في الشكل 2، من خلال مقارنة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا قدمنا بروتوكولا مفصلا لوضع العلامات الأيضية على النسخ الناشئ في بداية تكوين الجنين، بما في ذلك حقن 5-EU في أجنة خلية واحدة، واستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي وقياس تركيزاتها، وتنقية وتنقية الحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئة لتحضير المكتبة والتسلسل (EU-RNA-Seq) (الشكل 1). نظرا للحساسية العالية والخصوصية لهذا النهج مقارنة بإجمالي تسلسل RNA، سمح لنا هذا البروتوكول ليس فقط بتحديد مستوى ووقت بداية النسخ الناشئ بدقة خلال ZGA، بل أيضا باكتشاف أنماط تنشيط مك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف يصرح بعدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مختبر ماثيو جود في جامعة بنسلفانيا على توفير التدريب. وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (R03HD105802).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
> ماكينة PUPM Microinjectionorوورلد بريسيجن إنسترومنتسUPUMPللحقن الدقيق (الحقن الدقيق بالضغط)
5-إثينيل يوريدينثيرمو فيشر العلميE10345للحقن الدقيق (وضع علامات على الخطوط الناشئة)
المجاهر الستيريو ACCU-SCOPE 3075 زوومVWR470351-130للحقن الدقيق (رؤية الأجنة)
أسيتات الأمونيومسيغما-ألدرتشA2706بالنسبة لترسيب الحمض النووي الريبي
حمض الأسكوربيكسيغما-ألدرتشA7506للضغط على رد الفعل
شعيرات زجاج البوروسيليكاتوورلد بريسيجن إنسترومنتسTW100-4للحقن الدقيق (صنع إبر زجاجية)
الطرد المركزيإبندورف5425Rللطرد المركزي
مجموعة التقاط الحمض النووي الريبي الناشئ Click-iTثيرمو فيشر العلميC10365لبيوتنيل وتنقية الحمض النووي الريبي الناشئ
CuSO4سيغما-ألدرتش61230للضغط على رد الفعل
DNase Iروش ديسجنوستيكس4716728001لاستخراج الحمض النووي الريبي
فيكول 400سيغما-ألدرتشGE17-0300-10للحقن الدقيق (حضانة الأجنة)
طبق بتري زجاجي (60 مم)VWR75845-542للتخصيب
الجليكوجينثيرمو فيشر العلميAM9510بالنسبة لترسيب الحمض النووي الريبي
زيت هالوكربون 27سيغما-ألدرتشH8773للحقن الدقيق (معايرة حجم الحقن)
إل-سيستينسيغما-ألدرتش168149لإزالة الأجنة
نصائح المكرولودركاليبر ساينتيفكEPE-5242956003للحقن الدقيق (تحميل 5-EU في إبرة الزجاج)
مجموعة الكم في مكتبة NEBNext للعبة IlluminaNEBE7630لقياس المكتبات
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)إلومينا20024906للتسلسل
فلورومتر كوبي فليكسثيرمو فيشر العلميس33327لقياس تركيز الحمض النووي الريبي
مجموعة ربط الحمض النووي الريبي الكيوبت HSثيرمو فيشر العلميس32852لقياس تركيز الحمض النووي الريبي
مجموعة RNeasy الصغيرةتشياغن74104لاستخراج الحمض النووي الريبي
ميكرومتر المرحلةعلم وارد470175-914للحقن الدقيق (معايرة حجم الحقن)
تسلسل RNA شامل مع NuQuantNuGEN0364للتحضير للمكتبة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, M. T., Bonneau, A. R., Giraldez, A. J. Zygotic genome activation during the maternal-to-zygotic transition. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 581-613 (2014).
  2. Jukam, D., Shariati, S. aM., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  3. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), (2019).
  4. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  5. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  6. Tadros, W., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition: A play in two acts. Development. 136 (18), 3033-3042 (2009).
  7. Schier, A. F. The maternal-zygotic transition: Death and birth of rnas. Science. 316 (5823), 406-407 (2007).
  8. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  9. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  10. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  11. Heyn, P., et al. The earliest transcribed zygotic genes are short, newly exmaved, and different across species. Cell Rep. 6 (2), 285-292 (2014).
  12. Bhat, P., et al. Slamseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis. Cell Rep. 42 (2), 112070(2023).
  13. Palozola, K. C., Donahue, G., Zaret, K. S. Eu-rna-seq for in vivo labeling and high throughput sequencing of nascent transcripts. STAR Protoc. 2 (3), 100651(2021).
  14. Kwasnieski, J. C., Orr-Weaver, T. L., Bartel, D. P. Early genome activation in drosophila is extensive with an initial tendency for aborted transcripts and retained introns. Genome Res. 29 (7), 1188-1197 (2019).
  15. Chan, S. H., et al. Brd4 and p300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. , (2007).
  17. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  18. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  19. Dobin, A., et al. Ultrafast universal rna-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  20. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  21. Ma, S., Hong, Y., Chen, J., Xu, J., Shen, X. Single-cell nascent transcription reveals sparse genome usage and plasticity. Cell. 188 (24), 6873-6891.e23 (2025).
  22. Battich, N., et al. Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mrna turnover strategies. Science. 367 (6482), 1151-1156 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus 5

مقالات ذات صلة