مقالة منهجية

عزل الخلايا المفردة من أجنة زينوبوس المبكرة وفرزها حسب الحجم

DOI:

10.3791/70630

⸱

مارس 20, 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف طريقة لعزل الخلايا المفردة من الأجنة المبكرة Xenopus laevis وفرزها حسب حجم الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تكوين الجنين المبكر انخفاضا أسيا في حجم الخلية، بينما يبقى حجم الجنين ثابتا في المراحل الأولى من التطور. لا تزال الأهمية الوظيفية والآليات التي يؤثر بها حجم الخلية على تطور الأجنة غير مدروسة إلى حد كبير. يوفر جنين زينوبوس المبكر نظاما فريدا لسد هذه الفجوات الكبرى. مقارنة بالكائنات النموذجية الأخرى، فإن جنين زينوبوس المبكر كبير جدا ويحتوي على تدرج بحجم الخلية، من خلايا صغيرة عند القطب الحيواني إلى خلايا كبيرة عند القطب النباتي، عبر الجنين بأكمله في مراحل حول الانتقال الأريمية الوسطى. هنا، نصف بروتوكولا لفصل الخلايا المفردة عن الأجنة المبكرة لزينوبوس وفرزها حسب الحجم باستخدام مصفاات خلايا ذات أحجام مسام شبكية مختلفة. كما يتم تحديدها من خلال التصوير وقياسات الحجم، فإن الخلايا المرتبة ضمن النطاق المتوقع للحجم ويمكن استخدامها لتحليل أو تسلسل الخلايا الحية أو تثبيتها للتصوير. سيسلط هذا النظام ضوءا جديدا على آليات تنظيمية تعتمد على الحجم خلال مراحل التطوير المبكرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تغير حجم الخلية هو سمة شائعة في التطور الجنيني المبكر، عندما تخضع البويضة المخصبة لعدة جولات من الانقسام، مما يولد عددا متزايدا من الخلايا. بينما يعرف الكثير عن دور حجم الخلية كعامل رئيسي يتحكم في وظائف الخلية 1,2,3، إلا أن كيف يؤثر حجم الخلية على التطور المبكر أقل شهرة. تشير أبحاث حديثة عبر أنظمة جنينية نموذجية مختلفة إلى أن حجم الخلية ينظم تنشيط الجينوم الزيجوي (ZGA)4 ومواصفة مصير الخلية5، مما يدعم دورا مهما لحجم الخلية في قرارات النمو 6,7.

يعد جنين زينوبوس المبكر نموذجا مهما لدراسة اتخاذ قرارات النمو المنظمة بحجم الخلية. نظرا لأن جنين زينوبوس المبكر كبير الحجم (~1.2 مم في القطر)، فمن السهل تعديل حجمه فيزيائيا، مما يجعله مفيدا لتقييم العواقب المباشرة لتغير حجم الخلية. على سبيل المثال، يمكن توليد أجنة صغيرة بأحجام مختلفة عن طريق تضييق أجنة خلية واحدة باستخدام حلقات الشعر4،8، مما يدل على وجود ZGA4 المعتمد على الجرعة. علاوة على ذلك، يحتوي جنين زينوبوس المبكر على تدرج لأحجام الخلايا على محور الحيوان-النباتي، حيث تكون أصغر الخلايا عند القطب الحيواني وأكبر الخلايا عند القطب النباتي، مما يظهر فرقا يزيد عن 100 ضعف في الحجمالرابع. ومن المهم أنه من خلال تصور وقياس النسخ الناشئة مباشرة في خلايا منفردة للأجنة الكاملة، حددنا عتبة حجم الخلية التي تنظم ZGA4. علاوة على ذلك، أكد عزل الخلايا المفردة من أجنة Xenopus المبكرة وفرزها حسب الحجم أهمية عتبة حجم الخلية ZGA4.

هنا نصف الإجراءات التفصيلية لعزل الخلايا المفردة من الأجنة المبكرة من Xenopus laevis وفرزها حسب الحجم. يمكن تفكك الأجنة المبكرة لزينوبوس إلى خلايا فردية عن طريق حضانها في وسط خال من Ca2+ وMg2+ (CMFM)9، ويمكن فرز هذه الخلايا المفردة باستخدام مصفاات خلايا ذات أحجام مسام شبكية مختلفة. يمكن تنقية الخلايا المصنفة واستخدامها في تطبيقات متنوعة، بما في ذلك تحليل الخلايا الحية، أو التسلسل، أو اختبارات التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الموافقة على العمل الحيواني الموضح هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة ساوث كارولينا.

