مقالة منهجية

بروتوكول موحد لتحفيز الشيخوخة المبكرة الناتجة عن الإجهاد في الخلايا الميلانوسكستية البشرية الأولية باستخدام بيروكسيد تيرت-بيوتيل

DOI:

10.3791/70595

⸱

مايو 29, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biomedical Aging Research, Universität Innsbruck, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), 3European Innovation Center, Proya Europe

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول موحد لتحفيز الشيخوخة المبكرة في HNM باستخدام tBHP، وبروتوكولات موحدة لتحليل مؤشرات الشيخوخة الرئيسية، بما في ذلك توقف النمو، ونشاط SA-β-galactosidase، وعوامل SASP.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الضغوط البيئية، بما في ذلك الأشعة فوق البنفسجية، وتلوث الهواء، أو دخان السجائر، تدفع الشيخوخة الخارجية للجلد. التعرض لهذه العوامل الخارجية للشيخوخة يعزز تراكم الخلايا الشيخولة، مما يساهم في تكوين التجاعيد واضطرابات التصبغ. الخلايا الميلانوسيا، التي توفر الحماية الأولية من الأشعة فوق البنفسجية، تظهر نشاطا أقل مع التقدم في العمر. تتراكم الخلايا الميلانوزيتية المتقدمة في الجلد القديم وتساهم في مظهرها المتقدم؛ ومع ذلك، هناك عدد قليل من النماذج لدراسة شيخوخة الخلايا الميلانوية، ويهدف هذا العمل إلى تطوير نموذج قابل للتكرار لمزيد من البحث. في هذه الدراسة، نقدم نموذج الشيخوخة لخلايا الميلانوسكوس الوليدية البشرية (HNM) باستخدام تيرت-بيوتيل هيدروكسيد (tBHP)، وهو محفز إجهاد تأكسدي مميز جيدا. يقوم tBHP بتعطل توازن الأكسدة والاختزاز عن طريق استنزاف الدفاعات المضادة للأكسدة الخلوية وتعزيز الإنتاج المفرط للجذور، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي والبروتين. نقوم بتوصيف النمط الظاهري للشيخوخة للخلايا الصبغية المعالجة ب tBHP من خلال تحليل علامات الشيخوخة المثبتة، بما في ذلك محدودية جهد النمو، والتغيرات الشكلية ونشاط SA-β-Galactosidase. يوفر هذا النموذج أداة قيمة للتحقيق في الشيخوخة المبكرة الناتجة عن الإجهاد في الخلايا الصبغية، مما يوفر رؤى حول دورها في شيخوخة الجلد الخارجية واضطرابات التصبغ.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون شيخوخة الجلد من عاملين مميزين: الشيخوخة الداخلية والخارجية1،2. الشيخوخة الداخلية ناتجة عن عمليات زمنية طبيعية وعوامل وراثية، بينما ينتج الشيخوخة الخارجية عن التعرض التراكمي للضغوط البيئية، خاصة الأشعة فوق البنفسجية، وأيضا تلوث الهواء ودخان السجائر والعوامل الكيميائية التي تسرع عملية الشيخوخة إلى ما يتجاوز المعدلات الزمنية الطبيعية 3,4. التعرض البيئي يولد إجهادا تأكسديا يطغى على الدفاعات المضادة للأكسدة الخلوية، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي، وأكسدة البروتينات، وتأكسدة الدهون. هذه التغيرات الجزيئية تحفز استجابات تلف مستمرة في الحمض النووي وخلل في الخلايا، مما يؤدي في النهاية إلى تعزيز الشيخوخة المبكرة 5,6. يساهم هذا الشيخوختة الناتجة عن التوتر في الخصائص السريرية للجلد المتقدم، بما في ذلك التجاعيد، وعدم تساوي التصبغ، وانخفاض المرونة، وضعف وظيفة الحاجز7.

تعيش الخلايا الميلانوزي داخل البشرة القاعدية وتعمل كدفاع أساسي للجلد ضد الضرر الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية عن طريق تصنيع الميلانين ونقله إلى الخلايا الكيراتينية المحيطة. ومن المفارقات أن هذا الدور الوقائي يجعلها عرضة بشكل خاص للإجهاد التأكسدي والشيخوخة المبكرة خلال الشيخوخة الخارجية 8,9. تنتج عملية الميلانوجين نفسها أنواعا كبيرة من الأكسجين التفاعلي كنواتج ثانوية لتفاعلات متأثرة بالتيروزيناز، مما يخلق عبئا تأكسديا متأصلا يتضاعف أكثر بسبب التعرضات البيئية مثل الأشعة فوق البنفسجية والتلوث10،11. نتيجة لذلك، يمكن أن يسبب الإجهاد البيئي المزمن أضرارا تأكسدية، خللا في وظيفة الميتوكوندريا، وفي النهاية شيخوخة الخلية12. على الرغم من أهميتها، لا تزال هناك أسئلة رئيسية حول المسارات الجزيئية التي تحكم شيخوخة الخلايا الميلانوسيابية وكيف يبدأ الإجهاد التأكسدي هذه العملية. علاوة على ذلك، لا يزال تأثير الخلايا الميلانوسينية المسنونة على البيئة الدقيقة المحيطة بالجلد كعامل لتغيرات الجلد المرتبطة بالعمر، خاصة من خلال إفراز عوامل SASP، غير مفهوم بشكل كاف13,14.

على الرغم من أن الخلايا الميلانوسي حساسة بشكل خاص للشيخوخة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي، إلا أن النماذج التجريبية لدراسة هذه العملية لا تزال محدودة15,16. تستمر معظم أبحاث الشيخوخة في الاعتماد على نماذج الشيخوخة المكررة أو الناتجة عن الإجهاد في الأرومات الليفية، لكن هذه الأساليب لا تلتقط البيولوجيا المميزة للخلايا الميلانوسي أو قدرتها على التأثير على شيخوخة الجلد من خلال التداخل مع الخلايا المجاورة وملف SASP الخاص بها17. تسلط هذه الفجوة الضوء على الحاجة إلى نماذج شيخوخة خاصة بالخلايا الصبغية تعكس بشكل أدق استجاباتها الفسيولوجيةللضغوط البيئية ومساهمتها في شيخوخة جلد الإنسان.

على الرغم من توفر طرق الشيخوخة الناتجة عن الإجهاد، إلا أن تطبيقها في الخلايا الصبغية البشرية الأولية لا يزال تحديا تقنيا وغالبا ما يرتبط بتغيرات كبيرة. الخلايا الصبغية حساسة بشكل خاص للإجهاد التأكسدي، مما يؤدي إلى نافذة تجريبية ضيقة بين الحث الفعال للشيخوخة والسمية الزائدة للخلايا. بالإضافة إلى ذلك، تساهم الفروق المعتمدة على المتبرع في تحضيرات الخلايا الأولية في نتائج غير متسقة عبر الدراسات. غالبا ما يتم الإبلاغ عن هذه التحديات بشكل كاف، وغالبا ما تكون البروتوكولات غير موحدة بما فيه الكفاية، مما يحد من قابلية التكرار. يعالج البروتوكول الحالي هذه الفجوة من خلال توفير نظام علاج محسن وقابل للتكرار، وجدول جرعات محدد، وقراءات موحدة لتحفيز وتقييم موثوق للشيخوخة في الخلايا الميلانوسكوسية البشرية الأولية.

يعد تيرت-بيوتيل هيدروبروكسيد (tBHP) محفزا موصقا جيدا للإجهاد التأكسدي يعزز الشيخوخة من خلال توليد أنواع الأكسجين التفاعلية واستنزاف الدفاعات المضادة للأكسدة الخلوية. وقد استخدم على نطاق واسع لتحفيز الشيخوخة في الخلايا الليفية الجلدية، حيث يحفز علامات الشيخوخة المميزة مع الحفاظ على بقاء الخلايا20,21. نظرا لأن tBHP ينتج إجهادا تأكسديا مستمرا عبر مسارات كيميائية حيوية محددة، فإنه يوفر نظاما قابلا للتكرار وسهل الوصول لدراسة الشيخوخة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي ودراسة الآليات الجزيئية التي تربط الضرر التأكسدي بعمليات الشيخوخة22،23. على عكس النماذج المعتمدة على الأشعة فوق البنفسجية، يكون tBHP ميزة خاصة عندما يكون هناك حاجة إلى تحفيز إجهاد تأكسدي متحكم به وقابل للتكرار، بغض النظر عن معايير الإشعاع ودون الحاجة إلى معدات متخصصة.

توفر HNM نموذجا ذا صلة لدراسة آليات الشيخوخة الخارجية24. كونها خلايا أولية مشتقة من القلفة، تحتفظ بمسارات استجابة الإجهاد ومتماسكة وتتجنب الآثار المرتبطة بالتعديل الجيني أو الخلد25. توفر الخلايا الميلانوسينية حديثة الولادة نموذجا تجريبيا مثاليا لأنها تظهر ضررا أساسيا بسيطا، مما يتيح تقييما واضحا لمسارات الشيخوخة الناتجة عن الضغوط البيئية26,27.

تستخدم هذه الدراسة الإجهاد التأكسدي الناجم عن tBHP في الخلايا الميلانوسكية الوليدية البشرية الأولية، متغلبة على قيود نماذج الخلايا غير الميلانوسيتية والخالدة المستخدمة عادة في أبحاث الشيخوخة. يوفر منصة موحدة لفحص آليات الشيخوخة الخاصة بالخلايا الميلانوسيابية وتوصيف النمط الظاهري المسن بعلامات محددة. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول نموذجا قابلا للتكرار وذو صلة فسيولوجية لدراسة الشيخوخة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي في الخلايا الميلانوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحسين هذا البروتوكول للأبحاث على الخلايا الميلانوسينية الوليدية الأولية في الإنسان (HNM) لدراسة آليات الشيخوخة المبكرة الناتجة عن التوتر الناتج عن tBHP (الشكل 1). تم اشتقاق الخلايا الميلانوزي من قلفة القوقاز الوليدية (النمط الضوئي بصبغة خفيفة) وتم الحصول عليها من مصدر تجاري. وفقا لوثائق المورد، يتم جمع الأنسجة البشرية من متبرعين مطلعين بالكامل وقدموا الموافقة، وفقا للأطر الأخلاقية والقانونية المعتمدة، بما في ذلك إعلان هلسنكي واللوائح المعمول بها لحماية البيانات. تم توفير الخلايا بشكل غير محدد الهوية. لم تكن هناك حاجة لموافقة أخلاقية إضافية لاستخدامها في هذه الدراسة. أجريت جميع التجارب باستخدام نفس خط الخلايا الصبغية لضمان التناسق. لاحظ أنه عند استخدام خطوط خلايا أولية مختلفة، قد تحتاج ظروف الزراعة، بالإضافة إلى التركيزات وإجراءات التعامل، إلى تعديل إضافي.

1. التحضيرات

ملاحظة: لبدء علاج tBHP، يجب إذابة الخلايا الميلانوينية قبل ثلاثة أيام على الأقل للسماح بالتعافي والتلاقط بشكل كاف. تستمر مرحلة المعالجة 4 أيام، مع تخصيص يوم الزراعة كيوم 0. تفاصيل جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مذكورة في جدول المواد.

  1. لتحضير وسط الزراعة، اجمع وسط الخلية الصبغية مع عوامل النمو المقابلة. اشتعل غطاء كل قارورة قبل إضافة محتوياتها إلى الوسط لتقليل التلوث. أضف 1٪ (v/v) PenStrep إلى الوسط المحضر وخزنه عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. قبل البذر، حضر محلول مثبط التربسين عن طريق تخفيف مثبط التربسين من فول الصويا في DPBS. قم بترشيح المحلول عبر غشاء بحجم 0.22 ميكرومتر، مع زيادة السعر، وخزنها عند −20 درجة مئوية. بعد إذابته، يمكن استخدامه لمدة تصل إلى 10 أيام.

