مقالة منهجية

توليد ركائز مصفوفة خارج الخلوية من البولي أكريلاميد والسيليكون مع صلابة محددة لتطبيقات بيولوجيا الخلية

DOI:

10.3791/70626

⸱

يونيو 26, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Department of Surgery, University of California, San Francisco, 4Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, University of California, San Francisco, 5UCSF Helen Diller Comprehensive Cancer, University of California, San Francisco, 6Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, Eli and Edythe Broad Center for Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن صلابة المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي منظم رئيسي لسلوك الخلية، إلا أن آليات الاستشعار والتحويل الأساسية لا تزال غير واضحة. لمعالجة ذلك، نوفر بروتوكولات لإنشاء ركائز قائمة على البولي أكريلاميد والسيليكون مع صلابة قابلة للضبط لتعزيز فهمنا للتداخل بين الخلايا وECM.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي منظم حيوي لسلوك الخلية، حيث تعمل صلابة ECM كإشارة ميكانيكية رئيسية تحكم إشارات الخلية، والشكل، والمصير. ومع ذلك، فإن التحقيق التجريبي في الاستجابات الخلوية المعتمدة على الصلابة غالبا ما يكون محدودا بتوفر منصات زراعة قابلة للتكرار، فعالة من حيث التكلفة، وسهلة الوصول ذات خصائص ميكانيكية قابلة للضبط بدقة. يصف هذا البروتوكول الطرق القائمة على البولي أكريلاميد (PA) والسيليكون لتصنيع ركائز ECM ذات صلابة قابلة للضبط. توضح الإجراءات تحضير الركيزة، ووظائف السطح، واقتران بروتين ECM لضمان التصاق خلوي متسق عبر نطاق صلابة فسيولوجي ذي صلة. الركائز القائمة على PA متوافقة مع الفحوصات الكيميائية الحيوية في المرحلة اللاحقة، بما في ذلك استخراج البروتين والحمض النووي الريبي، بالإضافة إلى التصوير الفلوري عالي الدقة. تم تحسين الركائز القائمة على السيليكون لتصوير المجهر الفلوري الانعكسي الداخلي الكلي (TIRF)، مما يتيح رؤية تفاعلات الخلية-ECM في الغشاء القاعدي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف الركائز اللينة لدعم الثقافات الكروية الموضوعة ضمن مستوى تصوير متسق، مما يسهل التقاط الصور بشكل متسق. توفر هذه الطرق منصات قوية وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار لاستكشاف منهجية في كيفية تنظيم صلابة ECM للعمليات الخلوية، مما يعزز الرؤية الميكانيكية حول التفاعل المتقاطع بين الخلايا وECM في كل من السياقات الفسيولوجية والأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي هيكل هيكلي وكيميائي حيوي أساسي يحدد الخصائص الميكانيكية للأنسجة ويدعم وظائفها البيولوجية. على سبيل المثال، الأنسجة المرنة مثل الرئتين والشرايين غنية بمادة ECM المعتمدة على الكولاجين والإيلاستين، والتي توفر المرونة الميكانيكية اللازمة لتكرار دورات التمدد والارتداد أثناء التنفس. على النقيض من ذلك، يحتوي الجهاز العصبي المركزي على ECM غني بالجليكوزامينوجليكان، مما يخلق بيئة شديدة التوافق ومحسنة للتمايز العصبي وإرسال الإشارات1. عبر أنسجة مختلفة داخل الجسم، يمتد تيبس الأنسجة إلى عدة مراتب حجم، تتراوح من مئات الباسكال في الأنسجة الرخوة مثل الدماغ والرئتين إلى مستويات ميغاباسكال وجيجاباسكال من الصلابة في الأوتار والعظم، على التوالي 2,3. هذه الاختلافات الميكانيكية ليست مجرد هيكلية بل تلعب أيضا دورا حاسما في تنظيم سلوك الخلية 4,5. على سبيل المثال، تخضع الخلايا الجذعية الميزنشيمية لتحديد سلالة تعتمد على الصلابة، حيث تتبنى مصائر عصبية على الركائز اللينة، ومصائر ميوجينية على الركائز الوسيطة، ومصائر عظمية على الركائز الصلبة6. يمكن للتغيرات المرضية في صلابة ECM أن تدفع أيضا استجابات خلوية شاذة وتساهم في بدء وتقدم المرض 7,8,9. وبالمثل، فإن التغيرات في خصائص ECM حول الخلايا تغير وظيفة العضيات وسلوكيات الخلايا المختلفة10,11. على الرغم من الأهمية المعترف بها لإدارة الإشارات الكيميائية في توجيه الإشارات، ووظيفة العضيات، وتكوين الأمراض، إلا أن الآليات التي تستشعر الخلايا إشارات ECM وتحولها إلى إشارات كيميائية حيوية لا تزال غير مفهومة بشكل كامل.

لقد أعاق التقدم في فهم التفاعل الداخلي بين الخلايا وECM جزئيا بسبب محدودية توفر منصات تجريبية توفر تحكما دقيقا في خصائص ECM مع الحفاظ على التوافق الكامل مع الفحوصات الكيميائية الحيوية القياسية وسير عمل التصوير. بالإضافة إلى ذلك، ينظر إلى دراسة تفاعلات الخلايا والإلكترونيات الإلكترونية غالبا على أنها تحد تقني، لأنها تتطلب خبرة متعددة التخصصات تشمل علوم المواد، وعلم الأحياء الخلوي، والهندسة الحيوية. تهدف هذه الطريقة إلى معالجة هذه التحديات من خلال توفير بروتوكولات خطوة بخطوة لتوليد ركائز ECM تعتمد على ال PA والسيليكون بخصائص ميكانيكية محددة، ويمكن تحضيرها بسهولة في معظم بيئات المختبرات الرطبة.

الهيدروجيلز PA ذات الصلابة القابلة للتعديل هي أساسيات في علم الأحياء الميكانيكي؛ ومع ذلك، غالبا ما تتأثر فائدتها بارتفاع تكلفة الكواشف لاقتران ECM، وعدم اتساق وظائف السطح، وضعف التوافق مع سير العمل الكيميائي الحيوي واسع النطاق. بالإضافة إلى ذلك، لم تكن هناك طرق عملية وموحدة لجمع العينات والتصوير عبر ركائز ذات صلابة متفاوتة غير راسخة. يمكن معالجة هذه الاختناقات باستخدام منصة الجل PA التي وصفناها والتي تتميز بأربعة ابتكارات رئيسية: (1) تقليل كبير في التكاليف، (2) كيمياء الوظيفية القابلة لإعادة الإنتاج، (3) الإنتاج القابل للتوسع عبر الأجهزة القابلة لإعادة الاستخدام، و(4) الدمج السلس مع العديد من اختبارات بيولوجيا الخلايا التقليدية والكيميائية الحيوية. يستخدم هذا النهج نسب مختلفة من الأكريلاميد وبيساكريلاميد لتوليد هيدروجيلز ذات خصائص ميكانيكية مميزة (الجدول 1). جل PA خامد ولا يتوافق مباشرة مع بروتينات ECM. لذلك، يستخدم تفاعل بلمرة الراديكاليات الحرة الذي يبدأ بالأشعة فوق البنفسجية لدمج شبكة رقيقة متشابكة من رباعي أكريلات ثنائي (تريميثيلولبروبان)، وحمض الأكريليك إن-هيدروكسي سكوسينيميد إستر (NHS-أكريلات)، وبيساكريلاميد على سطح جل PA (الشكل 1). تخلق هذه الشبكة سطحا لاصقا ثنائي الفعل لبروتينات ECM: يوفر NHS-الأكريلات تثبيتا تساهميا مستقرا لبروتينات ECM، بينما يسهل رباعي الأكريلات امتصاص بروتين ECM الموحد12. بالإضافة إلى ذلك، نقدم طرقا توضح كيفية استخراج البروتينات والأحماض النووية مثل الحمض النووي الريبي من هذه الركائز بطريقة متوافقة مع تحليلات بيولوجيا الخلايا اللاحقة مثل التحليل الغربي للبالتقويم وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR). علاوة على ذلك، تدعم ركائز PA المتوافقة الناتجة أيضا تكوين الكرويدات ووضعها ضمن مستوى بؤري متسق، مما يمكن من التحليل المنهجي لسلوكيات الخلايا ثلاثية الأبعاد13.