1. تحضير المحلول

ملاحظة: قبل بدء البروتوكول، جهز الحلول التالية.

  1. جهز 20× MMR: اخلط 100 ملليمول HEPES، 2 ملليمول EDTA، 2 ملليمول NaCl، 40 ملليمولار KCl، 20 ملليمول MgCl2، و40 ملليمول CaCl2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 باستخدام NaOH. استخدم الأوتوكلاف ويخزن في درجة حرارة الغرفة.
  2. تحضير الوسط الحر من Ca2+، Mg2+ (CMFM): خلط 50.3 mM NaCl، 0.7 mM KCl، 9.2 mM Na2HPO4، 0.9 mM KH2PO4، 2.4 mM NaHCO3، و1.0 mM EDTA. اضبط درجة الحموضة إلى 7.4 إذا لزم الأمر. استخدم الأوتوكلاف ويخزن في درجة حرارة الغرفة.
  3. حضر جل أغاروز بنسبة 1.5٪ في طبق بتري بقطر 60 مم: أضف 0.75 جرام من الأجاروز إلى 50 مل من CMFM. سخن لإذابة الأجاروز في فرن ميكروويف. أضف 5-10 مل من جل الأغاروز لتغطية طبقة رقيقة في طبق بتري بقطر 60 مم.
  4. جهز وسط تدرج كثافة 15٪ (وزن/حجم)/CMFM: أضف ببطء 15 جرام من وسط تدرج الكثافة إلى 100 مل من CMFM. لتسهيل الذوبان، قم بتسخين وتحريك على طبق حتى يذوب وسط تدرج الكثافة بالكامل. حافظ على المحلول عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  5. تحضير 4٪ PFA/1× MEM: اخلط قارورة واحدة (10 مل) من مخزون بارافورمالديهايد 16٪ و4 مل من 10× MEM (1000 ملم MOPS pH 7.4، 20 ملليمول EGTA، و10 ملليمولار MgSO4). أضف ماء فائق النقي إلى 40 مل.
    ملاحظة: للحصول على أجنة Xenopus ، اتبع بروتوكول قياسي لإجراء التلقيح الصناعي (IVF) (على سبيل المثال، انظر Sive وآخرون، 2007). يجب أن يكون الجنين في معدل MMR 0.1× جاهز للاستخدام.

2. تفكك الأجنة المبكرة إلى خلايا مفردة

  1. أضف ~15 مل من CMFM إلى طبق بتري جديد مقاس 60 مم مغطى بجل أغاروز بنسبة 1.5٪. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل 10-100 جنين (حسب احتياجات التجارب) إلى الطبق. ضع الطبق تحت المجهر المجسم.
  2. استخدم الملقط في كلتا اليدين لإزالة غشية الفيتلين بعناية عن طريق تثبيته على سطح الأجنة بملقط واحد وتقشيره بالأخرى. تجنب إتلاف الأجنة أثناء العملية.
  3. حضن الأجنة المحاطة بالديفيتيل في CMFM لمدة ~1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اهز الطبق بلطف كل 5 دقائق لتسهيل تفكك الخلايا. تحقق بانتظام حتى لا تظهر أكوام من البلاستوميرات (الشكل 1).

3. فرز الخلايا المفكككة حسب الحجم

  1. أثناء تفكك بلاستومير، اغمر صبغات الخلايا (40 ميكرومتر، 70 ميكرومتر، و100 ميكرومتر) في أطباق بتري فردية مملوءة ب CMFM (الشكل 2). ضع الأطباق بالترتيب من اليسار إلى اليمين كما هو موضح. كما أضف طبقين آخرين مملوءين ب CMFM بين المجموعتين لغسل مؤقت لصبغات الخلايا أثناء كل فرز.
  2. حرك الطبق بلطف الذي يحتوي على البلاستوميرات الفردية المعزولة لإثرائها في مركز الطبق. انقل بلاستوميرات بحذر إلى صبغة 40 ميكرومتر في CMFM.
  3. اهز المصفاة بلطف عدة مرات لتسمح للبلاستوميرات < 40 ميكرومتر بالاستقرار عبر المصفاة. ثم انقل بسرعة مصفاة 40 ميكرومتر إلى الطبق المملوء ب CMFM للغسل القصير. انقل بلاستوميرات في مصفاة 40 ميكرومتر، والتي > 40 ميكرومتر، بحذر إلى مصفاة 70 ميكرومتر.
  4. كرر الخطوات حتى يتم فرز البلاستوميرات في مصفاة 100 ميكرومتر.
  5. لف كل طبق بلطف مع بلاستومير مرتبة لإثرائها في وسط الطبق. انقل بلاستوميرات (~4 مل) بعناية إلى قمة 0.5 مل من وسط تدرج كثافة 15٪ في أنبوب فرز الخلايا النشط بالفلورة (FACS) (الشكل 3). تجنب الخلط.
  6. اترك الأنبوب لمدة 10 دقائق. تستقر البلاستوميرات السليمة في القاع بفعل الجاذبية، وتنفصل عن كرات الصفار الناتجة عن البلاستوميرات المتفجرة أثناء الفرز والانتقال (الشكل 3).
  7. اعتمادا على غرض التجارب اللاحقة، يمكنك المضي قدما في تحليل الخلايا الحية، أو تجميد البلاستوميرات في النيتروجين السائل لعمل الحمض النووي الريبي، أو تثبيت البلاستوميرات لتلطيخ المناعة (الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم حضان أجنة Xenopus laevis (n = 50) في المرحلة 9 في وسط CMFM للتفكك إلى بلاستوميرات مفردة وفقا لهذا البروتوكول (انظر المثال في الشكل 1). تم فرز البلاستوميرات المفردة المفككة بشكل متسلسل باستخدام مصفاة الخلايا بحجم 40 ميكرومتر، 70 ميكرومتر، و100 ميكرومتر كما هو موضح أعلاه. تم تثبيت خليط التحكم غير المصنف والبلاستوميرات الفردية التي تم فرزها في 4٪ من بارافورمالديهايد، وتم تصويرها تحت مجهر ذو مجال ساطع (الشكل 4A). كما هو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حجم الخلية مهم جدا للوظائف الخلوية3، وتأثيره على التطور المبكر يتطلب مزيدا من التدقيق في الأنظمة الجنينية النموذجية. هنا وصفنا تفاصيل عزل الخلايا المفردة من الأجنة المبكرة من Xenopus laevis وفرزها حسب الحجم باستخدام مصافي الخلايا، وهو أمر قد ينطبق على دراسات حجم الخلية. سمحت لنا هذه الطريقة بتقديم دليل مباشر على تنشيط جينات الزيجوت المنظمة بالحجم في بداية تكوين الجنين4.

تعد هناك عدة خطوات رئيسية حاسمة لن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف يصرح بعدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر مختبر ماثيو جود في جامعة بنسلفانيا على تدريبه. وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (R03HD105802).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
16٪ بارافورمالديهيد (PFA)خدمات الطوارئ الطبية15710-Sلصنع الحل التثبيتي
أطباق بتري ذات الاستخدام الواحد بحجم 60 ممVWR25384-092لحضانة الأجنة
المجاهر الستيريو ACCU-SCOPE 3075 زوومVWR470351-130لتصور الأجنة
أغاروزسيغما-ألدرتشA-9414لتغطية أطباق البتري
مصفاة خلية، 100 وميكرو؛ mVWR76327-102لفرز الخلايا حسب الحجم
مصفاة خلية، 40 وميكرو؛ mVWR76327-098لفرز الخلايا حسب الحجم
مصفاة الخلايا، 70 وميكرو؛ mVWR76327-100لفرز الخلايا حسب الحجم
أنابيب النقل القابلة للتخلصVWR414004-035لنقل الأجنة
ملقط دومونت، النمط 5علوم المجهر الإلكتروني72701-Dلإزالة غشاء الفيتلين
طبق بتري الزجاجي، 60 ومرة؛ 15 ممVWR75845-542لحضانة الأجنة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
  2. Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 38, 291-319 (2022).
  3. Chadha, Y., Khurana, A., Schmoller, K. M. Eukaryotic cell size regulation and its implications for cellular function and dysfunction. Physiol Rev. 104 (4), 1679-1717 (2024).
  4. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  5. Hubatsch, L., et al. A cell size threshold limits cell polarity and asymmetric division potential. Nat Phys. 15 (10), 1075-1085 (2019).
  6. Fung, H. F., Bergmann, D. C. Function follows form: How cell size is harnessed for developmental decisions. Eur J Cell Biol. 102 (2), 151312(2023).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  9. Venkataraman, T., Dancausse, E., King, M. L. PCR-based cloning and differential screening of RNAs from Xenopus primordial germ cells: Cloning uniquely expressed RNAs from rare cells. Methods Mol Biol. 254, 67-78 (2004).
  10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة