توصيف بنية ووظيفة غشاء الدهون والبروتين باستخدام طبقات مزدوجة لواجهة القطرات

Summary

يتم تقديم بروتوكول تجريبي لتجميع وتحفيز كهربائيا وتحليل طبقات الطبقات الثنائية لواجهة القطرات الممزوجة بجراميسيدين A. يتم قياس علاقات البنية والوظيفة بين الدهون والبروتينات من خلال قياس التغيرات في مساحة الغشاء، والتدفق الأيوني، والموصلية أحادية القناة، وربط هذه الاستجابات بتغيرات شبيهة باللدونة في التوصيل الأيوني في نموذج غشاء مستوحى من المشابك الكهربائية.

Abstract

توفر طبقات الطبقات الثنائية لواجهة القطرات (DIBs) منصة قابلة للضبط لاستكشاف الخصائص الكهروميكانيكية لأغشية الدهون والببتيدات تحت التحفيز الكهربائي المسيطر عليه. تمكن DIBs من قياسات توصيل الأيونات أحادية القناة والمجموعة على مساحات أغشية أكبر بكثير من تلك التي يمكن تحقيقها باستخدام تقنيات تثبيت الرقعة التقليدية، مما يسمح بتحليل التشوه الكهروميكانيكي على مستوى الغشاء وتأثيره على الببتيدات الموصلة للأيونات. من خلال ضبط هيكل الغشاء بشكل منهجي عبر طور زيت الهيدروكربونات السائبة (مثل الهكساديكان [C16] مقابل الدوديكان/السداسي [C12/C16] [25٪/75٪، v/v])، تتيح هذه المنصة من الأسفل إلى الأعلى التغير المنهجي في تركيب الغشاء وبيئة الزيت، مما يؤثر على مرونة الغشاء اللزوجة وإعادة تنظيم الهيكل، وبالتالي توصيل أيونات الببتيد. تم توفير إجراءات مفصلة لتجميع أغشية الغراميسيدين A المطعم 1,2-ديفيتانويل sn-جليسرو-3-فوسفوكولين (DPhPC) باستخدام تركيبات زيت هيدروكربونية مختلفة، وتطبيق بروتوكولات النبضة الجهدية التي تدفع الأغشية إلى حالات كهروميكانيكية شبه مستقرة. يتميز التوصيل الأيوني الغشائي التكيفي، بما في ذلك الاستجابات قصيرة المدى الشبيهة باللدونة (شبيهة ب STP) وطويلة الأمد الشبيهة بالتعزيز والانخفاض (شبيهة ب LTP/LTD) في نظام الغشاء النموذجي. وبشكل أوسع، يوفر هذا البروتوكول نهجا قويا وقابلا للتكرار للتحقيق المنهجي في المساهمات الكهروميكانيكية المعتمدة على التركيب على مستوى الغشاء في سلوك التوصيل الشبيه بالتشابك، ولفهم كيفية تعديل بيئات أغشية الدهون لوظيفة قناة الأيونات.

Introduction

الأغشية البيولوجية هي هياكل فوق جزيئية حيوية يمكنها تنظيم التوصيل الأيوني وتمكين التواصل بين الخلايا العصبية من خلال المشابك الكهربائية والكيميائية ^1,2,3,4. يتم التحكم في هذا النوع من التواصل بشكل أكبر بواسطة اللدونة المشبكية، حيث تعدل التغيرات الهيكلية في المشابك العصبية قوتها واستمرارها على مدى فترات زمنية^5،6، والتي توصف عادة بمصطلحات اللدونة قصيرة المدى (STP) والتعزيز أو الانكماش طويل الأمد (LTP أو LTD). هذه الظواهر، التي تتضمن تغييرات ديناميكية في توصيل الغشاء استجابة للنشاط العصبي، غالبا ما ترتبط بالمرونة العصبية⁷، التي تشكل أساس التعلم والذاكرة⁸. غالبا ما تركز النماذج التقليدية للمرونة على التنظيم الكيميائي الحيوي لقنوات الأيونات من خلال تخليق البروتين، أو النقل، أو الفسفرة⁹. ومع ذلك، تم تجاهل دور أغشية البلازما العصبية في نماذج اللدونة إلى حد كبير،^10,11.

تستخدم طرق الرقعة المثبتة لأكثر من نصف قرن لدراسة الفيزيولوجيا الكهربائية ذات القناة الأيونية الواحدة. ومع ذلك، يمكنها فقط استجواب مناطق أغشية أصغر بكثير من المشابك العصبية السليمة أو النماذج الصناعية واسعة النطاق. وبالتالي، فهي تشكل قيدا تقنيا لدراسة إعادة تنظيم وتشوه الأغشية المتوسطة المقياس. يعتبر المقياس المتوسط بشكل متزايد مقياس طول حرج لفهم العديد من جوانب الفيزياء الحيوية للغشاء^12,13.

تم تقديم منهجية لاستخدام طبقات الواجهة القطرية 1,2-ديفيتانويل sn-جليسرو-3-فوسفوكولين (DPhPC) ذات الطبقات الثنائية (DIBs)^14,15 المطعمة بأيونوفور كاتيون الببتيد أحادي التكافؤ، غراميسيدين-A (gA)، لنمذجة التوصيل الأيوني، مشابها لما يحدث في المشبك الكهربائي. يقدم هذا النظام عدة مزايا رئيسية: (1) توفر DIBs منصة قابلة للضبط للدهون والزيت تسمح بإعادة تنظيم الأغشية بشكل منهجي¹⁶؛ (2) تسمح DIBs بدراسة أحداث القناة الأحادية وقناة المجموعات عبر نطاق من المقاييس الأطوال^17،18؛ و(3) تمكن DIBs من استجواب رقع غشاء بحجم² تحت المليمتر تلتقط إعادة هيكلة الأغشية الجماعية الناتجة عن الكهروميكانيكية، مع الحفاظ على القدرة على تحديد أحداث توصيل الأيونات أحادية القناة^19,20. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تتطلب استجوابا كهربائيا وبصريا متزامنا لكهروميكانيكا الغشاء على مساحات أغشية أكبر من تلك التي يمكن الوصول إليها بواسطة مشبك الرقعة التقليدي، مع الاحتفاظ بالقدرة على حل أحداث القنوات المنفصلة. ويكون مفيدا بشكل خاص عندما يكون الهدف التجريبي هو دراسة كيفية تأثير تركيب الغشاء، وبيئة الزيت، وموجات الجهد المفروض على إعادة هيكلة الغشاء الجماعي وتوصيل الببتيدات. الطريقة أقل ملاءمة للتجارب التي تتطلب بنية خلوية طبيعية أو قراءات جزيئية مباشرة لتغيرات تكوين البروتين في الأغشية البيولوجية السليمة 19,20,21.

من خلال تطبيق التحفيز الكهربائي الفسيولوجي المناسب، يتم دفع DIBs إلى حالات مستقرة غير متوازنة حيث يغير إعادة الهيكلة الكهروميكانيكية الديناميكية توصيل قنوات الأيونات الببتيدية. هذه التغيرات الناشئة في التوصيل الأيوني تشبه وصفيا ظواهر STP وLTP وLTD العصبية التي نوقشت في علم الأعصاب 22,23,24. في هذه الدراسة، تفسر هذه السلوكيات بشكل أساسي على أنها استجابات فيزيائية على مستوى الغشاء للتحفيز الكهربائي المرتبطة بخصائص ميكانيكية داخلية للغشية، مثل اللزوجة المرونة وقابلية الانضغاط في نظام الغشاء النموذجي²⁵. ومن الجدير بالذكر أن الدراسة الموضحة هنا تبني على أدلة سابقة تشير إلى أن طبقات الدهون الثنائية يمكن أن تظهر ذاكرة كهربائية أساسية من خلال تحولات التوصيل المستمرة وتخزين الشحنة السعوية بعد التحفيز^{14، 15، 25، 26، 27، 28، 29، 30، 31، 32، 33، 34}، مقدما رؤى جديدة حول آليات يمكن للطبقات الثنائية الدهنية من خلالها دعم الوظائف التكيفية الشبيهة بالتشابك في غياب آليات خلوية معقدة. وأخيرا، تتيح هذه المنهجية أيضا الفحص المباشر لعلاقات البنية والوظيفة وكيفية نشأة السلوك الكبير الناشئ من إعادة تنظيم هيكلية بسيطة 21,25,27.

Protocol

نظف جميع الأدوات الزجاجية والمعدات التحضيرية جيدا باستخدام منظفات المختبر المناسبة وشطفها بالماء المقطر قبل تحضير العينة. ارتد نظارات السلامة في جميع الأوقات وقفازات نيتريل أو لاتكس لتجنب التلوث. تخلص من جميع النفايات الكيميائية وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية. تأكد من تخزين المذيبات المتطايرة بشكل صحيح وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية. ضمان بقاء مساحة وأجهزة مختبر التجارب (الشكل 1A)، ووعاء التجارب (الشكل 1B)، والاتصالات الكهربائية والبصرية (الشكل 1C) غير عوائق وخالية من العقبات.

1. تحضير محلول العزل المائي

1. وزن الكمية المناسبة من حمض البروبانسولفونيك 3 (N-مورفولينو) وكلوريد البوتاسيوم (KCl) للحصول على التركيزات النهائية المطلوبة (مثل 10 ملليمولار MOPS، 0.1 مليون كيلوسيلتر في 500 مل).
2. أضف MOPS وKCl إلى ~450 مل من الماء المقطر في قارورة حجم 500 مل أو أسطوانة متدرجة وتحرك باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي حتى يذوب بالكامل.
3. قس الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس pH معاير. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 بإضافة 1 مليون هيدروكسيد بوتاسيوم (KOH) أو حمض الهيدروكلوريك (HCl) بزيادات 0.25 مل مع التحريك المستمر.
4. ارفع الحجم الكلي إلى 500 مل باستخدام الماء المقطر وامزجه جيدا. انقل المخزن إلى زجاجة نظيفة تحمل علامات، وأغلقها، وخزنها عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: استخدم المخزن لمدة تصل إلى ~2 شهر. تحقق من الرقم الهيدروجيني وأعد ضبطه إلى 7.4 قبل كل استخدام.

2. تحضير محلول جراميسيدين

1. في غطاء بخار كيميائي، أضف 5 ملغ من الجرامسيدين A (gA) إلى قارورة زجاجية نظيفة بسعة 20 مل. أضف 10 مل من الميثانول باستخدام حقنة زجاجية أو محكمة للغاز ودوامة حتى يذوب الببتيد بالكامل. ضع علامة على القارورة ك "gA stock" وخزنها عند -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: تستخدم تجارب المجموعة نسب أمورية للدهون: الببتيدات ~1:^10-4. تستخدم التجارب ذات القناة الواحدة ببتيد أقل ~10–100 ضعف (1:^10-5–^10-6) لتحليل الأحداث الفردية خلال أوقات تسجيل قصيرة (<دقيقة واحدة). تحضير مخزن مخفف يحسن دقة التوصيل عند نسب مولر منخفضة (< ~ 1:^10-4).
2. قم بتنظيف قارورتين زجاجيتين نظيفتين إضافيتين بسعة 20 مل باستخدام غاز الأرجون لمدة ~5 ثوان لكل منهما لإزالة الغبار.
3. باستخدام حقنة نظيفة محكمة الإغلاق للغاز، قم بتوزيع 9.9 مل من الميثانول في كل قارورة مطهرة.
4. قم بتوصيل 100 ميكرولتر من محلول مخزن gA مع حقنة معقمة محكمة الإغلاق للغاز في قارورة واحدة للحصول على حجم إجمالي يبلغ 10.0 مل. ضع علامة على هذه القارورة ب "A". التركيز = 2.66 ميكرومولار جيلاموسبير في الميثانول.
5. قم بإدخال 100 ميكرولتر من محلول "A" إلى الزجاجة الثانية للحصول على حجم إجمالي يبلغ 10.0 مل. ضع علامة على هذه القارورة كحل "B". التركيز = 26.6 نانومالوا جيلاغماكلون بالميثانول.
6. أغلق القوارير بأغطية ولفها بطبقة باراغليم.
7. خزن جميع محاليل الجيرومي عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. تحضير الحويصلات الببتيدية الدهنية

1. قم بتنظيف قارورة زجاجية نظيفة بسعة 20 مل باستخدام غاز الأرجون لمدة ~5 ثوان.
2. أضف 4 ملغ من الدهون 1,2-ديفيتانويل إس إن جلسيرو-3-فوسفوكولين (DPhPC) إلى القارورة.
3. في غطاء البخار، أضف 1 مل من الميثانول باستخدام ماصة زجاجية. قم بتدوير أو دوامة بلطف حتى يذوب كل الدهون.
4. باستخدام حقنة محكمة الإغلاق للغاز بسعة 500 ميكرولتر، أضف 178 ميكرولتر من محلول "A" (لتجارب STP على مستوى المجموعة؛ نسبة مولية DPhPC:gA = 1:^10-4) أو 890 ميكرولتر من محلول "B" (للتجارب ذات القناة الواحدة؛ نسبة DPhPC:gA المولية = 1:5×^10-6) إلى محلول DPhPC للميثانول. دوامة لطيفة للخلط.
5. تحت تيار أرجون لطيف في غطاء البخار، تبخر الميثانول حتى يتكون طبقة دهنية رقيقة وموحدة في قاع القارورة.
6. ضع القارورة المفتوحة في فرن تفريغ بدرجة حرارة 40 درجة مئوية واسحب تفريغ كامل لمدة 10–12 ساعة أو طوال الليل لإزالة المذيب المتبقي.
7. إزالة القارورة من فرن التفريغ وإضافة 2 مل من مخزن 0.1 مليون كيلو سيلتر المعد في القسم 1 لتجارب STP، مما يؤدي إلى تركيز نهائي للدهون والغراميسيدين في تعليق يبلغ 2.36 مللي مولار و236 نانومتر على التوالي. لتجارب قناة واحدة، أضف 2 مل من مخزن مؤقت بسعة 1 M KCl كما هو معد في القسم 1. دوامة لإعادة ترطيب طبقة الدهون والحصول على تعليق دهني بمقدار 2 ملغ/مل، مما يؤدي إلى تركيز نهائي للدهون والغراميسيدين في التعليق يبلغ 2.36 ملليمولار و11.8 نانومتر على التوالي.
8. جمد القارورة على درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6 دقائق، ثم قم بإذابة القارورة على صفيحة ساخنة أو حمام ماء بدرجة حرارة 40 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. دوامة للخلط لفترة وجيزة. كرر دورة التجمد والذوبان ست مرات لتعزيز تكوين الحويصلات متعددة الصفائح.
9. قم بتجميع جهاز بثق حويصلات دهنية بغشاء محفور بمسار بقطر مسام 0.1 ميكرومتر، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مرر 500 ميكرولتر من المخزن عبر البثق ثلاث مرات لترطيب الغشاء، والتأكد من عدم وجود تسربات، وتخلص من المخزن المؤقت.
10. قم بتحميل 1 مل من تعليق الببتيد الدهني المذائب في البثق وقم بإجراء 31 تمريرة عبر غشاء 0.1 ميكرومتر للحصول على حويصلات أحادية السطح قطرها ~100 نانومتر وضمان تجانس الحجم.
11. نقل الحويصلات البارزة (الحويصلات أحادية السطح الكبيرة، LUV) إلى أنبوب PCR بسعة 1 مل، مع وضع الملصق، وتخزينه عند 4 درجات مئوية. استخدم خلال أسبوعين من التحضير.
12. أغلق أي تعليق بروتيني دهني غير مطرود متبق في القارورة الأصلية، ولفه بطبقة بارافيلم، وتخزينه عند -80 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.
13. إذا استخدمت عينات متجمدة سابقا وغير مطروقة، أعد إذابة العينة عند 40 درجة مئوية باستخدام صفيحة ساخنة أو اترك العينة تسخن إلى درجة حرارة الغرفة، ثم قم ببثق العينة.

4. تحضير جل الأجاروز

1. ضع كأس زجاجي نظيف بسعة 50 مل على صفيحة ساخنة. أضف قرص أغاروز واحد إلى 50 مل من نفس المحلول المستخدم لترطيب طبقة الدهون (مثل 10 مللي مولار MOPS، 0.1 مللي كيلو سيلتر، الرقم الهيدروجيني 7.4) لتكوين محلول جل أغاروز بنسبة 1٪.
2. أضف بار تحريك تفلون نظيف وحرك بقوة حتى يتلاشى الحب.
3. غط الكأس بورق الألمنيوم واثقب فتحة تهوية صغيرة باستخدام ملعقة معدنية. اضبط درجة حرارة صفيحة التسخين على 220–230 درجة مئوية. يصبح المحلول شفافا ويصل إلى غليان متدحرج، مما يشير إلى ذوبان الأجاروز تماما.
4. أطفئ النار وأزل ورق الألمنيوم بحذر. قم بإزالة أي فيلم سطحي باستخدام ملعقة معدنية نظيفة. استخدم محلول الأغاروز الساخن فورا لطلاء الأقطاب الكهربائية أو اتركه ليبرد ويتصلب في الكأس لاستخدامه لاحقا.
5. بعد طلاء الأغاروز بالأقطاب الكهربائية، غط الأغاروز المتصلب، ثم أغلق بطبقة بارا فيلم، ثم ملصق، وخزن عند 4 درجات مئوية. عند الحاجة، أعد تسخينه حتى يغلي بالتحريك حتى يذوب تماما.

5. تحضير الأقطاب الكهربائية

1. قطع سلك فضي بقطر 0.125 مم إلى أطوال ~70 مم لأقطاب المنصة الأمامية وأطوال ~130 مم لأقطاب التأريح.
2. باستخدام لهب مفتوح (مثل ولاعة يدوية أو موقد بنسن)، أمسك أحد طرفي كل سلك فضي أفقيا في أكثر مخروط مركزي حرارة لللهب حتى يذوب الطرف ويشكل كرة كروية قطرها ~0.2 مم (الشكل 2A).
3. ضع الأسلاك على سطح نظيف وتحقق تحت المجهر من أن الكرات كروية وذات حجم متشابه. إذا كانت الكرة مستطيلة أو غير منتظمة، اقطع طرفها وكرر عملية الذوبان (الخطوة 5.2).
4. ضع طرفي كلا السلكين الفضيين في وعاء زجاجي يحتوي على مبيض منزلي طازج (هيبوكلوريت الصوديوم، NaClO). تأكد من أن الكرات مغمورة بالكامل وتحتضن لمدة ساعة واحدة على الأقل لتكلور السطح وتكوين Ag/AgCl. يؤكد المظهر البني الرمادي الباهت نجاح الكلورة (الشكل 2B).
5. أزل الأسلاك من المبيض بمجرد أن تصبح أطراف الكرة رمادية باهتة، اشطفها جيدا بالماء المقطر، وضعها على سطح نظيف وخال من الوبر لتجف.
6. احصل على حامل ماصة في المقدمة وحامل قطب أرضي واحد. اقطع شعيرات زجاجية بوروسيليكات بقطر 100 مم (1.0 مم OD، 0.58 مم ID) إلى نصفين باستخدام قاطع زجاج.
7. أدخل نصف شعرية في حامل الماصة في رأس المسرح وشد الحامل لتثبيته. قم بتركيب شعيرات شعرية كاملة بقطر 100 مم على حامل الأقطاب الأرضية وتثبيتها.
8. أدخل الطرف غير الكروي لسلك الفضة بطول 130 مم في شعيرات القطب الأرضي حتى يبرز ~20 مم من نهاية الكرة. قم بلصق الطرف المقابل للسلك بالحامل، مع ترك ~5 مم مكشوفا لتوصيل الأرضي.
9. كرر الخطوة التالية بسلك 70 مم لقطب المسرح الأمامي، لضمان اتصال قوي بين السلك وموصل المسرح الأمامي (قطعة ذهبية اللون). قم بقص أي سلك زائد من طرف موصل المنصة الرأسية.
10. اغمس كل كرة فضية مكلورة في الأغاروز، فوق نقطة التقاء عمود الكرة، لتكوين طبقة رقيقة ومتجانسة. ادخل وأخرج على الأقل 10 مرات.
11. اسحب القطب ودع الأغاروز يتشكل في درجة حرارة الغرفة. كرر الغمس إذا لزم الأمر لإنتاج قشرة أغاروز ناعمة ومتساوية بسماكة عشرات الميكرومترات. تجنب الطلاء المرتفع جدا أو المنخفض جدا على السلك (الشكل 2C).
12. قم بتركيب أقطاب المنصة الرأسية والأرضي على أجهزة التحكم الدقيقة. قم بتوصيل سلك التأريض المكشوف (~5 مم) بأرضية المضخم باستخدام مشبك تمساح.
13. باستخدام الملقط، قم بثني كل قطب بلطف في منتصف المسافة بين نهاية الكرة والشعيرات الدموية بحيث يكون طرف الكرة عموديا على مرحلة المجهر. تجنب الانحناءات التي تزيد عن 90° لتقليل التشوه البصري في المجهر في الرؤية والتقاط الفيديو.
14. اضبط اتجاه الأقطاب في حواملها بحيث تكون نهايات الكرة المغطاة بالأجاروز عمودية على مستوى التصوير في المجهر (الشكل 3A).

6. تكوين طبقات مزدوجة لواجهة القطرات (DIBs)

1. ضع طبق بتري نظيف وشفاف على منصة المجهر المقلوب. املأ الطبق بزيت الألكان (مثل 100٪ سداسي كان، أو 25٪/75٪ v/v دوديكان/سداسي كان) حتى عمق ~ 5 مم (الشكل 1B).
2. باستخدام أدوات التحكم الدقيقة في المعالج، اخفض طرفي الكرة المطلية بالأجاروز إلى عمق ~2.5 مم تحت سطح الزيت. تجنب الحركة السريعة مع الميكرو مانبوليتور لمنع تصادم رأس الكرة الكهربائي مع طبق البتري.
3. اضبط تركيز المجهر حتى تصبح طرفي الكرة وطبقات الأجاروز واضحة تماما. ضع الأقطاب بالقرب من حافة مجال الرؤية بحيث يمكن ملاحظتهما في نفس الوقت.
4. باستخدام ماصة معايرة بسعة 2 ميكرولتر، يتم استنشاق تعليق الحويصلات الببتيدية الدهنية المبثقة. قم بتوزيع 250 نانولتر من التعليق مباشرة على كل طرف كرة مطلية بالأجاروز باستخدام رأس ماصة منفصل لكل منهما، دون لمس رأس الماصة على قشرة الأغاروز.
   ملاحظة: لتقليل اهتزازات اليد وزيادة الثبات، ثبت كلا المرفقين على حافة طاولة مضادة للاهتزاز. ثبت معصم التوصيل باليد غير القابلة للعمل على الماصة، واغمس الماصة ببطء في الزيت، واقترب من القطب تدريجيا. قد يقلل حبس النفس القصير أثناء تحميل القطرات من الحركات غير المقصودة.
5. دع القطرات تنتشر وتغطي قشرة الأجوروز وتتدلي بعيدا عن القطب تحت الجاذبية. لاحظ الترهل من الجانب عبر جدار صحن بتري إذا كان الجو خاليا (الشكل 3B).
   ملاحظة: يعتمد الوقت المطلوب لترهل القطرات على توزيع حجم الحويصلة، ودرجة الحرارة، وتضاريس الأغاروز. بالنسبة لمستويات DIB DPhPC، انتظر على الأقل 5 دقائق بعد ترسيب القطرات¹⁵.
6. اهز طاولة مضادة الاهتزاز بلطف لتقييم جاهزية القطرات. تأكد من أن القطرات المتدلية تتحرك بتأخير طفيف بالنسبة لحركة الأقطاب، مما يشير إلى تكوين قطرات أحادية الطبقة الدهنية المغطاة بالكامل.
   ملاحظة: يحدث التأخير في الحركة لأن تكون طبقة أحادية دهنية حول القطرة المائية يقلل بشكل كبير من التوتر السطحي، مما يؤخر الاستجابة الفيزيائية عند تحريك القطب في الزيت.
7. إذا لم يلاحظ هذا السلوك، انتظر دقيقتين إلى ثلاث دقائق إضافية وكرر العملية.

7. الإعداد الكهربائي والمراقبة ذات الطبقتين (البصرية والكهربائية)

1. تأكد من توصيل المجهر، وطاولة مضادة الاهتزاز، وقفص فاراداي، وجميع المكونات الكهربائية، بما في ذلك المضخم، والمعدل، ومولد الدوال، والكمبيوتر، بأرضية مشتركة (الشكل 1).
2. رتب وصلات الأجهزة وفقا لدليل إعداد الشركة المصنعة. استخدم الشكل 1C كمرجع تخطيطي للتكوين الكهربائي والبصري الأساسي. راجع التعليمات التفصيلية حول التأريض³⁵، وتكوين الأجهزة/البرمجيات، وضبط إزاحة الماصات لتجارب DIB.
   ملاحظة: اتبع تعليمات إعداد المعدات الخاصة بجميع البرمجيات والأجهزة المدرجة في جدول المواد.
3. قم بتوصيل أقطاب المسرح الرأسي وأقطاب التأريض بمضخم التشكيلة المثبتة.
4. قم بتكوين مولد وظائف خارجي (أو قناة إخراج برنامج الاستحواذ) لتوليد موجة جهد مثلثي بتردد 10 هرتز و10 مللي فولت. تأكد من السعة والتردد على راسم الإشارة المتصلة وداخل برنامج الاستحواذ.
5. بعد أن ترهل القطرات لمدة ~ 10 دقائق، استخدم الميكرو مانبولايترز لجعل القطرتين يتلامسان بلطف. اضبط مواقع الأقطاب بحيث لا تزيد مساحة تلامس القطرات في البداية عن ~ ربع قطرها.
6. شغل موجة المثلث 10 هرتز و10 مللي فولت وراقب استجابة التيار السعوي باستخدام المضخم وبرنامج الاستحواذ.
7. انتظر تكوين الطبقة الثنائية التلقائي، والذي يشار إليه كهربائيا من خلال استجابة تيار سعوية متوسع من قمة إلى ذروة، وبصريا بانعكاس داخلي متزايد (مظهر بيضاوي) من تلامس الطبقتين (الشكل 4). تأكد من أن الطبقات الثنائية الدهنية النقية تظهر هضبات تيار مستطيلة إلى منبه الجهد المثلث، بينما تظهر الطبقات الثنائية المغذية ب gA عند ~1:^10-4 دهون: الببتيدات هضاب مائلة تعكس التوصيل الأيوني الجماعي.
8. اضبط مساحة تلامس القطرة عن طريق تحريك الأقطاب قليلا حتى تصل استجابة التيار السعوي من الذروة إلى القمة لشكل موجة المثلث 10 هرتز 10 مللي فولت بين ~100–200 بيكو أمبير ل~250 نانولتر DIBs في زيوت C16 أو C12/C16، مما يعادل نطاق سعة ~250–500 بيكوفوراد³³.
   ملاحظة: النبضات عالية التردد أو جهود التثبيت المستمر غير الصفرية يمكن أن تسبب الترطيب الكهربائي وتمدد الطبقة الثنائية بشكل مفرط، مما يؤدي إلى تماسك القطرات وتمزق الطبقتين. يوفر نطاق 100–200 pA توازنا بين استقرار الطبقتين والإشارة إلى ضوضاء، مما يسمح بتوسع كاف للمساحة أثناء التحفيز.
9. إذا تجمع DIB، ارفع الأقطاب الكهربائية من الزيت. اشطف رؤوس الأقطاب جيدا بنفس المحلول المائي المستخدم لعينات الدهون والأغاروز.
10. أزل أي قطرات مائية من طبق بتيري باستخدام حقنة معقمة. أعد ملئه بزيت طازج إذا لزم الأمر، ثم أغمر الأقطاب الكهربائية مرة أخرى. أعد تحميل محلول LUV على الأقطاب كما هو موضح في القسم 6 وكرر العملية.
11. بمجرد تأكيد الاستجابات السعوية أو الموصلة المستقرة، قم بإيقاف شكل الموجة المثلثية والسماح لمؤشر DIB بالتوازن لمدة لا تقل عن 15 دقيقة قبل تطبيق بروتوكولات التحفيز.

8. بروتوكولات التحفيز الكهربائي

1. تجارب النبض (تجمع استجابات شبيهة ب STP وLTP / LTD)
   1. تكوين مولد الدوال أو برنامج الاكتساب لتوصيل نبضات جهد ذات السعة ومدة والفترة الزمنية المرغوب فيها (مثل PPF [تسهيل النبضات المزدوجة] وأنماط PPD [انخفاض النبضات المزدوجة]).
   2. افتح برنامج التقاط الفيديو. اختر إعدادات الكاميرا والعدسة الموضوعية المناسبة. اضبط معدل الإطارات على الأقل 20 إطارا في الثانية وتأكد من أنه يبقى مستقرا أثناء التسجيل.
   3. في برنامج جمع البيانات، اضبط تردد أخذ العينات على الأقل 5 كيلوهرتز للإشارة الحالية.
   4. انقر على الحصول > بروتوكول جديد لإنشاء بروتوكول جديد ، أو انقر على الحصول > بروتوكول تحرير لتعديل بروتوكول موجود. في تبويب وضع الاستحواذ ، اختر التحفيز الحلقي. اضبط الجري/التجربة على 1 والسويب/الركض على 1.
   5. اضبط مدة المسح إلى 4 ثوان أطول من إجمالي مدة التجربة. بالنسبة لبروتوكول STP مدته 120 ثانية (60 ثانية PPF + 60 ثانية بعد يوميا)، اضبط مدة المسح إلى 124 ثانية للسماح بسنتين من الأساس قبل وبعد التحفيز.
   6. في تبويب المدخلات ، قم بتعيين قناة التسجيل إلى المدخل الحالي. في تبويب المخرجات ، قم بتعيين قناة التحفيز لخرج الجهد الذي يتحكم في الأقطاب الكهربائية.
   7. افتح تبويب الموجة. في العمود A، اضبط النوع إلى Step، والمستوى الأول إلى 0 mV، وFirst Duration إلى 2000 مللي ثانية لتحديد خط أساس للتحفيز المسبق.
   8. في العمود B (PPF)، اضبط Type إلى Step. حدد سعة الجهد المطلوبة (مثل +100 ميلي فولت)، مدة النبضة (مثلا 100 مللي ثانية)، ومعدل القطار لضبط فترة النبضات التي تتوافق مع دورة العمل المستهدفة (مثلا 90.9٪).
   9. في العمود C (PPD)، يتم تعيين Type to Step بنفس السعة ومدة النبضة، لكن زيادة معدل القطار أو فترة النبضات لتحقيق دورة العمل المنخفضة المطلوبة (مثلا، 28.6٪).
   10. في العمود D، قم بتكوين خط أساس ما بعد التحفيز مطابق للعمود A (0 mV، 2000 مللي ثانية).
       ملاحظة: إذا تجاوز إجمالي مدة جميع العصور في تبويب الموجة مدة المسح في تبويب الوضع/المعدل ، زد مدة المسح قليلا حتى يتم حل الخطأ.
   11. احفظ البروتوكول باسم وصفي (مثل "STP_120s").
   12. ابدأ تسجيل الفيديو، ثم ابدأ فورا في الاكتساب/التحفيز الكهربائي بالضغط على زر الدائرة الحمراء "تسجيل" لتسجيل البيانات. بدلا من ذلك، قم بضبط مشغل رقمي بحيث يؤدي بدء التحفيز إلى تحفيز تسجيل الفيديو والالتقاط الكهربائي في نفس الوقت.
   13. في أول 60 ثانية من التحفيز (PPF)، تزداد استجابة التيار المقاس عادة من النبضة الأولى وقد تصل إلى هضبة مرئية بمقدار t = 60 ثانية، بينما في آخر 60 ثانية من التحفيز (PPD)، تنخفض استجابة التيار المقاسة عادة (الشكل 5). في نهاية البروتوكول، توقف الاكتساب الكهربائي وتسجيل الفيديو في نفس الوقت.
2. تجارب القناة الواحدة
   1. على لوحة مضخم التثبيت الأمامية، قم بضبط مفتاح إدخال الأوامر الخارجية على وضع إيقاف. اضبط جهد التثبيت على +200 مللي فولت. قم بضبط مرشح التمرير المنخفض المدمج في المضخم على 1 كيلوهرتز. في برنامج الاستحواذ، اضبط معدل العينة على 10–50 كيلوهرتز واختر وضع تسجيل مستمر "خالي من الفجوات".
      ملاحظة: قد تقلل معدلات العينة العالية من نسبة الإشارة إلى الضوضاء في البيانات المكتسبة. استخدام معدلات عينة أعلى عند حل الانتقالات السريعة في البوابات أو حالات الوميض القصيرة العمر أمر مهم. متوسط أعمار الغراميسيدين A المفتوحة عادة ما يتراوح بين 0.1 ثانية إلى 10 ثوان، بينما قد تحدث حالات الوميض على مقاييس زمنية تحت مللي ثانية وميكروثانية؛ لذلك، قد تكون معدلات أخذ عينات ~50 كيلوهرتز ضرورية لالتقاط مثل هذه الأحداث³⁶. يسمح تحليل المثالية أحادية القناة اللاحق باستخدام JSMURF باكتشاف أحداث قوي عبر تسجيلات ذات نسب إشارة إلى ضوضاء متغيرة³⁷.
   2. بدون تطبيق أمر خارجي، ابدأ تسجيل إشارة التيار الأساسية. على المضخم، قم بتبديل أمر الجهد من إيقاف التشغيل إلى "+" لتطبيق جهد تيار مستمر +200 مللي فولت عبر DIB.
   3. سجل ل ~15 ثانية لالتقاط أحداث قناة واحدة مع الحد من انحراف الخط الأساسي. عند تركيز الدهون:gA الضرس 1:5×^10-6_، يبدو التيار المسجل متدرجا بسبب تكوين وإزالة أحداث بوابة توصيل القنوات.
   4. قبل إيقاف التسجيل، قم بتغيير أمر الجهد من "+" إلى إيقافه. أوقف جمع البيانات وحفظ التسجيل باسم ملف وصفي (مثل "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء تسجيلات قناة واحدة ذات مدة محددة من خلال تحفيز حلقي مبرمج، مع سعة ومدة ثابتة كما هو موضح في القسم 8 لفترات PPF/PPD. بالنسبة للتجارب أحادية القناة "بعد PPF"، يتم ربط التحفيز العرضي بجهد تيار مستمر +200 مللي فولت مباشرة بعد الستينيات من PPF.

9. استقراء مساحة الغشاء والتدفق

1. في نهاية كل تجربة جماعية (STP, LTP/LTD)، تحرك أحد الأقطاب ببطء جانبيا مع الميكرو مانبوليتورز لفصل DIB.
2. قم بفك حامل قطب الميكرو تلاعب بتدوير القطب في حاميه بمقدار ~45° بحيث يكون السلك الفضي بطول 125 ميكرومتر في مستوى التصوير.
3. اضبط ارتفاع القطب حتى يصبح السلك في حالة تركيز حاد تحت المجهر. التقط صورة ثابتة أو لقطة شاشة للسلك الفضي المركز باستخدام برنامج الكاميرا. احفظ صورة المقياس لمعايرة حجم البكسل إلى المليمترات لاحقا.
4. يعالج مسارات التيار المسجلة وفقا للإجراءات الموضحة في المرجع 28 للحصول على بيانات مستمرة خالية من العيوب الزائدة عن التيار مقابل الزمن (الشكل 6A).
5. تحديد الربط بين الإطار والزمن عن طريق قسمة مؤشرات الإطار على معدل الإطارات المقاس ومطابقته مع طوابع الوقت للاكتساب.
6. استورد صور معايرة المقياس وإطارات التجربة إلى برامج تحليل الصور.
7. استخدم قطر السلك المعروف (125 ميكرومتر) من صورة معايرة المقياس لضبط المقياس المكاني باستخدام دالة المعايرة البرمجية (تحليل > تعيين المقياس).
8. لحسابات التدفق لكل تجربة، اختر N نقطة زمنية تمتد عبر فترة التحفيز الكلية (مثلا، 30 نقطة زمنية خلال تجربة 120 ثانية). تأكد من أن نقطة الزمن الأولى تتوافق مع أول نبضة منبهة.
9. في كل نقطة زمنية، قس قطر DIB برسم خط عبر تقاطع حافة الطبقة الثنائية وتسجيل طوله بوحدات معايرة.
10. تحويل كل قطر مقاس إلى مساحة غشاء (A)، بافتراض الهندسة الدائرية أو باستخدام عامل مقياس هندسي بيضاوي مناسب لتكوين زيت الدهن المحدد. استخدم المناطق الناتجة لتقييم تطور مساحة الغشاء مع مرور الوقت لظروف تجريبية مختلفة (الشكل 6B).
11. لكل نقطة زمنية، اقسم قيمة التيار المقابلة على المساحة للحصول على التدفق (I/A). اقسم جميع نقاط بيانات التدفق N على القيمة الأولى للتدفق للحصول على التدفق المعدل إلى النبضة الأولى، (I/A) / (I₀/A₀)، عندما يرغب في تحليل التدفق الطبيعية (الشكل 6C).
12. التدفق المخطط أو التدفق المعياري مقابل الزمن أو رقم النبضة مقابل الوقت. تحليل التدفق المتكرر لجميع تجارب المجموعات (STP، LTP/LTD) (الشكل 6D).
13. تفسير الارتفاعات المستمرة للتدفق أو التدفق الطبيعي بالنسبة لأول نبضة خلال اكتئاب ما بعد الولادة أو بعد دقيقتين على أنها توصيلية معززة، بينما تشير الإشارات إلى البداية أو الانخفاض تحت قيمة النبضة الأولى إلى انخفاض التوصيل. استخدم الجداول الزمنية الناتجة لتصنيف الاستجابات كسلوك قصير الأمد يشبه المرونة (<دقيقتين) أو سلوك يشبه التعزيز/الاكتئاب طويل الأمد (> ~5 دقائق).

10. التحليل أحادي القناة

1. استيراد التسجيلات الخام أحادية القناة إلى بيئة تحليل مفضلة أو واجهة clampSeg وراجع³⁷ للحصول على أوصاف وشرح كاملة لوظائف البرمجيات.
2. تطبيق مرشح تمرير منخفض رقمي يطابق مرشح الاستحواذ التجريبي (مثل 1 كيلوهرتز بيسل).
3. تكوين المعلمات.
   1. تعيين ألفا (α) = 0.05، مما يحدد مستوى الثقة الإحصائية بحيث يكون لكل خطوة مكتشفة احتمال <5٪ أن تكون تذبذبا عشوائيا في الضوضاء.
   2. حدد 5,000-10,000 تكرار مونتي كارلو لكل جزء من الثانية لتقدير توزيع الضوضاء وتعزيز المتانة الإحصائية لاكتشاف الأحداث.
      ملاحظة: استخدم معالجة حسابية متوازية بمقدار "قطع" ثانية واحدة إذا كانت متاحة لتقليل وقت التحليل.
   3. شغل خوارزمية JSMURF على تتبع التيار المصفى.
4. التحقق من صحة النماذج.
   1. ضع فوق مسار التوصيل المثالي (الموجة المربعة) على مسار التيار المصفاة وتأكد بصريا أن انتقالات الخطوات تتزامن مع تغييرات مفاجئة في الإشارة التجريبية.
   2. استخدم خصائص مرشح التمرير المنخفض المعروف لتوليد إعادة بناء ملتوية للمسار المثالي ووضعه على المسار^{الخام 37}. تأكد من أن الإشارة المعاد بناؤها تطابق بشكل وثيق التوقيت والسعة للتيار المسجل.
5. قياس كمية الموصلية وأعمار العمر.
   1. عرف أدنى هضبة مستقرة في المسار المثالي كحالة خط أساس مغلق. حدد أول سعة هضبة غير صفرية كمستوى التوصيل المفتوح الأساسي (مستوى القناة الواحدة).
   2. صنف المضاعفات الصحيحة الأعلى لهذه السعة كحالات مفتوحة متعددة القنوات (2+، 3+، إلخ). حدد الهضاب المتوسطة المستقرة ولكن أقل من المستويات المفتوحة الكاملة كحالات توصيل فرعي.
   3. استخرج سعة ومدة كل حدث من الأثر المثالي ووضعهما في صندوق لإنشاء مخططات موصلية ورسوم عمرية.
6. مخططات السعة وتوزيعات العمر
   1. قارن مخططات الموصل-سعة المثالية مع مخططات السعة المولدة مباشرة من البيانات المصفاة. تأكد من أن المخططات المثالية تعرض قمم أكثر وضوحا وفصلا أفضل تتوافق مع حالات التوصيل المنفصلة³⁷.
   2. لكل شرط تجريبي، احسب دالة البقاء N(t)/N(0)، حيث N(0) هو إجمالي عدد الأحداث المفتوحة (الكامل والموصلية الفرعية) وN(t) هو عدد الأحداث ذات المدة الأطول من t. استبعد الفترات المغلقة من هذا التحليل.
   3. رسم N(t)/N(0) مقابل دوال الانحلال الأسي الزمني والملائم باستخدام روتين أقل مربعات غير خطي في برنامج مفضل.
   4. تفسير الإزاحات اليمنى في ذروة توزيع التوصيل في مخططات السعة على أنها زيادة في التوصيلية، وثوابت زمن الانحلال الأطول في مخططات N(t)/N(0) مقابل الزمن كزيادة في استقرار الحالة المفتوحة، والتوزيعات المنحرفة إلى اليسار كأعمار أقصر.
      ملاحظة: قلل من الاضطرابات البيئية مثل التيارات الهوائية، والاهتزاز، والأجسام المتحركة القريبة. تجنب الاتكاء على الطاولة البصرية وتجنب المحادثات عن الإعداد التجريبي. حافظ على الهواتف المحمولة، الأجهزة اللوحية، الحواسيب المحمولة، وغيرها من الأجهزة الإلكترونية الشخصية على بعد لا يقل عن 1.5 متر من قفص فاراداي لتقليل التداخل الكهرومغناطيسي. استخدم خزان زيت شفاف بصريا وقم بتحسين إضاءة المجهر والتباين لزيادة حدة حواف القطرات والطبقات الثنائية. احصل على فيديو بتقنية التدرج الرمادي و/أو تصديرها إذا كان ذلك يحسن تباين الحدود ويبسط القياسات اليدوية لقطر DIB. بالنسبة للتجارب التي لا تحقق تأثيرات درجة الحرارة، تأكد من الحفاظ على بيئة المختبر، وحامل المجهر، والزيت عند 21–22 درجة مئوية.

Results

إعداد تجريبي DIB
يتم وضع نظام التسجيل داخل قفص فاراداي على طاولة مضادة للاهتزاز، حيث يتم جمع البيانات الكهربائية والفيديو بواسطة جهازين منفصلين (الشكل 1A)، رغم أنه يمكن استخدام حاسوب واحد بقدرة تقسيم الشاشة. تتكون بيئة عينة DIB من قطبين مطليين بالأجاروز مغمورين في حجم محدد من زيت الألكاني (الشكل 1B). الشكل 1C يعرض مخططا للاتصالات الكهربائية والبصرية الأساسية للإعداد التجريبي الموضح في هذا المخطوطة.

الشكل 1: إعداد تجريبي. (أ) طاولة مضادة للاهتزاز وحوية قفص فاراداي مع المكونات الرئيسية المحددة، بما في ذلك المضخم، والرقمن، ومرشح الضوضاء، ومولدات الدوال، وواجهة الحاسوب المزدوجة لاكتساب الكهرباء والفيديو. (ب) عرض علوي لبيئة عينة DIB والأقطاب. (ج) مخطط للاتصالات الكهربائية والبصرية المرتبطة بالإعداد التجريبي الموضح في هذه المخطوطة. تشترك جميع المكونات الفردية في أرضية مشتركة في مبنى المختبر. أجريت جميع التجارب في درجة حرارة الغرفة (21–22 درجة مئوية). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحضير ومراقبة جودة أقطاب Ag/AgCl
إذابة رأس السلك الفضي تشكل كرة كروية (الشكل 2A)؛ تظهر الصهارات ذات الجودة الرديئة مستطيلة أو غير منتظمة. الكلور في المبيض ينتج سطحا بنيا-رماديا باهتا من Ag/AgCl (الشكل 2B). طبقة أغاروز رقيقة وموحدة بسماكة عشرات الميكرومترات على الكرة ضرورية لدعم القطرات المستقر والاقتران الكهروكيميائي منخفض المقاومة، بينما يؤدي الطلاء غير المتساوي إلى ضعف التصاق القطرات (الشكل 2C).

الشكل 2: تحضير الأقطاب الكهربائية. (أ) صور المجهر لذوبان الأقطاب ذات الجودة الجيدة والرديئة. (ب) مقارنة رؤوس الأقطاب غير المكلورة والمطلية بالكلور. (ج) أمثلة على طلاءات الأغاروز ذات الجودة الجيدة والضعيفة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: إعداد الأقطاب. (أ) العرض العلوي لمحاذاة زاوية الأقطاب المثبتة. (ب) نظرة جانبية لمقارنة القطرات غير المتدلية مباشرة بعد تحميل LUV مع القطرات المتهالكة بعد تكوين الطبقة الأحادية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحديد موقع الأقطاب وسلوك ترهل القطرات
تظهر العروض من الأعلى إلى الأسفل التموضع الزاوي الصحيح للأقطاب الكهربائية لتقليل التشوه البصري (الشكل 3A). تقارن العروض الجانبية بين القطرات غير المتهللة (مباشرة بعد تحميل محلول LUV) والقطرات المغطاة بالدهون المتدلية (بعد 5 دقائق) (الشكل 3B). تظهر القطرات المتدلية المستخدمة لتكوين DIB استجابة فيزيائية متأخرة للحركة بسبب انخفاض كبير في التوتر السطحي من طبقات الدهون الأحادية، مما يؤكد بصريا تكوين قطرة مائية معلقة مغطاة بالكامل بطبقة دهنية واحدة. بعد إثبات الترهل، يستخدم تحفيز الموجة المثلثية لتوفير تأكيد كهربائي لتكوين وثبات الطبقتين³⁵.

الشكل 4: تكوين طبقة ثنائية لواجهة القطرات. (أ) تسلسل الزمن الذي يظهر تكوين وتوسع الطبقتين بعد ملامسة القطرات. (ب) انعكاس الغشاء الداخلي المستخدم في تقدير قطر الطبقة الثنائية والمساحة. يتم إجراء تصوير DIB من تحت الإعداد بواسطة مجهر مقلوب. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تكوين وقياس مساحة DIB
تلتقط الصور المتسلسلة "الانزلاق الثنائي الطبقات" التلقائي وتمدد المنطقة عندما تتلامس قطرتان متدليتان (الشكل 4A). تستخدم الانعكاسات الداخلية الساطعة ذات الشكل البيضاوي عند تلامس القطرات لتقدير قطر الطبقة الثنائية، وبالتالي مساحة الغشاء مع مرور الوقت (الشكل 4B).

الشكل 5: بروتوكول STP — التحفيز والاستجابة. تظهر الاستجابات التمثيلية أثناء تسهيل النبضات المزدوجة (PPF، 0–60 ثانية، أحمر) وانخفاض النبض المزدوج (PPD، 60–120 ثانية، أزرق) (الأعلى)، إلى جانب بروتوكول التحفيز المقابل (الأسفل). مدة نبضات PPF وPPD تبلغ 100 مللي ثانية مع أوقات إيقاف 10 مللي ثانية و250 مللي ثانية على التوالي، مما ينتج دورات عمل بنسبة 90.9٪ و28.6٪. التسهيل يتوافق مع زيادة صافية في التيار الأيوني؛ الانخفاض يعادل صافي الانخفاضات. يتم تسجيل الاستجابات الحالية فقط خلال فترات ON؛ للتصور، يتم استيفاء البيانات بين النبضات لتسليط الضوء على الاتجاهات العامة في التيار. لا يتم رسم أطوال زمن النبضات المخطط وعدد النبضات ضمن مراحل PPF وPPD بمقياس كبير، بل يتم توضيحها لأغراض التصور. بيانات الاستجابة التمثيلية للتيار تم إنتاجها من Podar PT وآخرين،²⁵ تحت CC BY-NC-ND 4.0. حقوق النشر © 2025 للمؤلف(ين). نشرته PNAS. مخطط التحفيز المعدل للمخطوطة الحالية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بروتوكول التحفيز الكهربائي لتحفيز سلوك شبيه باللدونة قصيرة المدى (شبيه ب STP)
أنماط التحفيز المشار إليها هنا تمثل تسهيل النبض المزدوج (PPF) والاكتئاب (PPD) بالمقارنة مع مصطلحات علم الأعصاب، مشابهة لكونر ونجم^28,29. يتم توصيل تسهيل النبضة المزدوجة (PPF؛ 0–60 ثانية) وانخفاض النبضات المزدوجة (PPD؛ 60–120 ثانية) باستخدام نبضات 100 مللي ثانية مع أوقات إيقاف 10 مللي ثانية و250 مللي ثانية على التوالي، مما يتوافق مع دورات عمل 90.9٪ ل PPF و28.6٪ ل PPD. تظهر اللوحة العلوية استجابات ممثلة خلال فترات ON، بينما تظهر اللوحة السفلية نمط التحفيز.

تدفق التيار، المساحة والتدفق الأيوني أثناء STP والتحفيز طويل الأمد اللاحق
يتم عرض التيار المعياري (I/I₀) للطبقات الثنائية DPhPC المشوهة ب gA في زيوت C16 وC12/C16 خلال PPF وPPD (الشكل 6A). تكشف مساحة الغشاء المعادية (A/_{A 0}) المقاسة عند 30 نقطة زمنية عن تطور مساحة مماثل في كلا الظروفين النفطية رغم اختلاف التيارات (الشكل 6B). يتم تمثيل بيانات التيار والمساحة المعادية كمتوسط ± سحب وخطوط S.D. على التوالي عبر 28 قاعدة بيانات مستقلة لكل حالة نفطية. التدفق المطبع، J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)، يفصل التغيرات المستقلة عن المساحة في الموصلية ويتوافق مع التغيرات في توصيل الغشاء إلى ما بعد التوسع البسيط للمساحة (الشكل 6C). ومع ذلك، قد تعكس هذه التغييرات مساهمات من كل من التوصيل أحادي القناة وعدد القنوات الموسيقية النشطة. التحفيز الممتد لاكتئاب ما بعد الولادة لمدة تصل إلى 30 دقيقة ينتج سلوكا طويل الأمد يشبه الاكتئاب (LTD) في أغشية C16 لكنه يحافظ على تدفق مرتفع يتوافق مع السلوك الشبيه ب LTP في أغشية C12/C16 (الشكل 6D). تظهر هذه البيانات معا أن تركيب الغشاء يعدل التغيرات القصيرة والطويلة الزمنية الشبيهة باللدونية في التدفق الأيوني.

الشكل 6: التيار، المساحة، والتدفق الأيوني المحسوب لDIBs خلال STP والانتقال إلى LTP/LTD. (A) التيار المعياري (I/I₀) خلال PPF (0–60 ثانية، خلفية بيضاء) وPPD (60–120 ثانية، خلفية رمادية) لأغشية DPhPC المشوهة ب gA في زيوت C16 (برتقالية) وC12/C16 (زرقاء)، مع كل حالة تتكون من n = 28 DIB تتكون بشكل مستقل. (ب) مناطق الغشاء المعادية (A/A₀)، تقاس عند 30 نقطة زمنية، تظهر مسارات مساحة مماثلة رغم اختلاف استجابات التيار؛ تعرض البيانات كمتوسط ± S.D. عبر نفس n = 28 قاعدة بيانات مستقلة لكل حالة نفطية. (C) يتم حساب التدفق المطبع، J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀))، من قياسات التيار والمنطقة المقابلة، مما يبرز التغيرات في التوصيل خارج تأثيرات الساحة. (د) السلوك طويل الأمد تحت تحفيز PPD الممتد: بعد 120 ثانية STP الأولية (مظللة باللون الرمادي)، تم تعريض DIBs ل30 دقيقة في اليوم مع ON = 100 مللي ثانية وOFF = 250 مللي ثانية (أحمر/أخضر صلب) أو 30 ثانية (برتقالي/رمادي). يتحلل التدفق إلى أو تحت الأساس في أغشية C16، مما يشير إلى سلوك مشابه لمتلازمة LTD، لكنه يبقى مرتفعا في أغشية C12/C16، مما يشير إلى سلوك مستمر يشبه LTP. تمثل المناطق المظللة خطأ منتشر من I/I₀ و A/A₀. تم الحصول على مجموعات بيانات PPD الممتدة في (D) من n = 6 DIBs مستقلة لكل حالة زيت لبروتوكول 120 ثانية، تليها 3 DIBs لكل حالة PPD موسعة. جميع نقاط البيانات متصلة لأغراض التصور فقط. تم إعادة إنتاج اللوحات A وB وD تحت CC BY-NC-ND 4.0. حقوق النشر © 2025 للمؤلف(ين). نشرته PNAS. تم إنشاء اللوحة C حديثا للمخطوطة الحالية من بيانات تم الإبلاغ عنها في Podar PT وآخرون،²⁵. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أثر تيار ممثل 15 ثانية من أنبوب DIB مطعم ب gA متكون في زيت C16 بعد تحفيز PPF
يشمل التتبع الإشارة الخام الملتقطة عند 50 كيلوهرتز مع مرشح تمرير منخفض بسرعة 1 كيلوهرتز، ومسار 250 هرتز 8 أقدام مفلتر بيسل، وتركيب JSMURF المثالي. أدنى مستوى مستقر يحدد الحالة المغلقة، والمستويات الأعلى تتوافق مع أحداث القناة الواحدة، متعددة القنوات، والأحداث تحت الموصلية. توفر هذه الآثار الأساس لتحليل سعة الموصلية ومدى الحياة. يمثل مثال زمن التوقف في حالة التوصيل المشار إليه مدة مستوى موصلية محدد، حيث تعكس السعة والمدة، مساهمة متعددة في الوقت الواحد من الأحداث الكاملة و/أو الفرعية المتزامنة.

سعة الموصلية وتوزيعات العمر
تقارن مخططات سعة التوصيل لأغشية C16 وC12/C16 (الشكل 7A–B) بين الحالات قبل وبعد PPF بنسبة مولية DPhPC:gA تبلغ 1:5×^10-6. تشير التقريبات الغاوسية أدناه إلى تحولات في قمم الموصلية المتوسطة بعد PPF وتحل قمم منفصلة تتوافق مع حالات الموصلية الفرعية والحالات متعددة القنوات. تم إجراء مقارنات إحصائية لتوزيعات التوصيل على بيانات مجمعة على مستوى الأحداث باستخدام اختبار t لويلش واختبار مان-ويتني U (α = 0.05)، حيث تضمن كل شرط 3 تسجيلات مستقلة ل DIB وN لحالة توصيل معينة تشير إلى إجمالي عدد الأحداث المكتشفة المجمعة عبر تلك التسجيلات. توزيعات احتمالية العمر، N(t)/N(0)، قبل وبعد (الشكل 7C–D) تظهر أن أغشية C12/C16 تطور توزيعات توصيلية أطول وتغير أعمار العمر بالنسبة ل C16، مما يشير إلى تغيرات في استقرار القناة. تمثل بيانات المخطط التكراري أثر ال 15 ثانية المصفاة (الأثر الأحمر) الذي تم الحصول عليه لكل حالة. تم توليد توزيعات عمر حالة التوصيل من 3 تسجيلات مستقلة ل DIB لكل حالة؛ المنحنيات المنقطة تدل على النسخ الفردية، والمنحنيات الصلبة تدل على توافقات أسية عالمية بين N(t) / N(0) مقابل t.

الشكل 7: مخططات سعة التوصيل وتوزيعات زمن الاستمرار في حالة الموصل. تقارن مخططات سعة التوصيل لنشاط gA في أغشية (A) C16 و(B) C12/C16 بين الحالات قبل PPF (الرمادي) وما بعد PPF (البرتقالي/الأزرق) عند نسبة مولية 5 × 10-6 gA:دهون. تشير التقريبات الغاوسية تحت المخططات إلى تحولات في قمم التوصيل المتوسطة والانحرافات المعيارية للحالات ذات القناة الواحدة ومتعددة القنوات. تشير التغيرات في متوسط التوصيلية بعد PPF بخطوط متقطعة (الأسود = ما قبل PPF؛ الأزرق/البرتقالي = ما بعد PPF) والسهام. كل شرط يمثل 3 تسجيلات مستقلة ل DIB. تم إجراء مقارنات إحصائية لتوزيعات التوصيلية على بيانات مجمعة على مستوى الحدث باستخدام اختبار t لويلش واختبار مان-ويتني U (α = 0.05)، حيث يشير N لحالة توصيل معينة إلى إجمالي عدد الأحداث المكتشفة المجمعة عبر تلك التسجيلات الثلاثة. كما تم تضمين أحداث الموصلية الفرعية في التحليل، مع الإشارة إلى توزيعات الموصلية الفرعية التمثيلية إلى يسار أول قمة مفتوحة لكل حالة غشاء. توزيعات احتمالية عمر أحداث حالة التوصيل في أغشية C16 (C) وC12/C16 (D) قبل (برتقالي / أزرق) وبعد تحفيز PPF (برتقالي داكن / أزرق داكن) عند 5×10-6 M gA:دهونية تتوافق مع تحليلات التوصيل الموضحة في الشكل 7A–B. هنا، يمثل N(t) العدد التراكمي لأحداث الامتلاء والأحداث تحت الموصلية التي تمتد لها المدة أطول من الزمن t. تشير الخطوط المنقطة إلى توزيعات العمر من النسخ الفردية (n = 3 DIBs مستقلة لكل شرط)، وتظهر التركيبات الصلبة توافقات أسية عالمية يتم باستخدام برامج ملاءمة المنحنيات غير الخطية. اللوحات A–D مأخوذة من Podar PT وآخرون، ²⁵ وجمعت للمخطوطة الحالية تحت CC BY-NC-ND 4.0. حقوق النشر © 2025 للمؤلف(ين). نشرته PNAS. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: فحص سلوك القناة الواحدة — تتبع الاستجابة الحالية لأقراص DIBs في C16 بعد تحفيز PPF. (أ) مثال أثر تيار 15 ثانية يظهر بيانات خام (أزرق)، مصفى بفلتر بيسل منخفض التمرير 8 أقطاب 250 هرتز (أحمر)، والأثر المثالي (الأخضر) المستخدم لتحديد حالات الموصل. أدنى مستوى مستقر يحدد الحالة الأساسية "المغلقة". (B) مستويات الموصلية الفرعية الممثلة التي تم اكتشافها بين مستويين^{الموصلية} الكاملة^{الثانية والثالثة}، مدعومة بقمم وسيطة مميزة في مخطط السعة (انظر الشكل 7A، برتقالي). يتم استخراج أوقات التوقف الموصلية من مدة كل مستوى موصلية محدد (باستثناء الحالة المغلقة) لتوليد توزيعات عمر N(t)/N(0). تم إعادة إنتاجه من Podar PT وآخرين،²⁵ تحت CC BY-NC-ND 4.0. حقوق النشر © 2025 للمؤلف(ين). نشرته PNAS. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بعد PPF، تظهر أغشية C12/C16 انزياحا واضحا نحو اليمين في توزيعات سعة الموصل، مما يشير إلى زيادة التوصيل أحادي القناة، مصحوبا بانحراف يساري في توزيعات عمر حالة التوصيل، بما يتوافق مع أوقات فتح القناة القصيرة. تتوافق هذه التغيرات مع التخفيف الكهروميكانيكي لطبقة C12/C16 الثنائية خلال PPF، كما تدعمه القياسات الميكانيكية المباشرة والسماكة المبلغ عنها في المرجع 25، والتي تخفض الحاجز الطاقي لنقل الأيونات عبر gA وتزيد من إنتاجية الأيونات لكل فتحة مع تقليل استقرار القناة. على النقيض من ذلك، تظهر أغشية C16 تغيرات طفيفة في أي من التوزيعين، مما يبرز محدودية قدرتها الهيكلية على التكيف. تظهر هذه النتائج معا أن منصة DIB تلتقط كل من الترابطات الجماعية والقناة الأحادية للتكيف الكهروميكانيكي الغشائي، بما في ذلك التغيرات الشبيهة بSTP وLTP/LTD في التوصيل الأيوني الناتجة عن ديناميكيات تعتمد على تركيب الغشاء (الشكل 8).

Discussion

عمليا، توفر هذه الطريقة ثلاث قدرات تجريبية رئيسية: التغير القابل للتحكم في تركيب الطبقتين عبر تركيب الدهون وطور الزيت، المراقبة البصرية والكهربائية في نفس الوقت لإعادة هيكلة الغشاء، والوصول إلى نظام مساحة الغشاء الذي يربط بين الفيزيولوجيا الكهربائية أحادية القناة وميكانيكا الأغشية المتوسطة^{الحجم 14,15,20,21,25}. تجعل هذه الميزات الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسات الهيكل والدالة في أنظمة الأغشية المبسطة، حيث يكون المنظور التجريبي هو المنظور التجريبي 14,15,20,21,25,39 بدلا من التعقيد الخلوي الكامل.

يصف هذا البروتوكول تجميع وتحليل الديبايدات المشوهة بالجرامسيدين A في زيوت الألكان، لفحص قدرة أغشية الدهون على إعادة هيكلة تحت التحفيز الكهربائي الفسيولوجي 14,15,25,35,38. مقارنة بتقنيات تثبيت الرقعة²¹، تقوم منصة DIB بفحص رقع الأغشية التي تكون أكبر بمراتب الحجم مع الحفاظ على دقة كافية لالتقاط أحداث قناة الأيونات المنفصلة 14,15,19,20,21,28,38 . تعد هذه القدرة ذات قيمة خاصة لحل إعادة التشكيل الكهروميكانيكية على نطاق متوسط (مثل الترطيب الكهربائي والضغط الكهربائي) وربطها بسلوك القنوات المجهرية التي تؤدي مجتمعة إلى ظهور أنماط موصلية غشائية شبيهة ب STP وLTP وLTD تحت تحفيز مستوحى من الفسيولوجيا 13,25,27,38 . نظام DIB الحالي ليس مصمما لتكرار التعقيد الجزيئي للمشابك العصبية^{البيولوجية} 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . وبناء عليه، تستخدم مصطلحات مثل STP، LTP، LTD، PPF، وPPD بمعنى وصفي قائم على التشبيه للدلالة على زيادات وتناقص التوصيل الأيوني الغشائي على مدى قصير وطويل المدى ضمن بروتوكولات تحفيز محددة. لذلك، يتم تفسير النتائج الأساسية لهذا العمل بشكل مباشر من حيث كهروميكانيكا الغشاء، وتكيف التوصيل، وإعادة هيكلة غير التوازن المعتمدة على التركيب في DIBs، مما قد يقدم تشبيهات مفاهيمية مفيدة ووجهات نظر فيزيائية حول اللدونة المشبكية دون الإيحاء بالتكافؤ الميكانيكي مع الدوائر العصبية أو التنظيم الكيميائي الحيوي للتشابك^{10،11،25،38}.

تعد هناك عدة خطوات تقنية ضرورية للحصول على نتائج قابلة للتكرار. يضمن التحضير الدقيق لقطب Ag/AgCl، بما في ذلك انصهار موحد لطرف الفضة الكروي، والكلورة الكاملة، وطبقة رقيقة ومتساوية من الأروز، تثبيت القطرات وارتباط كيميائي منخفض المقاومة^20,35. التأكيد البصري لترهل القطرات والاتجاه الصحيح للأقطاب يقلل من التشوه البصري أثناء تسجيل الفيديو ويحسن دقة قياسات مساحة الغشاء. توفر معايرة المقياس بعد الاستحواذ باستخدام قطر السلك الفضي المعروف تحويلا قويا من البكسل إلى الملم، وهو أمر ضروري للحساب الموثوق لمساحة الغشاء وتدفق الأيونات. في هذا العمل، يعرف موصلية الغشاء (التدفق) بأنها تيار لكل وحدة مساحة (I/A)، ونظرا لأن مساحة DIB تتغير أثناء الترطيب الكهربائي، يتطلب قياس التدفق الدقيق قياسات التيار ومساحة الطبقة الثنائية مطابقة زمنيا ^13,25,27,35.

يدعم هذا النهج أيضا قراءات تكميلية على مستوى المجموعة وقناة واحدة ضمن نفس المنصة 14,15,20,25,35,38. على مستوى الفرقة، تقوم التسجيلات المتزامنة بالفيديو والكهرباء بقياس التغيرات الديناميكية في المساحة (الترطيب الكهربائي) والتيار، مما يشتق منه التدفق الأيوني (التيار/المساحة). تحت التحفيز الكهربائي، تدفع الأغشية إلى حالات استقرار غير متوازنة (NESS) حيث تولد إعادة هيكلة الغشاء المعتمدة على التركيب استجابات شبيهة بالمرونة قصيرة المدى يمكن أن تتطور إلى سلوك يشبه التقوية أو الانخفاض على مدى أطول زمن على مدى فترات طويلة (الأدنى)^{25،26،28،29،30،31،32،33، 38}. على مستوى القناة الواحدة، يتضمن التحليل تمثالية آثار التيار إلى مستويات توصيل تدريجي (حالات مغلقة، قناة واحدة، متعددة القنوات، وحالات الموصلية الفرعية). عادة ما تحل أدوات المثالية التقليدية للموجة المربعة عددا محدودا فقط من المستويات المنفصلة؛ بالنسبة للبيانات الأكثر تعقيدا أو الضوضاء، يفضل طرق المثالية الخالية من النماذج مثل JSMURF³⁷. توفر جهود الاحتجاز القصيرة للتيار المستمر التي تم تحليلها باستخدام JSMURF اكتشافا صارما إحصائيا للأحداث تحت ضوضاء غير متجانسة، مما ينتج مخططات موصلية-سعة (مستويات صحيحة وموصلية فرعية) وتوزيعات عمر N(t)/N(0). يمكن التركيب فوق مخططات السعة المثالية والمفلترة التحقق البصري والكمي من التحقق المتقاطع لتعيينات حالات التوصيل، بينما تؤكد إعادة البناء الملتففة (المسارات المثالية التي تمر عبر مرشح التمرير المنخفض المعروف) اختيارات المعلمات ودقة الأحداث³⁷.

من المتوقع أن يعدل تركيب الغشاء، الذي يتم ضبطه هنا من خلال طور الزيت المحيط (مثل C16 مقابل C12/C16)، مرونة الطبقة الثنائية وقدرة إعادة الهيكلة تحت التحفيز الكهربائي، بما يتوافق مع القياسات المباشرة المبلغ عنها في الأعمال السابقة^{22، 25، 39}. من المتوقع أن تظهر الأغشية الأكثر متوافقا ترققا أكبر مدفوعا ب EC وتحسن في المطابقة الكارهة للماء مع gA خلال PPF 22,23,25، مما يؤدي إلى زيادة التوصيل وتسهيل القناة الأحادية التي يمكن أن تستقر كسلوك شبيه ب LTP ^25,38. وعلى العكس، تظهر الأغشية الأكثر صلابة استجابة هيكلية محدودة، وتغيرات أصغر في التوصيل خلال PPF وPPD، وتميل إلى LTD تحت النبض المطول. تسلط هذه النتائج المعتمدة على التركيب الضوء على كيفية استعداد خصائص المادة للغشاء نحو أنظمة طويلة الأمد مميزة ذات صلة وظيفية 22,23,25,39.

منصة DIB لديها أيضا قيود مهمة²¹. التفسير الميكانيكي المطروح هنا هو أن الاختلافات في تركيب الزيت تغير خصائص المادة ذات الطبقة الثنائية وقابليتها لإعادة الهيكلة الكهروميكانيكية، والتي بدورها تعدل توصيل الجراميشيدين A 22,23,25. يدعم هذا التفسير الدراسة السابقة التي قاست مباشرة مرونة الغشاء، والتوتر بين الأوجه، بالإضافة إلى التغيرات الديناميكية في سمك الغشاء تحت هذه الظروف والتحفيز²². ومع ذلك، في العمل الحالي، لم يتم قياس هذه الخصائص المادية في نفس الوقت في كل تجربة، ولذلك تستخدم هنا لدعم الاستجابات الهيكلية والميكانيكية المختلفة للتحفيز الكهربائي للأغشية في بيئات C16 وC12/C16، بدلا من تحديد التفسير الميكانيكي للبيانات بشكل مستقل. بالإضافة إلى ذلك، قد يعكس تيار المجموعة والتدفق كلا من التغيرات في موصلية القناة الواحدة وتغيرات في عدد القنوات الموصلة التي قد تختلف مع مساحة الغشاء، وانتشار الببتيدات، والازدواجية في ظروف غير التوازن^{17، 18، 22، 23}. قد يتسلل الطور الزيلي المحيط ديناميكيا أو يتراجع من قلب الطبقة الثنائية أثناء التحفيز، مما يساهم في انحراف الأساس في التسجيلات أحادية القناة وتغيرات تدريجية في تركيب الغشاء مع مرور الوقت^13،21،25. معا، تحد هذه العوامل من استخدام تسجيلات الجهد الثابت طويلة المدة لتعريف خصائص الأغشية الثابتة وتؤكد أن DIBs تتصرف كأنظمة مفتوحة وديناميكية بدلا من أغشية توازن مغلقة 13,21,25. لذا، بينما يلتقط البروتوكول الحالي التغيرات المعتمدة على التحفيز والمشابهة للمرونة في التوصيل خلال الفترات الزمنية التجريبية المقصودة^25،38، ستكون الدراسات المستقبلية التي تجمع بين القياسات الميكانيكية المباشرة والتسجيلات الكهربائية والبصرية المتزامنة، وربما إلى جانب التصوير الجزيء الواحد القائم على الفلورة، ضرورية لحل مساهمات إعادة هيكلة الأغشية، وتوصيل القنوات، وعدد القنوات بشكل أكثر اكتمالا^{21، 25}.

تشمل أنماط الفشل الشائعة التصاق القطرات غير المستقر، وترهل القطرات غير المكتمل، والتجمع المبكر للقطرات أثناء تكوين الطبقتين، وضعف التعريف البصري لحافة الطبقة الثنائية أثناء تحليل المساحة. غالبا ما يكون التصاق القطرات غير المستقر ناتجا عن هندسة كرة فضية غير منتظمة أو طلاء أغاروز غير متساو، ويمكن تقليله من خلال التحقق من تناظر الكرة والحفاظ على غلاف أغاروز أملس. يتطلب تحميل الأقطاب أيضا ترسبا يدويا لقطرات مائية بحجم النانولتر على رأس قطب تحت المليمتر، مما يتطلب تنسيقا كبيرا بين اليد والعين وإدراك عمق عبر وسط مختلفة من معاملات الانكسار (الهواء مقابل الزيت). نتيجة لذلك، قد يلامس رأس الماصة غلاف الأغاروز عن غير قصد أو يفوت رأس القطب أثناء الصرف. تقنيات تعزيز الثبات مثل تدعيم المعصم، والتقدم البطيء للماصة في الزيت، وحبس النفس، إلى جانب التدريب المتكرر، يمكن أن تحسن كفاءة التحميل. علاوة على ذلك، يمكن أن ينتج عن الترهل غير الكامل أو تأخر تكوين الطبقة الأحادية نتيجة تباين الحويصلات، أو تغير درجة الحرارة، أو تضاريس الأغاروز، وقد يتم تحسينه بزيادة وقت الانتظار بعد ترسيب القطرات^{إلى 15، 20، 35}. غالبا ما يرتبط الاندماج أثناء تكوين الطبقتين بمساحة التلامس المفرطة أو التحفيز الكهربائي العدائي المفرط (> ± 200 ميلي فولت) ويمكن التخفيف منه باستخدام مناطق تلامس قطرات أولية أصغر، مما يسمح بوقت إضافي لتثبيت الطبقة الأحادية، والتحقق من استجابة السعة المثلثية منخفضة السعة قبل النبض^{25، 35، 38}.

رغم هذه القيود، فإن منصة DIB قابلة للتعديل والتوسع وقابلة للتكرار^بحجم 14,15,20,21,25,35,38,40، وتكمل الفيزيولوجيا الكهربائية المرتكزة على البروتين من خلال عزل مساهمة ميكانيكا الدهون في التوصيل 22,23,25. من خلال توحيد قياسات المجموعات وقياسات القناة الواحدة في نظام واحد، يوفر هذا البروتوكول مسارا عمليا لتحليل كيفية دمج العمل الكهربائي ومرونة الأغشية لإنتاج سلوك موصل شبيه بالتشابك (استجابات شبيهة ب STP، وLTP، وLTD) في نموذج قابل للتحكم من الأسفل^{إلى الأعلى 25,29,30,31,32,33,38}. وبالتالي، توفر المنهجية أساسا لاستكشاف منهجي لقواعد التعلم المعتمدة على التركيب في الأغشية ولقياس كيفية ربط القوى الميكانيكية والكهربائية بين بروتينات الأغشية وطبقتها الثنائية عبر المقياسين الزمني والمكاني 21,22,23,25. مجتمعة، تضع هذه القدرات DIBs كإطار قوي لتفكيك السلوكيات العصبية البيولوجية المعقدة إلى آليات فيزيائية حيوية قابلة للاختبار 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-ديفيتانووي-sn-جليسرو-3-فوسفوكولين (DPhPC)	أفانتي بولار ليبيدات	850356P/850356C	تم شراؤه كمسحوق متحمر (P) أو في الكلوروفورم (C)
أغاروز	سيغما-ألدرتش	A9539
أجاروز (أقراص أغاروز 0.5 جرام)	المعيار	A2501	يمكنك استخدام شكل البودرة أو الأقراص
مولد الموجات من Agilent Technologies 33522A	الرؤية المفتاح	–	يمكنك استخدام أي مولد موجة مع مخرجات كابل BNC
غاز الأرجون (Argon)	إيرغاز	AR UHP300؛ 72-402221259-1	مضغوط الأرجون؛ النقاء الفائق
التوازن التحليلي	ميتلر توليدو	الطراز: MS304S/03	أي توازن تحليلي مخبري بدقة 0.0001 جرام
مكبر الصوت Axopatch 200B	الأجهزة الجزيئية	–
مولد الكنس/الوظائف BK Precision 4017B بسرعة 10 ميجاهرتز DDs	مفتاح ديجي	BK4017B-ND
شعيرات زجاج البوروسيليكات	وورلد بريسيجن إنسترومنتس	1B100F-4
مجموعة برامج Clampex pCLAMP 11	الأجهزة الجزيئية	–
نظام DigiData 1550B	الأجهزة الجزيئية	–	يشمل ذلك جهاز بثق صغير، وحقنتين، وغشاء 100 PC، و100 دعامة فلتر، وحامل واحد/كتلة تسخين
دوديكان، 99٪	سيغما-ألدرتش	112-40-3
مجموعة البثق مع حامل وكتلة تسخين	أفانتي بولار ليبيدات	610000
برمجيات فيجي	ImageJ	–
الفريزر (-80 & درجة؛ C)	فيشر ساينتيفك	إيزوتيمب؛ الطراز: 8964؛ الرقم السري: 828278-21
الأواني الزجاجية	VWR الدولية	–
غراميسيدين-أ	ميليبور سيغما	368020
هيكساديكان، 99٪	سيغما-ألدرتش	544-76-3
مزيل ضوضاء الحشرة الطنين (60 هرتز)	أنظمة A-M	726300
نظام المجهر المقلوب (نيكون Ti2-A)	نيكون	–	يمكن استخدام أي مجهر مقلوب أو قائم
كحول الأيزوبروبيل	VWR الدولية	BDH1133-4LP
حامل الإلكترود الدقيق	وورلد بريسيجن إنسترومنتس	MEH1S
الميكرو مانبوليتورز	آلة ساتر	MP-285	يمكن استخدام أجهزة التحكم اليدوية
كاميرا المجهر	أوليمبوس	DP74
مايكروسوفت إكسل	مايكروسوفت	–
الممسحات	سيغما-ألدرتش	M1254
برنامج كاميرا المجهر من NIS-Elements	نيكون	–	يمكن استخدام برامج التقاط الكاميرا التي توفر إمكانية العرض المباشر و/أو الفيديو. قد يستخدم العرض المباشر وتسجيل الشاشة المتزامن كبديل لالتقاط الفيديو.
فيلم المختبر متعدد الأغراض بارافيلم إم	بارافيلم	PM999
بيتري ديش	-	-	يجب أن يكون الطبق شفافا من الأسفل ويفضل أن يكون الجدار الجانبي أيضا
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	سيغما-ألدرتش	P3911
قفازات فحص النتريل الناعمة الخالية من البودرة	VWR الدولية	CA89-38-272
ريفريجيراتور (4 & درجة؛ C)	فيشر ساينتيفك	رقم التسجيل: 97-938-1؛ رقم الطراز: 3556FS
سلك فضي	جودفيلو	147-346-94
تحريك الطبق الساخن	ثيرمو ساينتيفيك	SP131325