على النقيض من ذلك، تقيد القيود البصرية للهيدروجيلز PA استخدامها في وسائل التصوير المتقدمة، خصوصا المجهر14 للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF). لمعالجة هذا القيد، طورنا ركائز ECM قابلة للتعديل ميكانيكيا تعتمد على السيليكون ومحسنة لتصوير TIRF. تظهر هذه المواد معامل انكسار مماثل للزجاج مع الحفاظ على صلابة قابلة للتعديل عبر نطاق واسع (الشكل 2A). طبقة رقيقة من جل السيليكون، بنسب أجزاء مختلفة، تغلى بالدوران على زجاج تغطية قبل اقتران ECM (الشكل 2B والجدول 2). ومع ذلك، فإن الكراهية المائية الجوهرية وخاملة السيليكون الكيميائية تمنع الاقتران المباشر لل ECM. لذلك ننفذ استراتيجية تعديل السطح لتمكين الارتباط التساهمي لروابط ECM. معالجة بلازما الأكسجين تدخل مجموعات الهيدروكسيل على سطح السيليكون (الشكل 2C). لاحقا، يحول (3-أمينوبروبيل) تري إيثوكسيسيلان (APTES) هذه المجموعات الهيدروكسيل إلى أمين تفاعلي. 1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) هيدروكلوريد الكربوديميد (EDC)، وهو رابط متقاطع للكربوديديميد بطول صفري، يسهل تكوين روابط أميدية تساهمية بين مجموعات الأمين على سطح الجل ومجموعات الكربوكسيل على بروتينات ECM.

توفر هذه المنصات مجتمعة أنظمة فعالة من حيث التكلفة، قابلة للتكرار، وقابلة للتوسع لاستكشاف آليات الإشارة المعتمدة على صلابة ECM. تسمح مرونتها بالتكامل بسلاسة مع الاختبارات الكيميائية الحيوية، والتصوير عالي الدقة، وسير العمل عالي الإنتاجية، مما يمكن من دراسة كيفية تأثير صلابة ECM على سلوك الخلايا وتحفيز تقدم الأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد الهيدروجيلات الإلكترونية المعتمدة على نظام PA

  1. عملية تشغيل أسطح الزجاج لتثبيت هلام PA
    ملاحظة: قم بجميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز مداري. اشطف جيدا بماء عالي الجودة بين الخطوات.
    1. نظف أسطح الزجاج بمادة مبيض بنسبة 10٪ لمدة 3 ساعات في طبق مقاوم للمواد الكيميائية (مثل البوليسترين). استخدم حجما كافيا لتغطية الزجاج بالكامل وتأكد من عدم وجود فقاعات محبوسة أو مناطق جافة.
      تحذير: المبيض مادة كيميائية شديدة التآكل وتفاعلية. اتبع تعليمات السلامة من الشركة المصنعة.
    2. حضن الغطاء في حمض الهيدروكلوريك (HCl) بعمق 0.2 متر لمدة 16 ساعة مع تحريك خفيف على الهزاز.
      تحذير: HCl شديد التآكل وقد يسبب حروق جلدية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    3. أضف 0.1 مليون NaOH واحتضن لمدة ساعة واحدة.
      تحذير: محاليل NaOH تآكل وقد تسبب حروق الجلد. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    4. حضن الغطاء في 0.5٪ APTES في ماء عالي الجودة لمدة 30 دقيقة.
      تحذير: APTES سام. اعمل مع APTES في غطاء بخاري مع معدات حماية مناسبة للحماية.
    5. اشطف أغطية الغطاء بكمية كبيرة من الماء لإزالة أي بقايا APTES.
      ملاحظة: الغسل غير الكامل سيسبب تفاعلا بين APTES والجلوتارالديهيد في الخطوة التالية ويؤدي إلى ترسيب بيضاء تعيق تنشيط سطح الزجاج.
    6. حضن الغطاء في 0.5٪ جلوتارالديهايد في PBS لمدة ساعة.
      تحذير: غلوتارالديهيد سام. اعمل مع جلوتارالديهايد في غطاء بخار مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    7. جفف الغطاء على مواد ماصة (مثل مناشف ورقية) طوال الليل. احتفظ بألواح الأغطية في وعاء نظيف ومغلق حتى الاستخدام.
  2. تحضير محلول الهيدروجيل PA وصب الجل
    ملاحظة: التركيبات اللازمة للحصول على الهيدروجيلز ذات معامل المرونة المحدد موضحة في الجدول 1. تم عرض أحجام الجل الموصى بها وأبعاد الزجاج لتطبيقات تجريبية مختلفة في الجدول 3.
    1. امزج مكونات الهيدروجيل PA في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.7 مل، باستثناء بيرسلفات الأمونيوم (APS) ورباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED).
      ملاحظة: لا تحضر كميات كبيرة لأن الجل عالي الصلابة يبلمر بسرعة وقد يتصلب قبل اكتمال الصب.
    2. قم بإزالة غاز خليط الجل PA، وAPS، وأنابيب TEMED في غرفة تفريغ بقوة 25 مم زئبق لمدة 30 دقيقة.
    3. جهز أغطية الغطاء العلوي الكارهة للماء بتطبيق طبقة مقاومة للماء لتنظيف الغطاء باستخدام قطعة قطن. تأكد من أن أغطية الغطاء خالية من البقع للحفاظ على تبلمر هلام متسق.
    4. أضف APS وTEMED إلى المحلول المزيل من الغازات، ثم قم بوضع الخليط بلطف على الغطاء المنشط.
    5. ضع الغطاء الكاره للماء فوق المحلول لتكوين طبقة هيدروجيل رقيقة وموحدة. دع الجل يبلمر لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من عدم وجود فقاعات محبوسة بين الأغطية وعدم انسكاب المحلول من الحواف.
      ملاحظة: اتبع الحجم الموصى به لصب الجل لضمان السماكة المناسبة؛ تسمح الهلام الرقيق جدا للخلايا بالإحساس بالزجاج الأساسي15. قبل تفكيك ساندويتش الجل، تحقق من الخليط المتبقي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للتأكد من البلمرة.
    6. اغمر ساندويتش الهيدروجيل في PBS لفصل الطبقات. تأكد من بقاء الهيدروجيل ملتصقا بغطاء الغطاء السفلي المنشط، وأن الانزلاق العلوي الكاره للماء ينفصل بسهولة.
  3. وظيفية الهيدروجيلز باستخدام روابط ECM
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في هذا القسم تحت ظروف معقمة داخل خزانة السلامة البيولوجية.
    1. قم بتعقيم الهيدروجيلز بغمرها في 70٪ إيثانول، ثم انقلها إلى أدوات بلاستيكية لزراعة الأنسجة باستخدام PBS معقمة.
      ملاحظة: لا تترك الهيدروجيلز في الإيثانول لفترة طويلة لأن ذلك سيؤدي إلى جفاف الجل وتأثير اقتران ECM.
    2. تحضير محلول وظيفي لخلط رئيسي مكون من الماء، الإيثانول، HEPES، وبيساكريلاميد (الجدول 4).
      تحذير: بيساكريلاميد سام عند الاستنشاق أو الابتلاع.
    3. حضر محاليل مخففة من مبادرات الأشعة فوق البنفسجية ورباعي الأكرلات. كلا الكواشفين يذابان في الإيثانول (الجدول 4).
      ملاحظة: قم بتخفيفات متسلسلة من رباعي الأكريلات في كل مرة، حيث أن الكميات الزائدة قد تؤدي إلى زيادة البلمرة وترسبات سطحية سوداء مرئية (انظر الشكل 3A).
    4. قم بوزن الكمية المطلوبة من NHS-Acrylate باستخدام توازن تحليلي. أعد تعليق NHS-الأكريلات في 50٪ إيثانول/50٪ ماء قبل الاستخدام مباشرة.
      ملاحظة: كمية NHS-أكريلات الزائدة ستؤدي إلى تكوين ترسبات سطحية سوداء مرئية وقد تؤدي إلى طلاء ECM غير متساو (الشكل 3B).
    5. أضف المحاليل المبادرة الضوئية للأشعة فوق البنفسجية، وتتراكريلات، وحلول NHS-الأكريلات إلى المزيج الرئيسي المعد في الخطوة 1.3.2. استنشق PBS وأضف الخليط الرئيسي إلى الجل، لضمان تغطيتها بالكامل.
    6. تعرض الهيدروجيلز (بدون أغطية أطباق زراعة الأنسجة) لأشعة فوق بنفسجية لمدة 400 ثانية (مصدر ضوء UV بطول موجي أقل من 365 نانومتر).
      تحذير: ارتد واقي للعين مناسب عند العمل مع الأشعة فوق البنفسجية.
    7. أزل الجل وضعه على الثلج. استنشق محلول الوظيفة، ثم غسل الجل ثلاث مرات بمحلول HEPES معقم مبرد مسبقا بحجم 25 ملليمولار (pH 6.0)، تليها ثلاث غسولات بمحلول معقم مبرد مسبقا بنسبة NaCl بنسبة 0.9٪.
    8. حضن الهيدروجيلز باستخدام رابطة ECM المفضلة في HEPES المعقمة مسبقا 100 ململ (pH 8.0) مع 100 ملليمول NaCl طوال الليل عند 4 درجات مئوية على هزاز مداري.
      ملاحظة: يمكن اختيار تركيز روابط ECM حسب تقدير المستخدم؛ ومع ذلك، من الضروري الحفاظ على تركيزات ليغاند متساوية عبر جميع الركائز ذات الصلابة المختلفة داخل نفس الدفعة.
    9. استنشق محلول رابطة ECM بحذر بعد 16 ساعة. اغسل الهيدروجيل ثلاث مرات باستخدام PBS وأضف الوسط الأساسي الخالي من المصل (PBS) للحفاظ على رطوبته. حضن الجل طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة للتحقق من تعقيم الخلايا قبل البذر.
      ملاحظة: سيظهر الوسط غائما بعد الحضانة الليلية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في وسط الزراعة الأساسية إذا كان هناك تلوث.
    10. استخدم الجل فورا لزراعة الخلايا أو خزنها عند 4 درجات مئوية في الوسط الأساسي لمدة لا تزيد عن 3 أسابيع.

2. توليد ركائز ECM المعتمدة على السيليكون قابلة للضبط ميكانيكيا

  1. تحضير أغطية زجاجية لطلاء جل السيليكون
    1. أغطية زجاجية نظيفة ب 3 M NaOH لمدة 20 دقيقة.
    2. اغسله جيدا بماء عالي الجودة خمس مرات واسحب الماء في النهاية. دعها تجف في الهواء واستخدم نفث هواء بالنيتروجين لإزالة أي قطرات أو حطام متبق.
  2. تحضير جل السيليكون
    1. وزن المكون A والمكون B لمطاط السيليكون ذو المكونين وفقا لنسبة الوزن المحددة في الجدول 2، باستخدام ميزان تحليلي. استخدم رأس ماصة مقطوعة لاستنشاق المحاليل اللزجة.
    2. اخلط المكون A والمكون B جيدا باستخدام رأس الماصة لضمان دمج كامل.
    3. قم بإزالة الغاز من الخليط في غرفة تفريغ بقوة 25 مم زئبق لمدة 10 دقائق.
  3. صب الجل على أغطية زجاجية
    1. ضع غطاء غطاء على حصيرة مطاطية موضوعة على طبقة اللف، لضمان تمركزها جيدا.
      ملاحظة: الحصيرة المطاطية تضمن إحكام تفريغ مناسب. بدون ختم كاف، قد ينزلق الغطاء وينكسر. قد يؤدي التمركز غير الصحيح إلى طلاء غير متجانس.
    2. شغل المكنسة الكهربائية لتثبيت غطاء الخزان.
    3. أضف 100 ميكرولتر من خليط الجل إلى مركز غطاء الغطاء. لف الغلاف عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان، تليها 8,000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثوان.
    4. اخبز الغطاء المطلي على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. دعه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: خزنها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهر قبل الاستخدام.
  4. عملية هلام السيليكون باستخدام روابط ECM
    1. عرض الغطاء المغطى بالجل السيليكون لبلازما الأكسجين لمدة 5 دقائق بقوة 11 واط.
      ملاحظة: التعرض لبلازما الأكسجين لفترة أطول أو قوة أعلى قد يؤدي إلى تشقق الجل. قد يحتاج المزيج الأمثل من القوة والوقت إلى اختبار حسب المعدات المستخدمة.
    2. حضر محلول سيلان يحتوي على 95٪ إيثانول، 0.5٪ APTES، و4.5٪ dH2O.
      ملاحظة: قم بجميع الخطوات التالية تحت ظروف معقمة داخل خزانة السلامة البيولوجية.
      تحذير: APTES سام. اعمل مع APTES في غطاء بخاري مع معدات حماية مناسبة للحماية.
    3. حضن الغطاء المغطى بالهلام بمحلول السيلانية لمدة 10 دقائق.
    4. اغسله جيدا باستخدام PBS خمس مرات.
    5. جهز محلول ECM الذي يحتوي على 100 ميكروغرام/مل EDC وECM المختار بتركيز مطلوب في PBS.
      ملاحظة: EDC غير مستقر في المحلول وحساس للرطوبة. جهزه طازجا قبل الاستخدام واحتفظ به مغلقا بإحكام في مكان بارد وجاف، محمي من الرطوبة وأشعة الشمس المباشرة.
      تحذير: EDC ضار إذا ابتلعت وسام إذا تم استنشاقها. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة واعمل بغطاء بخار.
    6. حضن غطاء الغطاء بمحلول ECM لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    7. اغسل غطاء الغطاء ب PBS خمس مرات. اشطف بالوسائط الأساسية وأضف خلايا.
      ملاحظة: تعتمد الكثافة المثلى للخلايا على خط الخلايا المحدد والأهداف التجريبية (مثل التقاء فرعي للشكل أو الطبقة الأحادية للالتصاق الخلية بالخلية). على سبيل المثال، تستخدم كثافة 0.1 ×10 6 خلايا/سم2 عادة للأرومات الليفية لتحقيق 50٪ التقاء خلال 48 ساعة.

3. تحضير ركيزة ECM للصبغ المناعي والتصوير

  1. التلوين المناعي والتصوير على الركائز القائمة على PA
    ملاحظة: توفر الهيدروجيلات المقاومة بحجم ثمانية عشر ملم عموما مساحة تصوير كافية للتحليل الكمي. لتطبيقات التصوير، صب الهيدروجيلز وإجراء التلوين المناعي في "غرف برتقالية" محضرة من أنابيب 15 مل. أعد استخدام الحجرات البرتقالية لعدة جولات من الصب بالجل والتلوين، بشرط الحفاظ على السلامة الهيكلية.
    1. حلقات التثقيب من فيلم البولي كربونات وفيلم مطاط السيليكون باستخدام قطر خارجي 18 مم وثقوب داخلية 14 مم لتحضير الفواصل والحشيات.
    2. اقطع فتحة في وسط غطاء أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل باستخدام المقص لإنشاء حجرة لصب الجل والتلوين.
    3. رأيت أنبوب الطرد المركزي عند علامة 14 مل. قم بقص الحواف غير المستوية بالمشرط وقم ببرد حافة الغطاء لضمان تناسبه مع صفيحة قياسية ذات 12 تجوية.
    4. قم بتجميع ساندويتش الهيدروجيل-غطاء (كما هو موضح في القسم 1)، ووضع حلقة الفاصل على غطاء الانزلاق المنشط.
    5. قم بتفكيك الساندويتش بمجرد أن تصبح الهلام مبلمرة بالكامل.
    6. قم بتعقيم الهيدروجيلز بحجم 18 مم وانقلها إلى صفيحة زراعة أنسجة بسعة 12 بئر مع PBS معقمة.
    7. قم بتنفيذ وظيفة رابطة ECM كما هو موضح في القسم 1.
    8. قم بعمل خلايا البذور وتثبيتها بفورمالديهايد بنسبة 4٪.
      ملاحظة: تجنب المثبتات القائمة على الكحول، لأنها تجف الهلام وتضر بسلامة الهيكل.
      تحذير: الفورمالديهايد سام ويجب استخدامه دائما داخل غطاء الأبخرة.
    9. (اختياري) أعد تجميع العينات على غرفة غطاء أنبوب الطرد المركزي. استخدم حشية سيليكون لإغلاق الحجرة.
      ملاحظة: قم بإجراء اختبار تسرب باستخدام PBS لعدة ساعات قبل التلوين. على الرغم من أن هذه الطريقة قد تبدو أكثر صعوبة، إلا أنها تعزز التلوين الموحد وتقلل من استهلاك الأجسام المضادة.
    10. تابع التلوين بفلورية المناعة وفقا للبروتوكولات المفضلة لدى المستخدم.
    11. بعد التلوين، خزن العينات في PBS مع مكمل 50٪ جلسرول. صور العينات بأسرع وقت ممكن.
      ملاحظة: تجنب وسائط التثبيت القياسية التي تتصلب، لأنها قد تتسبب في تكسير الهيدروجيل مع الوقت وتتلف العينات. تتناقص شدة الفلورة مع مرور الوقت؛ الصورة خلال أسبوع واحد للحصول على أفضل جودة إشارة.
    12. ضع قطرة صغيرة من PBS (أو وسط تركيب) على سطح زجاجي قاع لطبق زراعة المناديل. اقلب الهيدروجيلز الملونة بعناية على القطرة بحيث تواجه الخلايا زجاج الغطاء وتابع التصوير.
  2. التلوين المناعي والتصوير على ركائز ECM القائمة على السيليكون
    1. ثبت العينات باستخدام الفورمالديهايد بنسبة 4٪ وصبغها مباشرة على طبق زجاجي قاع باستخدام بروتوكول الفلورة المناعية القياسي. تجنب المثبتات القائمة على الكحول لأنها قد تتسبب في تكسير ركائز ECM.
    2. عينات الصور مباشرة باستخدام مجهر فلوري تقليدي.

4. جمع البروتينات والحمض النووي الريبي من الخلايا المطلية على ركائز ECM

  1. باستخدام الملقط، أزل الهلام بعناية من طبق الزراعة وغمره في PBS معقم لإزالة بقايا الوسط والمصل.
    ملاحظة: تعامل مع الأغطية برفق، فهي هشة جدا وقد تنكسر بسهولة.
  2. ضع بلطف حافة الهيدروجيل على مناديل منخفضة الوبر لإزالة فائض PBS.
  3. أضف كمية مناسبة من محلول استخراج الحمض النووي الريبي إلى غطاء طبق زراعة الأنسجة.
    ملاحظة: الكواشف القائمة على الفينول-جوانيدين متوافقة مع استخراج الحمض النووي الريبي من هلام PA. يمكن استخدام مخازن تحلل البروتين وفقا لمتطلبات التجريب. تصور العينات تحت المجهر بعد حضانة مخزن التحلل لضمان تعطيل كامل للخلايا.
  4. ضع غطاء الغطاء (جانب الجل للأسفل) على محلول التحلل. ارفع وخفض الهيدروجيل بحذر عدة مرات لضمان تفتيش جميع الخلايا بشكل منتظم.
  5. اكشط سطح الجل بلطف لتحرير المادة الليزاتية.
    ملاحظة: لا تستخدم كاشطات الخلايا البلاستيكية التجارية، لأن البلاستيك الصلب قد يضر الهيدروجيلز اللينة ويلوث الليزات بقطع الجل. البلاستيك الناعم المستخدم في صنع الفواصل (انظر الخطوة 3.1.1) مناسب لهذا الغرض ويمكن إعادة استخدامه لصنع كشاطات مخصصة.
  6. تخزين الحمض النووي الريبي أو محللات البروتين عند -80 درجة مئوية حتى المعالجة الإضافية باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية أو استخدمها فورا.

5. توليد ثقافة الكروية ذات المستوى الواحد

  1. جهز الهيدروجيل بقدرة 75 باسكال PA على أغطية 18 مم وجعل السطح وظيفيا باستخدام مستخلص الغشاء القاعدي (BME) أو أي رابطة ECM مناسبة أخرى لتسهيل تثبيت الخلايا.
  2. تقوم الخلايا بالبذور على الهيدروجيلات المطلية ب ECM أو جل السيليكون بالكثافة المطلوبة.
  3. بعد ساعتين، قم بإزالة الخلايا غير المتصلة بلطف وأضف طبقة BME مخففة في وسط قاعدي مبرد مسبقا.
    ملاحظة: الميكروفون الحيوي يبلمر مع ارتفاع درجة الحرارة. قم بالتبريد المسبق قبل استخدام الماصات. يتم تحديد نسبة الوحدة الطبية الحيوية المدمجة بناء على السلامة الميكانيكية المطلوبة والثبات للسقالة ثلاثية الأبعاد الناتجة.
  4. حضن المزارعين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 1.5 ساعة للسماح ببلمرة الطب الحيوي.
  5. أضف بلطف وسط زراعة الخلايا لتغطية الجل ثلاثي الأبعاد بالكامل.
  6. الحفاظ على الثقافات تحت ظروف قياسية. ستستمر الخلايا في النمو والتجميع ذاتيا إلى كريات ثلاثية الأبعاد مع مرور الوقت حتى يتم الوصول إلى النقطة النهائية التجريبية المرغوبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اختبار صلابة جل PA الناتجة عن التركيبات في الجدول 1 تجريبيا باستخدام جهاز قياس الريومتر. تم اختيار هلام بقيم صلابة اسمية تبلغ 0.4 كيلو باسكال، 6 كيلو باسكال، و60 كيلو باسكال، تمتد عبر ثلاثة رتب من الحجم. كانت قيم الصلابة المقاسة 363 ± 76 باسكال لجل 400 باسكال، 6.41 ± 0.50 كيلوباسكال لجل 6 كيلوباسكال، و36 ± 8 كيلوباسكال لجل 60 كيلوباسكال (الشكل 4A). لتقييم الارتباط المتحد ب ECM بجل PA، تم ربط الفيبرونكتين الموسوم بالفلورية على سطح الهلام. تم تصوير خمسة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر بروتوكول تصنيع ECM الموضح سير عمل قابل للتكرار وقابل للتوسع وفعال من حيث التكلفة، ويمكن تنفيذه بسهولة في معظم المختبرات. على الرغم من أن أدوات الزراعة الزجاجية والبلاستيكية التقليدية مريحة وتتيح جمع البيانات بسرعة، إلا أن الركائز الصناعية تفشل في تكرار صلابة الأنسجة ذات الصلة فسيولوجيا. الركائز البديلة القابلة للتعديل ميكانيكيا مثل بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) أو ميثاكريلويل الجيلاتين (GelMA) أسهل في التصنيع، لكنها عموما لا تستطيع تحقيق قيم صلابة في النطاق تحت كيلو باسكال، مما يحد م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من جائزة التميز البحثي والتنوع والاستقلال من CIHR لانتقال المسار المهني المبكر 202305ED8-509143-244657 (إلى F.B.K.) ومعهد السرطان الوطني للصحة R35 CA242447-01A1 إلى V.M.W. ك.ج. هو زميل لويس أ. سينيلي في مؤسسة أبحاث السرطان دامون رونيون (DRG-2547-25).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)919-30-2-Thermo Fisher Scientific
1.7 mL microcentrifuge tubes-LMCT1.7BFroggaBio
12-well tissue culture-treated plates-83.3921Sarstedt
15 mL centrifuge tubes (for orange chamber)-CLS430790Corning
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure)106797-53-9-Thermo Fisher Scientific
2% Bisacrylamide solution110-26-9-Bio-Rad
3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)25952-53-8-Chem Impex International
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride28718-90-3-Sigma
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)-D1306Invitrogen
40% Acrylamide solution01/06/1979-Bio-Rad
50% Glutaraldehyde111-30-8-Thermo Fisher Scientific
6 cm tissue culture-treated dishes-83.3901Sarstedt
A549 cells-CCL-185ATCC
Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester38862-24-7-Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit antibody-A11008Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS ester (tris(triethylammonium salt))-A37572Invitrogen
Ammonium persulfate7727-54-0-Bio-Rad
Clear impact-resistant polycarbonate film (0.005 in.; spacer)-85585K72McMaster-Carr
CY 52-276 silicone gel, Components A and B2624028-Dow
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-11995-065Thermo Fisher Scientific
Ethanol, anhydrous64-17-5-Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix-4385612Thermo Fisher Scientific
Fetal bovine serum-A52567-01Thermo Fisher Scientific
Fibronectin-356008Corning
Formaldehyde (16%)-28908Thermo Fisher Scientific
HEPES7365-45-9-BioShop
High-temperature silicone rubber sheet (0.020 in.; gasket)-86435K452McMaster-Carr
Hydrochloric acid7647-01-0-BioShop
Large hollow hole punch tool set-66000Mayhew Pro
Matrigel-356234Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 250 mL-CLS1395250Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 500 mL-CLS1395500Corning
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate-4346906Thermo Fisher Scientific
Microscope slide coverslips, 18 mm diameter-72222-01Electron Microscopy Sciences
Microscope slide coverslips, 50 mm diameter-1.84E+16eBay
PBS (1×)-14190144Thermo Fisher Scientific
PBS (10×)-70011044Thermo Fisher Scientific
Phalloidin17466-45-4-Biotium
Phospho-FAK (Tyr397) antibody-85567Cell Signaling Technology
Phospho-MLC (Ser19) antibody-3671Cell Signaling Technology
Plasma cleaner-PDC-32GHarrick Plasma
qPCR primers (forward and reverse)-N/AIntegrated DNA Technologies
qScript cDNA Synthesis Kit-95047QuantaBio
Rain-X--Rain-X
Screw-cap tubes, conical base, 15 mL-62.554.101Sarstedt
Screw-cap tubes, conical base, 50 mL-62.547.205Sarstedt
Serological pipette, 10 mL-170356NThermo Fisher Scientific
Serological pipette, 25 mL-170357NThermo Fisher Scientific
Serological pipette, 5 mL-170355NThermo Fisher Scientific
Serological pipette, 50 mL-170358NThermo Fisher Scientific
Sodium hydroxide1310-73-2-BioShop
SYPRO Ruby protein gel stain-S12000Invitrogen
TEMED110-18-9-Bio-Rad
TRIzol reagent-15596026Thermo Fisher Scientific
UV chamber-165-5031Bio-Rad

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BiologyAllAllExtracellular matrixstiffnessmechanotransductionhydrogelsfibrosis
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة