يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الشيخوخة المرتبطة بالتنكس العصبي: تقييم متزامن لنشاط β جالون وصبغة نيسل في الأقسام النسيجة من دماغ القوارض

107 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70676

⸱

يوليو 17, 2026

 ,  , 
1Laboratorio de Neuroinmunología, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de Mexico "Dr. Eduardo Liceaga"

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول كأداة للكشف عن نشاط إزنازيم β جالاكتوسيداز المرتبط بالشيخوخة، وإجراء تلوين نيسل لتقييم التقدم في السن وسلامة الخلايا العصبية في نفس الوقت، ولدراسة الروابط بين عبء الشيخوخة والتنكس العصبي.

الملخص

الشيخوخة الخلوية هي عملية فسيولوجية تتميز بتوقف دورة الخلية غير القابل للعكس، مما يعيق تجديد الأنسجة ووظائفها. وقد برزت هذه الظاهرة كعامل رئيسي للتنكس العصبي، مدفوعا بتراكم الخلايا الشيخنة داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS). تكتسب الخلايا الشيخوخة نمطا ظاهريا إفرازيا مرتبطا بالشيخوخة الالتهابية (SASP) يحافظ على الالتهاب العصبي المزمن ويعطل البيئة الدقيقة العصبية. وبالتالي، تتعرض العمليات الأساسية مثل تكوين الأعصاب، واللدونة المشبكية، وبقاء الخلايا العصبية للخطر. تربط مجموعة واسعة من الأدبيات شيخوخة الخلايا بعدة اضطرابات تنكسية عصبية، مثل مرض باركنسون، مرض الزهايمر، أو التصلب المتعدد، والأضرار الحادة المرتبطة بالخلايا العصبية، مثل نقص التروية الدماغية أو إصابات الدماغ الرضحية.

يوفر التقييم المشترك لنشاط β-جالاكتوسيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) وتلوين نيسل في المقاطع النسيجية نهجا شاملا لتقييم شيخوخة الخلية وسلامة الخلايا العصبية في نفس السياق النسيجية. تمكن هذه الاستراتيجية من الارتباط المكاني الدقيق بين تراكم الخلايا المتقدمة في مناطق حساسة محددة (مثل الحصين أو القشرة) وفقدان الخلايا العصبية أو تلف الأنسجة. من خلال دمج مؤشر وظيفي للشيخوخة مع مؤشر كلاسيكي لشكل وكثافة الخلايا العصبية، يعزز هذا النهج متانة التحليل التفسيرية. علاوة على ذلك، يتيح توصيفا أكثر دقة للعلاقة بين عبء الشيخوخة والتغيرات التنكسية العصبية، مما يعظم إنتاج المعلومات من عينات الأنسجة المحدودة.

علاوة على ذلك، يمكن لهذا البروتوكول تحديد كيفية تراكم الخلايا الشيخوخة استجابة للتدخلات (التلاعب الدوائي، التلاعب الجيني، إلخ) في نماذج القوارض للأمراض التنكسية العصبية، مما يوفر أداة قوية لتحليل هذه المساهمة في الفيزيولوجيا المرضية.

المقدمة

يعرف شيخوخة الخلية بتوقف لا رجعة فيه تقريبا لدورة الخلية مصحوبا بتغيرات جزيئية كبيرة1. علاوة على ذلك، تكتسب الخلايا المتقدمة في السن نمطا ظاهريا مفرط الإفراز (SASP)، يتميز بإفراز قوي لمجموعة متنوعة من السيتوكينات الالتهابية وعوامل النمو والبروتيازات2. تساهم هذه العوامل مجتمعة في إنشاء بيئة دقيقة مؤيدة للالتهابات تعزز الشيخوخة وتؤثر على توازن الأنسجة. في الجهاز العصبي المركزي المركزي، تتراكم الخلايا المتقدمة تدريجيا مع التقدم في العمر، خاصة في المناطق المعرضة للأمراض المرتبطة بالعمر3. يلعب شيخوخة الخلايا دورا مهما في التغيرات الوظيفية المرتبطة بالشيخوخة والاضطرابات التنكسية العصبية، حيث يزداد عبء الخلايا المسنة تدريجيا خلال الشيخوخة الطبيعية. أنواع الخلايا المتعددة داخل الجهاز العصبي المركزي عرضة للشيخوخة، بما في ذلك الخلايا النجمية، والدبقية الدقيقة، والخلايا العصبية العصبية، والخلايا العصبية، والخلايا الجذعية العصبية4. تشير الأدلة المتراكمة إلى شيخوخة هذه الخلايا في الجهاز العصبي المركزي في الاضطرابات النفسية لعدة أمراض تنكسية عصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر، ومرض باركنسون، والخرف الجبهي الصدغي، والتصلب الجانبي الضموري الضمولوجي، والتصلب المتعدد5. تم ربط اضطرابات التنكس العصبي بشيخوخة الخلايا6، وقد ثبت أن الخلايا الشيخوخة تتراكم بالقرب من لويحات β الأميلويد والتشابك الليفي العصبي. تم وصف زيادات مرتبطة بالعمر في نشاط SA-β-gal في أدمغة القوارض (مثلا، 3، 8، 17، و24 شهرا)، مع ارتفاعات ذات دلالة إحصائية تظهر بشكل أكبر في أقدم مجموعة (24 شهرا)7.

توفر دراسات مختلفة رؤى مهمة حول العلاقة بين التغيرات النسيجة والنتائج الوظيفية، مثل ضعف الإدراك واضطراب الأيض، في نماذج حيوانية مرضية تعالج الارتباطات الوظيفية أو السلوكية لإصابة الدماغ8،9.

على الرغم من الأبحاث المكثفة، لا يوجد مؤشر عالمي واحد يحدد الخلايا المتقدمة بشكل موثوق مع تمييزها عن الحالات غير التكاثرية الأخرى؛ ومع ذلك، فإن أكثر العلامات استخداما لشيخوخة الخلايا هي إنزيم β-جالاكتوسيداز المرتبط بالشيخوخة الليسوسومية (SA-β-GAL)، والذي يكتشف عند درجة الحموضة 6، وهو إنزيم هيدرولاز يحفز تحلل مائي β-جالاكتوسيدات إلى أحادي السكريات. عامل مميز رئيسي هو الرقم الهيدروجيني. يظهر SA-β-gal نشاطا مثاليا عند pH 6، على عكس β-جالاكتوسيداز البكتيري الذي يعمل عند pH 7.4، وداز β-جالاكتوسيداز الليزوزومي الداخلي الذي يعمل بقيم حموضة حمضية تتراوح بين 3 إلى 5 7,10.

كثافة الخلايا وبنية خلوية الدماغ هما محددان أساسيان لتنظيم ووظيفة الأعصاب. التوزيع المكاني ووفرة مجموعات الخلايا المحددة أمر بالغ الأهمية لوظيفة الدوائر، وتحديد دقتها ضرورية لدراسة الحالات العصبية المرضية التي تتضمن الضعف أو الفقدان الانتقائي للخلايا. التلوين بتقنية Nissl، وهي طريقة قياسية في علوم الأعصاب، هي تقنية نسيجية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم كثافة الخلايا العصبية وبنية الخلايا في الأنسجة العصبية. من خلال تصنيف أجسام Nissl بشكل انتقائي داخل السوماتا العصبية، تتيح هذه الطريقة التصور والقياس الدقيق لمجموعات الخلايا العصبية عبر مناطق الدماغ11. بالإضافة إلى متانته، يتميز تلوين نيسل بساطته التقنية، وتكلفته المنخفضة، ووقت المعالجة القصير نسبيا، مما يجعله أداة عملية ومتاحة للدراسات الروتينية للتشريح العصبي والتنكس العصبي.

يوفر التقييم المشترك لصبغ نيسل ونشاط β-جالاكتوسيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) ضمن نفس المقطع النسيجي إطارا قويا ومحليا لفحص سلامة الخلايا العصبية وعبء الخلايا الشيخوخة في آن واحد. يتيح هذا النهج التكاملي رسم الخرائط المباشرة للشيخوخة إلى السمات التنكسية العصبية الخاصة بالمناطق، بما في ذلك فقدان الخلايا العصبية والاضطراب الهيكلي الخلوي. ربط علامة هيكلية كلاسيكية مع مؤشر وظيفي للشيخوخة يعزز تفسير البيانات ويكشف عن روابط ميكانيكية بين تراكم الخلايا القديمة وخلل الأنسجة، مع تعظيم العائد التحليلي من عينات محدودة.

ومن المهم أن هذه الاستراتيجية مناسبة بشكل خاص للدراسات ذات توفر الأنسجة المحدود، والتصاميم الطولية أو القائمة على التدخل (مثل العلاجات المحللة أو الشحولية)، والتحليلات الخاصة بالمنطقة في البنى الدماغية المعقدة، حيث يكون ربط الشيخوخة بالضعف العصبي أمرا بالغ الأهمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا للإرشادات المؤسسية والوطنية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والحصول على موافقة مسبقة من لجنة الأخلاقيات المختصة. يتوافق هذا البروتوكول مع المعيار الرسمي المكسيكي الحالي لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية (NOM-062-ZOO-1999(Muñoz, 2001))، والمراجعة والموافقة المسبقة من لجان الأخلاقيات والبحث، ولجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (CICUAL) التابعة لكلية الطب، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (FM/DI/039/2023، CICUAL-009-2023). تم تزويد الحيوانات من قبل الحوض الحيوي لوحدة الطب التجريبي، كلية الطب.

ملاحظة: لتمكين التقييم المتزامن لنشاط β-جالاكتوزيداز (SA-β-gal) المرتبط بالشيخوخة وتلوين Nissl في أنسجة دماغ القوارض، يستخدم هذا البروتوكول أدمغة قوارض مثبتة ب بارافورمالديهايدز بنسبة 4٪ ويتم تجميدها بالتبريد عند -20 ± 1 درجة مئوية. يتم تقييم جميع الأقسام أولا لنشاط SA-β-gal (الخطوة 1)، ثم صبغ Nissl (الخطوة 2)، ثم تركيبها بوسط تثبيت مضاد للتلاشي (الخطوة 3). بعد معالجتها، يتم فحص الشرائح تحت مجهر بصري ذو مجال ساطع، مما يتيح التقاط صور عالية الدقة للمناطق المعنية لمزيد من التحليل.

1. تحضير مقاطع الأنسجة واكتشاف نشاط β-جالاكتوسيداز (SA-β-gal) المرتبط بالشيخوخة

  1. تحضير أقسام الدماغ
    1. الحصول على الدماغ عن طريق تروية القلب باستخدام بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ وفقا للبروتوكول الذي وصفه وو وآخرون سابقا، 202112. انقل الأدمغة إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.01٪ من أزيد الصوديوم للتخزين طويل الأمد عند 4 درجات مئوية.
    2. للمضي قدما مع البروتوكول، ضع الدماغ في محلول السكروز بنسبة 30٪، وانتظر حتى يغوص في القاع، ثم خزنها عند -20 إلى -80 درجة مئوية. يمكن استخدام هذا البروتوكول في أنسجة دماغ القوارض المختلفة (مثل الجرذ، الفأر، خنزير غينيا) وتجمده في 2-ميثيل بوتان.
    3. يتم تقسيم الأنسجة بالتبريد عند -20 ± 1 درجة مئوية للحصول على مقاطع منتظمة مدمجة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (O.C.T.) (سمك 20–40 ميكرومتر) وتركيبه على شرائح زجاجية مطلية بالجيلاتين.
    4. ثبت الأجزاء على شرائح زجاجية وخزنها في ظروف باردة حتى الاستخدام.
  2. اكتشاف نشاط دوز β جالاكتوسيداز (SA-β-gal) المرتبط بالشيخوخة.
    1. حضر محلول صبغة SA-β جالون طازجا في يوم الاستخدام من المحاليل الموضحة في الجدول 1.
    2. قم بضبط المحلول إلى pH 6.0 لضمان خصوصية نشاط SA-β-gal.
      ملاحظة: حضر محلول التلوين SA-β جالون قبل الاستخدام؛ تجنب الخلط المسبق في محلول مائي.
      5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-D-جالاكتوبيرانوزيد (X-Gal) غير مستقر في المحلول المائي.
  3. توازن درجة حرارة شرائح الأنسجة.
    1. أزل الشرائح من التخزين البارد.
    2. ضع الشرائح في جرة كوبلين ودعها تتوازن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
    3. رطب الأقسام بإضافة كمية كافية من PBS لتغطية الشرائح في جرة كوبلن.
    4. ضع الشرائح على جهاز هز مداري منخفض السرعة لمدة 5 دقائق عند RT.
    5. كرر الغسيل مرة واحدة.
  4. جهز شرائح للصبغ.
    1. أزل فائض PBS بلطف من حواف الشريحة باستخدام ورق ماص.
    2. ارسم حاجزا كاره للماء حول كل قسم باستخدام قلم حاجز طارد للماء، مع تجنب ملامسة الأنسجة.
  5. قم بصبغ SA-β-gal
    1. ضع الشرائح في غرفة رطوبة.
    2. مع ميكروبايبت، أضف حوالي 200 ميكرولتر من محلول التلوين لكل قسم، لضمان التغطية الكاملة للأنسجة.
    3. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    4. بعد الحضانة، قم بإزالة محلول التلوين باستخدام ورق ماص.
    5. ضع الشرائح في جرة كوبلين وأضف PBS لتغطية الشرائح، ثم قم بتحريك خفيف على هزاز مداري منخفض السرعة لمدة 5 دقائق عند RT.
      ملاحظات: لا تستخدم حاضنة ثاني أكسيد الكربون. توجه فورا إلى تلطيخ نيسل.

2. تلوين نيسل

  1. جهز محلول Nissl العامل.
    1. حضر حلول المخزون كما هو موضح في الجدول 2.
    2. من المحاليل المخزنة، يتم تحضير محلول Nissl العامل بخلط 15 مل من محلول الكريسيل البنفسجي مع 85 مل من محلول الأسيتات.
    3. قم بتصفية المحلول لإزالة الرواسب باستخدام ورق الترشيح (الدرجة 4، حجم المسام 20-25 ميكرومتر).
    4. بعد محلول الفلتر، قم بتسخينها مسبقا على 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة (أو 40–43 درجة مئوية في حمام ماء).
    5. أضف 10 قطرات من حمض الأسيتيك 0.1 M مباشرة قبل الاستخدام إلى محلول Nissl العامل.
      ملاحظة: استخدم محلول Nissl العامل حتى أربع مرات في نفس اليوم؛ لا تخزن طوال الليل.
    6. تحضير الإيثانول المحمض بإضافة 95 مل من الإيثانول المطلق إلى قارورة حجمية وإضافة 15 قطرة من حمض الأسيتيك بقوة 0.1 مل. ارفع السعة إلى 100 مل مع ماء مقطر وامزجه جيدا.
  2. قم بتكييف الشرائح مسبقا.
    1. ضع الشرائح في جرة كوبلين وأضف PBS حسب الحاجة لتغطية الشرائح واحتضنها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. أقسام الصبغ.
    1. اغمر الشرائح بعناية في محلول نيسل المسخن مسبقا، شريحة تلو الأخرى.
    2. حضن الشرائح لمدة 5–20 دقيقة في محلول نيسل.
      ملاحظة: الوقت يعتمد على سمك الأنسجة. قم بالتلوين على الشاشة كل 5 دقائق حتى يظهر لون بنفسجي داكن.
  4. اغسل الأقسام.
    1. اشطف الشرائح بلطف في ماء مقطر لمدة دقيقة واحدة. انقله إلى شرائح في جرة كوبلين مع ماء مقطر طازج لمدة دقيقة إضافية.
    2. قيم جودة الصبغ. راقب الشرائح تحت مجهر المجال الساطع (10× الهدف).
    3. في مجهر المجال الساطع، تأكد من تلوين مكثف باللون البنفسجي مع خلفية قليلة.
      ملاحظة: إذا كان الخلفية مفرطة، اغمر شرائح في إيثانول محمض بنسبة 95٪ لمدة 10 ثوان.
    4. انقله فورا إلى الإيثانول المطلق لمدة 10 ثوان لإيقاف التمايز.
      ملاحظة: قم بإعادة الصبغ إذا لزم الأمر، وكرر خطوات التلوين (8.1-9.3) إذا كان التلوين ضعيفا.
  5. جفف الزلاجات ونظفها.
    1. اغمر السلايدات في الزيلين لمدة لا تقل عن 5 دقائق (حتى ساعتين إذا لزم الأمر)
      ملاحظة: اعمل بسرعة، حيث تجف الأنسجة خلال ~2 دقيقة.

3. التركيب

  1. تحضير وسط التركيب
    1. اخلط 8 مل من وسط التركيب مع 2 مل من الزيلين.
      ملاحظة: جهز فقط المجلد المطلوب؛ وسيط التثبيت سيتصلب بسرعة.
    2. أزل الشرائح من الزيلين وامسح الحواف بلطف. ضع الشرائح على سطح مستو.
    3. ضع ~120 ميكرولتر من وسط التثبيت على النسيج.
    4. ضع غطاء الغطاء ببطء من جانب واحد لتجنب الفقاعات.
  2. جفف الشرائح واحصل على صور.
    1. اترك الشرائح تجف لمدة لا تقل عن 5 دقائق في RT.
    2. راقب تحت مجهر المجال الساطع والتقاط صور لمناطق ذات اهتمام.
    3. بعد التركيب، يتطلب تجفيف وسائط التثبيت بالكامل وقتا أطول (24 ساعة).
  3. خزن الشرائح.
    1. تخزين الزلاجات في RT للحفاظ على المدى الطويل (لعدة أشهر).

4. قياس عبء الشيخوخة

ملاحظة: يتم تطبيق هذا النهج كتقييم نوعي؛ ومع ذلك، عندما يتطلب تصميم الدراسة ذلك، يمكن توسيعها لتشمل التحليل الكمي.

  1. عرف عبء الشيخوخة بأنه الوفرة النسبية لخلايا β-جالاكتوسيداز (SA-β-gal) المرتبطة بالشيخوخة ضمن منطقة محددة من الاهتمام (ROI). عبر عن هذا المقياس كنسبة مئوية من الخلايا الموجبة بالنسبة لعدد الخلايا الكلي، أو ككثافة الخلايا الموجبة لكل وحدة مساحة (خلايا/مم2).
  2. اختر منطقة الاهتمام (ROI). تحديد العائد على الاستثمار بناء على المعالم العصبية التشريحية الموحدة باستخدام أطلس دماغي مناسب للنوع والعمر. تشمل المناطق الموصى بها الحقول الفرعية للحصين (CA1، CA3، التلفيف المسنن) والمناطق القشرية ذات التنظيم الطبقي المحدد.
    1. اختر 3–5 حقول غير متداخلة لكل عائد استثمار لكل قسم.
    2. تحليل ما لا يقل عن 2–3 أقسام لكل حيوان، موزعة على فواصل تشريحية متسقة.
    3. حافظ على نفس حجم وشكل العائد على الاستثمار عبر جميع العينات.
    4. تعمى المشغل عن الظروف التجريبية أثناء اختيار العائد على الاستثمار لتقليل التحيز.
  3. احصل على صور.
    1. التقاط الصور باستخدام مجهر ذو مجال ساطع مزود بكاميرا رقمية في ظروف موحدة:
      1. استخدم تكبيرات متسقة (مثلا 10× للنظرة الإقليمية العامة، 20× أو 40× للقياس).
      2. حافظ على إضاءة مستمرة، ووقت تعريض، وتوازن اللون الأبيض عبر جميع العينات.
      3. تجنب تشبع إشارة SA-β-gal (الأزرق) وتأكد من رؤية واضحة لتلوين Nissl (البنفسجي).
      4. احفظ الصور بصيغة بدون فقدان (مثل TIFF) للتحليل اللاحق.
  4. معالجة الصور مسبقا.
    1. قم بإجراء المعالجة المسبقة باستخدام برامج تحليل الصور (مثل ImageJ/Fiji)13.
      1. حول الصور إلى صيغة RGB إذا لزم الأمر.
      2. طبق طرح الخلفية لتصحيح الإضاءة غير المتساوية.
      3. تطبيع التباين بشكل موحد عبر جميع الصور دون تغيير شدة الإشارة النسبية.
      4. تجنب الإفراط في المعالجة التي قد تشوه حدود الإشارة.
  5. تحديد خلايا SA-β-gal الإيجابية.
    1. حدد الخلايا الموجبة بناء على وجود ترسيب أزرق مميز داخل السيتوبلازم. استخدم عتبة الألوان لعزل الإشارة الزرقاء (مثلا، نطاقات الدرجة اللونية/التشبع/الشدة المحددة تجريبيا).
    2. تحقق من العتبات باستخدام ضوابط سلبية (نسيج صغير أو غير معالج) لاستبعاد التلوين الخلفي.
  6. تأكيد الاتساق الشكلية مع الملفات الخلوية التي لوحظت في تلوين Nissl.
  7. طرق القياس
    1. القياس القياسي القائم على الخلية: عد الخلايا الموجبة SA-β جال يدويا أو باستخدام أدوات شبه آلية. حدد العدد الإجمالي للخلايا ضمن نفس العائد على الاستثمار باستخدام صبغة Nissl.
    2. تعبر عن النتائج كالتالي:
      عبء الشيخوختة (٪) = (خلايا SA-β-جالونية/خلايا كلية) ' 100
    3. القياس الكمية بناء على الكثافة: احسب عدد الخلايا الموجبة SA-β جالون لكل وحدة مساحة:
      كثافة الخلايا = الخلايا الموجبة/مساحة العائد على الاستثمار (مم2)
    4. تعريف العتبة والضوابط: تحديد عتبات الكشف تجريبيا:
    5. استخدم عناصر التحكم السلبية لتحديد مستويات الإشارة في الخلفية.
    6. تضمين ضوابط إيجابية (مثل أنسجة دماغية قديمة أو نماذج ناتجة عن التوتر) للتحقق من صحة الحساسية.
    7. تطبيق إعدادات العتبة المتطابقة على جميع العينات داخل التجربة. وثق جميع معايير العتبة لضمان قابلية التكرار.

5. تطبيع البيانات والتحليل الإحصائي

  1. تطبيع عبء الشيخوخة لأخذ الفروق الإقليمية في كثافة الخلايا في الاعتبار؛ استخدم تلوين Nissl لتقدير إجمالي عدد الخلايا لكل عائد على الاستثمار — قياسات متوسطة عبر العائد على المؤشرات والأقسام والحيوانات. إجراء تحليلات إحصائية باستخدام اختبارات مناسبة (مثل اختبار t، اختبار ANOVA) حسب تصميم التجارب.
  2. أبلغ عن البيانات كمتوسط ± SEM أو SD، مع تحديد عدد النسخ البيولوجية (n).
  3. التسمية والقابلية للتكرار: إجراء جميع تحليلات القياس تحت ظروف العمى. التحقق من قابلية التكرار من خلال: (أ) تحليل مستقل من قبل مراقبين على الأقل، أو (ب) إعادة تحليل مجموعة فرعية من الصور لتقييم التغير داخل المراقب.
  4. حدود استراتيجية التكميم: تفسير النتائج الكمية جنبا إلى جنب مع العلامات التكميلية حيثما أمكن. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤثر التغير في شدة التلوين عبر الأقسام على القياس القائم على العتبة ويجب التحكم فيه بعناية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتيح التطبيق المشترك لتلوين β-جالاكتوسيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) وتلوين Nissl التصور المتزامن لعبء الخلايا الشيخوخة وبنية الخلايا العصبية داخل نفس قسم الدماغ.

بعد إجراء التلوين ب SA-β-gal (الخطوة 1)، افحص الشرائح تحت مجهر المجال الساطع. يشير النجاح إلى التلوين بوجود ترسيب أزرق مميز داخل الخلايا يظهر نشاطا من β جالاكتوسيدازيد (الشكل 1). عند التكبير المنخفض، حدد المناطق الرئيسية في الدماغ مثل الحصين والقشرة الدماغية (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حاليا، لا يزال توفر الأدوات القوية والمحددة لتحديد وعزل وإزالة الخلايا المسنة في الجهاز العصبي المركزي عقبة رئيسية أمام الدراسات الميكانيكية. تحد هذه الفجوة المنهجية من قدرتنا على فصل المساهمات السببية للشيخوخة الخلوية في علم الأمراض العصبية عن مجرد ارتباط بتقدم المرض. يجمع سير العمل المعروض هنا بين الكشف الإنزيمي بنظام SA-β-gal مع التلوين المضاد Nissl لرسم خريطة العبء المحتمل للخلية الشيخوخة ضمن سياقات عصبية تشريحية محددة، مما يربط القراءات الإنزيمية بالتغيرات الهيكلية الخلوية النموذجية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المديرية العامة للأكاديمية الشخصية، UNAM (PAPIIT IN224624)، وبرامج Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) مثل Science de Frontera CBF-2025-I-1337 وبرنامج UNAM Posdocal Program (POSDOC). حصل RJRC على رقم الزمالة 1020262 من CONAHCyT. حصل VSV على زمالة ما بعد الدكتوراه من برنامج بيكاس لما بعد الدكتوراه، المديرية العامة للأكاديمية الشخصية (DGAPA)، UNAM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-metilbutaneSIGMAM32631-500ML
5-برومو-4-كلور-3-إندوليل & بيتا;-D-جالاكتوبيرانوزيد (X-Gal)PROMEGAV394AStore at -30 إلى -10 & درجة;مئوية
حمض الستريك MERCK251275-5G
كريسيل فيولايت أسيتاتSIGMAC5042-10G
DPX مركب لعلم الأنسجةSIGMA06522-500ML
ورق الترشيحWhatmanWHA1001929
حمض الأسيتيك الجلياليSIGMA695092-500ML
قلم مائي مقاوم للماء MERCKZ672548
زيلين من درجة علم الأنسجةSIGMA534056-500ML
غرفة الرطوبةSTAINTRAY25501
كلوريد المغنيسيوم اللامائيSIGMAM8266-100GAdjust molarity if hydrated magnesium chloride is used.
OCTSAKURA FINE TEK4583
محلول فوسفات عازل (PBS)SIGMAP4417-50TABCommercial tablets are used.
بوتاسيوم فيريكيانيد (بوتاسيوم هيكساسيانوفيرات(III))SIGMAP8131-100G
بوتاسيوم فيروكيانيد (بوتاسيوم هيكساسيانوفيرات(II) ثلاثي الهيدرات)SIGMAP9387-100G
أسيتات الصوديوم اللامائيSIGMAS2889-250GAdjust molarity if hydrated sodium acetate is used.
كلوريد الصوديومSIGMAS9888-2.5KG
فوسفات الصوديوم (فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اثنا عشري الهيدرات)SIGMA71649-500G

المراجع

  1. Melo Dos Santos, L., et al. Cellular senescence in brain aging and neurodegeneration. Ageing Res Rev. 93, 102141(2024).
  2. Chinta, S. J., et al. Cellular senescence and the aging brain. Exp Gerontol. 68, 3-7 (2015).
  3. Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. J Clin Invest. 128 (4), 1208-1216 (2018).
  4. Kuźniar, J., et al. Connections between cellular senescence and Alzheimer’s disease—a narrative review. Int J Mol Sci. 26 (17), 8638(2025).
  5. Martínez-Cué, C., Rueda, N. Cellular senescence in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 14, 16(2020).
  6. Wang, Y., et al. The role of cellular senescence in neurodegenerative diseases. Arch Toxicol. 98 (8), 2393-2408 (2024).
  7. Piechota, M., et al. Is senescence-associated β-galactosidase a marker of neuronal senescence? Oncotarget. 7 (49), 81099-81109 (2016).
  8. Zhang, H., et al. Mangiferin alleviated poststroke cognitive impairment by modulating lipid metabolism in rats with cerebral ischemia/reperfusion. Eur J Pharmacol. 977, 176724(2024).
  9. Hussain, M. S., et al. Autophagy and cellular senescence in Alzheimer’s disease: key drivers of neurodegeneration. CNS Neurosci Ther. 31 (7), e70503(2025).
  10. Si, Z., Sun, L., Wang, X. Evidence and perspectives of cell senescence in neurodegenerative diseases. Biomed Pharmacother. 137, 111327(2021).
  11. Meystre, J., et al. Cell density quantification of high resolution Nissl images of the juvenile rat brain. Front Neuroanat. 18, 1463632(2024).
  12. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), (2021).
  13. Lozano-Gerona, J., García-Otín, Á-L. ImageJ-based semiautomatic method to analyze senescence in cell culture. Anal Biochem. 543, 30-32 (2018).
  14. Huang, W., et al. Cellular senescence: the good, the bad and the unknown. Nat Rev Nephrol. 18 (10), 611-627 (2022).
  15. Zeng, W. -J., et al. A novel inflammation-related lncRNAs prognostic signature identifies LINC00346 in promoting proliferation, migration, and immune infiltration of glioma. Front Immunol. 13, 810572(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

233 233 JoVE
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.