2. ذوبان الخلايا (اليوم -3)

تحذير: يجب اعتبار جميع المواد التي تلامس الخلايا البشرية ملوثة بيولوجيا والتخلص منها وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية. لتقييم الشيخوخة، نستخدم اختبارات تكميلية تقيم توقف النمو، ونشاط SA-β-gal، ومؤشرات جزيئية إضافية. هنا، نقدم بروتوكولات هذه الاختبارات والنتائج المتوقعة عند العمل مع مؤشرات الشيخوخة هذه.

  1. بيبت 20 مل من محلول محلول الفوسفات من دولبيكو (درجة زراعة الخلايا) إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل في درجة حرارة الغرفة. حافظ على الخلايا التي تحتوي على القارورة على الثلج حتى تذوبها.
  2. اشتعل الغطاء قبل فتح القارورة التي تحتوي على الخلايا، ثم فك البراغي، ثم أشعل الجوانب مرة أخرى لمنع التلوث المحتمل.
  3. انقل 500 ميكرولتر من DPBS إلى القارورة التي تحتوي على الخلايا. قم بإذابة الخلايا بلطف عن طريق التوصيل بأنابيب صعودا وهبوطا، ثم انقل كل المحتويات إلى الأنبوب.
  4. الطرد المركزي عند 100 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تبدو الحبيبات الناتجة بلون بيج إلى بني (أو أغمق، حسب عرق المتبرع).
  5. جهز قارورة T75 تحتوي على 14 مل من وسط الخلايا الميلانوسياتيكية.
  6. اشعل ماصة باستور زجاجية (اشتعل في كل مرة عند التعامل مع الخلايا الميلانوسياتيكية)، استنشق DPBS بحذر، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المتوسط.
  7. انقله إلى القارورة المعدة مسبقا.
  8. حضانه عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂، وراقب يوميا تحت المجهر. غير المتوسط على الأقل كل 48 ساعة.
    ملاحظة: تحتوي كل قارورة محجوزة بالتجميد على حوالي 1 × 106 خلايا ميلانوسي بشرية أولية. أجريت جميع التجارب باستخدام الخلايا في المقطع 9.

3. بذر الخلايا (اليوم 0)

  1. تأكد من التقاء 80–90٪ من الخلايا في يوم البذر.
  2. استنشق الوسط من القارورة واغسل مرتين باستخدام DPBS.
  3. فصل الخلايا بإضافة 2 مل من محلول التربسين-إيدتا والاحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  4. انقر بلطف على القارورة وراقب تحت المجهر لتأكيد انفصال الخلايا الكامل (احتضن لفترة أطول إذا لزم الأمر).
  5. أوقف التفاعل بإضافة 1.5 ضعف حجم مثبط التريبسين.
  6. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وتخفيفه باستخدام DPBS إلى حجم نهائي يبلغ 10 مل.
  7. قم بعمل نظام الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 100 × جرام لمدة 5 دقائق.
  8. استنشق الفائق وأعد تعليقه إلى الحجم المطلوب في المتوسط.
  9. بالنسبة للأطباق المعالجة ب tBHP، قم بزراعة 6 × 10إلى 5 خلايا لكل طبق بحجم 10 سم. بالنسبة لألواح التحكم، قم بزرع 4 × 10إلى 5 خلايا لكل طبق.
    ملاحظة: بالنسبة للألواح المعالجة ب tBHP، قم بزرع كثافة خلوية أعلى لضمان توفر عدد كاف من الخلايا للتجارب، حيث سينخفض معدل نموها تدريجيا أثناء المعالجة. إذا تم زرع الخلايا على الألواح المغلفة لتجارب المجهر، يجب تغطية الغطاء ب 0.1 ملغ/مل بولي-دي-ليسين وتجفيفها بالكامل قبل البذر.
  10. حضن الحوض طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. غير المتوسط كل 48 ساعة للوحات التحكم.

4. علاج TBHP (اليوم 1–4)

  1. جهز محلول عمل بسعة 10 مللي موتر من مخزون tBHP (مخفف في DPBS أو الوسط).
    ملاحظة: tBHP حساس للضوء: غط الحاوية عند العمل بها. يمكن استخدام محلول العمل لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند تخزينه بشكل صحيح عند 4 درجات مئوية. جدول العلاج: اليوم الأول (اليوم التالي للبذر) يمثل بداية التعرض لالتهاب الجلد العصبي (tBHP). تعالج الخلايا الميلانوزيتية مرتين يوميا بفاصل لا يقل عن 4 ساعات بين التطبيقات. يتكرر هذا النظام من اليوم الأول حتى اليوم الرابع، ليصبح المجموع 4 أيام من العلاج. تم تعديل تركيز tBHP المختار وجدول العلاج من أبحاث سابقة في الخلايا الليفية الجلدية، حيث كانت التركيزات المنخفضة كافية لتحفيز الشيخوخة. أما في الخلايا الصبغية الأولية، فقد كانت هناك حاجة إلى تركيزات أعلى لتحقيق تحفيز شيخوخة قوي، وتم تحديد 100 ميكرومولار tBHP كأمثل بناء على تجارب المعايرة التي توازن بين تحفيز الشيخوخة وحيوية الخلية
  2. أضف 100 ميكرومولار tBHP إلى الخلايا لمدة ساعة واحدة لكل معالجة (للبدء، أضف الحجم المناسب من محلول العمل، مع التأكد من استخدام الماصة في وسط سائل).
  3. حرك اللوحة ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر لتوزيع القوة الحصانية بشكل متساو على الوسط.
    ملاحظة: تجنب الحركات الدائرية لأنها قد تسبب توزيعا غير متساو لقوة الضغط السريع عبر الوسط.
  4. حضن لمدة ساعة واحدة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  5. لإنهاء علاج tBHP، استنشق الوسط.
  6. غسل الألواح مرتين باستخدام DPBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
  7. أضف الحجم المناسب من الوسط الطازج إلى الأطباق.
  8. اترك الخلايا تتعافى في الحاضنة لمدة لا تقل عن 4 ساعات قبل بدء العلاج التالي.
  9. كرر هذا الإجراء في نفس اليوم للعلاج الثاني واستمر في الأيام المتبقية. حافظ على الخلايا في الزراعة بعد الانتهاء من العلاج حتى اليوم التاسع لتقييم علامات الشيخوخة.
  10. راقب ألواح التحكم والممرات إذا كانت متقاطعة.

5. تحليل منحنى النمو

  1. عد الخلايا المعالجة ب tBHP وعناصر التحكم وفقا لبروتوكول البذر.
  2. أعد زرع نفس الكثافة الأولية أو جميع الخلايا في حال عدت أقل من 6 × 10 أو5 خلايا لألواح tBHP.
  3. قم بإجراء عد الخلايا في الأيام 4 و9 و15 من الزراعة.
  4. احسب منحنى النمو باستخدام الصيغة التالية:
    LG (العد) - log (seed) / 0.301 + cPDL
    العد: عدد الخلايا التي تم الحصول عليها في نهاية المقطع.
    البذرة: عدد الخلايا التي تم تغطيتها في بداية الممر.
    cPDL: مستوى تضاعف السكان التراكمي تم نقله من المقاطع السابقة.

6. نشاط SA-β-جالاكتوسيدازيد

  1. في اليوم التاسع، اغسل الخلايا مرتين في PBS قبل التثبيت ب 2٪ فورمالديهايد و0.4٪ جلوتارالديهايد.
  2. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.
  3. حضن الخلايا الثابتة بمحلول صبغ بدرجة حموضة 6.0 (150 ملليمولار NaCl، 2 ملليمولار MgCl، 5 ملليمولايد فيريسيانيد البوتاسيوم، 5 ملليمولار فيروسيانيد البوتاسيوم، 40 ملليمول حمض الستريك، 12 ملليمول فوسفات الصوديوم، و1 ملغ/ملليتر 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-دي-جالاكتوزيد (X-جال).
  4. بعد 18 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية وغياب ثاني أكسيد الكربون، غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.
  5. صورة باستخدام المجهر الضوئي.
  6. قم بقياس عدد الخلايا الملونة بالزرقاء تحت المجهر عن طريق عد عدد الخلايا الزرقاء وقسمها على إجمالي عدد الخلايا في الحقل. عبر عن النتائج كنسبة مئوية للخلايا الإيجابية.

7. التلوين بفلورة مناعة

تحذير: يجب التعامل مع النفايات التي تحتوي على الفورمالدهيد، والجلوتارالديهايد، والنفايات التي تحتوي على بارافورمالديهايد، كنفايات كيميائية خطرة والتخلص منها وفقا للوائح السلامة المؤسسية.

  1. استخدم خلايا مزروعة على أغطية مغطاة مسبقا ب 0.1 ملغ/مل بولي-دي-ليسين.
  2. في اليوم التاسع، اغسل الخلايا مرتين، ثم ثبته ب 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة.
  3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.
  4. النفاذ باستخدام 0.3٪ تريتون-إكس و0.1٪ سترات الصوديوم في PBS.
  5. قم بكتلة مع 1٪ BSA في PBS-T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. حضن الخلايا التي تحتوي على الجسم المضاد الأساسي γH2AX لاكتشاف استجابة تلف الحمض النووي الدائمة خلال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
  7. في اليوم التالي، اغسلي مرتين باستخدام PBS.
  8. ضع جسما مضادا ثانويا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  9. قم بتلوين النوى باستخدام DAPI إذا رغبت.
  10. اغسله مرتين ب PBS-T، تليها غسلتين ب PBS ومرتين ب ddH2O.
  11. ركبوا أغطية الغطاء واتركوها تجف تماما قبل التصوير.
  12. تحليل متوسط شدة الفلورة و/أو تركيزات γH2AX باستخدام برنامج ImageJ.

8. عزل الحمض النووي الريبي وRT-qPCR

تحذير: β-ميركابتوإيثانول سام للغاية ويجب التعامل معه في غطاء بخاري. يجب التخلص من النفايات التي تحتوي على β-ميركابتوإيثانول كنفايات كيميائية خطرة.

  1. في اليوم التاسع، قم بتريبسين الخلايا باستخدام 2 مل من تريبسين-إيدتا.
  2. أوقف التفاعل بتطبيق كمية 1.5 ضعف مثبط التربسين.
  3. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 100 × g لمدة 5 دقائق.
  4. استنشق السوبرناتانت بحذر.
  5. حبيبات خلايا ليز عن طريق إعادة تعليقها في مخزن RLT بسعة 350 ميكرولتر يحتوي على 1٪ β ميركابتوإيثانول.
  6. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية RNA تعتمد على الأعمدة.
  7. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طياف (260 نانومتر).
  8. لتخليق cDNA، استخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 10 ميكرولتر باستخدام مزيج نسخ عكسي قياسي (بما في ذلك مخزن RT، وdNTPs، وبادئات عشوائية، ونسخ عكسي، ومثبط RNase) يليه ظروف دورة حرارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  9. إجراء RT-qPCR لعوامل SASP
    ملاحظة: عوامل SASP المختارة (IL-8، IL-6، وMMP-1) تمثل مكونات مثبتة جيدا لنمط الإفرازات المرتبط بالشيخوخة وتم اختيارها بناء على أهميتها ببيولوجيا الجلد، بما في ذلك الإشارات الالتهابية وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية
    IL-6 (دفع أمامي: 5' AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA 3' Rev: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
    IL-8 (مهاجم: 5' ACCGGAAGGAACCATCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCACCTCACACCACAG 3')
    MMP-1 (الدفع الأمامي: 5' CATCGTGTGGCAGCTCATGA 3' التوالي: 5' ATGGGCTGGACAGGATTTG 3')
    GAPDH (دفع أمامي: 5' GAGTCAACGGATGGGTGTGTGT 3' Rev: 5' GATCTCGCTCTGGAAGATG 3')
  10. تحليل التعبير النسبي لل mRNA باستخدام طريقة ΔΔCt مع تطبيع جين التدبير المنزلي GAPDH.

9. عزل البروتين ونقطة الغرب

  1. في اليوم التاسع، اجمع ليزاتات البروتين.
  2. استنشق وسط واغسل الألواح مرتين باستخدام DPBS البارد.
  3. تستخدم خلايا التحليل ميكانيكيا مكشطة خلايا بعد إضافة 150 ميكرولتر من مخزن RIPA (50 ملليموتر تريس-HCl، درجة حموضة 7.4، 150 ملليمولار NaCl، 1٪ NP-40، 0.5٪ دي أوكسيكولات الصوديوم، 0.1٪ SDS، و2 مللي مولار EDTA) مع إضافة مثبطات للبروتياز وتنقل إلى أنبوب بسعة 1.5 مل.
  4. قم بثلاث دورات من التجمد والذوبان تليها حضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  5. جهاز طرد مركزي عند 9600 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. تحديد تركيز البروتين في المادة الفائقة باستخدام اختبار BCA.
  7. افصل كميات متساوية (20 ميكروغرام) من البروتين على هلام بولي أكريلاميد ونقلها إلى أغشية PVDF المنشطة.
  8. حجب الأغشية في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ في TBS-T.
  9. احتضن الأجسام المضادة الأولية pRB و LaminB1 طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  10. في اليوم التالي، اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBS-T.
  11. حضن الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المتوافقة مع HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  12. اكتشاف البروتينات عن طريق الإضاءة الكيميائية وإجراء تحليل كثافة القياس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علاج tBHP يحفز توقف النمو في الخلايا الميلانوسينية الوليدية البشرية.
علاج tBHP يثبط تكاثر الخلايا الميلانوية مقارنة بالضوابط غير المعالجين (n = 3) (الشكل 2A). بحلول اليوم التاسع، تصل الخلايا المعالجة إلى 1.4 cPDL فقط، بينما تصل نسبة التحكم إلى 3.1 cPDL. يزداد هذا التباعد مع مرور الوقت، حيث تقترب الخلايا الميلانوسي المعالجة من هضبة 1.9 cPDL بحلول اليوم 15، بينما تستمر الضوابط في التوسع إلى ما يقرب من 5.1 cPDL. الانخفاض المستمر في القدرة عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يضع هذا البروتوكول نهجا موحدا لتحفيز الشيخوخة المبكرة الناتجة عن الإجهاد (SIPS) في الخلايا الميلانوسينية الوليدية البشرية باستخدام tBHP، مقدما نموذجا قويا لدراسة الشيخوخة تحديدا في هذا النوع من الخلايا. تدعم التغيرات المستمرة في التكاثر، والشكل، ونشاط SA-β-gal، وعلامات تلف الحمض النووي، ومكونات SASP النمط الظاهري المستحث. من خلال التركيز على الخلايا الميلانوسياسية، وهي الخلايا التي لا تزال غير مدروسة في أبحاث الشيخوختة رغم أدوارها الرئيسية في فسيولوجيا الجلد واضطرابات التصبغ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة. ليف ديكيرك مرتبط ببرويا أوروبا؛ ومع ذلك، لم يكن للشركة أي تأثير على تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها أو قرار نشرها. ويصرح المؤلفون أيضا أن أدوات الذكاء الاصطناعي (AI) استخدمت فقط للمساعدة في تحرير اللغة وتحسين النصوص. تم تطوير والتحقق من صحة جميع المحتوى العلمي، وتصميم التجارب، وتفسير البيانات من قبل المؤلفين.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة Tiroler Wissenschaftsfonds (ZAP746010، F.33287/10-2021، F.50279/7-2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 µm membrane filterMerck SLGVR33RS
1 M citric acid Merck K91567844تحضير في aq. dest.
1 M MgCl2MerckA649033تحضير في aq. dest.
1 M Na2HPO4MerckK56036736تحضير في aq. dest.
10 M NaOHLab Honeywell30620تحضير في aq. dest.
37% formaldehydeSigma252549
4% paraformaldehydeCarlRoth0335.3
5 M Sodium Chloride SigmaS3014تحضير في aq. dest.
50% glutaraldehydeSigmaG6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)SigmaB9146
Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mLInvitrogenA11008
BSA (bovine serum albumin)SigmaA7030
Chemiluminescent substrateSigmaWBKLS0500
Costar CellLifter Corning3008
Coverslips for cell culture/microscopyEprediaCB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal MediumCellSystemsLM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit CellSystemsLS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline SigmaD8537
Human neonatal melanocytesCellSystemsFC-0023
LaminB1 antibody (rabbit)AbcamAB16048تخفيف 1:1000 في 5% BSA
Mounting medium containing DAPIAbcamAB104139
Penicillin-Streptomycin solution SigmaP4333
Polyacrylamide gradient gelsBio-Rad456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL GibcoA38904-01
Potassium ferricyanideSigmaP8131
Potassium ferrocyanideSigmaP-9387
pRB antibody (rabbit)CellSignalling93085تخفيف 1:1000 في 5% BSA
Protease inhibitor cocktailself preparedN/A500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate
RIPA buffer self preparedN/Aمحتوي على: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT bufferQiagen1015762متضمن في RNeasy Mini Kit 
RNeasy Mini KitQiagen74106
Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)Sigma70166
Sodium citrate (for 0.1% solution)SigmaS4641
Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL Thermofisher17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)Sigma458139
Triton X-100 (for 0.3% solution)SigmaT9284
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
β-mercaptoethanolCarlRoth4227.3
γH2AX antibody (rabbit)CellSignalling2577Sتخفيف 1:200 

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight. J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).
  2. Dorf, N., Maciejczyk, M. Skin senescence-from basic research to clinical practice. Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).
  3. Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model. Sci Rep. 13, 17969 (2023).
  4. Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).
  5. Zhang, S., Duan, E. Fighting against skin aging: the way from bench to bedside. Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).
  6. Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review. Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).
  7. Addor, F. A. S. Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging. Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).
  8. Mucha, M., Skrzydlewska, E., Gęgotek, A. Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes. Commun Biol. 8, 1283 (2025).
  9. Hughes, B. K., Bishop, C. L. Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing. Biomedicines. 10, 3111 (2022).
  10. Kamiński, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development. Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).
  11. Jiménez-Cervantes, C., Martínez-Esparza, M., Pérez, C., et al. Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor. J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).
  12. Dańczak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Polańska, A., et al. Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents. Aging Cell. 22, e13845 (2023).
  13. Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis. Bioessays. 46, e2400135 (2024).
  14. Ali, L., Al Niaimi, F. Pathogenesis of melasma explained. Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).
  15. Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing. Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).
  16. Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
  17. Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts. Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).
  18. Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro. Cells. 11, 1489 (2022).
  19. Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation. Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).
  20. Kučera, O., Endlicher, R., Roušar, T., et al. The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro. Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).
  21. Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging. Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).
  22. Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD. Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).
  23. Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research. Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).
  24. Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142, 620-632 (2015).
  25. Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. Isolation, culture, and transfection of melanocytes. Curr Protoc. 3, e774 (2023).
  26. Martic, I., Wedel, S., Jansen-Dürr, P., et al. A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes. Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).
  27. Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction. EMBO J. 38, e101982 (2019).
  28. Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging. Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).
  29. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).
  30. Kang, H. Y., Ortonne, J. P. What should be considered in treatment of melasma. Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).
  31. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases. Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).
  32. Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).
  33. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).
  34. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153, 1194-1217 (2013).
  35. Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. Mechanisms regulating melanogenesis. An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).
  36. Ratz-Łyko, A., Arct, J. Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review. J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).
  37. Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).
  38. Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice. Aging Cell. 20, e13296 (2021).
  39. Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة