يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير اللحظي للاستجابة للإجهاد الناتج عن المضيف في تجمعات Pseudomonas aeruginosa

173 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70682

⸱

مايو 15, 2026

 , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida

في هذه المقالة

ملخص

تظهر تجمعات Pseudomonas aeruginosa زيادة في تحمل المضادات الحيوية والخلايا المناعية. دور سلامة الغشاء في بقاء الكليات لا يزال غير مستكشف حاليا. توضح هذه الدراسة طريقة لقياس التغيرات في ديناميكيات غشاء الخلايا داخل تجمعات P. aeruginosa لفهم كيف يمكن أن تؤثر سلامة الخلايا على القدرة العامة على بقاء التجميع.

الملخص

العدوى المزمنة مثل تلك الموجودة في التليف الكيسي (CF) تدعمها تجمعات صغيرة وعالية التحمل من Pseudomonas aeruginosa تستمر رغم الضغوط المناعية والعلاجية. على عكس الأغشية الحيوية الكلاسيكية، تمثل هذه التجمعات وحدة ممرضة مميزة - مجتمعات منظمة مكانيا على نطاق دقيق تحافظ على السلامة الهيكلية والتوازن الفسيولوجي تحت ضغط المضيف. ومع ذلك، فإن الآليات التي تمكن التجمعات من البقاء سليمة تحت هذه الظروف، وما إذا كان يمكن تعطيل هذه العمليات التوازن الداخلي بشكل انتقائي، لا تزال غير محددة بشكل جيد. كان أحد العقبات الرئيسية لمعالجة هذه الفجوة هو نقص الأدوات القادرة على التقاط العمليات الديناميكية والمحسولة مكانيا التي تربط الإجهاد الفسيولوجي بالاستقرار والانهيار الهيكلي في الوقت الحقيقي. تقدم هذه الدراسة سير عمل متكامل للتصوير والتحليل لقياس الاستجابات المجمعة للضغوط المرتبطة بالمضيف. باستخدام الصبغة الحساسة للجهد DiBAC4(5)، تم مراقبة إزالة استقطاب الغشاء كمؤشر مبكر للاضطراب الفسيولوجي داخل التجمعات المكونة في وسط بلغم التليف الكيسي الصناعي (SCFM2). يتيح المجهر الكونفوكي عالي الدقة التايم لابس تصور التجمعات في كل من الحالات المستقرة والحالة الناتجة عن الإجهاد، بينما يوفر تقسيم الصور والتحليل القائم على الفوكسل خرائطا كمية للتباينات المكانية في سلامة الغشاء وتفكيك التجميع بدقة خلية واحدة. يؤسس هذا السير في هذا المسار منصة قابلة للتكرار وقابلة للتكيف لربط الإجهاد الفسيولوجي بالنتائج الهيكلية في التجمعات البكتيرية متعددة الخلايا. من خلال تمكين التشريح الكمي للعمليات التي تحافظ على سلامة الكليات أو تضر بها، يوفر هذا النهج أساسا حيويا لتحديد واستهداف الآليات التوازن الداخلي التي تدعم مرونة الكل، مما يطور استراتيجيات جديدة لتعطيل هذا النمط السريري المهم من استمرار البكتيريا.

المقدمة

غالبا ما تستمر العدوى البكتيرية المزمنة ليس بواسطة أغشية حيوية كبيرة متصلة على السطح، بل بواسطة تجمعات صغيرة متعددة الخلايا تتكون داخل بيئات مرتبطة بالمضيف. في التليف الكيسي (CF) وأمراض مجرى الهواء المزمنة الأخرى، توجد Pseudomonas aeruginosa عادة على شكل تجمعات معلقة مدمجة داخل المخاط أو البلغم بدلا من أن تكون كأغشية حيوية كلاسيكية ملتصقة بأسطح الظهارة. تمثل هذه التجمعات نموا مميزا، يتميز بتنظيم مكاني على نطاق دقيق، وتباين فسيولوجي واضح، وتحمل استثنائي للضغوط المناعية والمضادة للميكروبات 1,2,3,4. على الرغم من أهميتها السريرية، فإن الآليات التي تحكم استقرار المجموع، والتي تعرف في هذا البروتوكول بأنها القدرة على الحفاظ على سلامة الغشاء وتنظيمه المكاني تحت هذه الضغوط، لا تزال غير مفهومة جيدا، مع تركيز الدراسات السابقة أكثر على مكونات المصفوفة التي تدعم تكوين الأغشية الحيوية المثبتة على السطح 5,6.

أحد العائقات الرئيسية أمام دراسة الأحداث التي تساهم في زعزعة الاستقرار الكامي، مثل التغيرات في إزالة استقطاب الغشاء وبنية التجميع، هو غياب سير العمل التجريبي الذي يلتقط التغيرات الفسيولوجية والهيكلية الديناميكية في الوقت الحقيقي 7,8. لا يمكن للاختبارات التقليدية للحجم وطرق التصوير النهائي أن تحدد كيف تظهر استجابات الإجهاد داخل التجميعات، أو كيف يتم توزيع هذه الاستجابات مكانيا، أو كيف يترجم الضعف الفسيولوجي، مثل إزالة استقطاب الغشاء وفقدان توازن الأيونات، إلى علامات مبكرة للإجهاد الخلوي والانهيار الفيزيائي في النهاية. بينما تم تطبيق المجهر الكونفوكلي على نطاق واسع على الأغشية الحيوية المثبتة على السطح، فإن عددا أقل من الأساليب تدمج التصوير الزمني مع التحليل الكمي الذي يربط مباشرة فسيولوجيا الخلايا ببنية التجميع ونشاط الغشاء.

توفر التغيرات في جهد الغشاء البكتيري مؤشرا مبكرا وحساسا للإجهاد الخلوي وفقدان التوازن الخلوي. تتراكم الأصباغ الحساسة للجهد مثل أوكسونول البنتاميثين (DiBAC4(5)) في الخلايا منزوعة الاستقطاب وتوفر قراءة غير مدمرة قائمة على الفلورية لسلامة الغشاء. على الرغم من استخدام أصباغ DiBAC لتقييم إزالة استقطاب الغشاء في المزارع العوالقة والأغلفة الحيوية المتصلة بالسطح9،10، إلا أن تطبيقها على التجمعات متعددة الخلايا، خصوصا في ظروف النمو الفسيولوجية ذات الصلة وتصوير الزمن، كان محدودا.

هنا، نقدم سير عمل متكامل للتصوير والتحليل يتيح التصور والقياس الفوري لإزالة استقطاب الغشاء والفشل البنيوي في تجمعات P. aeruginosa. تتكون التجمعات في وسط بلغم التليف الكيسي الصناعي (SCFM2)، وهو وسط معرف كيميائيا يعيد تلخيص الخصائص الغذائية والأيونية الرئيسية لمجرى التليف الكيسي ويدعم تكوين التجمع التلقائي دون وجود أسطح مفروضة أو تدفق11,12. في ظل هذه الظروف، يشكل P. aeruginosa تجمعات معلقة بأحجام وتنوع هيكلي مماثل لتلك التي لوحظت في عينات بلغم التليف الكيسي ومجاري الهواء، مما يوفر منصة فسيولوجية ذات صلة لدراسة سلوك التجميع13.

باستخدام المجهر الماسح بالليزر الكونفوكال بتقنية التايم لابس تحت درجة حرارة ورطوبة محكومة بذلك، يلتقط هذا السير كل من الحالات المجمعة المستقرة والحالات الناتجة عن الإجهاد التي تتسم بزيادة إزالة استقطاب الغشاء وفقدان التوازن الخلوي خلال فترات تصوير طويلة. من خلال دمج تقارير جهد الغشاء المعتمد على DiBAC مع تصوير z-stack عالي الدقة، تتيح هذه الطريقة قياس فلورة DiBAC₄(5) على مستوى الخلية الواحدة، مع رسم القيم وتحليلها ضمن السياق المكاني للتجميعات الفردية. يسمح تقسيم الصور في المراحل النهائية وتحليل الأسطح المعتمد على فوكسل بقياس التغيرات في بنية التجميع وإزالة استقطاب الغشاء بالتوازي.

ومن المهم أن هذا البروتوكول يظهر باستخدام تجمعات P. aeruginosa المكونة في SCFM2، إلا أن سير العمل قابل للتعميم بشكل عام. يمكن تكييف استراتيجية التصوير، والقراءة الفسيولوجية المعتمدة على الصبغة، والإطار التحليلي بسهولة مع أنواع بكتيرية أخرى، ووسائط تعزز التجمع، والضغوط، بما في ذلك العوامل المضادة للميكروبات، والتأثيرات المناعية، أو الاضطرابات البيئية. وبالتالي، يوفر هذا النهج منصة قابلة للنقل وإعادة الإنتاج لفحص استقرار المجتمعات البكتيرية عبر سياقات تجريبية متنوعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يجب أن تجرى جميع الأعمال مع P. aeruginosa وفقا لظروف احتواء BSL-2 المناسبة وموافقات السلامة البيولوجية المؤسسية. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. توليد تجمعات Pseudomonas aeruginosa في وسط بلغم التليف الكيسي الصناعي (SCFM2)

ملاحظة: تصف هذه الخطوة تحضير زراعة P. aeruginosa وتكوين تجمعات متعددة الخلايا معلقة تحت ظروف فسيولوجية ذات صلة تحاكي بيئة مجرى الهواء للحمض التليفي الكيبي.

  1. تحضير المزارع البكتيرية
    1. في اليوم السابق للتجربة، قم بتلقيح النوع البري Pseudomonas aeruginosa PAO1 الحامل للبلازميد pMRP9-1 (GFP)14 من مخزونات الجلسرون المجمدة إلى مرق ليزوجيني بسعة 5 مل (LB).
    2. أضف الكاربينيسلين (300 ميكروغرام/مل) للحفاظ على اختيار البلازميد.
    3. ازرع الثقافات طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع هز عند 200 دورة في الدقيقة.
  2. التخفيف العكسي والتحضير لتكوين الركام
    1. في يوم التجربة، يتم تخفيف الزراعة الخلفية ليلا بنسبة 1:5 (1 مل خلال الليل: 4 مل رطل). لا تعاد إضافة المضادات الحيوية في هذه المرحلة؛ الانتقال المتبقي ضئيل ولا يؤثر على النمو).
    2. ازرع الثقافات لمدة ~2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة) للوصول إلى الطور اللوغاريتمي.
      ملاحظة: عادة ما تكون الخلايا في المرحلة الأسية المبكرة بعد ~2 ساعة تحت هذه الظروف. بالإضافة إلى ذلك، يتم غسل الخلايا بعد ذلك قبل تلقيح SCFM2 لتقليل أي بقايا من المضادات الحيوية.
  3. تحضير وتوازن SCFM2
    1. قبل حوالي 30 دقيقة من نهاية فترة التخفيف العكسي، يتم تركيب SCFM2 المحضر مسبقا في أنابيب معقمة ويتم تدفئته إلى 37 درجة مئوية.
    2. للتصوير في طبق بصري ذو 4 آبار ذات قاع زجاجي، خصص 500 ميكرولتر SCFM2 لكل بئر. جهز الحجم الزائد لأخذ خطأ في التوصيل بالماصات في الاعتبار.
      ملاحظة: يتم تخزين SCFM2 عند 4 درجات مئوية. يقلل التسخين المسبق من صدمة درجة الحرارة ويحسن من قابلية تكرار تكوين الركام.
  4. غسل وتوحيد اللقاح
    1. زراعة الحبيبات بالطرد المركزي عند 4200 x جرام لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة لحسابات سرعة الدوران، فإن نصف قطر الدوار لدوار الدلو المتأرجح هو 172 مم.
    2. أزل الفائق وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من PBS المعقمة (pH 7.0).
    3. كرر خطوات الغسيل مرتين إضافيتين (بمجموع ثلاث غسولات).
    4. قس OD₆₀₀ واحسب الحجم المطلوب لتحصين SCFM2 بمقدار OD₆₀₀ الابتدائي 0.05.
    5. دوامة لفترة وجيزة لتجانس الخلايا وتلقيح كل بئر يحتوي على 500 ميكرولتر SCFM2.
  5. تكوين الركام تحت الظروف الثابتة
    1. تم حضانة SCFM2 بشكل ثابت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات للسماح بتكوين الركام.
      ملاحظة: الحضانة لمدة 4 ساعات تنتج بشكل متكرر تجمعات معلقة بأحجام وتنوع مماثل لتلك التي لوحظت في عينات بلغم التليف الكيف ومجاري الهواء، مع تقليل نضج الأغشية الحيوية في المرحلة المتأخرة 1,15.

2. تحضير المجهد المناعي المرتبط (إنزيم العدلات البشري)

ملاحظة: تصف هذه الخطوة تحضير مسبب إجهاد مشتق من المضيف يستخدم لإحداث الإجهاد الخلوي وزعزعة استقرار التجمعات البكتيرية.

  1. إعادة تشكيل وتخزين إنزيم العدلات البشرية (HNE)
    1. إعادة تكوين إنزيم العدلات البشري وفقا لتوصيات الشركة المصنعة باستخدام 50 ملليمولار أسيتات الصوديوم، و200 ملليمول NaCl، وماء معقم.
    2. جهز محلول مخزون بقوة 50 ميكروغرام/لتر وقم بتعقيم الفلتر باستخدام فلتر بحجم 0.2 ميكرومتر.
    3. أليكوت في أحجام 50 مل وتخزينها عند −20 درجة مئوية.
    4. في الليلة التي تسبق الاستخدام، قم بإذابة المحلول عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يقلل الاقتباس من دورات التجمد والذوبان، مما يمكن أن يقلل النشاط الإنزيمي ويضيف التباين. ال Aliquots مستقرة عند 4 درجات مئوية لمدة شهر تقريبا.

3. تحضير وتطبيق DiBAC4(5) للإبلاغ عن إزالة استقطاب الغشاء

ملاحظة: تصف هذه الخطوة تحضير واستخدام صبغة حساسة للجهد لتصور إزالة استقطاب الغشاء داخل التجمعات.

  1. تحضير وتخزين DiBAC4(5)
    1. ابدأ بتحضير محلول مخزن من DiBAC4(5). إعادة تكوين مسحوق DiBAC4(5) في DMSO اللامائي إلى 1 ملغ/مل.
      ملاحظة: إعادة تشكيل DiBAC4(5) في DMSO تتبع توصيات الشركة المصنعة القياسية.
    2. يتم تحويل Aliquot إلى أحجام بسعة 100 ميكرولتر وتخزينها عند −20 درجة مئوية محمية من الضوء.
    3. استخدم كل أليكوت مرتين لا تزيد عن مرتين.
      ملاحظة: DiBAC4(5) يعادل وظيفيا DiBAC4(3) لكنه تم اختياره هنا ليطابق أطياف الإثارة/الانبعاث GFP. في هذا البروتوكول، يستخدم DiBAC4(3) فقط لصبغة إضافية نوقشت في قسم النتائج. الصبغة الأساسية المستخدمة في هذا البروتوكول هي DiBAC4(5).

4. تصوير كونفوكال بالتايم لابس لإزالة استقطاب الغشاء في تجمعات P. aeruginosa

ملاحظة: تصف هذه الخطوة الحصول على صور كونفوكالية عالية الدقة ومحددة الزمن لالتقاط التغيرات الفسيولوجية والبنيوية الديناميكية في التجميعات.

  1. تحضير المجهر وغرفة البيئة
    1. قم بتركيب إدخال ميكرولوح مسخن أو غرفة بيئية على مرحلة المجهر الكونفوكلي.
    2. شغل التحكم في درجة الحرارة والرطوبة قبل التصوير ساعة على الأقل واضبط على 37 درجة مئوية.
    3. في تبويب الاكتساب ، حدد موقع تبويب الليزر وقبل حوالي ساعة من الاستخدام، شغل الليزر المطلوب للسماح بتسخين كاف (ليزر الأرجون ل GFP؛ DPSS 561-10 ل DiBAC4(5)) (الشكل التكميلي 1A).
      ملاحظة: التحكم البيئي المستقر يقلل من انحراف التركيز ويحافظ على سلامة المجموع خلال تجارب الفاصل الزمني الطويل.
  2. تطبيق عامل الضغط المناعي
    1. بعد 4 ساعات من تكوين الركام، أضف HNE إلى الآبار التجريبية إلى تركيز نهائي 20 ميكروغرام/لتر 16.
    2. اترك آبار التحكم دون علاج.
    3. انقل طبق الأربعة إلى مرحلة المجهر.
      ملاحظة: تم تحضير HNE بتركيزات فسيولوجية ذات صلة (μg/L)، استنادا إلى مستويات البلغم المستحث، وليس كمخزون مركز. يمكن العثور على تركيزات مستخدمة في هذه الدراسة في ماكغارفي وآخرين. 16 تحت IS (بلغم مستحث)، NE-AAT (مركب مضاد للتربسين NE/a1)، HV (متطوع صحي).
  3. تحديد المناطق المجمعة ذات الاهتمام
    1. باستخدام علامة التبويب Locate وهدف 20×، قم بتشغيل الضوء المرسل لتحديد المناطق الغنية بالتجمعات باستخدام تصوير الحقل الساطع (الشكل التكميلي 1B).
    2. أثناء الاستمرار في استخدام تصوير الحقول المضيئة، انتقل إلى تبويب الاكتساب واحفظ إحداثيات x و y- و z باستخدام وحدة المواقع (الشكل التكميلي 1C).
    3. كرر ذلك لعدة نسخ تقنية في كل بئر.
  4. اكتساب z-stack عالي الدقة والسلاسل الزمنية
    1. انتقل إلى موقع محفوظ ثم انتقل إلى هدف غمر الزيت بزاوية 63×.
    2. ضع زيت الغمر قبل وضع الطبق.
    3. في تبويب الاستحواذ ، قم بتكوين القنوات باستخدام الإعداد الذكي (الشكل الإضافي 1D): GFP (488/509 نانومتر) – تعيين اللون الأخضر، DiBAC4(5) (591/615 نانومتر) – تعيين الأحمر.
    4. انتقل إلى عرض حي ، ثم باستخدام وحدة Z-stack ، حدد أسفل غطاء الغطاء عن طريق ضبط التركيز الدقيق ثم ضبطه كأول موضع z بالنقر على تعيين أولا (الشكل الإضافي 1E).
    5. تحرك للأعلى حتى يشير النطاق إلى 60 ميكرومتر وحدد الوضع النهائي على z بالنقر على تعيين الأخير (الشكل الإضافي 1E).
    6. أوقف العرض المباشر وفعل التركيز المحدد. اختر البحث عن السطح، ثم اختر تركيز المخزن فقط عندما تشير الحالة إلى رد الفعل الموجود (الشكل الإضافي 1F).
    7. كرر معايرة التركيز لكل موقع محفوظ باستخدام وحدات Z-stack وDefinite Focus .
    8. قم بضبط اكتساب السلاسل الزمنية لتصوير كل موقع كل 3 دقائق لمدة 6 ساعات (الشكل التكميلي 1G).
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا لإذابة وإضافة واحتضان صبغة DiBAC4(5)، ويمكن استئنافها بعد فترة الحضانة.
    9. اختر بدء التجربة.
      ملاحظة: توازن فترات الثلاث دقائق الدقة الزمنية مع السمية الضوئية واعتبارات التبييض الضوئي.
  5. إضافة وحضانة DiBAC4(5)
    1. أضف DiBAC4(5) لكل بئر إلى تركيز نهائي 5 ميكروغرام/مل9.
    2. حضانة في الظلام لمدة 30 دقيقة قبل بدء التصوير الزمني (time-lapse).
      ملاحظة: تسمح هذه الحضانة بتوازن الصبغة مع تقليل الفلورة الخلفية.

5. التحليل الكمي للصور لبنية التراكم وتحديد المواقع المشتركة في DiBAC4(5)

ملاحظة: تصف هذه الخطوة سير عمل كمي لربط إزالة استقطاب الغشاء ببنية التجميع وعدم الاستقرار.

  1. استيراد الصور وفصل القنوات
    1. رفع ملفات الصور (.czi أو ما يعادلها) إلى برنامج Imaris x64 الإصدار 10.2.0 أو أعلى.
    2. تحقق من معايرة الفوكسل من خلال التحقق من أن أبعاد بكسل x و y و z (حجم الفوكسل) في بيانات الصورة تعكس بدقة معلمات الاكتساب الكونفوكال (الهدف، التكبير، حجم الخطوة z). المعايرة غير الصحيحة ستؤدي إلى أخطاء في القياسات المكانية والحجمية.
  2. الرسم السطحي للتجمعات البكتيرية وإشارة DiBAC4(5)
    1. استخدم وحدة الأسطح لعرض تجمعات P. aeruginosa :
      1. تحت إعداد التقسيم، اختر قناة GFP (الشكل الإضافي 2A).
      2. اختر تمكين تقسيم لمس الأجسام (نمو المنطقة) وضبط عتبة الشدة لالتقاط التجمعات بالكامل (الشكل التكميلي 2B).
      3. تحت وحدة نقاط بذور التصفية ، غير نوع المرشح إلى عدد فوكسلات Img = 1 واضبط على 90٪ (الشكل الإضافي 2C).
      4. بعد معالجة التصيير، اضبط الأسطح على 100٪ (الشكل الإضافي 2D).
    2. أكمل عملية التصيير وخصص اللون الأخضر للأسطح البكتيرية (الشكل الإضافي 2E).
    3. كرر التصيير لقناة DiBAC4(5) وتعيين اللون الأحمر.
  3. التداخل المشترك والكميم القائم على الحجم
    1. اختر عرض السطح DiBAC4(5) (الشكل الإضافي 3A) وحدد أي نقطة زمنية سيتم إجراء تحليل التنقل المشترك فيها.
    2. انتقل إلى الإحصائيات > تبويب مفصل > القيم المحددة (الشكل التكميلي 3B).
    3. عرف التموضع المشترك باختيار كائنات ذات أقصر مسافة إلى الأسطح البكتيرية 0.00 (الشكل التكميلي 3B).
    4. حدد موقع التحرير، ثم قم بتكرار هذه الكائنات لتوليد سطح يتداخل مع الخلايا في DiBAC (الشكل التكميلي 3C). تأكد من إعادة تسمية هذا السطح للدلالة على تداخل خصائصه.
    5. في تبويب التفصيل تحت القيم المتوسطة، سجل قيم الحجم المجمعة في كل نقطة زمنية محددة ل: (1) إجمالي إشارة DiBAC4(5) (الشكل التكميلي 3D); (2) إشارة DiBAC4(5) الموضعية المشتركة (الشكل 3E الإضافي).
    6. احسب نسبة التداخل كالتالي:
      figure-protocol-1
      ملاحظة: يعكس التداخل النسبي نسبة إشارة DiBAC₄(5) المرتبطة بالخلايا داخل التجميعات، مما يعكس إزالة استقطاب الغشاء في نقطة زمنية معينة.
      ملاحظة: على الرغم من إثبات ذلك باستخدام تجمعات P. aeruginosa في SCFM2 وتم إثباته باستخدام HNE، فإن هذا السير يمكن التكيف بشكل عام مع أنواع البكتيريا الأخرى، والوسائط التي تعزز التجمعات، والمراسلين الفلوريين، والمسببات الضغوط، بما في ذلك العوامل المضادة للميكروبات أو الاضطرابات البيئية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البروتوكول الموضح أعلاه يتضمن طريقة لتتبع التغيرات في ديناميكيات الأغشية لتجمعات P. aeruginosa النمذجة في بيئة رئة تليف كيسي (الشكل 1). باستخدام سلالة PAO1 من النوع البري تحمل بلازميد pMRP9-1 (GFP) (الشكل 1A)، وHNE لمحاكاة الإجهاد المناعي، وصبغة الغشاء DiBAC4(5) (الشكل 1C)، تم قياس التغيرات في إزالة استقطاب الغشاء، التي تعكس اضطراب جهد الغشاء وتوازن الخلية، (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعمل جهد الغشاء كقراءة حساسة ومبكرة للإجهاد الخلوي واضطراب التوازن الخلوي. داخل التجمعات البكتيرية متعددة الخلايا، تحدث هذه التغيرات الفسيولوجية قبل وقد تؤدي إلى زعزعة البنيوية اللاحقة. هنا، نقدم سير عمل قائم على التصوير يستخدم أوكسونول الصبغة الحساسة للإمكانات والاستجابة البطيئة وذات الحساسية المحتملة (DiBAC4(5)) لتتبع إزالة الاستقطاب في تجمعات Pseudomonas aeruginosa المعرضة لإجهاد مشتق من المضيف. يوفر تتبع إزالة الاستقطاب رؤى قيمة حول فسيولوجيا الخلايا داخل التجميعا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

تحظى S.E.D بدعم من أموال الشركات الناشئة المقدمة من قسم الطب الجزيئي بجامعة جنوب فلوريدا، بالإضافة إلى منح بحثية من مؤسسة التليف الكيسي (CFF) (DARCH19G0، DARCH22P0، DARCH25G0).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض 1,3-ديبيوتيل باربيتوريك) أوكسونول بنتاميثين (DiBAC4(3))AAT Bioquest21411  الجزيء الأنيوني الدهني، الدهني 
حمض 1,3-ديبيوتيل باربيتوريك) أوكسونول بنتاميثين (DiBAC4(5))AAT Bioquest21410  الجزيء الأنيوني الدهني، الدهني 
كاربينيسيلين  منتجات البحث الدولية  C46000-5.0يستخدم لاختيار GFP التي تعبر عن سلالات PAO1
طبق سيلفيس ذو 4 حجرات بحجم 35 مم من الزجاج السفليفيشرNC0600518يسمح طبق الحجرة الزجاجي السفلي بتثبيت التجمعات المعلقة في وسط النمو أثناء التصوير 
الطرد المركزيبيكمان كولتر لايف ساينسز  B06320مقترن بدوار دلو متأرجح Beckman Coulter Life Sciences SX4400 (رقم القطعة B01425)
المجهر الماسح بالليزر الكونفوكال (CLSM)زايسLSM 880النموذج المستخدم في التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول لم يعد متاحا، لكن LSM 900 هو خيار معادل محدث 
أنابيب الزراعةجينيسي21-130عقيم؛ بولي بروبيلين  
DAPIثيرمو فيشر62248استخدم في التطبيقات المستقبلية المقترحة لتلوين العدلات باستخدام DiBAC4(5)
الكوفيتات ذات الاستخدام الواحد  براند تك759086D1.5 مل، شبه ميكرو
DMSOميليبور-سيغما276855-100MLواستخدمت لإعادة تشكيل DiBAC4(3,5)
DRAQ5ثيرمو فيشر65-0880-92يستخدم في التطبيقات المقترحة المستقبلية لتلوين العدلات باستخدام DiBAC4(3)
غرفة البيئة لإدارة العلوم الاجتماعية والثقافيةPECONLSM 880تم تصنيع هذا النظام حصريا لمنتجات زايس ويشار إليه عموما باسم "نظام الحاضنة S"، ويمكن طلب جميع المكونات عبر زايس كإضافة إلى نظام LSM 880 (أو نظام مشابه)
جنتامايسين سلفات فيشرBP918-1يستخدم لاختيار طلبات التقديم التي تعبر عن سلالات PA1633
الجلسرول  جينيسي18-205يستخدم لتجميد السلالات للتخزين طويل الأمد عند -80  ° C
إنزيم العدلات البشري (HNE)ميليبور-سيغما324681-50UGوبمجرد إعادة تأسيسها، تصبح مستقرة لمدة شهر واحد عند الساعة 4 ؛ ° C أو سنة واحدة في عمر 20 و20 سنة فقط؛ ° C
برنامج إيماريس x64أكسفورد إنسترومنتس الإصدار 10.2.0
زيت الغمر  علوم المجهر الإلكتروني  16919-12غير جاف؛ موحدة عند 37  ° C
الحاضنة معيار العلومH1001-Mقادر على الاهتزاز
مرق الليسوجيني (LB)جينيسي11-118مزيج ميلر
بلازميد mCherry  تم الحصول عليه من مشارك في التعاون 
سلالة PA1633 المتحولة الترانسبوزونية  تم الحصول عليه من مشارك في التعاون 
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو فيشر3002درجة الحموضة 7.0
أسيتات الصوديومثيرمو فيشرAM97403M; الرقم الهيدروجيني 5.5؛ خالي من RNase
كلوريد الصوديومفيشر  S271-500استخدم في إعادة تشكيل HNE
مقياس الطيف  VWR634-0882يستخدم لقياس كثافة الخلايا لتلقيح PAO1/PA1633 في SCFM2
عقم .22µ مرشح mجينيسي25-244يستخدم لتنقية HNE المعاد تشكيله
أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمةجينيسي24-272LR0.6 مل
حقنة معقمةفيشر14955459يستخدم لتنقية HNE المعاد تشكيله
دوار الدلو المتأرجح SX4400  بيكمان كولتر لايف ساينسز  B01425مقترن مع جهاز الطرد المركزي بيكمان كولتر لعلوم الحياة (رقم الجزء B06320)
وسط بلغم التليف الكيسي الصناعي (SCFM2)سينث بيوم10002-500الدفعة #: 001-CF2-0724
المياه النقية للغايةجينيسي18-195استخدم في إعادة تشكيل HNE
النوع البري Pseudomonas aeruginosa PAO1 مع بلازميد pMRP9-1 و-nbsp;يحتوي هذا البلازميد pMRP9-1 على GFP ويعبر عن مقاومة الكاربينيسيلين.
برنامج ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Imaging  زايسمتوافقة مع LSM 880

المراجع

  1. Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. mBio. 8 (2), e00240-17(2017).
  2. Rada, B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 6 (1), 10(2017).
  3. Kragh, K. N., Tolker-Nielsen, T., Lichtenberg, M. The non-attached biofilm aggregate. Commun Biol. 6 (1), 898(2023).
  4. Gannon, A. D., Matlack, J., Darch, S. E. Exploring aggregation genes in a P. aeruginosa chronic infection model. J Bacteriol. 207 (1), e00429-24(2025).
  5. Melaugh, G., et al. Distinct types of multicellular aggregates in Pseudomonas aeruginosa liquid cultures. npj Biofilms Microbiomes. 9 (1), 52(2023).
  6. Letizia, M., Diggle, S. P., Whiteley, M. Pseudomonas aeruginosa: Ecology, evolution, pathogenesis and antimicrobial susceptibility. Nat Rev Microbiol. 23, 701-717 (2025).
  7. Andersen, J. B., et al. Identification of small molecules that interfere with c-di-GMP signaling and induce dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 59(2021).
  8. Andersen, J. B., et al. Induction of native c-di-GMP phosphodiesterases leads to dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 65 (4), e02431-20(2021).
  9. Lee, W., Woo, E. R., Lee, D. G. Phytol exhibits antibacterial activity by inducing oxidative stress in Pseudomonas aeruginosa. Free Radic Res. 50 (12), 1309-1318 (2016).
  10. Shirazi, F., et al. Biofilm filtrates of Pseudomonas aeruginosa inhibit preformed Aspergillus fumigatus biofilms via apoptosis. PLoS One. 11 (3), e0150155(2016).
  11. Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and key physiological traits of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
  12. Turner, K. H., et al. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  13. Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for real-time assessment of a Pseudomonas aeruginosa infection model. J Vis Exp. (170), e62420(2021).
  14. Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
  15. Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4779-4784 (2018).
  16. McGarvey, L. P. A., et al. Cytokine concentrations and neutrophil elastase activity in bronchoalveolar lavage and sputum in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 1 (4), 269-275 (2002).
  17. Adams, D. S., Levin, M. Measuring resting membrane potential using fluorescent voltage reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 459-464 (2012).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  19. Lagendijk, E. L., et al. Genetic tools for tagging Gram-negative bacteria with mCherry for visualization. FEMS Microbiol Lett. 305 (1), 81-90 (2010).
  20. Meylan, S., et al. Carbon sources tune antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa via TCA cycle control. Cell Chem Biol. 24 (2), 195-206 (2017).
  21. Wickremasinghe, H., et al. Polymyxin B and meropenem synergistically kill multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and reduce biofilm formation. Antibiotics (Basel). 10 (4), 405(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.