مقالة منهجية

التلاعب الجسدي لتوليد أجنة زينوبوس الصغيرة

DOI:

10.3791/70602

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف طريقة تضييق فيزيائي لتكوين أجنة صغيرة من أجنة Xenopus laevis أحادية الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من السمات المميزة لتكوين الجنين المبكر الانخفاض السريع والأسي في حجم الخلية الفردية بينما يبقى حجم الجنين الكلي ثابتا. تلعب نسبة النيوكليوسيتوبلازم (N:C) دورا حاسما في تنظيم الأنشطة الخلوية والجزيئية الضرورية لتكوين الأجنة المبكر. لذلك، يمثل التلاعب الفيزيائي بحجم الجنين طريقة مهمة للتحقيق في هذه الآليات التطورية. الحجم الكبير (~ 1.2 مم في القطر) والمرونة التطورية العالية للأجنة المبكرة Xenopus laevis يجعلانها نموذجا مثاليا للتشريح الجسدي والتلاعب لاستكشاف الآليات التنظيمية للنمو. هنا، نصف نهجا لتوليد أجنة صغيرة ذات حجم سيتوبلازمي متغير ونسبة N:C عن طريق تضييق أجنة Xenopus laevis ذات الخلية الواحدة بعقد شعر. لقد ثبت أن الأجنة الصغيرة الناتجة تبدأ تنشيط الجينوم الزيغوتي المبكر (ZGA) مباشرة عن طريق تقليل حجم الخلية ونمو نسبة النيتروجين إلى الكربون. لذلك، توفر هذه الأجنة الصغيرة، التي يمكن تعميمها على أنظمة جنينية أخرى، أداة فريدة وقوية لتحليل الآليات التي تتتوسط في الحجم لتطور الأجنة المبكر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من أكثر السمات لفتا للنظر في التوجد الجنيني المبكر هي التقليل الأسي لحجم الخلية الفردية داخل الجنين مع الحفاظ على حجم ثابت. يؤدي تخليق الحمض النووي السريع وتقليل حجم الخلية إلى زيادة نسبة النوكليوسيتوبلازم (N:C)، والتي تلعب دورا مهما في تنظيم العديد من الأنشطة المميزة لانتقال منتصف الأبلاستولا (MBT) في الأنظمة الجنينية النموذجية، بما في ذلك نسخ الجينات الزيجوتية، وإطالة دورة الخلية، وحركة الخلايا 1,2,3,4 . تدعم التلاعبات بنسبة N:C من خلال تغيير صبغة الحمض النووي أهميتها الوظيفية في التطور المبكر عبر عدة أنظمة نموذجية 3,4,5,6.

يمثل التلاعب الفيزيائي بحجم الجنين تقنية مهمة لدراسة الآليات التنظيمية في التطور الجنيني المبكر7. إزالة السيتوبلازم عن طريق الشفط، والتي تغير نسبة N:C في الأجنة المبكرة للفئران، تسبب انضغاطا مبكرا8. علاوة على ذلك، كشف تقليل حجم جنين سمك الزرد عن طريق التقطيع عن آلية جديدة قائمة على التدرج لتكبير السوميت9. علاوة على ذلك، كشف تقليل حجم السيتوبلازم في أجنة زينوبوس عن ديناميكيات دورة الخلايا المعتمدة على نسبة N:C10. ومن المهم أنه من خلال توليد أجنة زينوبوس المصغرة عبر تقليل حجم الخلية ووضع علامات على النسخ الناشئة ب 5-إيثينيل-يوريدين (5-EU) في خلايا منفردة، أثبتنا أن تقليل حجم الخلية يحفز تنشيط الجينوم الزنججي (ZGA) بطريقة تعتمد على الجرعة. تدعم هذه النتائج الدور الحاسم لحجم الخلية في تكوين الجنين المبكر.

هنا، نصف إجراء مفصلا لتوليد أجنة Xenopus laevis الصغيرة عن طريق التلاعب الجسدي باستخدام عقد الشعر (الشكل 1)10،11. يبني هذا النهج على الاستخدام الأساسي لنيوبورت وكيرشنر (1982) لتضيق حلقة الشعر على الأجنة المبكرة لزينوبوس 1، موفرا بروتوكولا واضحا وموثوقا لتوليد الأجنة الصغيرة كأدوات تجريبية. بالإضافة إلى ذلك، تنطبق هذه الطريقة على أنظمة جنينية أخرى7، مما يسهل اكتشاف آليات جديدة لتكوين الجنين المبكر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الموافقة على العمل الحيواني الموضح هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة ساوث كارولينا.

1. تحضير المواد

  1. إعداد الحلول
    1. جهز 20× MMR عن طريق خلط 100 ملليمولار HEPES، 2 ملليمولار EDTA، 2 ميلار NaCl، 40 ملليمولار KCl، 20 ملليمولار MgCl2، و40 ملليمول CaCl2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 باستخدام NaOH. استخدم الأوتوكلاف ويخزن في درجة حرارة الغرفة.
    2. تحضير محلول وسط تدرج كثافة 3٪ (وزن/حجم) عن طريق خلط 1.5 جرام من وسط تدرج الكثافة في 50 مل من 0.5× MMR. حرك بلطف باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي حتى يذوب البوليمر. حافظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    3. حضر جل أغاروز بنسبة 1٪ في طبق بتري بحجم 60 مم عن طريق خلط 0.5 جرام من الأغاروز في 50 مل من 0.1× MMR. سخن بفرن ميكروويف لإذابة الأغاروز، ثم أضف 5 مل من الأغاروز لتغطية قاع طبق بتري بحجم 60 مم بطبقة رقيقة.
  2. تحضير عقد الشعر للأجنة المضغوطة
    1. احصل على بعض الشعر الرقيق واقطعه إلى قطع ~5 سم.
    2. استخدم ملقطا لإدخال أحد طرفي الشعر في طرف P10 بعمق حوالي ~1 سم.
    3. ضع الشمع على ملعقة وسخنه ليذوب الشمع. اغمس بسرعة رأس P10 المثبت بالشعر في الشمع، واتركه يجف لمدة دقيقة واحدة. تأكد من تثبيت الشعر عند نهاية رأس P10.
    4. استخدم الملقط لعمل عقدة علوية بعناية من الشعر. اضبط حجم الحلقة ليكون ~1.5 مم. قم بقص الحافة البروز إذا لزم الأمر. ضع العقدة جانبا لاستخدامها مستقبلا.
    5. كرر الخطوات السابقة لعمل المزيد من العقد حسب الحاجة.

2. صنع أجنة صغيرة لزينوبوس

  1. للحصول على أجنة زينوبوس ، اتبع بروتوكول قياسي لإجراء التلقيح الصناعي (IVF) (على سبيل المثال، انظر Sive وآخرون، 2007). يجب أن يكون الجنين في معدل MMR 0.1×، وجاهزا للاستخدام.
  2. لرؤية ZGA في خلايا الأجنة المفردة ودراسة آلياتها التنظيمية، قم بحقن الأجنة ذات المرحلة الواحدة من مرحلة الخلية الواحدة ب 5-إيثينيل-يوريدين (5-EU) لوضع علامة أيضية على النسخ الناشئة11,13 قبل المضي قدما في الإجراءات التالية.
  3. عندما يكون الأجنة عند ~1 ساعة بعد الإخصاب (hpf)، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل ~20 جنينا في طبق بتري بقطر 60 مم (مغطى بجل أغاروز 1٪) يحتوي على ~15 مل من وسط تدرج كثافة 3٪ / 0.5× MMR.
  4. استخدم ملقطا في يد واحدة لتدوير الجنين بزاوية ~45–60 درجة تحت المجهر المجسم للوصول إلى القطب النباتي (نصف الكرة الشاحب). امسك الجنين المائل بالملاقط واستخدم إبرة 30 جرام في اليد الأخرى لثقب العمود النباتي بعناية. أطلق بعض السيتوبلازم بالضغط اللطيف على الجنين.
  5. غط بعناية عقدة شعر مثبتة في طرف P10 على الجنين بحيث يكون عمود الحيوان (نصف الكرة الداكنة) داخل عقدة الشعر. ضبط موضع العقدة حسب حجم الجنين الصغير المطلوب.
  6. أمسك ماصة P10 بيد واستخدم ملقطا في اليد الأخرى لسحب طرفي العقدة في اتجاهين متعاكسين. ستشد عقدة الشعر حول الجنين، بين القطب الحيواني (سليم) والقطب النباتي (مع تحرير السيتوبلازم). اقطع عقدة الشعر في الموقع الذي تثبت فيه على رأس P10.
  7. كرر الخطوات 2.4–2.6 أعلاه لصنع الكمية المطلوبة من الأجنة الصغيرة.
  8. دع الأجنة تبقى في وسط تدرج كثافة 3٪ / 0.5× MMR لمدة ~1–2 ساعة. ثم أزل الوسط باستخدام ماصة P1000 دون إزعاج الأجنة وأعد تعبئته ب 15 مل من 0.1× MMR.
  9. دع الأجنة تتطور إلى المراحل المطلوبة، ثم استخدم الملقط لإزالة العقد بعناية من الأجنة الصغيرة.
  10. جمع الأجنة للتحليل المطلوب، مثل تصور ZGA في خلايا منفردة11,13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت أجنة Xenopus laevis في مرحلة الخلية الأولى مضغوطة بعقد الشعر كما هو موضح أعلاه. تم تصوير الأجنة الضابطة والأجنة الصغيرة عند ~المرحلة 9 (8.5 حصان قوة عند 23 درجة مئوية) تحت ميكروسكوب مجسم. كما هو موضح في الشكل 2، حجم بعض الأجنة الصغيرة هو ~1/3 حجم الأجنة الضابطة. تشير هذه النتيجة إلى أن أجنة زينوبوس المبكرة يمكن التلاعب بها لتوليد أجنة صغيرة، مما يوفر نموذجا فريدا لدراسة تأثير حجم الخلية على ديناميكيات دورة الخلية10

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نصف طريقة لتوليد أجنة صغيرة في زينوبوس عن طريق تضييق أجنة المرحلة الخلوية الواحدة بعقد شعر. يوفر هذا النهج دليلا مباشرا على أن تقليل حجم الخلية يحفز ZGA في الجنينالنموذجي 11.

تعد عدة جوانب من هذا البروتوكول ضرورية لإنتاج أجنة صغيرة بنجاح. لصنع عقد الشعر، من المهم استخدام شعر رقيق ومتين، ويفضل أن يكون شعر الأطفال. كلما كان الشعر أكثر سمكا وهشاشة، أصبح من الصعب صنع أو استخدام العقد. علاوة على ذلك، يجب تجنب معالجة الشعر بصبغا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف يصرح بعدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مختبر ماثيو جود في جامعة بنسلفانيا على توفير التدريب. وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (R03HD105802).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إبرة 30-GBD Medical305128لثقب الأجنة
أطباق بتري ذات الاستخدام الواحد بحجم 60 ممVWR25384-092لحضانة الأجنة
المجاهر الستيريو ACCU-SCOPE 3075 زوومVWR470351-130لتصور الأجنة
أغاروزسيغما-ألدرتشA-9414لتغطية أطباق البتري
ملقط دومونت، النمط 5علوم المجهر الإلكتروني72701-Dلتعديل واحتجاز الأجنة
فيكول 400سيغما-ألدرتشGE17-0300-10لحضانة الأجنة
نصيحة TipOne Pipette Key، 10 وميكرو؛ Lيو إس إيه ساينتيفك1111-3700لتثبيت عقد الشعر
كتلة شمعية، أسودشركة كارولينا بيولوجي سبلاي974228لتثبيت عقد الشعر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة