فحص المكونات الفعالة بمساعدة الحاسوب والتحقق من صحة أدوية الدونغ لاستكشاف الحمى والسعال

ملخص

هنا، أنشأنا شبكة متعددة الأبعاد من "المكون-الهدف-المسار-المرض"، تدمج فحص الدواء الشبكي، والالتحام الجزيئي، والتحقق من نموذج الفأر الناتج عن LPS. من خلال وضع معايير رئيسية واضحة، يمكن التعرف بكفاءة على المكونات الفعالة في طب تونغ العرقي، لينغيوشياو تانغ، والتحقق من عملية قابلة للتكرار.

الملخص

لفحص والتحقق بشكل منهجي من المكونات الفعالة في طب دونغ العرقي لينغيوشياو تانغ (LYXT؛ السائل المنوي Pharbitidis، Verbena officinalis L.، وZingiber officinale Rosco) لعلاج الحمى والسعال، وقد أسس هذا النظام عملية منهجية تدمج التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق التجريبي. أولا، باستخدام قاعدة بيانات وتحليل أنظمة الأدوية التقليدية للطب الصيني (TCMSP)، مع توفر حيوي فموي (OB) ≥ 30٪ وتشبه الدواء (DL) ≥ 0.18 كمعايير، تم فحص المكونات النشطة الرئيسية ل LYXT، وتم جمع الأهداف المرتبطة بالحمى والسعال من عدة قواعد بيانات للأمراض. لاحقا، تم بناء شبكة تفاعل "المكون-الهدف-المرض"، ومن خلال التحليل الطوبولوجي وأنطولوجيا الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG)، تم تحديد أهداف العمل الأساسية (CYP3A4، POR) ومسارات الإشارة الرئيسية (مسار MAPK). تم استخدام تقنية الالتحام الجزيئي للتحقق من قدرة المكونات الرئيسية على الارتباط بالأهداف الأساسية. وأخيرا، تم تأسيس نموذج لالتهاب الشعب الهوائية المزمن للفأر من خلال التلقيح عبر الأنف لدهون بوليسكاريد (LPS)، وتم التحقق من فعالية المكونات النشطة الرئيسية المتوقعة المضادة للالتهاب في الجسم الحي . أظهرت النتائج أن مكونات مثل β-كاروتين والسابارينول، التي تم فحصها بواسطة علم الأدوية الشبكي، أظهرت درجات متفاوتة من التأثيرات المضادة للالتهاب في التجارب الحيوانية، وقد تشمل آلياتها تثبيط مسار الإشارة MAPK/p38. يوفر هذا النظام مثالا قابلا للتكرار لفحص وأبحاث آليات المكونات الفعالة في الطب العرقي التقليدي.

المقدمة

طب دونغ هو نظام إثنوميدابيكال ضمن إطار الطب الصيني التقليدي (TCM)، يمارسه العرق الدونغ في قويتشو وهونان وقوانغشي. يمثل معرفتهم التجريبية التراكمية، التي تطورت عبر الأجيال. يدمج هذا النظام الطب العشبي، والوخز بالإبر، وتثبيت العظام، والتدليك، والعلاج الغذائي، والممارسات الروحية. تنبع خصائصها المميزة من العزلة الجغرافية التاريخية للمجموعة وتقاليدها الشفوية، التي عززت دواء فريدا قائم على الممارسة متكيفة مع البيئة المحلية والمعتقدات الثقافية.

الحمى المستمرة، وهي حالة تتطور عندما لا يستطيع الجسم التحكم في حرارته، هي علامة على أن الجسم غير وظيفي ووظيفة حيوية للحماية الذاتية في الخلايا البشرية¹. توجد العديد من الطرق المختلفة لعلاج طب التدفئة لشعب دونغ. من بينها، تصنف الحمى إلى حمى داخلية وحمى خارجية. الحمى الداخلية تشير إلى الحرارة الناتجة عن الأمراض الداخلية، والحمى الخارجية تشير إلى الحرارة الناتجة عن البرد أو الصدمة². عادة ما تؤثر الحمى الخارجية على وظيفة الجهاز الهضمي³. يستخدم أطباء دونغ الوطنيون علاج منشط للحرارة الباردة لعلاج الحمى. من بين وصفات أدوية دونغ المختلفة، لينغيوشياو تانغ (LYXT) هو محلول قياسي يستخدم للحمى والألم، ويحتوي على السائل المنوي Pharbitidis وVerbena officinalis L. وZingiber officinale Roscoe، والتي يتم دحنها وخلطها باستمرار^{مع الماء}. يستخدم بشكل رئيسي للحمى والصداع الناتجين عن نزلة البرد.

ومع ذلك، لا تزال المكونات الفعالة ل LYXT وآلياتها الجزيئية الأساسية غير مفهومة بشكل جيد. لسد هذه الفجوة، استخدمت الدراسة الحالية نهج علم الأدوية الشبكي للتنبؤ بالمكونات الفعالة المحتملة والأهداف. لتأكيد هذه التوقعات، تم اختيار نموذج فأر مستقر بفعل الدهون البوليسكارية (LPS) لالتهاب الرئة، حيث يحاكي الاستجابات الالتهابية الرئيسية المرتبطة بالحمى والسعال، بما في ذلك تسرب كريات الدم البيضاء وإنتاج السيتوكين الالتهابي.

في عملية اكتشاف الأدوية، كشفت دراسات مختلفة أن المركبات يمكن أن تتفاعل مع عدة أهداف بروتينية. لذا، فإن نموذج "دواء واحد، هدف بيولوجي واحد" يتحول إلى نموذج علم الأدوية المنظومة. المركب الذي يتفاعل مع عدة بروتينات بيولوجية مستهدفة للفيروسات أو البكتيريا يمكن أن يوفر تأثيرات دوائية مفيدة⁵. تحليل علم الأدوية الشبكي هو طريقة فعالة وفعالة للتخفيف من عملية اكتشاف الأدوية المكلفة والطويلة. يمكن أن يساعدنا في فهم أفضل للتفاعلات بين الأدوية، والتنبؤ بالآليات المسببة للمرض، واقتراح أعضاء دوائية بديلة للتأثيرات الدوائية المقصودة دون آثار جانبية، والتنبؤ بالأنشطة الحيوية للطب التقليدي. تم تطبيق الأساليب الكيميائية المعلوماتية، والالتحام الجزيئي، والنمذجة المستمدة من البيانات بنجاح للتنبؤ بالأنشطة الحيوية وتحليل الآليات. تسهل هذه الطرق الاكتشاف السريع للمركبات المضادة للفيروسات والبكتيريا ذات الإمكانيات السريرية، وتستخدم هذه الأساليب أيضا لشرح فعالية وآثار الأدوية الجانبية⁶. على سبيل المثال، إيماتينيب ميسيلات، وهو جزيء صغير، هو مثبط للعامل السببي في سرطان الدم النخاعي المزمن، وهو بروتين الاندماج Bcr-Abl، لكنه أيضا يمنع نشاط عدة كينازات تيروزين مثل Abl وKIT وPDGFR⁷. لذلك، لا يزال البحث في تحديد الأدوية وأهدافها أمرا حيويا في علاج الأمراض المحتملة، مما يساعدنا على فهم الآليات التي تعمل بها مركبات الأدوية لعلاج الأمراض على المستوى الجزيئي. يمكن لأساليب النمذجة الحاسوبية وتحليل الشبكات أن تفحص الأدوية والأهداف المحتملة بدقة، ويمكن لتحليل التفاعل الضربي أن يوفر أساسا نظريا وإرشادا عمليا للتحقق التجريبي. في هذه الورقة، باستخدام أداة البحث عن العكس المتبادل للجينات/البروتينات المتفاعلة (STRING)، وقاعدة بيانات للتعليق والتصور والاكتشاف المتكامل (DAVID)، وقواعد بيانات أخرى، مع تحليل الأنطولوجيا الجينية الديناميكية (GO) وتحليل المسارات، تم جمع بيانات المكونات الفعالة وبروتينات الفعل ذات الصلة من دواء دونغ LYXT للحمى والسعال، وتم استكشاف آلية العلاج المركب للمكونات الفعالة. والتي يمكن أن توفر مرجعا نظريا محددا لمزيد من الأبحاث حول دواء دونغ LYXT، وتوفر استراتيجية قابلة للتكرار لاستكشاف الآليات الدوائية للصيغ الإثنوطبية، وتقدم رؤى حول تطوير عوامل مضادة للالتهاب جديدة.

البروتوكول

تمت مراجعة برنامج التجارب الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات التجريبية في جامعة لانتشو (D2024-292). يتوافق مع مبادئ حماية الحيوان، ورفاهية الحيوان، وأخلاقياته، بالإضافة إلى الأحكام ذات الصلة بأخلاقيات رعاية الحيوانات التجريبية الوطنية.

1. إعداد قاعدة البيانات والبرمجيات

1. فحص المكونات الفعالة وجمع الجينات المستهدفة
   1. يمكنك الوصول إلى قاعدة بيانات وتحليل نظام طب الطب الصيني التقليدي (TCMSP) (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) وإجراء عمليات بحث منفصلة باستخدام الأسماء اللاتينية لكل عشبة في تركيبة LYXT، وهي السائل المنوي Pharbitidis، Verbena officinalis L.، وZingiber officinale Roscoe، ككلمات مفتاحية لاسترجاع جميع المركبات الكيميائية المرتبطة بكل عشبة.
   2. تطبيق معايير الفحص لتصفية المركبات المستخرجة لكل عشبة كما يلي: بالنسبة ل Verbena officinalis L.، اضبط التوافر الحيوي الفموي (OB) ≥ 30.1٪ وشبه الدواء (DL) ≥ 0.12؛ بالنسبة لمسؤولية زينجيبر روسكو، سجل OB ≥ 60٪ وDL ≥ 0.13; بالنسبة للسائل المنوي Pharbitidis، اضبط OB ≥ 16.93٪ وDL ≥ 0.50. ثم دمج قوائم المركبات المفلترة من الأعشاب الثلاثة وإزالة الإدخالات المكررة بناء على معرفات TCMSP الفريدة لإنشاء القائمة النهائية للمركبات النشطة في LYXT.
   3. تصدير جميع البروتينات المستهدفة المرتبطة بهذه المركبات الفعالة من قاعدة بيانات TCMSP كجدول يحتوي على معرفات المركبات وأسماء البروتينات المستهدفة، ثم استيراد قائمة البروتينات المستهدفة إلى قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org/).
   4. استخدم أداة تعيين معرف UniProtKB لتحويل جميع أسماء البروتينات المستهدفة إلى رموز جينية بشرية رسمية مع تعيين اتجاهات من اسم بروتين إلى آخر اسم الجين، وإزالة أي إدخالات تفتقر إلى رمز جين صالح لتوليد القائمة النهائية للجينات المستهدفة المرتبطة بالمكونات النشطة في LYXT.
2. تحليل جمع الجينات المستهدفة للمرض والتداخل
   1. قم بتنزيل جينات الحمى والسعال من قاعدة بيانات GeneCards (www.genecards.org) عن طريق البحث بشكل منفصل باستخدام المفتاحتين "الحمى" و"السعال"، والاحتفاظ بالجينات ذات الأهمية ≥ 5، ودمج نتائج البحثين داخل قاعدة البيانات.
   2. قم بتحميل الجينات المرتبطة بالحمى والسعال من قاعدة بيانات الأهداف العلاجية (TTD) (db.idrblab.net/ttd) بالبحث بشكل منفصل باستخدام الكلمات المفتاحية "حمى" و"سعال"، وتحميل جميع الجينات المستهدفة المرتبطة، وادمج نتائج كلتا البحثين داخل قاعدة البيانات.
   3. قم بتنزيل الجينات المرتبطة بالحمى والسعال من قاعدة بيانات PharmGkb (www.pharmgkb.org) عن طريق البحث بشكل منفصل باستخدام الكلمات المفتاحية "الحمى" و"السعال"، وتحميل جميع الجينات المرتبطة، وادمج نتائج كلتا البحثين داخل قاعدة البيانات.
   4. قم بتنزيل الجينات المرتبطة بالحمى والسعال من قاعدة بيانات الوراثة المندلية في الإنسان (www.omim.org OMIM) عبر البحث بشكل منفصل باستخدام كلمتي "الحمى" و"السعال"، وتحميل جميع الجينات المرتبطة، وادمج نتائج البحث في قاعدة البيانات.
   5. قم بتنزيل جينات الحمى والسعال من قاعدة بيانات DrugBank (go.drugbank.com)⁸ عن طريق البحث بشكل منفصل باستخدام كلمتي "الحمى" و"السعال"، وتحميل جميع الجينات المرتبطة، وادمج نتائج كلتا البحثين داخل قاعدة البيانات.
   6. قم بدمج قوائم الجينات التي تم الحصول عليها من جميع قواعد البيانات الخمس في قائمة شاملة واحدة وإزالة رموز الجينات المكررة لتوليد القائمة النهائية للجينات المستهدفة المرتبطة بأمراض الحمى والسعال.
   7. قارن قائمة أهداف المرض من الخطوة 1.2.6 مع قائمة الجينات المستهدفة النشطة للمكونات النشطة في LYXT من الخطوة 1.1.4 لاختيار الجينات المتداخلة المشتركة في كلتا القائمتين، وتصدير قائمة الجينات المتداخلة هذه كملف CSV.
3. تحويل الهوية وتحليل المقطع العرضي
   1. قم بتحميل قائمة الجينات المتداخلة من الخطوة 1.2.7 إلى بيئة R والوصول إلى موقع DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. قم بتحميل قائمة الجينات المتداخلة إلى DAVID مع تعيين النوع على الإنسان العاقل ونوع القائمة على رمز الجين، ثم نفذ أداة التعليق الوظيفي لإجراء تحليل المقطع العرضي.
   3. حول معرفات الرموز للبروتينات المتقاطعة إلى معرفات تجميعية باستخدام دالة تحويل معرف الجين داخل DAVID، مع تعيين اتجاه التحويل من رمز الجين إلى معرف المجموعة.
   4. تصدير قائمة معرف المجموعة المحولة مع رموز الجينات الأصلية كملف CSV لتحليل الإثراء في مرحلة لاحقة.

2. فحص المكونات الفعالة الحيوية والبروتينات المستهدفة

1. بناء شبكة الهدف المركب
   1. تحميل قائمة الجينات المتقاطعة من الخطوة 1.2.7 وقائمة الجينات المستهدفة النشطة للمكونات النشطة من الخطوة 1.1.4 إلى بيئة R، ثم قم بإجراء تحليل مقارنة لتحديد المركبات المرتبطة بكل من الجينات المستهدفة والجينات المتقاطعة.
   2. استورد بيانات العلاقة بين المركب والهدف إلى إصدار Cytoscape 3.8.1 وأنشئ مخطط شبكة "LYXT-Fever وهدف السعال" لعرض التفاعلات بين المكونات الفعالة وأهدافها المرتبطة.
2. جمع بيانات تفاعل البروتين مع البروتين
   1. استيراد ملف معرف الجينات لتقاطع أهداف المكونات الفعالة LYXT وأهداف الحمى والسعال التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.1.1 إلى قاعدة بيانات STRING عند https://stringdb.org/، واختيار Homo sapiens كنوع، وعدة بروتينات كطريقة معالجة البيانات.
   2. تصفية تفاعلات البروتين والبروتين عن طريق ضبط عتبة الثقة إلى ≥ 0.90 وعزل البروتينات ذات الارتباط المنخفض جدا، ثم إنشاء ملف TSV يحتوي على بيانات التفاعل المصفاة للتحليل اللاحق.
3. تأكيد تحليل التقاطعات
   1. استخدم لغة R لتحليل التقاطع بين البروتينات المستهدفة للمكونات الفعالة والبروتينات المستهدفة للحمى والسعال، مؤكدا مجموعة الجينات المتداخلة المحددة في الخطوة 1.2.7.
   2. جهز هذه المجموعة الجينية المتداخلة المؤكدة لتحليل شبكة تفاعل البروتين (PPI) لاحقا.

3. فحص البروتينات المستهدفة الرئيسية

1. تصور شبكة PPI
   1. استيراد بيانات التفاعل المفلترة من الخطوة 2.2.2 إلى إصدار Cytoscape 3.8.1 واستخدم أداة تصور الشبكة لرسم مخطط شبكة PPI.
   2. قم بتثبيت وفتح إضافة CytoNCA داخل Cytoscape، ثم استخدم هذه الإضافة لإجراء تحليل طوبولوجي عن طريق حساب المعلمات التالية لكل عقدة في الشبكة: مركزية الدرجة (DC)، مركزية المسافة (BC)، مركزية القرب (CC)، مركزية المتجه الذاتي (EC)، مركزية الشبكة (NC)، والاتصال المتوسط المحلي (LAC).
2. تحديد البروتين المستهدف الرئيسي باستخدام الفحص الوسيط
   1. تصدير جدول المعلمات الطوبولوجية المحسوبة من CytoNCA كملف CSV يحتوي على جميع معرفات العقد وقيم DC وBC وCC وEC وNC وLAC المقابلة.
   2. احسب القيمة الوسيطة لمركزية الدرجة (DC) عبر جميع العقد في الشبكة وحدد جميع العقد التي تتجاوز DC أكثر من ضعف القيمة الوسيطة.
   3. احسب القيم الوسيطة لمركزية القرب (CC) ومركزية المسافة (BC) عبر جميع العقد في الشبكة، ثم من العقد المحددة في الخطوة 3.2.2، احتفظ فقط بالعقد التي تحقق في الوقت نفسه CC أكبر من القيمة الوسيطة وBC أكبر من القيمة الوسيطة، باتباع نهج الفرز الذي وصفه Kibble وآخرون^.
3. تجميع هدف المفتاح النهائي
   1. تجميع معرفات العقد المحتجزة من الخطوة 3.2.3 في قائمة بالبروتينات المستهدفة الرئيسية وتصدير هذه القائمة كملف CSV.
   2. تطبيق قاعدة الفحص الوسيط هذه (DC أكبر من ضعف الوسيط، CC أكبر من الوسيط، وBC أكبر من الوسيط) كمعيار وحيد لتحديد الأهداف الرئيسية في جميع أنحاء المخطوطة، لضمان الاتساق مع نهج الفحص الموحد المنصوص عليه في البروتوكول.

4. تحليل إثراء GO وتحليل مسارات KEGG

1. تحليل الإثراء الوظيفي باستخدام قاعدة بيانات ديفيد
   1. باتباع الطريقة التي وصفها Tanabe وآخرون ¹⁰، قم بتحميل قائمة الجينات المتقاطعة من الخطوة 1.3.4 بصيغة رمز الجين إلى قاعدة بيانات DAVID في https://david.ncifcrf.gov/، وتعيين النوع إلى الإنسان العاقل، ونوع القائمة إلى رمز الجين.
   2. إجراء تحليل إثراء GO باختيار GOTERM_BP_DIRECT للعملية البيولوجية، GOTERM_CC_DIRECT للمكون الخلوي، GOTERM_MF_DIRECT للوظيفة الجزيئية، وإجراء تحليل إثراء مسار KEGG باختيار KEGG_PATHWAY.
   3. اضبط عتبة الدلالة إلى p < 0.05 وطبق تصحيح معدل الاكتشاف الكاذب بنجاميني-هوشبرغ (FDR) للاختبارات المتعددة، ثم قم بتنزيل نتائج الإثراء كملفات CSV تحتوي على أسماء المصطلحات، وعدد الجينات، وقيم p، وقيم p المعدلة ب FDR، والجينات المرتبطة بها.
2. توليد الرسوم البيانية الفقاعة باستخدام منصة OmicShare السحابية
   1. استيراد نتائج إثراء GO من الخطوة 4.1.3 إلى منصة OmicShare السحابية في https://www.omicshare.com/tools واختر أداة مخطط إثراء GO.
   2. قم بتحميل ملف النتائج الذي يحتوي على أسماء المصطلحات، وعدد الجينات، وقيم p، ثم قم بتكوين الأداة لعرض أفضل 20 مصطلحا بأدنى قيم p.
   3. اضبط محور x ليمثل نسبة الإثراء، ومحور y لسرد مصطلحات GO، وحجم الفقاعة لتمثيل عدد الجينات، ولون الفقاعة لتمثيل قيمة p.
   4. قم بإنشاء مخطط الفقاعات وتحميله كملف صورة عالي الدقة.
3. تصور مسار KEGG باستخدام KEGG mapper
   1. قم بترتيب نتائج إثراء مسار KEGG حسب قيمة p بترتيب تصاعدي واختيار أفضل 20 مسارا بأصغر قيم p.
   2. لكل مسار محدد، يمكنك الوصول إلى قاعدة بيانات KEGG في https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html للحصول على مخطط المسار.
   3. تحديد البروتينات المستهدفة من قائمة الجينات المتقاطعة الموجودة في كل مسار عن طريق المقارنة مع مجموعات الجينات المسارية من نتائج الإثراء.
   4. يمكنك الوصول إلى أداة رسم الخرائط KEGG عند https://www.kegg.jp/kegg/mapper/، واختيار دالة مسار اللون ، وأدخل قائمة رموز الجينات المتقاطعة ومعرف مسار KEGG، وأنشئ مخطط مسار ملون مع تمييز البروتينات المستهدفة المحددة باللون الأحمر.
   5. قم بتجميع جميع مخرجات تحليل الإثراء، بما في ذلك ملفات CSV لإثراء GO لثلاث فئات، وملف CSV الخاص بإثراء مسار KEGG، وصورة المخطط الفقاعي، ومخططات المسارات الملونة لأفضل 20 مسارا، ثم تصدير هذه الملفات للتحليل اللاحق.

5. التحقق من الالتحام الجزيئي

1. قم بتنزيل البنى ثلاثية الأبعاد للبروتينات الحيوية (مثل CYP3A4 وPOR المحددين كأهداف رئيسية في تحليل الشبكة) من قاعدة بيانات RCSB PDB في https://www.rcsb.org/، واختيار هياكل بدقة ≤ 2.5 آنغو من الإنسان العاقل التي تحتوي على رابطة متبلور لتحديد الموقع النشط، وحمل ملفات بيانات البنية للمركبات النشطة (بما في ذلك بيتا-كاروتين، سباتولينول، وبيتا-سيتوستيرول) من قاعدة بيانات PubChem بصيغة SDF.
2. تحضير هياكل البروتينات باستخدام AutoDockTools عن طريق إزالة جزيئات الماء والليگاند المتبلور معا، وإضافة الهيدروجين القطبي، وتعيين شحنات Gasteiger، ثم حفظ البروتينات المعدة بصيغة PDBQT، وتحويل ملفات SDF المركبة إلى صيغة PDB باستخدام Open Babel، واكتشاف الروابط القابلة للدوران لكل ليجند في AutoDockTools، وحفظ الروابط بصيغة PDBQT.
3. حدد صندوق شبكة الالتحام بأبعاد 60 × 60 × 60 Å مركزا على إحداثيات موقع ربط الليغاند المتبلور معا، ثم قم بتنفيذ الالتحام الجزيئي باستخدام AutoDock Vina مع ضبط الشمولية على 8 و num_modes على 10 لتوليد 10 وضعيات ربط لكل زوج من الليغاند-البروتين.
4. استيراد ملفات الالتحام الناتجة وملفات الهدف المقابلة لها إلى PyMOL، وتحديد وحفظ نموذج الالتحام الذي لديه أقل طاقة ربط (أعلى قيمة سلبية) كوضعية تمثيلية.
5. ثم يرسل هذا النموذج إلى قاعدة بيانات PLIP في https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ لتحليل التفاعلات بين الجزيئات الصغيرة والبروتينات، بما في ذلك الروابط الهيدروجينية، والتفاعلات الكارهة للماء، وتكديس π، وجسور الملح.
6. احسب وتجميع طاقات الارتباط لجميع المكونات النشطة في LYXT مقابل البروتينات المستهدفة المرتبطة بالحمى والسعال، ثم أنشئ جدولا ملخصا يحتوي على أسماء المركبات، البروتينات المستهدفة، طاقات الارتباط (kcal/mol)، وأنواع التفاعل الرئيسية لعرضها في قسم النتائج.
   ملاحظة: وصفة R المستخدمة في تحليل علم الأدوية الشبكي متوفرة في الملف التكميلي 1.

6. تجربة حيوانية

1. الجدول الزمني التجريبي
   1. تعويد الحيوانات لمدة أسبوع، ثم أجري LPS أو إعطاء محلول ملحي في اليوم 0، وأعطي العلاجات الدوائية يوميا من اليوم السابع حتى اليوم 20 لمدة أسبوعين، وأجري القتل الرحيم مع جمع العينات في اليوم 21.
2. اكتساب الحيوانات وتجميعها
   1. اشتر 60 فأرا ذكرا بالغا C57BL/6 بوزن 25 ±± 4 جرام، وأطعمها لمدة أسبوع، ثم قسمها عشوائيا إلى مجموعة ملحية طبيعية (6 فئران) ومجموعة مصابة ب LPS (54 فأرا).
   2. في اليوم السابع قبل بدء العلاج، قسم مجموعة المصابين ب LPS بشكل عشوائي إلى سبع مجموعات فرعية تضم كل منها 6 فئران: المجموعة النموذجية، المجموعة الإيجابية (ديكساميثازون، 50 ملغ^·كجم-1·^يوم-1)، مجموعة علاج LYXT (200 ملغ·كغ-1·^يوم-1)، مجموعة بيتا-كاروتين (50 ملغ·^كجم-1·^يوم-1)، مجموعة سباتولينول (50 ملغ^·كجم-1·يوم^)، ومجموعة بيتا-سيتوستيرول (50 ملغ·^كجم-1·^د-1).
      ملاحظة: تم تعميم تقييم إدارة العلاج ونتائجه.
3. نموذج التهاب الرئة الناتج عن LPS
   1. أعط 2٪ بنتوباربيتال الصوديوم عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة 60 ملغ/كغ للتخدير. تأكد من عمق متوسط للتخدير من خلال غياب استجابة ضغط الذيل. وأخيرا، بناء على وزن الجسم المسجل، احسب حجم الحقن المطلوب من LPS بتركيز 10 ملغ/مل.
   2. استعد للإعطاء الأنفي عن طريق سحب الحجم المحسب بدقة من محلول LPS إلى الماصة. أمسك الفأر بقوة بالإمساك بقاعدة ذيله بيده اليمنى، مع استخدام إبهام وسبابة اليد اليسرى لتثبيت رأسه بلطف من الأذنين.
   3. طرد السائل ببطء حتى تتكون قطرة صغيرة (حوالي 2 ميكرولتر) عند طرف الماصة. قرب القطرة بحذر من فتحة أنف الفأر اليمنى حتى تلامس. ارفع اليد اليسرى بسرعة وفورا للأعلى بمقدار 30–40 سم، ثم أعده برفق مع الفأر إلى وضعية البداية.
      ملاحظة: من الضروري الانتباه لفتحتي أنف الفأر للحفاظ على الحالة الصعودية.
   4. استخدم نفس الطريقة لحقن قطرات سائلة صغيرة في فتحة الأنف اليسرى للفأر، وأضفها إلى فتحتي الأنف الأيسر والأيمن على التوالي حتى يكتمل التنقيب السائل.
   5. ثم أطلق الفأرة، وثبت الفأرة على لوحة الفأرة بشريط لاصق، وحافظ على وضعية البطن مرفوعة والرأس مائل لأكثر من 4 ساعات. بعد استيقاظ الفأر، أعده إلى القفص للمراقبة، باتباع الطريقة التي وصفها لورينز ^{وآخرون.}
4. جمع سائل الغسيل الحصيفي الهوائي
   1. قسم فئران مجموعة LPS المصابة عشوائيا إلى سبع مجموعات: مجموعة التحكم السلبية، مجموعة النموذج، المجموعة الإيجابية (ديكساميثازون، 50 ^mg.kg-1.d-1)، مجموعة علاج LYXT (200 ^mg.kg-1.d-1)، مجموعة بيتا-كاروتين (50 ^mg.kg-1.d-1)، مجموعة سباتولينول (50 ^mg.kg-1.d-1)، ومجموعة بيتا-سيتوستيرول (50 ^mg.kg-1.d-1)، مع ستة فئران في كل مجموعة.
      ملاحظة: حضر LYXT كما يلي: اخلط Pharbitis nil (L.) Choisy، Verbena officinalis L.، ومسحوق Roscoe بمعدل كتلة 5:3:2.  اخلط المسحوق مع الماء عند 1:30 (ج/مل) وارتجاع عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بترشيح وتركيز المحلول (30 درجة مئوية، 0.01–0.08 ميغاباسكال) وذوبه في الماء لتحضير محلول بسعة 2 جرام/مل. تم استخدام بيتا-كاروتين، بيتا-سيتوستيرول، وسباتولينول كمعايير مرجعية للتحقق التجريبي. أعط الأدوية لكل مجموعة مرة واحدة يوميا لمدة أسبوعين، بدءا من أسبوع بعد علاج LPS. قم بقتل الحيوانات بجرعة زائدة من ثيوبنتال (100 ملغ/كجم)، وفقا لجين ^{وآخرين.}
   2. قم بتنيب البطين باستخدام القنية رقم 23. ثم حقن ببطء 10 مل من PBS في نسيج الرئة تحت ضغط 25 سم H₂O، وكرر هذا الغسل حوالي 6 مرات للحصول على سائل غسل القصبات الهوائية (BALF)، وفقا للطريقة التي وصفها بينهيرو ^{وآخرون.}
5. تحليل الكريات البيضاء والسيتوكين في BALF والمصل
   1. قم بالطرد المركزي ب BALF المجمع عند 500 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS، وتخفيف بنسبة 1:10 باستخدام تريبان بلو، وعد إجمالي الكريات البيضاء باستخدام مقياس الدم تحت مجهر ضوئي بتكبير 400×.
   2. اجمع عينات من مادة BALF الفائقة وعينات المصل من ثقل القلب.
   3. قس تركيزات TNF-α وIL-1β وIL-18 باستخدام مجموعات ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وقراءة الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكرولوتينغ، وحساب التركيزات من المنحنيات القياسية. حدد تركيز البروتين في BALF باستخدام اختبار BCA.
6. التحقق من صحة المكونات النشطة بواسطة تحليل HE وWB
   1. لتحديد المكونات الفعالة التي تساهم في فعالية LYXT، أعد تأسيس نموذج التهاب الرئة الناتج عن LPS وفقا للقسم 6.3.
   2. اشتر 60 فأرا، وتتأقلم لمدة أسبوع، وقسمها عشوائيا إلى خمس مجموعات (n = 12 لكل مجموعة): مجموعة النموذج، مجموعة LYXT (200 ملغ^·كجم-1·^يوم-1)، مجموعة بيتا-كاروتين (50 ملغ·كجم-1·^يوم-1)، مجموعة سباتولينول (50 ملغ·^كجم-1·^يوم-1)، ومجموعة التركيبة (25 ملغ^{·كجم-1.يوم-1} لكل مجموعة).
   3. أعط LPS في اليوم 0 والعلاجات من اليوم 7 حتى اليوم 20 كما هو موضح في الخطوة 6.3. في اليوم 21، اجمع أنسجة الرئة¹⁴.
7. التحليل النسيجي
   1. تثبيت الفص العلوي للرئة اليسرى في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة، ثم غرس في البارافين، وقطع مقاطع بحجم 5 ميكرومتر، وإجراء تلوين بالهيماتوكسيلين والإيوسين (HE).
   2. افحص المقاطع تحت المجهر الضوئي عند تكبير 200× و400× لتقييم تسرب الخلايا الالتهابية وتكثيف جدران السنيخ. التقط صورا تمثيلية.
8. تحليل البقع الغربية
   1. توحيد نسيج الرئة في جهاز اختبار التقرب المناعي الإشعاعي (RIPA) باستخدام مثبطات البروتياز والفوسفاتاز. قم بالطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتحديد تركيز البروتين باستخدام اختبار حمض البيسينكونينيك (BCA).
   2. تحميل 30 ميكروغرام من البروتين في كل بئر على جل الرحلان الكهربائي الهلام الدوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE)، ثم انقله إلى أغشية بولي فينيليدين فلوريد (PVDF)، وحظر الحليب ب 5٪ خالي من الدسم.
   3. حضانة الأجسام المضادة الأولية ضد p-p38، p38، TNF-α، IL-1β، IL-18، و β-أكتين طوال الليل عند 4 درجات مئوية، ثم باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المتقاربة مع HRP.
      ملاحظة: تم تضمين تخفيف الأجسام المضادة في جدول المواد.
   4. تصور النطاقات باستخدام ركيزة ECL، التقاط الصور، وقياس الشدة باستخدام ImageJ. تطبيع تعبير البروتين المستهدف إلى β أكتين أو إجمالي p38.

النتائج

تم استخدام قاعدة بيانات TCMSP لجمع 409 مكونات نشطة من LYXT. من بينها، جاءت 58 مكنا من فيربينا أوفيسيناليس إل.، و86 من سائل منوي فاربيتيديس، و265 مكونا نشطا من زينجيبر أوفيسينالي روسكو. تم فحص ستة وعشرين مكونا نشطا رئيسيا وفقا للمؤشر، حيث ≥ OB بنسبة 30.1٪ وDL ≥ 0.12 ل Verbena officinalis L.، وOB ≥ 60٪، وDL ≥ 0.13 لزنجيبر أوفيسينالي روسكو، وOB ≥ 16.93٪، وDL ≥ 0.50 لفيربيتيديس السائل المنوي (الجدول 1).

تم الحصو...

المناقشة

نجحت هذه الورقة في تحديد 26 مكونا نشطا و207 أهدافا محتملة ل LYXT، وهو محلول دواء دونغ التقليدي يستخدم لعلاج الحمى والسعال. تشمل النتائج الرئيسية تحديد CYP3A4 كبروتين مستهدف حيوي من خلال تحليل طوبولوجيا الشبكة، والتحقق التجريبي لLYXT وبيتا كاروتين وسباتولينول كمركبات نشطة ذات تأثيرات مضادة للالتهابات بشكل كبير في نموذج التهاب رئة ناتج عن LPS. تم تحقيق هذه النتائج من خلال نهج متكامل يجمع بين علم الأدوية الشبكي (فحص قواعد البيانات، تحليل شبكة مثبطات مضخة البروتون، والربط الجزيئي) مع التحقق ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مكافحة IL-18	بروتين تيك، ووهان، الصين	27095-1-AP	الأرنب متعدد النسيلات، 1:500
Anti-IL-1 & beta;	بروتين تيك، ووهان، الصين	66737-1-Ig	وائن النسيلة الفأرية، 1:500
ضد p38	بروتين تيك، ووهان، الصين	14064-1-AP	الأرنب متعدد النسيلات، 1:1000
Anti-p-p38	بروتين تيك، ووهان، الصين	28796-1-AP	الأرنب متعدد النسيلات، 1:1000
ضد TNF-α	بروتين تيك، ووهان، الصين	80258-6-RR	وحيد النسيلة الأرنب، 1:500
مضاد الأكتين وبيتا	بروتين تيك، ووهان، الصين	66009-1-Ig	وحيد النسيلة في الفأر، 1:2000
أوتودوك فينا	https://vina.scripps.edu/	الإصدار 1.5.6	برنامج الالتحام الجزيئي
أوتودوكتوز	https://autodock.scripps.edu/	الإصدار 1.5.6	أداة تحضير الالتحام الجزيئي
مجموعة اختبار بروتين BCA	ثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية	23225	لتحديد تركيز البروتين
بيتا-كاروتين	سيغما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية	83-46-5	معيار النقاء العالي، >95٪
بيتا-سيتوستيرول	سيغما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية	83-46-5	معيار النقاء العالي، >95٪
فئران C57BL/6	مركز الحيوانات الطبية في جامعة لانتشو	-	ذكر بالغ، 25 سنة وما فوق عمره؛ 4 ج
سيتوسكيب	https://cytoscape.org/	الإصدار 3.8.1	برامج التصور والتحليل الشبكي
ديكساميثازون	سيغما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية	D4902	التحكم الإيجابي
ركيزة ECL	ميليبورسيغما، برلنغتون، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية	WBKLS0500	لاكتشاف البقع الغربية
مجموعات إليسا
منشور جراف باد	https://www.graphpad.com/	الإصدار 8.0 أو أعلى	برامج التحليل الإحصائي والرسوم البيانية
الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&) ه) مجموعة التلوين	بكين سولاربيو للعلوم والطاقة الشمسية شركة تكنولوجي المحدودة، بكين، الصين	G1120	لصبغ أنسجة الرئة
علم الأنسجة
مضاد الفأر المرتبط ب HRP	بروتين تيك، ووهان، الصين	SA00001-7G	الأجسام المضادة الثانوية، 1:5000
مضاد الأرنب المرتبط ب HRP	بروتين تيك، ووهان، الصين	SA00001-7H	الأجسام المضادة الثانوية، 1:5000
مجموعة IL-18 إليسا	بكين سولاربيو للعلوم والطاقة الشمسية شركة تكنولوجي المحدودة، بكين، الصين	SEKH-0016	لقياس IL-18 في BALF والمصل
IL-1 & بيتا؛ مجموعة إليسا	بكين سولاربيو للعلوم والطاقة الشمسية شركة تكنولوجي المحدودة، بكين، الصين	SEKM-0004	لقياس IL-1 وبيتا؛ في BALF والمصل
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	الإصدار 1.53	برنامج تحليل الصور
ليبوبوليسكاريد (LPS)	سيغما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية	L2630	من  إشريكيا قولونية  O111:B4
مواد خام LYXT	جامعة هوايهوا	-	خليط مسحوق من   Pharbitis nil  (ل.) تشويسي،  فيربينا أوفيسيناليس ل.، و  Zingiber officinale  روسكو (5:3:2، مع الأربع/الأربع)
مواد أخرى
الصوديوم البنتوباربيتال	سيغما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية	P3761	محلول 2٪ للتخدير
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	محلل تفاعل البروتين-الليغاند
أغشية PVDF	ميليبورسيغما، برلنغتون، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية	IPVH00010	لنقل البقعة الغربية
باي مول	https://pymol.org/	الإصدار 2.5	برنامج التصوير الجزيئي
R	https://www.r-project.org/	الإصدار 4.0 أو أعلى	الحوسبة الإحصائية وبرمجيات الرسومات
سباثولينول	ميدكيم إكسبريس، مونماوث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية	HY-N1205	معيار النقاء العالي، >95٪
الوتر	https://stringdb.org/	-	أداة البحث لاسترجاع الجينات/البروتينات المتفاعلة
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	قاعدة بيانات أنظمة الأدوية للطب الصيني التقليدي
ثيوبنتال	سيغما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية	T102	للقتل الرحيم
TNF-&; مجموعة إليسا	بكين سولاربيو للعلوم والطاقة الشمسية شركة تكنولوجي المحدودة، بكين، الصين	SEKM-0034	لقياس TNF-&; في BALF والمصل
يوني بروت	https://www.uniprot.org/	-	تسلسل البروتين وقاعدة بيانات التعليقات التوضيحية