جهاز ميلي فلويديك مزرعة مستمرة لدراسة الإشريكية القولونية تحت ظروف منخفضة ومتقلبة من العناصر الغذائية

Juanita Lara-Gutiérrez; Kang Soo Lee; Jen Nguyen; Zachary Landry; Uria Alcolombri; Johannes Keegstra; Joaquín Jiménez-Martínez; Roman Stocker

doi:10.3791/70652

مقالة منهجية

جهاز ميلي فلويديك مزرعة مستمرة لدراسة الإشريكية القولونية تحت ظروف منخفضة ومتقلبة من العناصر الغذائية

DOI:

10.3791/70652

⸱

يوليو 7, 2026

Juanita Lara-Gutiérrez¹ , Kang Soo Lee¹^,² , Jen Nguyen¹ , Zachary Landry¹ , Uria Alcolombri¹^,³ , Johannes Keegstra¹ , Joaquín Jiménez-Martínez¹^,⁴ , Roman Stocker¹

¹Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, ²Department of Mechanical Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), ³Department of Plant and Environmental Sciences, Institute of Life Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, ⁴Department of Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology (Eawag)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا لجهاز الزراعة المستمر الميلي فلويديك (MCCD)، الذي يسمح بزراعة تجمعات البكتيريا في ظروف منخفضة المغذيات باستمرار (حتى مئات التركيزات النانومولية) أو تقلبات المغذيات الزمنية على نطاق زمني دقيق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تتميز المواطن الميكروبية في الطبيعة بتركيزات منخفضة من المغذيات المختلطة، والتباين المكاني، والتقلبات الزمنية. ومع ذلك، تفشل طرق الزراعة المخبرية التقليدية في تكرار هذه الظروف. لا يمكن للزراعة الدفعية الحفاظ على النمو في بيئات منخفضة المغذيات، بينما تحافظ الكيموستاتات على نمو مستقر مع عنصر مغذي محدد واحد، لكنها تتحدى التنفيذ عندما يكون الهدف هو الحفاظ على تركيزات منخفضة محددة من خلطات المغذيات أو إدخال تقلبات سريعة. تولد الأنظمة الميكروفلويدية بيئات ديناميكية لكنها تنتج كتلة حيوية غير كافية لتحليلات الأوميك على مستوى السكان. لمعالجة هذه القيود، نقدم جهاز الزراعة المستمرة الميلي فلويدية (MCCD)، وهو منصة متعددة الاستخدامات لدراسة الاستجابات الميكروبية للظروف الغذائية المستقرة والمتقلبة. يحتوي MCCD على مجموعات البكتيريا داخل مرشح Sterivex (غشاء تصفية مسامي بحجم 0.45 ميكرومتر بولي فينيليدين فلوريد [PVDF])، حيث يحافظ تدفق مستمر من الوسط على ظروف زراعة مستقرة مع منع استنزاف المغذيات. نظام صمام الملف اللولبي ثلاثي الاتجاهات، الذي يتم التحكم فيه عبر برنامج ماتلاب المخصص، يتيح تقلبات دقيقة ودقيقة في المغذيات. يوفر هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لتشغيل MCCD في وضعين: (1) ظروف منخفضة المغذيات الثابتة و(2) ظروف تقلب العناصر الغذائية. باستخدام هذا النظام، نمت الإشريكية القولونية بشكل أسي في مزيج من الأحماض الأمينية والنيوكليوبازات الموجودة بتركيزات من عشرات إلى مئات النانومولات، وبلغت تركيزات الخلايا في حدود 10⁹ خلايا/مل. من خلال إعادة خلق السمات الرئيسية للمواطن الميكروبية الطبيعية، يمكن MCCD دراسة نمو البكتيريا وفسيولوجيا تحت ظروف مضبوطة لكنها ذات صلة بيئية في الإشريكية القولونية وغيرها من الأنواع الميكروبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تواجه البكتيريا في المواطن الطبيعية منظرا طبيعيا من العناصر الغذائية يختلف غالبا في التركيب والتركيز، ويمكن أن يتقلب عبر نطاق واسع من الفترات الزمنية 1,2,3,4. في بيئات مثل المحيط⁵، والتربة³، والأمعاء⁶، غالبا ما يكون نمو الميكروبات مقيدا بواحد أو أكثر من العناصر الغذائية الأساسية، ويمكن أن يتغير توفر العناصر الغذائية بسبب العمليات الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية⁴. تدفع هذه الخلطات الغذائية وتقلباتها استراتيجيات ميكروبية للبقاء والنمو، وتشكل استجابات عبر مستويات مختلفة من التنظيم البيولوجي⁴.

تحدث التكيفات الميكروبية مع ديناميكيات العناصر الغذائية على مستوى المجتمع، والسكان، والخلايا الواحدة. على مستوى المجتمع، يمكن أن تعزز التقلبات تعايش الأنواع⁷، وتنسق تكوين المجتمع والنشاط الأيضي مع التغير الزمني⁸، وتخلق فرصا لأنواع جديدة لاستعمار⁹. على مستوى السكان، يمكن أن يسرع تغير ظروف المغذيات التطور من خلال اختيار التغيرات الجينية¹⁰ أو تحفيز التغيرات الظاهرية، بما في ذلك استراتيجيات التحوط¹¹، التي تحسن البقاء في ظروف غير متوقعة. على مستوى الخلية الواحدة، تعدل البكتيريا فسيولوجيتها استجابة للبيئة الغذائية¹²^،¹³. أحد الأمثلة التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا هو فسيولوجيا محددة تمنح البكتيريا ميزة نمو تحت ظروف^{متقلبة 14}. نظرا لأن البكتيريا تواجه كثيرا محدودية في العناصر الغذائية، فإن دراسة كيفية استجابتها لظروف نقص وتنوع العناصر الغذائية — سواء كخلايا فردية أو داخل مجموعات أو مجتمعات — أمر ضروري لفهم سلوكها في بيئاتها الطبيعية.

الكيميائيات مناسبة جيدا لدراسة النمو تحت القيود بواسطة عنصر غذائي واحد، لكنها صعبة الاستخدام عندما يكون الهدف هو التحكم في تركيزات عدة عناصر غذائية في خلطات منخفضة التركيز. كانت الأنظمة الكيميائية أدوات قيمة لدراسة تكيف البكتيريا مع قيود العناصر الغذائية من خلال توفير بيئة مستقرة ومضبوطة جيدا. ومع ذلك، فإن عملها يقيدها بطبيعتها في ظروف يكون فيها النمو محدودا بعنصر غذائي أساسي واحد. في الكيموستات، يتم ضبط معدل التخفيف بحيث يوازن نمو الخلايا إمداد عنصر غذائي محدد واحد، مما يثبت معدل النمو بدلا من تركيزات العناصر الغذائية^{الفردية.} لا يعمم هذا الإطار بسهولة على البيئات التي تحتوي على خلطات من المغذيات القابلة للاستبدال — مثل مصادر الكربون المتعددة — لأن معدل التخفيف يتحكم فقط في معدل النمو الكلي، وليس تركيزات كل مكون في الوسط^16,17. نتيجة لذلك، تنشأ تركيزات العناصر الغذائية الفردية وأنماط الاستخدام المشترك لها من الاستخدام الميكروبي بدلا من أن يتم وصفها خارجيا^16,17.

بالإضافة إلى ذلك، بينما يمكن أن تحدث تقلبات المغذيات في الكيميائيات، فإن التقلبات السريعة أو الانزياحات الفردية على مقياس الدقائق يصعب تحقيقها بسبب حجم الزراعة الكبير عادة. برزت الأجهزة الميكروفلويدية كأدوات قوية لإنشاء بيئات غذائية دقيقة منخفضة التركيز وتقلبات¹⁴. عند دمجها مع المجهر المرئي، تمكن من قياس نمو الخلية الواحدة. على الرغم من أن الأنظمة الميكروفلويدية تسمح بقياس تعبير البروتينات المختارة باستخدام مراسلات فلورية، إلا أن الأجهزة الميكروفلويدية النموذجية صغيرة جدا لإنتاج الكتلة الحيوية اللازمة لتحليلات الأوميك، على سبيل المثال، لدراسة بروتيوم مجموعة بكتيرية. لسد هذه الفجوة، طورنا جهاز الزراعة المستمر الميلي فلويديك (MCCD).

يتيح MCCD نمو البكتيريا تحت ظروف مغذية مضبوطة، بما في ذلك ظروف منخفضة المغذيات المستمرة مع استنزاف طفيف أو معدوم، بالإضافة إلى ظروف تذبذب المغذيات، باستخدام نظام زراعة تدفق مستمر قادر على توليد كتلة حيوية كافية للتحليلات اللاحقة. يستخدم MCCD مرشح PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر كوعاء للزراعة، حيث يتم تجديد الوسط باستمرار بواسطة مضخة بيري ستالتية توصل وسط طازج من الخزان (الشكل 1A). يحتفظ الغشاء المسامي للمرشح بالبكتيريا مع السماح بتدفق محدد للمغذيات، مما يمنع استنزاف العناصر الغذائية حتى عند تركيزات منخفضة (من مئات النانو موللار إلى الميكرومول). نظرا لأن الكتلة الحيوية تحتفظ بها أثناء تدفق الوسط الطازج باستمرار عبر الجهاز، فإن MCCD يشترك في أوجه تشابه مع الريتينتوستاتس¹⁸، حيث تحتفظ الخلايا بينما يتم تجديد الوسط. ومع ذلك، يختلف MCCD عن الريتينتوستات الكلاسيكية في بنيته وطريقة توصيل المغذيات. عادة ما يعمل الريتنتوسات كمفاعل كتلة متحرك، حيث تعلق الخلايا في حجم زراعة مختلط جيدا. في مثل هذه الظروف، يعتمد توفر المغذيات على التوازن بين الخلط والانتشار وامتصاص الخلايا، وقد ينشأ استنزاف أو تدرجات محلية، خاصة عند تركيزات منخفضة من العناصر الغذائية وكثافة الخلايا العالية. على النقيض من ذلك، في MCCD، تتجمع الخلايا مباشرة على الغشاء داخل خرطوشة ستيريفيكس ذات الحجم الصغير، مكونة طبقات بسماكة بضع خلايا تتعرض باستمرار لوسط جاري. لا يتم فرض خلط نشط داخل الخرطوشة؛ بدلا من ذلك، يتم توحيد الوسط في أعلى التيار ويتم توصيله عبر تدفق مستمر. يتم توفير العناصر الغذائية عبر النقل الحراري عبر طبقات الخلايا الرقيقة، ونظرا لصغر مسافة الانتشار وارتفاع معدل التدفق، تقل تدرجات المغذيات المحلية. نتيجة لذلك، فإن ظروف المغذيات التي يعاني منها السكان تتحدد بشكل أساسي بتركيب الوسط الداخل، مما يتيح ظروفا أكثر اتساقا ووضوح من نقص المغذيات مقارنة بأنظمة الاحتفاظ بالعناصر المختلطة.

figure-introduction-1
الشكل 1: جهاز الزراعة المستمر بالميليفلويدية (MCCD) للزراعة البكتيرية في ظروف منخفضة التركيز أو متقلبة في المغذيات. (أ) مخطط MCCD للظروف الغذائية الثابتة. تدفع مضخة التباهي تدفق وسط جديد من خزان عبر فلتر PVDF بقوة 0.45 ميكرومتر يحتوي على خلايا بكتيرية. الغشاء المسامي في المرشح يحتفظ بالبكتيريا مع السماح للوسط بالمرور من خلالها. يحافظ تدفق الوسط المستمر على ظروف مغذية ثابتة داخل المرشح، حتى عند تركيزات منخفضة جدا من المغذيات. (ب) مخطط MCCD للظروف الغذائية المتقلبة. صمام ملف لولبي ثلاثي الاتجاه يتحكم فيه البرمجيات أعلى مضخة التبريستالية بالتناوب بين تدفق الوسط بين خزانين (مثل تركيز المغذيات العالي، C_عالي، وتركيز منخفض المغذيات، C_منخفض). يتحكم البرنامج في موقع المكبس في الصمام لتحديد مصدر التدفق النشط. (ج) التجميع السائل لحالات المغذيات الثابتة. غطاء يحتوي على ثلاثة أنابيب سيليكون تمر بإغلاقه يغلق الزجاجة التي تحتوي على وسط جديد. يتصل أحد الأنابيب بفلتر تهوية للتهوية، بينما يحمل الاثنان الآخران الوسط إلى المرشحات. تربط وصلات الشوكة إلى الذكر هذه الأنابيب بأنبوب التبيض، وتربط كل أنبوب بريستالي بصمام فحص أحادي الاتجاه، يعمل كنقطة دخول إلى الفلتر. كما أن مخرج الفلتر مزود بصمام فحص أحادي الاتجاه. تظهر الصورة عينتين، كل واحدة تحتوي على مرشح واحد. (د) التجميع السائل لظروف المغذيات المتقلبة. تحتوي المنصة المعدنية على المتحكم الدقيق والمكونات الإلكترونية التي تتحكم في صمامين لولبيين عبر برنامج ماتلاب المخصص. تربط وصلات ملولبة إلى بارب كل من مداخل ومخارج صمامات الملف اللولبي بالأنبوب. يحتوي كل صمام على مدخلين للوسطين البديلين، هنا وسط عالي التركيز على العناصر الغذائية، C_عالي الأنابيب ذات العلامة الحمراء، ووسط منخفض تركيز المغذيات، C_منخفض، وأنابيب تحمل علامة زرقاء. تحتوي الوسائط داخل زجاجات مغطاة بفلتر فتحة تهوية، كما في (C). تتصل مخارج الصمامات اللولبية بالمرشحات عبر أنابيب التوازن، كما في مجموعة الحالة المستقرة (C). تظهر الصورة عينتين، كل واحدة تحتوي على مرشح واحد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج صمام ملف لولبي ثلاثي الاتجاه يتحكم فيه البرمجيات في أعلى التيار من مرشح ستيريفكس المستخدم من تبديل تدفق الوسط بين وسطين محتويين في خزانات مختلفة (الشكل 1B). وبالتالي، يمكن استخدام الجهاز لدراسة استجابة البكتيريا إما لبيئة مستقرة في حالة مغذية ثابتة (بما في ذلك انخفاض التركيز) أو لتقلبات العناصر الغذائية، مع فترات زمنية تمتد لعدة دقائق أو أكثر.

يوضح هذا البروتوكول تجميع وتشغيل MCCD لدراسة البكتيريا في ظروف منخفضة المغذيات وتقلبات المغذيات. كمثال، يوفر هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لإجراء تجربة نمو باستخدام الإشريكية القولونية NCM3722 في وضعين تشغيليين لMCCD: ظروف منخفضة المغذيات الثابتة وظروف المغذيات المتقلبة. يمكن تكييف نظام MCCD بسهولة مع ظروف غذائية أخرى وأنواع ميكروبية، مما يجعله منصة متعددة الاستخدامات لدراسة فسيولوجيا البكتيريا في بيئات غذائية نموذجية لتلك التي تواجهها الطبيعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نمو البكتيريا في ظروف المغذيات الثابتة

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إجراء إجراء منحنى نمو الإشريكية القولونية NCM3722 في حالة متوسط معرف غني مخفف جدا ("RDM منخفض"). يمتد منحنى النمو هذا لمدة 12 ساعة، مع عينة واحدة يتم جمعها كل ساعتين (بمجموع 6 نقاط زمنية). المبدأ الأساسي لهذا البروتوكول هو أن كل نقطة زمنية تمثل مرشح ستيريفيكس واحد (ويشار إليه من الآن فصاعدا بمرشح PVDF بقوة 0.45 ميكرومتر). لجمع عينة، يتم استرجاع الزراعة داخل الفلتر عن طريق طرده رأسا على عقب، ويتم قياس رقم الخلية، ثم يتم التخلص من المرشح. كل مرشح PVDF بقوة 0.45 ميكرومتر ينتج عينة واحدة فقط. يتطلب إعداد التجربة تحديد ثلاثة معايير رئيسية في التجربة: معدل تدفق مضخة التبيض، مدة التجربة، والعدد المطلوب من العينات (أي عدد مرشحات PVDF بقطر 0.45 ميكرومتر). اضبط معدل التدفق الأولي على 2 مل/دقيقة. قم بتعديل هذا المعامل حسب الحاجة (مثلا، زيادة معدل التدفق للحفاظ على إمداد عنصر غذائي مخفف جدا).

تحضير الوسط والمواد
ملاحظة: بما أن كل مرشح يتوافق مع عينة زمنية واحدة، فإن وقت التشغيل التجريبي لكل مرشح PVDF بقوة 0.45 ميكرومتر يختلف حسب وقت جمعه (مثلا، ساعتان لنقطة الزمن الأولى، 4 ساعات لنقطة الزمن الثانية، وهكذا).
1. تقدير حجم وسط الزراعة المطلوب باستخدام الصيغة
  ,
  حيث n هو عدد العينات (مرشحات PVDF بقطر 0.45 ميكرومتر)، وQ هو معدل التدفق (بالملليمتر/دقيقة)، وt_i هو وقت التشغيل التجريبي (بالدقائق) لكل عينة.
2. اضرب في 1.2 لإضافة حجم إضافي بنسبة 20٪ لأخذ تباين معدل التدفق في الاعتبار. في هذا المثال، احسب
3. قم بتقريب الحجم المحسوب للأعلى (مثلا، جهز 6,200 مل في هذا المثال).
4. تحضير المواد للتعقيم (انظر الجدول 1).
  ملاحظة: جهز وتعقيم المواد في اليوم السابق للتجربة لضمان الجاهزية وتقليل التأخيرات. قم بتعقيم هذه المواد، باستثناء صمامات لوير أحادية الاتجاه؛ قم بتعقيم الصمامات بنسبة 70٪ إيثانول.
  1. اربط طرفي ستة أنابيب سيليكون بتركيبات بلاستيكية من نوع "Male Luer to Barb" عن طريق إدخال طرف Barb من الوصلة في الأنبوب. غط نهايات اللوئر الذكري بورق الألمنيوم لمنع التلوث.
    ملاحظة: تم تجهيز ستة أنابيب بيضعة لأن التجربة تستخدم ستة مرشحات PVDF بقوة 0.45 ميكرومتر. سيتم تركيب جميع الأنابيب لاحقا على نفس رأس المضخة البدائية بحيث تتلقى جميع المرشحات نفس التدفق الطبيعي.
  2. ضع الأنبوب داخل وعاء مغلق وقابل للتعقيم.
  3. ضع فلاتر التهوية داخل حاوية مغلقة وقابلة للتعقيم.
  4. ضع أغطية الزجاجات المغطاة بأنابيب سيليكون تمر عبر الأغطية داخل حاوية مغلقة وقابلة للتعقيم.
    ملاحظة: أغطية الزجاجات الأنبوبية المستخدمة في هذا البروتوكول مزودة بثلاثة أنابيب تعبر الأغطية: أنبوبان متساوي القطر لتوصيل الوسط إلى مرشحات PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر، وأنبوب ثالث بقطر أوسع. هذه الأنابيب مثبتة بإحكام على الأغطية ولا يمكن إزالتها.
  5. اغمر 12 صمام فحص Luer أحادي الاتجاه في محلول إيثانول بنسبة 70٪ واتركها طوال الليل لتعقيم.
    ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين المواد المعقمة مغمورة ومغلقة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل بدء التجربة. قبل الاستخدام، قم بإزالة الصمامات من الإيثانول وشطفها بماء معقم فائق النقي لإزالة بقايا الإيثانول. بدلا من ذلك، يمكن طباعة صمامات الفحص ثلاثية الأبعاد باستخدام مواد قابلة للتعقيم للسماح بالتعقيم باستخدام التعقيم بدلا من معالجة الإيثانول.
5. استخدم الأنابيب البائسة، ومرشحات التهوية، وأغطية الزجاجات، والأسطوانة المتدرجة، والزجاجات باستخدام إعدادات المختبر القياسية.
6. تحضير 6,200 مل من الوسائط منخفضة المعرفة (RDM؛ انظر جدول المواد) عن طريق خلط الكواشف المدرجة في الجدول 2.
  ملاحظة: حضر الوسط في يوم التجربة، خلال فترة الانتظار التقارب 5 ساعات بعد بدء الزراعة المسبقة (انظر الخطوة 1.2.1). هذا يحافظ على نضارة متوسطة ويقلل من خطر التلوث.
تحضير مزرعة بكتيرية مسبقة
ملاحظة: استخدم ما قبل الزراعة في المرحلة الأسية لبدء التجربة. خلال هذه المرحلة، تنمو البكتيريا بمعدل ثابت، حيث تصنع مكونات الخلايا بشكل متوازن وتنقسم عند كتلة خلوية محددة. استخدم الخلايا ذات الطور الأسي لتقليل التغير وتوحيد الحالة الفسيولوجية الابتدائية.
1. في اليوم السابق للتجربة، جهز مزرعة ليلية (ON) كما يلي: تلقيح 3 مل من RDM الكامل بمخزون جليسرول مجمد من NCM3722 الإشريكية القولونية في أنبوب زراعة معقم بسعة 15 مل. حضن الثقافة طوال الليل (~16 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع هز عند 200 دورة في الدقيقة في حاضنة هز.
  ملاحظة: (نقطة توقف) بمجرد دخول ثقافة ON إلى الحاضنة، لا يتم اتباع أي خطوات أخرى في هذا اليوم. استأنف البروتوكول في اليوم التالي بالانتقال إلى الخطوة 1.2.2.
2. في يوم التجربة، جهز الزراعة المسبق كما يلي: أضف 6 ميكرولتر من زراعة ON إلى 6 مل من RDM الكامل. قسمهما بالتساوي إلى أنبوبين زراعة بسعة 15 مل ووضع علامة A و B. حضن كلا الأنبوبين عند 37 درجة مئوية مع هز عند 200 دورة في الدقيقة.
  ملاحظة: عادة ما تتطلب مرحلة ما قبل الزراعة حوالي 5 ساعات للوصول إلى المرحلة الأسية (OD₆₀₀ ≈ 0.5). استخدم هذه الفترة لتحضير الوسط الطازج (انظر الخطوة 1.1.6). لا تتابع الخطوة 1.2.3 حتى يصل OD₆₀₀ إلى حوالي 0.5.
3. راقب الكثافة الضوئية (OD) عند 600 نانومتر باستخدام أنبوب B. تابع التجربة عندما يصل OD₆₀₀ إلى حوالي 0.5، مما يشير إلى نمو أسي في RDM الكامل ل E. coli NCM3722 (انظر القسم 1.4).
  ملاحظة: ابدأ التجربة باستخدام خلايا الطور الأسي لتحسين قابلية التكرار وتوحيد شروط البداية.
تحضير تجربة في MCCD مع ظروف مغذية ثابتة
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات من 1.3.1 إلى 1.3.5 داخل خزانة أمان حيوي معقمة فور بدء نمو الزراعة المسبقة.
1. خصص الحجم المتوسط الكلي لكل زجاجة.
  ملاحظة: استخدم الزجاجات كخزانات متوسطة. استخدم أغطية زجاجات مزودة بأنبوبين للتوصيل المتوسط، حيث يوصل كل أنبوب إلى فلتر PVDF واحد بقوة 0.45 ميكرومتر. توزيع حجم الوسط الكلي (المعد في الخطوة 1.1.6) بين الزجاجات بناء على الكمية المطلوبة لكل عينة زمنية (أي كل مرشح PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر) خلال التجربة.
  1. استخدم الصيغة المقدمة في الخطوة 1.1.1 لتحديد حجم الوسط المطلوب لكل مرشح PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر. على سبيل المثال، باستخدام المصطلحات التالية:
    
    إجمالي حجم الوسائط المطلوبة لكل نقطة زمنية، بالترتيب الزمني، هو 288، 576، 864، 1152، 1440، و1728 مل.
  2. وزع أحجام الوسط المحسوبة عبر الزجاجات، مع تجميع الأحجام المطلوبة لنقطتين زمنيتين في زجاجة واحدة. على سبيل المثال: ~900 مل في زجاجة واحدة سعة 1 لتر (لنقاط الزمن 1 و2)، ~2,100 مل في زجاجة واحدة سعة 2.5 لتر (لنقاط الزمن 3 و4)، ~3200 مل من الوسط في زجاجة واحدة سعة 4 لتر (لنقاط الزمن 5 و6).
2. أغلق كل زجاجة بأغطية الزجاجات المغطاة بأنابيب (الشكل 1C). شد الأغطية بإحكام لمنع التسرب.
3. قم بتوصيل فلتر تهوية بحجم 0.2 ميكرومتر بأوسع أنبوب سيليكون يمتد من غطاء الزجاجة الأنبوب (الشكل 1C). وهذا يسمح بتبادل هواء معقم أثناء التجربة.
4. قم بتثبيت أحد طرفي كل أنبوب بريستالتيك (مع تركيبات مثبتة مسبقا؛ انظر القسم 1.1.4 حول تحضير المواد) بأنابيب السيليكون ذات القطر الأصغر الممتدة من أغطية الزجاجات المغلقة (الشكل 1C). تأكد من وجود وصلات آمنة للحفاظ على التعقيم. اترك غطاء ورق الألمنيوم على وصلة قفل Male Luer الحرة في مكانه حتى تبدأ التجربة لمنع التلوث.
5. ضع الزجاجات مع الأنابيب المجمعة ومضخة التمريض في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية. ثبت الأنبوب في قنوات رأس المضخة التبيضية.
  ملاحظة: جميع أنابيب التبريستال تركب على نفس رأس المضخة لمضخة بيريستالية واحدة، بحيث تستقبل جميع مرشحات PVDF بقوة 0.45 ميكرومتر وسط من نفس المضخة. استخدام مضخة واحدة يضمن أن معدل التدفق متطابق عبر المرشحات ويمنع التغيرات التي قد تنشأ من الاختلافات بين المضخات.
بروتوكول تجربة في MCCD مع ظروف مغذية ثابتة
1. تخفيف الزراعة المسبقة (OD = 0.5) بنسبة 1:10 بإضافة 600 ميكرولتر من الزراعة المسبقة إلى 5.4 مل من RDM الطازج المنخفض.
2. باستخدام منارة بسعة 1 مل، أدخل 1 مل من الزراعة المسبقة المخففة في كل من مرشحات PVDF الستة بحجم 0.45 ميكرومتر.
3. شطف صمامات الفحص أحادية الاتجاه بماء فائق نقي ومركب واحدا في كل طرف من كل فلتر PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر.
4. قم بإزالة أغطية رقائق الألمنيوم من وصلات أنابيب التبريستاتيك.
5. توصيل كل من مرشحات PVDF الستة بحجم 0.45 ميكرومتر بمفصل ذكر لوير على أنبوب التبريستالي (الشكل 1C).
6. اضبط معدل التدفق على 2 مل/دقيقة على مضخة التبيضات وابدأ التدفق. عرف هذه اللحظة بأنها الزمن 0.
7. ضع مقبس نفايات تحت مرشحات PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر لجمع التدفق.
  ملاحظة: يوضح الشكل 2A التجميع الكامل للتجربة داخل صندوق الحاضنة.
جمع عينات
1. بعد ساعتين، افصل أحد فلترين PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر المتصلين بزجاجة 1 لتر.
2. قم بفك صمامات الفحص أحادية الاتجاه وضع فلتر PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل مع توجيه المدخل للأسفل.
3. قم بالطرد المركزي بأنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على فلتر PVDF بقطر 0.45 ميكرومتر بقوة 2000 × جرام لمدة دقيقتين.
4. باستخدام قاطع الأنابيب، اضغط بلطف على الغلاف البلاستيكي في الطرف الأقرب إلى المخرج لفتح فلتر PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر.
  ملاحظة: قم بتعقيم قاطع الأنابيب قبل الاستخدام (مثلا بمسح 70٪ إيثانول) لتجنب التلوث عند فتح فلتر PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر.
5. حرر الأسطوانة الداخلية التي تحتوي على الغشاء المسامي وتخلص من الجزء من المرشح الذي يحمل الغشاء.
6. شطف الجدران الداخلية لغلاف فلتر PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر (تلك العمودية على اتجاه التدفق) باستخدام وسط الزراعة الذي تم جمعه في أنبوب الطرد المركزي.
  ملاحظة: تضمن هذه الخطوة جمع أي خلايا محاصرة على الجدران أثناء الطرد المركزي.
7. قس الحجم الكلي المجمع باستخدام ماصة مصلية بحجم 5 مل.
8. في النقاط الزمنية التالية (4 ساعات، 6 ساعات، 8 ساعات، 10 ساعات، و12 ساعة)، افصل مرشحات PVDF المقابلة بتردد 0.45 ميكرومتر وكرر الخطوات 1.5.2–1.5.6. اتبع هذا الترتيب المحدد:
  1. عند 4 ساعات، افصل الفلتر الثاني بحجم 0.45 ميكرومتر PVDF المتصل بزجاجة 1 لتر.
  2. عند 6 ساعات و8 ساعات، قم بفصل فلاتر PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر المتصلة بزجاجة 2.5 لتر.
  3. عند 10 ساعات و12 ساعة، افصل فلاتر PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر المتصلة بزجاجة 4 لتر.
    ملاحظة: اتبع هذا الترتيب لمطابقة نقاط وقت أخذ العينات مع أحجام الوسائط الموزعة في الخطوة 1.3.1.
التحليلات اللاحقة
1. خذ ثلاثة أليكوات بحجم 100 ميكرولتر من كل عينة وثبت بغلوتارالديهايد إلى تركيز نهائي يبلغ 1.5٪.
  تحذير: غلوتارالديهيد سام، ومهيج قوي، وحساس محتمل. أمسك داخل غطاء بخار كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات نيتريل، ونظارات أمان). تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. التخلص من النفايات التي تحتوي على الجلوتارالديهايد وفقا للوائح النفايات الكيميائية الخطرة المؤسسية.
2. استخدم العينات الثابتة لعد عدد الخلايا لكل ميكرولتر باستخدام قياس تدفق الخلايا بعد وضع الوسم بصبغة الحمض النووي الفلورية.
  تحذير: قد تكون أصباغ الحمض النووي الفلورية مسببة للطفرات. ارتد القفازات والتخلص من النفايات المحتوية على الصبغة وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية.
  ملاحظة: كبديل لتلوين الحمض النووي وقياس خلوية التدفق، يمكن تقدير كثافات الخلايا عن طريق طلاء حجم صغير من العينة على ألواح أغار غنية متوسطة (مثل الأجار الغنية) وعد وحدات تكوين المستعمرات (CFUs).
3. اضرب عدد الخلايا لكل ميكرولتر في الحجم الكلي المقاس في الخطوة 1.5.7 لحساب إجمالي عدد الخلايا الموجودة داخل مرشح PVDF بحجم 0.45 ميكرومتر.
4. قم بالطرد المركزي بحجم ما تبقى في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل عند 10,000 × جرام لمدة 4 دقائق.
5. أزل السوبرناتانت.
6. تخزين حبيبات الخلايا عند -80 درجة مئوية للتحليلات المستقبلية (مثل النسخ).

figure-protocol-4
الشكل 2: التجميع التجريبي لمركز MCCD. (أ) صورة لإعداد MCCD لظروف المغذيات الثابتة. يتم وضع الإعداد في صندوق حاضنة للحفاظ على درجة حرارة ثابتة، مع مقبس نفايات يجمع وسط التدفق عبر الجسم. (ب) صورة فوتوغرافية لإعداد MCCD لظروف العناصر الغذائية المتقلبة. تحتوي الزجاجة الموسومة بشريط أحمر على وسط عالي التركيز على العناصر الغذائية (C_عالي)، بينما تحتوي الزجاجة المميزة بشريط أزرق على وسط منخفض تركيز المغذيات (C_منخفض). المنصة المعدنية في الوسط تدعم المكونات التي تتحكم في تقلبات المغذيات، والتي تتوافق مع تلك الموضحة في الشكل 1D. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. نمو البكتيريا في ظروف المغذيات المتقلبة

تجميع وحدة تحكم لصمام الملف اللولبي
ملاحظة: التحكم في صمام الملف اللولبي ثلاثي الاتجاهات باستخدام دائرة تبديل تعتمد على المتحكم الدقيق متصلة بجهاز كمبيوتر يعمل بواجهة مستخدم رسومية مخصصة (GUI) تم تطويرها في MATLAB.
1. قم بتجميع دائرة التحكم في صمام الملف اللولبي (الشكل 3A).
  1. قم بتوصيل دبوس الإخراج الرقمي من المتحكم الدقيق بقاعدة ترانزستور NPN عبر مقاومة بقوة 1 كيلو أوم.
  2. قم بتوصيل جامع الترانزستور بالطرف السالب لصمام الملف اللولبي.
  3. قم بتوصيل باعث الترانزستور بالأرضي.
  4. قم بتوصيل الطرف الموجب لصمام الملف اللولبي بمزود طاقة تيار مستمر خارجي متوافق مع جهد الصمام.
  5. ضع دايود عبر أطراف الملف اللولبي. قم بتوصيل الجانب المخطط من الصمام الثنائي بخط التزويد الموجب.
    ملاحظة: يقوم الصمام الثنائي بكبح ارتفاعات الجهد الناتجة عند إيقاف تشغيل الملف اللولبي.
2. قم بتثبيت وصلات بلاستيكية "ملولبة إلى شوكة الخرطوم" على صمامات الملف اللولبي، لضمان امتداد طرف الشوكة للخارج.
3. قم بتثبيت MATLAB R2022b أو أحدث على جهاز كمبيوتر مزود باتصال USB.
4. قم بتثبيت حزمة دعم MATLAB المطلوبة للاتصال التسلسلي مع أجهزة المتحكم الدقيق.
5. قم بتوصيل لوحة المتحكم الدقيق بالكمبيوتر باستخدام كابل USB لإنشاء اتصال تسلسلي.
6. افتح واجهة المستخدم الرسومية المبنية على MATLAB المستخدمة لتوليد ظروف مغذية متقلبة في MCCD (متوفرة في الرابط https://github.com/juanitaLara/MCCD).
7. تحقق من الاتصال بين صمامات الملف اللولبي ومنصة واجهة المستخدم الرسومية في MATLAB:
  1. افتح منصة واجهة المستخدم في Matlab واضغط على زر Connect (الشكل 3B). انتظر حتى تظهر رسالة Controller متصل بنجاح في نافذة الأوامر.
  2. أدخل قيمة للخطوة الزمنية (مثلا، 5 ثوان للمراحل العالية والمنخفضة) تحت لوحة التشغيل الآلي .
  3. راقب صمامات الملف اللولبي واستمع لصوت النقر الذي تصدره أثناء التبديل بين الوسائطين.
  4. باستخدام ساعة، تأكد من أن صمامات الملف اللولبي تتحول بدقة عند الفترة المحددة (مثلا كل 5 ثوان).
    ملاحظة: قم بإجراء هذا التحقق قبل كل تجربة لتأكيد الاتصال وتصحيح تبديل الصمامات. (نقطة توقف) بعد التحقق من تشغيل صمام الملف اللولبي، يمكن للنظام البقاء مجمع داخل الحاضنة لعدة ساعات قبل بدء التجربة.
إعداد الوسائط والمواد
ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول التناوب بين حالات المغذيات بين RDM المنخفض والعالي مع فترة ساعة واحدة (30 دقيقة في RDM العالي تليها 30 دقيقة في RDM المنخفض). تستمر التجربة لمدة ثلاث ساعات من التقلبات، مع جمع عينتين: (1) عند 3 ساعات و1 دقيقة (طور RDM عالي، مباشرة بعد التبديل من منخفض إلى عالي)، و(2) عند 3 ساعات و31 دقيقة (طور RDM منخفض، مباشرة بعد التبديل من العالي إلى المنخفض).
1. تقدير أحجام وسائط الزراعة المطلوبة حسب المراحل التجريبية.
  1. أولا، احسب الأحجام المطلوبة لأول 3 ساعات (ثلاث فترات تذبذب كاملة):
    حجم RDM منخفض = 1.2 × 2[mL/min] × 90[دقيقة] × 2 [مرشحات PVDF 0.45 ميكرومتر] = 432[mL]
    حجم RDM العالي = 1.2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2 [مرشحات PVDF 0.45 ميكرومتر] = 432[mL]
  2. احسب الحجم المطلوب للمرحلة النهائية التي مدتها 30 دقيقة:
    حجم RDM العالي = 1.2 × 2[mL/min] × 30[دقيقة] × 1 [مرشحات PVDF 0.45 ميكرومتر] = 72[mL]
  3. قم بتقريب الأحجامات إلى قيم مناسبة (مثلا، 500 مل من RDM منخفض و600 مل من RDM عالي).
2. تحضير المواد لتعقيم المعقم (انظر الجدول 3) من خلال الخطوات 1.1.4 – 1.1.5.
  ملاحظة: جهز وتعقيم المواد في اليوم السابق للتجربة لضمان الجاهزية وتقليل التأخيرات في يوم التجربة (الخطوات 2.2.3 و2.2.4). هذا الإعداد، مقارنة بتجارب المغذيات الثابتة، يتطلب أنابيب إضافية لتوصيل زجاجات الوسائط مباشرة بصمام الملف اللولبي (الشكل 1B,D). تتطلب هذه الأنابيب وصلة واحدة فقط من "بارب إلى لوير ذكر"، حيث أن وصلات الصمامات الصلوبية مجمعة مسبقا. غط أطراف هذه الأنابيب بورق الألمنيوم قبل التعقيم (الأوتوكلاف).
3. قم بتعقيم أنابيب التفريغ المحضر، ومرشحات التهوية، والأغطية، والأسطوانة المتدرجة، والزجاجات في جهاز تعقيم (أوتوكلاف).
4. اغمر 4 صمامات فحص Luer أحادية الاتجاه في محلول إيثانول 70٪ واتركها طوال الليل لتعقيم.
  ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن أن تبقى صمامات الفحص المعقمة مغمورة في الإيثانول طوال الليل وتخزن محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 ساعة. قبل الاستخدام، اشطف الصمامات بماء ميلي-كيو معقم.
5. نظف وتعقيم صمامات الملف اللولبي عن طريق غسلها بإيثانول 70٪ 3–5 مرات، ثم بالماء فائق النقي 3–5 مرات.
6. في يوم التجربة، خلال فترة الانتظار التي تبلغ حوالي 5 ساعات بعد تحضير الزراعة المسبقة (انظر الخطوة 2.3)، حضر 500 مل من RDM منخفض و600 مل من RDM العالي عن طريق خلط المواد المدرجة في الجدول 4.
  ملاحظة: تحضير الوسائط في يوم التجربة يضمن الحداثة ويقلل من مخاطر التلوث.
تحضير مزرعة بكتيرية مسبقة
1. اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 1.2.
تحضير تجربة في MCCD مع ظروف تذبذب المغذيات
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات 2.4.1–2.4.4 داخل خزانة أمان حيوي معقمة فور بدء نمو الزراعة المسبقة.
1. ضع كل وسط في زجاجة سعة 1 لتر.
2. أغلق الزجاجات بأغطية مجمعة مسبقا مزودة بثلاثة منافذ وأنابيب سيليكون مثبتة مسبقا. شد الأغطية بإحكام لمنع التسرب.
3. قم بتوصيل فلتر تهوية بحجم 0.2 ميكرومتر إلى أنبوب السيليكون العريض الممتد من أحد منافذ كل غطاء زجاجة.
4. توصيل "أنبوب المدخل" (الموضح في الشكل 1D) بأنابيب السيليكون الممتدة من أغطية الزجاجات الأنبوبية قبل توصيلها بصمامات الملف اللولبي:
  1. قم بتثبيت أحد طرفي أنبوب السيليكون (مع تركيب واحد فقط) على الأنبوب الممتد من غطاء الزجاجة منخفض RDM.
  2. اترك غطاء ورق الألمنيوم على وصلة قفل Male Luer الحرة حتى يتم نقل الزجاجات إلى الحاضنة لمنع التلوث.
  3. كرر الخطوة 2.4.4.1 للزجاجة ذات ال RDM العالي.
5. ضع الزجاجات مع أنابيب الدخول المجمعة، والمضخة الدوارة، وصمامات الملف اللولبي مع وحدة التحكم داخل الحاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية.
6. توصيل "أنبوب المدخل" (المثبت في الخطوة 2.4.4) بمداخل صمامات الملف اللولبي بالطريقة التالية:
  1. قم بتوصيل الأنبوبين من زجاجة RDM منخفضة إلى أحد المدخلين في كل صمام ملف لولبي (الأنابيب الموسومة بشريط أزرق في الشكل 1D).
  2. قم بتوصيل الأنبوبين من زجاجة RDM عالية إلى أحد المدخلين في كل صمام ملف لولبي (أنابيب موسومة بشريط أحمر في الشكل 1D).
7. قم بتوصيل أنبوب سيليكون متوافق مع مضخة البيريستاليك (مع وصلة واحدة فقط) بمخرج كل صمام لولبي (الشكل 1D). اترك غطاء ورق الألمنيوم على وصلة قفل Male Luer الحرة حتى تبدأ التجربة في الحفاظ على التعقيم.
بروتوكول تجربة في MCCD مع ظروف تقلب المغذيات
1. تحقق من الاتصال بين صمامات الملف اللولبي وبرنامج Matlab من خلال تنفيذ الخطوة 2.1.7.
2. أدخل قيم الخطوات الزمنية المطلوبة للتقلبات في منصة واجهة ماتلاب الرسومية: أدخل خطوات زمنية بمقدار 1800 ثانية في ال High RDM (30 دقيقة) و1800 ثانية في RDM المنخفض (30 دقيقة).
3. اختر Low تحت قائمة Start من القائمة للبدء في حالة RDM منخفضة (الشكل 3).
4. تم زرع مرشحي PVDF بسرعة 0.45 ميكرومتر كما هو موضح في الخطوة 1.4.
5. ابدأ التجربة.
  ملاحظة: يوضح الشكل 2B التجميع السائل الكامل لهذا التجربة.
جمع عينات
1. اجمع عينات كما في الخطوة 1.5. احصد أول فلتر PVDF بقوة 0.45 ميكرومتر خلال 3 ساعات ودقيقة والثاني بعد 3 ساعات و31 دقيقة.
  ملاحظة: افصل أي من الفلترين أولا؛ كلا المرشحين يغذيان نفس الوسيط.
التحليلات اللاحقة
1. اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 1.6 لحساب عدد الخلايا عبر قياس خلوي التدفق ولمعالجة وتخزين العينات للتحليلات اللاحقة (مثل علم النسخ النصي).

figure-protocol-5
الشكل 3: متحكم صمامات الملف اللولبي لفرض تقلبات في العناصر الغذائية. (أ) مخطط الأسلاك للدائرة الإلكترونية المستخدمة للتحكم في صمام الملف اللولبي. تتكون الدائرة من لوحة متحكم دقيق، وترانزستور يستخدم كعنصر تحويل، ومقاومة متصلة بقاعدة الترانزستور، وديود ارتداد مثبت عبر صمام الملف اللولبي لحماية الدائرة من ارتفاعات الجهد الناتجة أثناء تبديل الصمامات. يتحكم المتحكم الدقيق في الترانزستور، الذي بدوره يحول الطاقة المؤدية إلى صمام الملف اللولبي. تم التكييف بإذن من المرجع ²⁰ . (ب) بعد توصيل لوحة المتحكم الدقيق بكل من الكمبيوتر الذي يشغل واجهة المستخدم الرسومية ومصدر طاقة بالجهد المطلوب من صمامات الملف اللولبي، يتم التواصل بالنقر على زر الاتصال . يمكن تشغيل الصمامات يدويا باستخدام لوحة التشغيل اليدوي ، حيث يختار المستخدم الوسيط الذي سيتم طيرانه (مثل "عالي" أو "منخفض"). بدلا من ذلك، تتيح لوحة التشغيل الآلي للمستخدم تحديد الوسيط الأولي والخطوات الزمنية (بالثواني) لكل مرحلة (عالية ومنخفضة)، وبدء العملية بالنقر على زر البدء . تعرض شاشة الوقت الحقيقي دالة خطوة (0 = منخفض، 1 = عالي) مع مرور الوقت، تشير إلى أي وسط كان يتدفق عبر صمامات الملف اللولبي إلى المرشحات خلال الثواني السابقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، استخدمنا MCCD لقياس معدل نمو NCM3722 الإشريكية القولونية تحت ظروف منخفضة المغذيات باستمرار عند ثلاثة تركيزات RDM. تم اشتقاق هذه التراكيز من صيغة الوسط الغني المعرفة (RDM) التي وصفها نيدهارت¹⁹، حيث تم تخفيف مكملات الأحماض الأمينية والنيوكليوبازية إلى 0.5٪، 0.25٪، و0.01٪ من التركيبة الأصلية على التوالي.

أجريت تجارب نمو مكررة في كل وسط لقياس معدلات النمو. بالنسبة لظروف RDM بنسبة 0.5٪ وRDM بنسبة 0.25٪، أجرينا ثلاث ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طرق الزراعة البكتيرية التي تلتقط تعقيد العناصر الغذائية في البيئات الطبيعية ضرورية لتقدم دراسة فسيولوجيا الميكروبات إلى ما هو أبعد من الظروف المخبرية المبسطة. تحتوي النظم البيئية الطبيعية على خلطات من العناصر الغذائية تغطي نطاق تركيز واسع، وغالبا لا تدعم معدلات النمو القصوى 1,3,4,21,22,23. ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بكل امتنان التمويل من جائزة الباحث من مبادرة التعايش في الأنظمة المائية من مؤسسة جوردون وبيتي مور (GBMF9197؛ https://doi.org/10.37807/GBMF9197)، ومؤسسة سيمونز من خلال تعاون مبادئ النظم البيئية الميكروبية (PriME) (المنحة 542395FY22)، ومنحة المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم 205321_207488 ل R.S. K.S.L. تعترف بالدعم من معهد كوريا للعلوم الأساسية (المركز الوطني للمرافق والمعدات البحثية؛ جرانت رقم RS2025-00554860) والمؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF؛ جرانت رقم RS2025-23523643)، وكلاهما ممول من قبل حكومة كوريا (MSIT)، ومن صندوق أبحاث 2025 (1.260002.01) التابع ل UNIST.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1K Ohm Resistor	BC Robotics	ELC-021	Power Rating: 1/6 W
1N4001 Diode	BC Robotics	ELC-001	DC Reverse Voltage: 50 V; Average Rectified Current: 1 A
3-stop platinum-cured silicone peristaltic tubing	Innofluid	SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8	Inner diameter 0.8 mm; outer diameter 2.4 mm; compatible with peristaltic pump used
3-way Solenoid valves	Emerson Electric Co.	0055A301L0T00F3	12 V DC, 1 W
Aluminum foil			Suitable for autoclaving
Arduino Uno Rev4	Arduino	SKU ABX00173
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Cap closure with three ports – for 1 and 2 L bottles	Nalgene	2162-0531	Or different company (make sure they fit the selected bottles)
Cap closure with three ports – for 4 L bottle	Nalgene	2162-0830	Or different company (make sure they fit the selected bottles)
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge that fits 50 mL Falcon tubes
Centrifuge	Eppendorf	5424R	Centrifuge that fits 1.5 and 2 mL eppendorf tubes
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fischer Scientific	10788561	Falcon tube
Culture tubes (14 mL, sterile)	Greiner bio-one		Culture tubes
Ethanol	Sigma Aldrich	493511	Dilute to 70%
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Graduated cylinder - 500 mL	Nalgene	3662-0500	Or different company
Incubator box			Custom-built incubator box – contact corresponding authors for construction details
LabV1 Intelligent Low Flow Rate Peristaltic Pump	Innofluid	SE-LABV1-AMC12(10)	Available at Darwin Microfluidics
Male Luer-to-barb fitting	Aldrich	Z277142	Male Luer-to-barb adapter compatible with 0.8 mm ID tubing (see Figure 1C)
Male Luer-to-threaded fitting	Aldrich	Z277142	Used to connect the solenoid valve to the "inlet tubing" (see Figure 1D)
Matlab	Mathworks	R2022b or later	Software to run the custom-made software for the solenoid valves
MOPS EZ Rich Defined Medium Kit	Teknova	M2105	MOPS medium for Enterobacteria
One-way Luer check valve	Masterflex	30505-92	Prevents backflow into medium reservoirs
Pipe cutter - 0-37 mm	KS Tools	2222051	Or different company
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/16 in	Nalgene	8060-0020	Inner diameter 1/16 in (1.6 mm); used for fluctuating-nutrient experiments
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/8 in	Nalgene	8060-0030	Inner diameter 1/8 in (3.2 mm); used for fluctuating-nutrient experiments
Polypropylene copolymer bottle - 1 L	Nalgene	2126-1000	Or different company
Polypropylene copolymer bottle - 2 L	Nalgene	2126-2000	Or different company
Polypropylene copolymer bottle - 4 L	Nalgene	2126-4000	Or different company
Serological pipette - 5 mL	Corning	CLS4487	Or different company
Solderless Breadboard	BC Robotics	PROTO-001
Sterivex-HV filter - 0.45 µm PVDF	Millipore	SVHV01015
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563	Nucleic acid stain for cell counting in flow cytometer
TIP120 Darlington Transistor	BC Robotics	TRN-005
Tubes - 1.5 mL	Eppendorf	3810X	Tubes for centrifuging cell cultures and storing pellets
Vent filter	Millex	SLFG05000	0.2 µm hydrophobic vent filter
Waste receptacle			Volume capacity should be at least the total media volume to be used in the experiment

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
Or, D., et al. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30 (6–7), 1505-1527 (2007).
Nguyen, J., et al. Environmental fluctuations and their effects on microbial communities, populations and individuals. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), (2021).
Moore, C. M., et al. Processes and patterns of oceanic nutrient limitation. Nat Geosci. 6 (9), 701-710 (2013).
Doranga, S., et al. Nutrition of Escherichia coli within the intestinal microbiome. EcoSal Plus. 12 (1), eesp-0006(2024).
Rodríguez-Verdugo, A., et al. The rate of environmental fluctuations shapes ecological dynamics in a two-species microbial system. Ecol Lett. 22 (5), 838-846 (2019).
Thaiss, C. A., et al. Transkingdom control of microbiota diurnal oscillations promotes metabolic homeostasis. Cell. 159 (3), 514-529 (2014).
Kearney, S. M., et al. Orthogonal dietary niche enables reversible engraftment of a gut bacterial commensal. Cell Rep. 24 (7), 1842-1851 (2018).
Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat Rev Genet. 4 (6), 457-469 (2003).
Beaumont, H. J. E., et al. Experimental evolution of bet hedging. Nature. 462 (7269), 90-93 (2009).
Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced growth of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
Ballesta, J. P. G., Schaechter, M. Effect of shift-down and growth inhibition on phospholipid metabolism of Escherichia coli. J Bacteriol. 107 (1), 251-258 (1971).
Nguyen, J., et al. A distinct growth physiology enhances bacterial growth under rapid nutrient fluctuations. Nat Commun. 12 (1), (2021).
Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112 (2920), 715-716 (1950).
Egli, T., Lendenmann, U., Snozzi, M. Kinetics of microbial growth with mixtures of carbon sources. Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 289-298 (1993).
Lendenmann, U., Snozzi, M., Egli, T. Kinetics of the simultaneous utilization of sugar mixtures by Escherichia coli in continuous culture. Appl Environ Microbiol. 62 (5), 1493-1499 (1996).
Tappe, W., et al. Cultivation of nitrifying bacteria in the retentostat, a simple fermenter with internal biomass retention. FEMS Microbiol Ecol. 19 (1), 47-52 (1996).
Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
Controlling a solenoid valve with Arduino. , Available from: https://bc-robotics.com/tutorials/controlling-a-solenoid-valve-with-arduino/ (2015).
Egli, T. The Ecological and Physiological Significance of the Growth of Heterotrophic Microorganisms with Mixtures of Substrates. Advances in Microbial Ecology. , Plenum Press. New York. (1995).
Koch, A. L. Oligotrophs versus copiotrophs. BioEssays. 23 (7), 657-661 (2001).
Muenster, U. Concentrations and fluxes of organic carbon substrates in the aquatic environment. Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 243-274 (1993).
Murugan, A., et al. Roadmap on biology in time varying environments. Phys Biol. 18 (4), (2021).
Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Bacterial mechanosensors. Annu Rev Physiol. 80 (1), 71-93 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233 Millifluidics

جهاز ميلي فلويديك مزرعة مستمرة لدراسة الإشريكية القولونية تحت ظروف منخفضة ومتقلبة من العناصر الغذائية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة