سرطان الثدي داخل الجمجمة: نموذج الفأر لتوصيف الخلايا المناعية والبيضية في السحايا والبصنة الشمية

ملخص

يحدد البروتوكول انتشارات سرطان الثدي في الدماغ عبر التلقيح داخل الجمجمة، ويحدد من خلال قياس تدفق الخلايا الأجزاء الرئيسية من الخلايا اللمفاوية والمناعة التي تنظم مناعة الدماغ. توفر هذه التحليلات رؤى حول ديناميكيات الخلايا المناعية والخلايا البمثيرة التي تشكل البيئة الدقيقة للدماغ، مما يساعد على تطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

الملخص

الجهاز العصبي المركزي محاط بواجهات مناعية متخصصة، بما في ذلك السحايا والبصلة الشمية، والتي يمكن أن تكون مسارات تسمح للاستعمار النقيلي ونقاط دخول للاستجابات المناعية المضادة للأورم. فهم كيفية تطور ديناميكيات الخلايا المناعية داخل هذه الهياكل أثناء تقدم الانتقال أمر ضروري لتحديد الآليات التي تدعم أو تقيد نمو الأورام في الدماغ. يوضح هذا البروتوكول تأسيس نموذج فأر سرطان الثدي السرطاني (BCBM) من خلال حقن خلايا سرطان الثدي E0771 داخل الجمجمة في فئران C57BL/6. بعد تطور الورم، يتم تشريح السحايا والبصلة الشمية بعناية، وهضمهما إنزيما، ومعالجتها إلى تعليقات خلية واحدة. ثم يتم تحليل هذه التجمعات باستخدام القياس الخلوي الطيفي متعدد المعلمات لتوصيف شامل لمجموعات الخلايا اللمفاوية والنخاعية والسترومية ضمن المجالات المناعية المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي. يتيح هذا السير إجراء تحليلات مقارنة بين الأنظمة القابلة للسيطرة على الأورام وغير الورمية، مما يحدد التغيرات في واجهات الجهاز المناعي في الجهاز العصبي المركزي التي قد تكون وراء تفادي المناعة الورمي وتمثل أهدافا علاجية محتملة. بشكل عام، يوفر البروتوكول نهجا قابلا للتكرار لدراسة BCBM واستجواب تنظيم المناعة عند واجهات الجهاز العصبي المركزي والجهاز المناعي الطرفي. يمكن تكييفها لخطوط خلايا سرطانية إضافية، أو علاجات مناعة، أو نماذج فئران جينية لدراسة آليات مقاومة المناعة والاستجابة العلاجية داخل البيئة الدقيقة للدماغ.

المقدمة

النقائل الدماغية هي أكثر الأورام الخبيثة شيوعا التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وتحدث بشكل أكثر تكرارا من الأورام الدماغية الأولية. سرطان الرئة، وسرطان الثدي، والميلانوما هي السرطانات الرئيسية التي غالبا ما تنتقل^{إلى الدماغ}. من بين هذه الموارد، تمثل نقائل سرطان الثدي في الدماغ (BCBM) تحديا سريريا كبيرا، حيث تؤثر على 10٪–30٪ من المرضى المصابين بأمراض النقالية، وتظهر زيادة في الحدوث بسبب تحسين العلاجات الجهازية والتقدم في التصوير العصبي². لا تزال التوقعات لمرضى BCBM ضعيفة، حيث أن العلاجات المتاحة – بما في ذلك الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي – هي إلى حد كبير تلطيفية، وتؤثر الأعراض العصبية بشكل كبير على جودة الحياة³. على الرغم من أن العلاجات المستهدفة والعلاجات المناعية يتم استكشافها كاستراتيجيات مكملة، إلا أن الفائدة السريرية للعلاج المناعي في النقائل الدماغية لا تزال محدودة ^4,5,6.

لقد صقلت الأعمال الحديثة فهمنا لمناعة الدماغ واهتمامنا المتجدد بالمسارات اللمفاوية الوظيفية المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك الأوعية اللمفاوية في السحايا⁷ والمخاط الأنفي⁸. تشكل هذه البنى شبكة لمفاوية مستمرة تحيط بالدماغ وتمتد بجوار البصلة الشمية والصفيحة الصوفية، وتتصل في النهاية بالعقد اللمفاوية العنقية. يلعب هذا النظام أدوارا رئيسية في توازن السوائل، والمراقبة المناعية، وحركة الخلايا المناعية بين الجهاز العصبي المركزي والأعضاء اللمفاوية الطرفية^. مع تزايد الاهتمام بطرق العلاج المناعي لأورام الدماغ والنقائل، تظهر هذه الواجهات المناعية اللمفاوية كطرق واعدة لكنها لا تزال غير مدروسة بشكل كاف، يمكن من خلالها التواصل مع الآفات داخل الجمجمة. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال الآليات التي تحكم تجنيد الخلايا المناعية في بيئة ورم الدماغ وكيفية تفاعل هذه الخلايا داخل هذا البيئة الفريدة غير مفهومة بشكل جيد. معا، تؤكد هذه الفجوات الحاجة إلى نماذج وإجراءات ما قبل السريرية تسمح بتحليل شامل لتفاعلات الأورام والمناعة وتدعم تطوير استراتيجيات لتحسين المناعة المضادة للأورام ضد نقائل الدماغ.

هنا، نصف بروتوكولا يجمع بين توليد نموذج فأر BCBM قابل للتكرار وقادر على المناعة من خلال التطعيم الفراغي داخل الجمجمة لخلايا E0771 مع عزل وفصل السحايا والبصلة الشمية لإجراء التصنيف المناعي عبر القياس الخلوي الطيفي. يتيح هذا النهج النمذجة المسيطر عليها للسرطان الكيميائي للقارات لتقييم سلامة وفعالية التدخلات العلاجية، ويسمح بتوصيف عميق للمجموعات المناعية والعضلات البمثيرة عند واجهة الدماغ اللمفاوية المناعية، مما يوفر رؤية حول اللاعبين الخلويين الذين يشكلون البيئة الدقيقة لأورام الدماغ ويؤثر على استجابات العلاج.

تظل النماذج الحيوانية ضرورية لدراسة انتشارات الدماغ، حيث لا يمكن تكرار العديد من الجوانب الحيوية لتقدم الانتقال في المختبر. تم تطوير عدة نماذج فئران في الجسم الحي لتوليد نقائل دماغية، لكل منها مزايا وحدود محددة¹⁰. نماذج النقائل التلقائية، بما في ذلك الزرع التقويمي أو نماذج الفئران المعدلة وراثيا، تحاكي بشكل أقرب تقدم المرض السريري لكنها نادرا ما تولد آفات داخل الجمجمة، وتتطلب جداول زمنية طويلة من التجارب، وغالبا ما تنتج تباينا عاليا بسبب انتشار الأمراض خارج الجمجمة. الأساليب الجهازية، بما في ذلك حقن القلب أو الخص السباتي أو الوريد الذيلي، تدخل خلايا الورم إلى الدورة الدموية وتحاكي بشكل أفضل الانتشار الدموي، وتمدد الحاجز الدموي والدماغي، والاستعمار. ومع ذلك، لا تلتقط هذه النماذج الخطوات الأولى لغزو الأورام الأولي وغالبا ما تنتج انتشارات خارج الجمجمة واسعة ومتغيرة، خصوصا في الرئتين. من بين النماذج الجهازية، الحقن داخل السباط لديه أقل تغير، لكنه يتطلب خبرة جراحية متقدمة. بدلا من ذلك، يوفر الحقن داخل الجمجمة عدة مزايا، منها التحكم الدقيق في موقع الورم، وتطور الورم السريع والقابل للتكرار، وتقليل التباين بين التجارب. قد يكمل هذا النهج أيضا بزرع ورم أولي في الورم التقويمي يتبعه استئصال جراحي لمحاكاة مسار الانتقال بدقة أكبر. على الرغم من أن الحقن داخل الجمجمة لا يعيد التسلسل الكامل للانتشار المنتشر ولا يصلح لدراسة الغزو والانتشار المبكر، إلا أنه يوفر نموذجا قويا لتقييم الفعالية العلاجية ضد الآفات المعروفة ولدراسة التفاعلات داخل البيئة الدقيقة للدماغ. من القيود المعروفة أن الحقن نفسه قد يسبب التهابا عصبيا موضعيا، مما قد يؤثر على قراءات المناعة، والتي يمكن تقييمها من خلال مقارنة الملفات المناعية في الفئران المحقونة وغير المحقونة.

لا يزال التوصيف المناعي للسحاء والبصلة الشمية مجالا بحثيا جديدا نسبيا وغير مستكشف بشكل كاف. تعتمد معظم الدراسات على عينات العقد اللمفاوية الكاملة للدماغ أو عنق الرحم¹¹، والتي تفشل في التقاط التركيب الخلوي المميز والوظائف المناعية المتخصصة لهذه الأنسجة المرتبطة باللمفاويات. استعادة كلا الهيكلين توفر رؤية أوسع وأكثر إفادة لمناعة الدماغ. عند دمجه مع القياس الخلوي الطيفي متعدد المعلمات، يدعم هذا السير التحليل عالي الإنتاجية لمجموعات الخلايا المناعية الوفيرة والنادرة المشاركة في الاتصال المناعي المحيطي مع الجهاز العصبي المركزي. يشمل ذلك قياس العلامات السطحية وداخل الخلايا لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا، وتقييم حالات التنشيط، وتقييم التغيرات الناتجة عن العلاج. تشمل المنهجيات الأخرى لتحليل المناعة في الجهاز العصبي المركزي التي لا يغطيها هذا البروتوكول الكيمياء المناعية النسبية (IHC) والفلورية المناعية (IF)، التي تحافظ على التوزيع المكاني لخلايا المناعة لكنها محدودة بتعدد المؤشرات المنخفض، والقياس الذاتي للكم، وتمثيل الأنواع النادرة¹² من الخلايا النادرة. مؤخرا، وسع تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) القدرة على تحليل مجموعات المناعة في الجهاز العصبي المركزي من خلال تمكين اكتشاف الحالات الخلوية وبرامج النسخ بدقة عالية. على الرغم من تقديم رؤى قوية في النسخ، فإن scRNA-seq محدود بالتكلفة، وتشكيلات التفكك، وفقدان النسخ، وفقدان دقة البروتين^13,14. القياس الخلوي الجري، رغم افتقاره إلى التحليل المكاني وحساسيته لتأثيرات التفكك، يقدم دقة ظاهرية متفوقة من خلال لوحة متعددة المعلمات المتقدمة ويوفر تحليل مناعي كمي قوي.

معا، توفر المنهجيات الموضحة هنا منصة مرنة وقوية لنمذجة BCBM وفحص ديناميكيات المناعة عند واجهات الجهاز العصبي المركزي اللمفاوي، مما يدعم تطوير العلاجات قبل السريرية التي تستهدف كل من البيئة الدقيقة لأورام الدماغ ومسارات المناعة المرتبطة بها.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات كلية الصيدلة بجامعة لشبونة. تمت مراجعة البروتوكولات والموافقة عليها من قبل الهيئة المختصة البرتغالية لحماية الحيوانات، إدارة العلوم والحيوانات البيطرية (المرجع 0421/000/000/2021).

1. تحضير خلايا E0771 للزرع في الجسم الحي

1. في غطاء معقم، تزرع خلايا E0771 في قارورة T75 باستخدام وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 10٪ (v/v) مصل البقر الجنيني (FBS) و1٪ (v/v) البنسلين والستريبتوميسين (PEST).
   1. تأكد من أن الخلايا تتحقق من خلال تحليل STR عند استلامها من المورد وتأكد من خلوها من الميكوبلازما من خلال الاختبارات الروتينية. زراعة الخلايا الورمية لمدة لا تقل عن 2–8 ممرات بعد الذوبان قبل زرع الدماغ.
2. في يوم الزرع، تأكد من صحة الخلايا وتلاقي بنسبة 80-90٪. قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
3. أضف التريبسين إلى القارورة وحضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم أضف ثلاثة أضعاف حجم الوسط المكمل (DMEM مع 10٪ من الحمض الجزئي الزائد و1٪ من الآفات المضادة) لتعادلية التربسين وتفكك الخلايا.
4. انقل الخلايا إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات في PBS لإجراء عد الخلايا.
5. يقوم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى (300 × جرام لمدة 5 دقائق)، ثم التخلص من السوبرناتينت، ثم يعلق الخلايا في PBS بتركيز 1 × 10⁵ E0771 خلايا في 2 ميكرولتر لكل حيوان. احتفظ بتعليق الخلايا على الثلج حتى يتم تطعيم الورم. جهز تعليق الخلية مباشرة قبل الحقن.

2. تلقيح الورم داخل الجمجمة باستخدام جهاز الورم الفراغي

1. احصل على فئران إناث C57BL/6 (عمرها 6-8 أسابيع) واعتادهن على منشأة الحيوانات لمدة لا تقل عن 7 أيام قبل الجراحة. احتفظ بالفئران المنزلية تحت ظروف محكمة مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة وقدم الطعام والماء حسب الرغبة.
   ملاحظة: يوصى بوجود خمسة حيوانات على الأقل لكل مجموعة تجريبية لضمان قوة إحصائية كافية لتحليل مناعي مقارن ذي معنى بين الحالات الحاملة للورم وحالات السيطرة على الورم.
2. جهز المجال الجراحي وجميع المواد المطلوبة قبل بدء الإجراء:
   1. الأدوات الجراحية: شفرات المشرط، المقص، الملقط، حاملات الإبر، سلك الخياطة.
   2. المعدات وغيرها: جهاز استيريوتاكسي، حقنة زجاجية، مثقاب، ماكينة حلاقة، أعواد قطنية، وسادة تدفئة.
   3. التخدير: تحضير الكيتامين-زيلازين (K-X) (25 ملغ/مل و2 ملغ/مل، على التوالي) في PBS في أنبوب بحجم 15 مل.
   4. تسكن: تحضير البوبرينورفين عند 15 ميكروغرام/مل في PBS في أنبوب بحجم 15 مل.
   5. الحلول الأخرى: بوفيدون-يود، بيروكسيد الهيدروجين 3٪ v/v (_H2O₂)، مرهم العيون.
      تحذير:_H2O ضار إذا تم ابتلاعه وقد يسبب تهيج الجلد.
3. تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) من K-X (100 ميكرولتر لكل 10 جرام من وزن الجسم). تأكد من وجود تخدير كاف بعدم الاستجابة لقرص إصبع القدم.
4. ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع الجفاف وضع الفأر على وسادة تسخين طوال العملية.
5. احلق فروة الرأس وقم بتعقيم منطقة الجراحة ببوفيدون-يود. قم بعمل شق طولي بطول 1 سم على طول الخط الأوسط لكشف الجمجمة.
6. نظف الجمجمة المكشوفة باستخدام H₂O₂ باستخدام مسحة قطنية بحركة دائرية لتصور البريغما. إذا حدث رغوة زائدة، أزلها بمسحة جافة.
7. ضع الفأرة في إطار الستيريوتاكسي. حدد البريغما كنقطة مرجعية (0.0) وقم بقياس 2.5 مم جانبيا و0.5 مم أمام البريغما. حدد موقع الحقن.
8. أزل الفأر واحفر فتحة صغيرة عند الإحداثيات المحددة. تجنب الحفر بعمق شديد لمنع تلف الدماغ.
9. ركبوا الحقنة على الحقنة. أعد تعليق الخلايا وتحميل الحقنة الزجاجية بحجم كاف لحقنتين (4–5 ميكرولتر). لا تحضر أكثر من حقنتين في نفس الوقت لتجنب استقرار الخلايا.
10. أعد وضع الفأر في الستيريوتاكسيك، ومحاذاة الإبرة مع الثقب، ثم أنزلها ببطء إلى عمق 3.0 مم داخل نسيج الدماغ. حقن الخلايا (أو PBS المعقمة للسيطرة على الوهم) بسرعة 1 ميكرولتر/دقيقة.
11. بعد الحقن، حافظ على الإبرة في مكانها لمدة لا تقل عن دقيقة واحدة، ثم اسحب 1.5 مم، ثم ابقيه دقيقة أخرى، ثم اسحب الإبرة تماما. هذا يقلل من التدفق العكسي ويضمن ترسيب الخلايا بشكل صحيح.
12. أغلق الشق بالخياط ووضع البوفيدون-يودين. أعط البوبرينورفين (100 ميكرولتر) تحت الجلد.
13. احتفظ بالفأرة على وسادة تسخين حتى تتعافى تماما من التخدير. أعد الفأر إلى قفص نظيف وراقب يوميا بحثا عن الضيق أو العلامات العصبية أو العدوى.

3. تروية القلب للفأر

1. تخدير الفئران عن طريق حقن K-X (100 ميكرولتر لكل 10 جرام من وزن الجسم). تأكد من وجود تخدير كاف بعدم الاستجابة لقرص إصبع القدم.
2. باستخدام المقص، قم بعمل شق بعرض 5–6 سم عبر جدار البطن وشقين عبر القفص الصدري حتى عظمة الترقوة. احرص على عدم قطع أي أوعية دموية رئيسية.
3. مع كشف القلب، اقطع الأذرين الأيمن للسماح بتدفق الدم. حقن PBS بارد جدا في البطين الأيسر باستخدام حقنة 20 مل مزودة بإبرة 25G × 1 بوصة.
4. أوقف التروية عندما يكون السائل المتدفق خاليا من الدم. بالنسبة للفئران البالغة، يحتاج الأمر إلى حوالي 20 مل من PBS.

4. عزل السحايا والبصلة الشمية في الفأر

1. بعد التروية داخل القلب، قم بقطع رأس الفأر باستخدام مقص جراحي. قم بإزالة فروة الرأس بالكامل لكشف الجمجمة.
2. باستخدام المقص، اقطع الجمجمة في المستوى العرضي من المنطقة الخلفية نحو العينين، مع الحرص على عدم إتلاف الأنسجة الدماغية الأساسية. استخرج الدماغ بلطف باستخدام ملقط دقيق، متجنبا ملامسة أو خدش سطح الجمجمة الداخلي.
3. بعد إزالة الدماغ، تبقى السحايا الجافية ملتصقة بالسطح الداخلي للجمجمة. اغمر الجمجمة في PBS البارد لمدة لا تقل عن 5 دقائق لتسهيل فصل السحايا سليما.
4. قم بتشريح البصلة الشمية من المنطقة الأمامية للدماغ ونقلها إلى البصلة الباردة جدا لتخزينها مؤقتا حتى المعالجة.
5. باستخدام ملقط ذو أطراف دقيقة، قم بفصل السحايا بلطف عن سطح الجمجمة الداخلي عن طريق رفع وتقشير طبقة الأنسجة الرقيقة بعناية. انقل السحايا إلى PBS البارد جدا حتى يتم المعالجة بشكل إضافي. تجنب تمزيق النسيج لضمان استعادة الخلايا المثلى في مرحلة لاحقة.

5. تفكك الأنسجة إلى خلايا مفردة

1. السحايا
   1. انقل السحايا إلى 3 مل RPMI 1640 يحتوي على 0.05٪ كولاجناز II و DNase I. حضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، مع تحريك خفيف كل 10 دقائق. الهضم المفرط يقلل من قدرة الخلايا على البقاء ويجب تجنبه.
   2. مرر الأنسجة المهضومة عبر مصفاة خلوية بحجم 40 ميكرومتر إلى أنبوب بسعة 50 مل. قم بفصل النسيج المتبقي ميكانيكيا عن طريق الضغط اللطيف على مكبس الحقنة على المصفاة واغسله ب 5 مل من PBS.
   3. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتينت وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من PBS.
   4. كرر الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت، وأعد تعليق الحبيبات النهائية بالحجم المتبقي، ثم انطلق إلى صفيحة U-bottom بسعة 96 بئرا.
2. بصلة الشم
   1. قم بإزالة PBS وتفكيك الأنسجة ميكانيكيا باستخدام مكبس الحقنة. أضف محلول هضم بسعة 3 مل يحتوي على 0.02٪ كولاجناز II في محلول الملح المتوازن لهانكس (HBSS). حضانه لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، مع تحريك خفيف كل 10 دقائق.
   2. مرر نظام تعليق الخلية عبر مصفاة بقطر 70 ميكرومتر إلى أنبوب 50 مل واغسله ب 10 مل PBS.
   3. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات النهائية بالحجم المتبقي. انقله إلى صفيحة U-bottom بسعة 96 بئر.
3. احتفظ بالألواح عند 4 درجات مئوية حتى تتلوث.
   ملاحظة: قم بإجراء التلوين في نفس اليوم لضمان بقاء الخلايا المثلى.

6. تلوين الخلايا واكتساب قياس خلوي التدفق

1. تصميم اللوحة
   1. يرجى مراجعة الجدول 1.
      ملاحظة: تم تصميم اللوحة في هذا البروتوكول لمقياس تدفق طيفي مزود بأربعة ليزرات (بنفسجي، أزرق، أصفر-أخضر، وأحمر) وإجمالي 51 كاشفا (48 فلورة + 3 قنوات تشتت). يجب تصميم اللوحة بناء على تكوين مقياس التدفق الخلوي والبروتينات/العلامات المعنية.
2. تلوين الخلايا
   1. قم بالطرد المركزي بألواح U-bottom 96 بئر بقوة 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت بعناية. من هذه الخطوة فصاعدا، احم الصفائح من الضوء.
   2. أضف صبغة قابلية للحياة بسعة 50 ميكرولتر (FVD، تخفيف 1:5000 في PBS) إلى الآبار المناسبة وحضن لمدة 20 دقيقة في RT. اغسله ب 150 ميكرولتر PBS، واستخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتانت. أضف صبغة قابلية الاستخدام فقط إلى أدوات التحكم والعينات القابلة للحياة.
   3. حجب مستقبلات Fc عن طريق حضان الخلايا ب 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة CD16/CD32 (0.01 ميكروغرام/مل في مخزن FACS: PBS مع 2 ملي مولار EDTA و0.5٪ BSA) لمدة 10 دقائق على الثلج. اغسل بمخزن FACS بسعة 170 ميكرولتر، واستخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتانت.
   4. أضف 30 ميكرولتر خليط أجسام مضادة أو عناصر تحكم بلون واحد (تم تحضيره وفقا لتخفيفات الأجسام المضادة المدرجة في جدول المواد في مخزن FACS) وحضن لمدة 20 دقيقة على الثلج. اغسل بمخزن FACS بسعة 170 ميكرولتر، واستخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتانت.
   5. قم بتثبيت الخلايا ب 100 ميكرولتر ب 2٪ بارافورمالديهيد (PFA) في PBS لمدة 20 دقيقة عند RT. اغسله ب 100 ميكرولتر من PBS، واستخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من الفائق.
      ملاحظة: بالنسبة للعلامات داخل الخلية، استبدل هذه الخطوة بالتثبيت والنفاذية باستخدام مجموعة تخزين تجارية، ثم قم بإجراء التلوين داخل الخلية قبل إعادة التعليق النهائية.
   6. أعد تعليق الحبيبات الخلوية النهائية في 200 ميكرولتر من مخزن FACS. تخزين الألواح عند 4 درجات مئوية حتى الحصول عليها على جهاز قياس تدفق السيلتومتر.
3. أدوات التلوين بلون واحد وتحكم فلورية ناقص واحد (FMO)
   1. العينات الملونة بلون واحد مطلوبة لتحسين فك الخلط. تستخدم الخلايا للعينات الملونة بلون واحد للعلامات التي تظهر قمم إيجابية وسالبة. وإلا، يفضل استخدام خرزات تعويضية ويوصى بها لتحقيق أفضل طريقة لفصل الخلط. جهز خرزات تعويض للأجسام المضادة المتقاربة بالفلورسنت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يعد إعداد ضوابط FMO خطوة مهمة لتحقيق الإغلاق الصحيح، خاصة للمؤشرات التي لا تظهر قمم إيجابية وسلبية واضحة. جهز عدة عينات FMO لأنواع مختلفة من الفلوروكروم حسب الحاجة.
   2. جهز عينات FMO لمستضدات سطح الخلية باتباع الخطوات في الجزء 6.2 ولكن استبعاد الجسم المضاد المعني من مزيج الأجسام المضادة في الخطوة 6.2.4.
4. اكتساب وتحليل قياس تدفق الخلايا
   1. شغل جهاز قياس الخلوية، وتشغيل برنامج اكتساب مقياس تدفق السيل، وحضر حبات مراقبة الجودة (قطرة واحدة في 300 ميكرولتر PBS) في أنبوب عينة بحجم 12 × 75 مم أثناء تسخين الجهاز (على الأقل 30 دقيقة).
   2. نظف الجهاز بتشغيل: 3 دقائق 10٪ تبيض V/V، 30 دقيقة H2 O عند معدل تدفق عال. أعد معدل التدفق إلى منخفض للخطوات التالية.
   3. اختر تبويب مراقبة الجودة، حمل الأنبوب وشغل القطع بالضغط على زر التشغيل. بمجرد الانتهاء من مراقبة الجودة، تظهر رسالة تقول "تم النجاح".
   4. اذهب إلى تبويب الاستحواذ، اختر أو أنشئ التجربة وابدأ عملية الاقتناء عن طريق تحديد الخلايا حسب FSC وSSC. احصل على عناصر تحكم غير ملونة وغير ملطخة، شغل ساحر فك المزج واحفظ الإعدادات. تابع في شراء عينات مصبوغة.

النتائج

بعد تلقيح خلايا E0771 داخل الجمجمة، طورت الفئران آفة موضعية في سرطان الثدي عند الإحداثيات المستهدفة للسرطان الفراغي. تم اختيار الإحداثيات المجسمة التي تستهدف النسيج المخطط (2.5 مم جانبيا، 0.5 مم أمام البريغما، و3.0 مم بطني من البريغما) بناء على أطلس دماغ الفأر القياسية وطرق الزرع داخل الجمجمة الموصوفة سابقا^15،16. تستخدم هذه المنطقة على نطاق واسع لزرع الأورام داخل الجمجمة بسبب سهولة وصولها وقدرتها على دعم زرع الورم مع تقليل التسرب إلى البطينين أو على طول مسار الحق...

المناقشة

من خلال دمج زرع الورم داخل الجمجمة مع عزل وتفكك وتوصيف المناعة للسحايا والبصلة الشمية، يتيح هذا البروتوكول تحقيقا مفصلا للتفاعل الديناميكي بين البيئة الدقيقة لورم الدماغ وواجهات المناعة المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي. توفر الطريقة تكوين أورام داخل الجمجمة قابلا للتكرار، وتعليق خلوي عالي الجودة، وحلولا قويا لمجموعات مناعية. ومع ذلك، فإن الانغراس داخل الجمجمة يتجاوز المراحل المبكرة من السلسلة النقائلية ولا يعيد تماما انتشار الدماغ التلقائي. لذلك، قد يفضل الباحثون المهتمون بالانتشار المبكر...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	To prepare FACS Buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorphine
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	To prepare FACS Buffer
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viability dye (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	To prepare Fixation Buffer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	non-absorbable
Surgi