التحليل الليزوزومي باستخدام LysoTracker للتقييم الكمي لشيخوخة الخلايا في الخلايا الليفية البشرية

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكول ليزوتراكر للخلايا الحية لقياس إعادة تشكيل الليسوسوم أثناء الشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية IMR-90.

الملخص

الشيخوخة الخلوية هي حالة توقف مستمرة في دورة الخلية مرتبطة بالأنماط الظاهرية المميزة، بما في ذلك تضخم شكل الخلية، وتغير إشارات الإفراز، وإعادة تشكيل الليسوسوم الواضحة. تظهر الخلايا الشيخوخة عادة توسع الحجرة الداخلية الليزوزومالية الحمضية، مصحوبة بتغيرات في الحموضة اللومية والقدرة على التحلل، مما يخلق فرصة لقراءات بسيطة لإعادة تشكيل العضيات المرتبطة بالشيخوخة. يصف هذا العمل بروتوكول تصوير الخلايا الحية يستخدم صبغة LysoTracker Deep Red، وهي صبغة فلورية حمضية، لتوفير بديل غير مباشر يعتمد على الرقم الهيدروجيني لقسم العضيات الحمضي كعلاقة لحمل الشيخوخة. تم عرض هذه الطريقة في الأرومات الليفية الرئية البشرية من نوع IMR-90 التي تخضع لشيخوخة تكرارية عبر الانتقال المتسلسل. يوضح البروتوكول تتبع زراعة الخلايا وممرها، وتلوين LysoTracker، وتصوير الفلورة، والقياس القياسي المعتمد على الصور لشدة الإشارة الليسوسومية ومساحة الإشارة الموجبة لكل خلية. يتم تضمين صبغ β-جالاكتوسيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-Gal) على الثقافات المتوازية كمؤشر تأكيدي اختياري وليس كمعيار مرجعي. تظهر النتائج التمثيلية إشارة صبغة فلورية حمضية أعلى ومناطق موجبة ليزومبوية أكبر في المزارع المتأخرة مقارنة بالضبطات في المراحل المبكرة، مما يتوافق مع توسع حجرة العضيات الحمضية أثناء الشيخوخة. نظرا لأن القراءة تعتمد على حجم الحجرة، وتدرج البروتون، وتوفر الصبغة، فمن الأفضل تفسيرها كارتباط غير مباشر بإعادة تشكيل الليسوسوم بدلا من مقياس مباشر لعدد أو تكوين الليسوسوم الحيوي. البروتوكول سهل الاعتماد ويمكن تكييفه لأنواع خلايا أخرى أو ضغوط تسبب الشيخوخة، مما يوفر مكملا عمليا وكميا لاختبارات النهاية التقليدية.

المقدمة

الشيخوخة الخلوية هي برنامج توقف دائم لدورة الخلايا يتم تفعيله بواسطة ضغوط مختلفة ومحفزات مرتبطة بالشيخوخة 1,2,3,4. يتم التعرف على الخلايا القديمة تقليديا من خلال مجموعة من العلامات، حيث لا يوجد مؤشر واحد محدد تماما. تشمل العلامات المميزة تضخم وتسطح شكل الخلية، نشاط داز β-جالاكتوسيداز (SA-β-Gal) المرتبط بالشيخوخة، تكوين بؤر تلف الحمض النووي، وملف إفرازي مؤيد للالتهابات (SASP)^2,4,5. من بين هذه الخصائص، برز إعادة تشكيل الليزوسوم كسمة بارزة وذات أهمية وظيفية للشيخوخة ^6,7. تظهر الخلايا القديمة تغيرات عميقة في الليسوسوم، بما في ذلك توسع كبير في حجم وعدد الليسوسوم إلى جانب تغير في الوظيفة (غالبا ما يتضمن تحييدا جزئيا لدرجة الحموضة الليسوسومية وتراكم المادة غير المتحللة)6,7,8,9. يساهم هذا التوسع الليزوزومي في زيادة نشاط SA-β-Gal، وهو علامة شيخوخة معروفة تعكس زيادة نشاط β جالاكتوسيدازات الليسوسومية في الخلايا المتقدمة^{في السن} 10,11,12. في الواقع، يستغل تلوين SA-β-Gal هذه الظاهرة باستخدام حضانة pH دون المستوى المثالي (6.0) لترسيب الصبغة بشكل انتقائي في الليسوسومات الشيخوخة، التي تراكم الإنزيم وتظهر درجة حموضة أعلى من الخلايا الشابة^10،12،13.

تلعب الليسوسومات أدوارا مركزية في دوران البروتين والإشارات، ويعتبر اختلالها الآن علامة مميزة للشيخوخة والشيخوخة 1,2,4,6. غالبا ما تظهر الخلايا الشيخوة خللا في الوظائف الليسوسومية، يتضح ذلك من ارتفاع درجة الحموضة اللومعية، وتغير نشاط الإنزيم، وتراكم الليبوفوسين (صبغة ذاتية التألق للجزيئات الكبيرة المؤكسدة)^6,14. غالبا ما يتم تنظيم أو تعديل تكوين الليسوسوم الحيوي من خلال شبكة التعبير والتنظيم المنسقة للليسوسوم (CLEAR) تحت سيطرة عامل النسخ EB (TFEB) والعوامل ذات الصلة ^6,7,15. يمكن لهذه العملية أن تزيد من الكتلة الليسوسومية في الخلايا المسنة أثناء تكيفها مع الإجهاد عن طريق توسيع الحجرة المتحللة ^6,7,10. وعلى العكس، قد تشهد الخلايا المتقدمة في السن أيضا تدهورا وظيفيا في الليسوسوم (مثل انخفاض الحموضة)، مما قد يؤثر على عمليات مثل الالتهام الذاتي ويمنح مقاومة لبعض الضغوط، بما في ذلك موت الخلايا الفيروبتوتيكية ^6,8. لذلك، فإن قياس محتوى ووظيفة الليسوسوم هو جوهر لفهم وتحديد الشيخوخة ^6,16.

ليسو تراكر ديب ريد هو مسبار فلوري يغشائي يتجمع بشكل انتقائي في العضيات الحمضية من خلال الاحتجاز المدفوع بالبروتونيشن عبر الغشاء الليسوسومي^16,17. تعكس الإشارة الناتجة حجم الحزام الحمضي المجمع، وقوة تدرج البروتون، وتوفر الصبغة المحلية بدلا من الكتلة الليسوسومية، ويمكن أن تتغير مع تغيرات في درجة الحموضة أو حالة الغشاء الليسوسومية التي تحدث بشكل مستقل عن الرقم الكلي للليسوسوم ^6,16. في سياق الشيخوخة الخلوية، تظهر الخلايا حجرات موسعة وأكثر وسوما بكثافة موجبة LysoTracker مقارنة بنظيراتها قبل العجوز⁹، بما يتوافق مع توسع حجرة العضيات الحمضية وزيادة تكوين الليزوسوم الليزوزومي كما أبلغت عنها الدراسات الكيميائية الحيوية والفائقة البنيوية ^6,7,10. يقدم هذا النهج الخلوي الحي عدة مزايا مقارنة بتلوين SA-β-Gal التقليدي في نقطة الطرف: حيث يتيح تحليلا كميا ومحليا للخلايا الفردية، ويمكن دمجه مع مبلغات فلورية أخرى، لا يتطلب تثبيتا، ويلتقط التباين من خلال الإبلاغ عن ميزات مستمرة بدلا من نقطة نهاية ثنائية ^6,16. خلال هذا البروتوكول، يستخدم إشارة ليزوتراكر كقراءة لمقصورة العضيات الحمضية في الخلايا الحية، وتفسر التغيرات المعتمدة على الحالة بناء على ذلك بدلا من معاملتها كمقياس مطلق لعدد الليسوسوم ^6,16.

يوضح هذا البروتوكول استخدام LysoTracker Deep Red لتحليل التغيرات الليسوزومالية في الأرومات الليفية IMR-90 التي تخضع لمرحلة التقدم في السن التكراري. IMR-90 هو خط طبيعي من الأرومات الليفية ثنائية الصيغة الصبغية البشرية (أنثى، من أصل رئة جنينية) يستخدم على نطاق واسع في أبحاث الشيخوخة؛ مثل غيرها من الخلايا الليفية الأولية الشبيهة (مثل WI-38)، تدخل خلايا IMR-90 مرحلة الشيخوخة بعد تضاعف ~50–60 (حد هايفليك) بسبب قصر التيلوميرات وتلف الحمض النووي الذي يشير^{إلى 18,19}. يصف البروتوكول كيفية زراعة خلايا IMR-90 لتحفيز الشيخوخة عبر المرور المتسلسل، والتحقق من الشيخوخة بالشكل وتلوين SA-β-Gal، وصبغ المزارع الحية باستخدام LysoTracker Deep Red لتصوير الفلورة 5,10,12,13. يشمل التقاط الصور وتحليلها، مع قراءات كمية مثل عدد الليزوسوم لكل خلية، وإجمالي مساحة الليسوسوم لكل خلية، ومتوسط شدة التألق. يتم التركيز على الضوابط التجريبية واعتبارات السلامة، بما في ذلك التعامل الدقيق مع الأصباغ والمثبتات، وتقليل السمية الضوئية أثناء التصوير، وأخذ التألق الذاتي الخلوي في الاعتبار في الخلايا المتقدمة في السن. يتم إثبات الطريقة باستخدام الشيخوخة المكررة، لكنها يمكن تكييفها مع نماذج أخرى، بما في ذلك الشيخوخة الناتجة عن الأدوية (مثل علاج دوكسوروبيسين أو الإيتوبوزيد) أو الشيخوختة المبكرة الناتجة عن الإجهاد (SIPS) بواسطة المؤكسدات 2,3,4,19,20. في كل حالة، يجب مقارنة قراءات LysoTracker مع الضوابط المناسبة (الخلايا المتكاثرة أو الساكنة)، وعند الإمكان، التحقق منها مع علامة تقدم تقليدية واحدة على الأقل (مثل SA-β-Gal أو تعبير p16INK4a)3,5,12,13.

تملأ التنميط الليزوزومي للخلايا الحية فجوة عملية في اختبارات الشيخوخة من خلال توفير قياس دقة خلية واحدة قابل للتكرار لنمط رئيسي للعضيات — التوسع الليزوزومي — مرتبط مباشرة بوظيفة الخلية الشيخوخة (مثل زيادة القدرة التحللية والنشاط الإفرازي)2,3,4,6 . نظرا لأن تلوين LysoTracker متوافق مع التصوير عالي الإنتاجية وقياس تدفق التوترية، يمكن توسيع البروتوكول لتطبيقات مثل فحص الأدوية (مثل اختبار السينوليتيكس أو معدلات وظيفة الليسوسوم)^2،3،6. كاتجاه مستقبلي، فإن الميزات الليسوسومية لكل خلية التي يولدها هذا البروتوكول قابلة للتطبيق على أساليب التصنيف اللاحقة، بما في ذلك نماذج التعلم الآلي؛ تدريب والتحقق من هذه المصنفات خارج نطاق هذا البروتوكول. بشكل عام، تتيح هذه الطريقة (الشكل 1) تصور وقياس البعد الليزوزومي في بيولوجيا الشيخوخة، مما يوفر فهما لكيفية تغير تكوين وشكل الليسوسوم أثناء الشيخوخة أو الإجهاد، ويوفر منصة لاختبار التدخلات التي تستهدف الليسوسومات في الخلايا الشيخوخة. يتم تنفيذ سير عمل تحليل الصور المستخدم لتقسيم الأنوى، واشتقاق المناطق المرتبطة بالخلية، وتحديد عتبة، وقياس ميزات LysoTracker، وإعادة إنتاج تحليلات لكل بئر ولكل خلية المعروضة هنا، كحزمة مرافقة مفتوحة المصدر (SenTrackLite v0.5.0)، مقدمة كملف تكميلي 1 ويتم أرشفتها بملف DOI دائم للاستشهاد وإعادة الاستخدام²¹.

الشكل 1: نظرة عامة على اختبار الشيخوخة الليسوزوزومي للخلايا الحية. (أ) سير عمل تجريبي. تلون الخلايا حية باستخدام LysoTracker Deep Red وصبغة نووية، يتم تصويرها بواسطة مجهر فلوري قياسي، ومعالجتها اختياريا بالتوازي لتلوين SA-β-Gal للتحقق من الصحة. (ب) قياسات لكل خلية مشتقة من الصور. تستخدم القناة النووية لتحديد الخلايا الفردية، وتمدد النواة المرتبط بالمنطقة لكل خلية لاستخراج قياسات مرتبطة بالليسوسوم من قناة ليزوتراكر. تشمل القياسات التمثيلية لكل خلية مساحة الليسوسوم، ومتوسط شدة LysoTracker، وعدد الليسوسومات. يمكن استخدام تلوين SA-β-Gal كتسمة تحقق اختيارية عند توليد أو تأكيد مجموعات البيانات المرجعية. (ج) القياس والمخرجات. يتم دمج قياسات الليزوزومات لكل خلية في درجة أو احتمال شيخوخة لكل خلية باستخدام طريقة تسجيل بسيطة. تشمل النتائج قيم لكل خلية وملخصات على مستوى البئر أو على مستوى الحالة لعبء الشيخوخة، والتي يمكن مقارنتها عبر حالات تحفيز الشيخوختة أو المعالجة المحللة. تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com
يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

خلايا IMR-90 هي سلسلة خلايا للأرومات الليفية البشرية المعروفة ولا تشكل أبحاثا بشرية. لم تكن هناك حاجة لموافقة أخلاقية أو موافقة مستنيرة. تم إجراء جميع الإجراءات وفقا لإرشادات السلامة الحيوية لجامعة ألباني، جامعة ولاية نيويورك، للعمل على خطوط الخلايا المشتقة من الإنسان تحت شروط المستوى 2 للسلامة البيولوجية (BSL-2).

1. نظرة عامة على التحضير وسير العمل

1. حدد الهدف التجريبي كاختبار تحليل تحليل للنسيج الليزوزومي للخلايا الحية باستخدام تلوين LysoTracker Deep Red وصبغة نووية حية لقياس إعادة تشكيل الليسوسوم كقراءة مستمرة لحمل الشيخوخة في خلايا IMR-90. عرف المقارنة البيولوجية الأساسية كواحدة من التصاميم التالية:
   1. التحفيز في الشيخمة مقابل التحكم غير المحفز المطابق.
   2. الحالات التي تتجاوز الشيخوختة العالية مقابل المنخفضة عبر جرعة أو سلسلة زمنية.
   3. حالة الشيخوخت-المرتفعة التي عولجت بمادة سينوليتيك مقابل معالجة المركبة - تحكم عال في الشيخوخة.
   4. تشمل سلسلة العلاجات المحللة للشيرينة مجموعة أساسية منخفضة الشيخوخة ومجموعة عالية الشيخوخة.
2. حدد الحد الأدنى من هيكل التحكم لجميع التجارب.
   1. أدرج مجموعة ضابطة منخفضة الشيخوخة مطابقة لكثافة الدرع وتوقيت التلوين وإعدادات التصوير.
   2. يشمل مجموعة عالية الشيخوخة مولدة بواسطة محفز شيخوخة محدد أو بواسطة شيخوخة تكرارية في الممر المتأخر.
   3. تضمين النسخ البيولوجية لكل حالة وإجراء التلوين والتصوير بتوقيت متطابق عبر الحالات.
3. عرف قراءات الاختبار بأنها مقاييس مباشرة قائمة على الصور لإعادة تشكيل الليسوسوم:
   1. قس متوسط شدة LysoTracker لكل خلية داخل القناع الإيجابي باستخدام عتبة شدة ثابتة كقراءة أساسية للاختبار. على مستوى الخلية الواحدة، يفصل هذا المقياس بين الشيخوخة المنخفضة والظروف ذات الشيخوخة العالية ذات الحجم الأكبر للتأثير، وهو غير حساس لكثافة النواة على مستوى الحقل (الشكل التكميلي 1).
   2. سجل ما يلي كقراءات ثانوية توثق توسع الحجرة لكنها أكثر حساسية لخيارات التقسيم أو كثافة النواة على مستوى الحقل: مساحة غنية بالليسوسوم لكل خلية وشدة LysoTracker متكاملة لكل نواة على مستوى الحقل. الشدة المتكاملة لكل نواة مفيدة في الحقول المأهولة بكثرة لكنها تصبح غير مستقرة عندما يحتوي الحقل على عدد قليل من النوى، حيث تصبح الخلايا الفردية تهيمن على تطبيع كل نواة.
   3. سجل مقاييس الاختيار لعدد وحجم النقاط الليسوسومية عندما تدعم دقة التصوير تمييز البونكتا.
4. استخدم تلوين β-جالاكتوسيداز (SA-β-Gal) المرتبط بالشيخوخة كخطوة اختيارية للتحقق تجرى على آبار متوازية أو عينات مطابقة، حسب القيود التجريبية. استخدم هذا التحقق للتأكد من أن الثقافات المتأخرة تظهر زيادة إيجابية SA-β-Gal مقارنة بثقافات العبور المبكر.
5. توحيد الاختبار عبر الظروف عن طريق تثبيت المتغيرات التالية قبل جمع البيانات:
   1. تركيز عمل LysoTracker (75 نانومتر) ومدة التلوين (30 دقيقة).
   2. هوية الصبغة النووية ونطاق تركيز العمل (مثلا، Hoechst 33342 عند 1 ميكروغرام/مل إلى 2 ميكروغرام/مل).
   3. معلمات التصوير، بما في ذلك التكبير الموضوعي، زمن التعريض، شدة الإضاءة، التقطيع، واستراتيجية التركيز.
   4. تنسيق اللوحة وتكوين التصوير (ألواح التصوير ذات القاع الشفاف أو أطباق ذات قاع زجاجي)، بما في ذلك تخطيط البئر المقلد.
   5. اختيار العتبة وتطبيع الشدة.
      1. تطبيق عتبة شدة ثابتة واحدة على قناة LysoTracker عبر جميع الآبار داخل التجربة لتعريف القناع الإيجابي.
      2. اختر العتبة مرة واحدة أثناء إعداد الاختبار باستخدام مجموعة معايرة من الحقول التي تمتد عبر نطاق الشدة المتوقع (مثل حقلين منخفضين للشيخوخة وحقلان مرتفعين للشيخوخة)، وحافظ عليها ثابتة عبر جميع الآبار داخل تلك الجلسة؛ السماح بتغير العتبة لكل بئر يدخل اعتمادا دائريا بين القياس والنتيجة.
      3. للمقارنات بين التجارب المتقاطعة، احصل على جميع الظروف في جلسة واحدة تحت نفس إعدادات طاقة الليزر والتعريض والكسب وقم بالإبلاغ عن هذه الإعدادات في أسطورة الشكل.
      4. إذا كانت هناك حاجة لمقارنات الشدة المطلقة عبر الجلسات، قم بتضمين معيار مرجعي فلوري (مثل لوحة مرجعية أو بئر مرجعي ثابت) وقم بتطبيع الشدة المقاسة وفقا لذلك.
         ملاحظة: لا تقارن قيم الشدة الخام عبر الجلسات بدون إعدادات اكتساب متطابقة أو تطبيع قائم على المرجع.
   6. تطبيع الكثافة النووية.
      ملاحظة: نظرا لأن المزارع المتقدمة في السن عادة ما تظهر انتشارا أقل وكثافة نووية أقل عند أوقات بذر مماثلة7,10، فقد تتأثر مقاييس الحقل بناء على عدد البكسلات المطلقة (مثل المساحة الموجبة للليزو) بعدد الخلايا في الحقل.
      1. أبلغ عن القيم الخام ولكل النواة التي تم تطبيعها (القيمة الخام مقسومة على عدد النوى المقسمة إلى هوشت).
         ملاحظة: ضوابط تطبيع كل نواة للخلط المرتبط بالكثافة ويعد المقارنة المناسبة لتفسير كل خلية. بالنسبة للقراءات القائمة على المناطق، تعمل القيمة التطبيعة كمقياس أساسي، بينما يتم الاحتفاظ بالإجمالي غير المعدل للاكتمال.
6. احصل على الصور في ظروف تحافظ على جودة إشارة الخلايا الحية وتقلل من التفاوت التقني. حافظ على حماية الألواح المبكرة والمتأخرة من الضوء أثناء التلوين والنقل، وقلل من الوقت خارج ظروف الزراعة المحكومة أثناء التصوير.
7. احفظ صور الفلورة كملفات TIFF أحادية المستوى، أحادية القناة، وبدون فقدان. استخدم نظام تسمية متسق يحافظ على الاقتران بين الصور النووية وصور LysoTracker ويحافظ على قابلية التتبع إلى الصفائح، البئر، التحاليف، والتكرار. استخدم اسم قاعدة مشترك مع لواحق القناة (مثل _Hoechst.tif و _Lyso.tif). تخزين الصور في مجلد مخصص منظم حسب التجربة، مع المجلدات الفرعية حسب الحاجة.
   ملاحظة: نقطة توقف عملية هي بعد تحديد مجموعات المراحل المبكرة والمتأخرة والتأكد من أن ثقافات العبور المتأخر تظهر نموا بطئا وشكلا يشبه الشيخوخة.
8. (اختياري) إدراج الأكسجين كمتغير تجريبي من خلال الحفاظ على مجموعات IMR-90 المتطابقة في ظروف البيئة وظروف منخفضة الأكسجين. عالج جميع المجموعات بنفس الطريقة.

2. زراعة الخلايا وتحفيز الشيخوخة المتكررة

1. قم بإذابة الأرومات الليفية الرئية البشرية IMR-90 وفقا لممارسات زراعة الخلايا القياسية وتوسيع الخلايا في الوسط الأساسي الأدنى (MEM) مع 10٪ مصل أبقار جنيني. أضف البنسلين-ستربتوميسين بنسبة 1٪ إذا كان متوافقا مع الممارسة المخبرية وتصميم التجارب. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
2. الحفاظ على الثقافات في النمو اللوغاريتمي والمرور قبل التقاء 70٪ إلى 80٪. استخدم جداول معالجة وتغذية الوسائط المتسقة لتقليل التباين عبر التجارب التجريبية. استبدل وسيط الزراعة الكامل كل يومين إلى ثلاثة أيام بين المرات.
   ملاحظة: لا تدع الوسط يبقى دون تغيير لأكثر من 72 ساعة، لأن استنزاف العناصر الغذائية وتراكم العوامل المفرزة يمكن أن يعزز الأنماط الظاهرية الناتجة عن الإجهاد والتي تخلط الشيخوخة التكرارية.
3. عرف مجموعة الأساس منخفضة الشيخوخة بأنها تكاثر نشط لثقافات IMR-90 التي تحافظ عليها تحت ظروف تحافظ على سلوك النمو الطبيعي. مطابقة كثافة الطلاء والتعامل مع جميع مجموعات التجريب.
4. توليد مجموعة عالية الشيخوخة باستخدام أحد الأساليب التالية، يتم اختيارها بناء على الأهداف التجريبية.
   1. تحفز الشيخوخة المتكررة عن طريق الانتقال التسلسلي مع تتبع تضاعف السكان حتى تتباطأ التكاثر وتظهر الشكل المرتبط بالشيخوخة.
      ملاحظة: مستوى مضاعفة السكان (PDL) وعدد المرور هما مقاييس منفصلة ويتم تتبعهما بشكل منفصل. يشير PDL إلى التكرارات التراكمية بعد الذوبان ويتم حسابها في كل مقطع كالتالي:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂(الخلايا المحصودة / الخلايا المزروعة)¹⁸,
      بينما رقم الممر يحسب عدد الثقافات الفرعية منذ الذوبان. نظرا لأن الثقافات عادة ما تنقسم بنسبة 1:4 عند التقاء حوالي 70٪–80٪، فإن كل مقطع يساهم بحوالي مضاعفتين في عدد السكان، لذا فإن رقم المقطع وPDL التراكمي غير قابلين للتبادل.
      ملاحظة: عادة ما تلاحظ الثقافات ذات الشيخوخة العالية عند مستويات متقدمة تباعد السكان، عندما يتباطأ الانتشار، ويصبح الشكل المرتبط بالشيخوخة واضحا. يجب تحديد العتبات الدقيقة تجريبيا لكل دفعة IMR-90، حيث تختلف معدلات PDL بين البائعين.
   2. الشيخوخة الناتجة عن الإجهاد من خلال تطبيق محفز شيخوخة محدد والسماح بنافذة تطور ظاهري مناسبة.
   3. الشيخوخة الناتجة عن العلاج من خلال تعريض الخلايا للحالة قيد الدراسة عندما يكون الهدف هو اختبار ما إذا كانت تلك الحالة تسبب الشيخوخة.
5. التحقق من أن النهج المختار ينتج نمطا ظاهريا عالي الشيخوخة باستخدام قراءة متعامدة واحدة على الأقل تجرى على آبار متوازية. قم بإجراء تلوين SA-β-Gal كطريقة تحقق اختيارية ووثق نسبة الخلايا الإيجابية لكل حالة عند تضمينها.
   1. تعتبر الزراعة عالية الشيخوخة عندما تظهر 50٪ على الأقل من الخلايا تلوين أزرق غير غامض ب SA-β-Gal بعد حضانة لمدة 12 إلى 16 ساعة عند pH 6.0، بينما تظهر نسبة التحكم المطابقة مع الشيخوخة المنخفضة لا تزيد عن 10٪ من الخلايا الإيجابية تحت ظروف تلوين متطابقة¹³.
   2. تشير القيم خارج هذه الحدود إلى استحث شيخوخة غير مكتمل أو خلفية مرتفعة وتستحق إعادة التحسين قبل الانتقال إلى التصوير.
      ملاحظة: التوقف بعد تحديد مجموعات الشيخوخة المنخفضة والعالية وتأكيد اختلاف ظاهري واضح من خلال الشكل والتلوين الاختياري للتحقق الظاهري.
6. اختياري: تصميم معالجة السينوليتيك
   1. ظروف الشيخوخة المنخفضة والعالية في الآبار تكرر وتسمح للخلايا بالالتصاق والتعافي قبل العلاج.
   2. يعالج الآبار ذات الشيخوخة العالية بمركب أو مركبات تحللية ويشمل نظام تحكم عالي الشيخوخة المعالج بالمركبة.
   3. تضمين مجموعة منخفضة الشيخوختة تعالج بنفس المركبة، وعند الضرورة، نفس تركيز المركبات لمراقبة حساسية غير الشيت.
   4. تابع استخدام LysoTracker وتطبيق التلوين النووي في وقت ثابت بعد المعالجة عبر جميع الحالات.
7. راقب الزراعة أثناء مراحل المرور/تقدم العلاج ووثق الشكل وأنماط النمو. تحديد الثقافات المتقدمة في السن من خلال تباطؤ التكاثر، وتضخم وتسطيح الشكل، وزيادة الحبيبية السيتوبلازمية. بمجرد أن يظهر توقف النمو، حافظ على الثقافة كمجموعة عالية الشيخوخة للتلوين والتصوير بدلا من الانتقال إلى مراحل أخرى.
8. تقليل الضغوط المربكة أثناء صيانة الزراعة باستخدام تحضير الوسائط بشكل منتظم، وجداول تغذية منتظمة، ووقت تعامل منتظم خارج الحاضنة. اعتبر تقلبات درجة الحرارة، وطول الوقت خارج ثاني أكسيد الكربون المسيطر عليه، وعدم التسق في ارتفاع حرارة الوسط كمصادر للتغيرات التقنية التي يمكن تجنبها.
9. اختياري: الحفاظ على الزراعة المتطابقة تحت الأكسجين المحيط وقليل الأكسجين. حافظ على زراعة أقل من 21٪ O₂ وأقل من 5٪ O₂ كمجموعات منفصلة، والحفاظ على كل مجموعة تحت حالة الأكسجين المخصصة لها أثناء التعامل الروتيني مع الزراعة عند الإمكان. الحد من التعرض للأكسجين المحيط أثناء النقل والتحضير للتصوير للمجموعات منخفضة الأكسجين.
   ملاحظة: نقطة توقف عملية هي بعد تحديد وتثبيت مجموعات العبور المبكر والمتأخر والتأكد من أن ثقافات العبور المتأخر تظهر نموا بطئا مستمرا ومورفولوجيا مرتبطة بالشيخوخة.

3. تلوين الخلايا الليسوسومية والنووية الحية باستخدام LysoTracker Deep Red وصبغة نووية

1. ضع خلايا IMR-90 في جميع الظروف التجريبية في ألواح التصوير ذات القاع الشفاف أو الأطباق ذات القاع الزجاجي. تضمين حالة تحكم منخفضة الشيخوخة وحالة واحدة على الأقل عالية الشيخوخة تولدها المحفز المختار، وتشمل النسخ البيولوجية لكل حالة.
2. الخلايا البذرية لتحقيق طبقة أحادية متماسكة في يوم التلوين. سجل كثافة البذور والوقت بين الطلاء والتلوين لكل تجربة لدعم قابلية المقارنة بين المراحل والتشغيل.
3. حرارة دافئة كاملة للزراعة متوسطة إلى 37 درجة مئوية. جهز محلول عمل LysoTracker Deep Red عند 75 نانومتر في الوسط الدافئ وحمه من الضوضاء. يتم تحضير محلول العمل عن طريق تخفيف مخزن LysoTracker Deep Red بحجم 1 مللي متر (الذي توفره الشركة المصنعة في DMSO) بحجم 1:13,333 في وسط الزراعة الكاملة الدافئ (على سبيل المثال، 0.75 ميكرولتر من مخزون 1 مللي مول لكل 10 مل من الوسط المسخن).
   ملاحظة: تتراكم الخلايا المتأخرة في العبور والخلايا الشيخنة الناتجة عن الإجهاد ومواد فلورية ذاتية غير محددة أخرى تصدر عبر نطاقات موجية واسعة ويمكن أن تسهم في ظهور إشارة ليزوتراكر الظاهرة في عناصر التحكم غير المصبوغة¹⁴. لتقدير مساهمة التألق الذاتي في تجربة معينة، يجب تضمين بئر واحد على الأقل غير مصبوغ في كل حالة واكتسبه تحت نفس إعدادات التصوير. اطرح متوسط إشارة البئر غير الملونة من قياسات البئر المصبوغ، أو أبلغ عن القيم الخام والقابلة للبيع من الخلفية.
   ملاحظة: عمليا، إشارة قناة ليزوتراكر غير الملونة في ثقافات IMR-90 صغيرة مقارنة بإشارة الشدم الملونة (حوالي 5٪ إلى 10٪ من متوسط السن الملونة في هذه البيانات)، لكن المساهمة تزداد مع عدد الممرات ويمكن أن تصبح كبيرة (أكثر من 20٪) في الزراعة المتقدمة بعمق السن أو الجينات المسرحية ^6,14. تحقق دائما من مقدار التألق الذاتي عند اعتماد هذا البروتوكول لنوع خلية جديد أو نموذج الشيخوخة-الحث.
4. جهز محلول تشغيل كاف من LysoTracker لجميع الآبار التي ستتعرض للطخ. اخلط المحلول العامل بعكس لطيف وابق محميا من الضوء حتى الاستخدام.
5. استنشاق متوسط من كل بئر. أضف محلول LysoTracker العامل بلطف على طول جدار البئر لتجنب إزعاج الطبقة الأحادية والحفاظ على حجم تلوين ثابت عبر الآبار.
6. حضن الخلايا باستخدام LysoTracker لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ CO₂. حافظ على جميع المجموعات التجريبية تحت نفس مدة ودرجة حرارة الحضانة.
7. أضف صبغة نووية حية خلال آخر 10 دقائق من حضانة LysoTracker. أضف هوشت 33342 مباشرة إلى الوسط الذي يحتوي على ليزوتراكر بتركيز العمل الموصى به من الشركة المصنعة، على سبيل المثال 1 ميكروغرام/مل إلى 2 ميكروغرام/مل، وامزج اللوح بلطف بحركة خفيفة.
8. أزل وسط التلوين في نهاية الحضانة. شطف الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات مسبقا لتقليل التألق الخلفي.
9. أضف وسط زراعة خالية من الفينول الأحمر المسخن مسبقا أو محلول تصوير فوري بعد الشطف. تابع مباشرة إلى التصوير الحي وحافظ على وقت ثابت بين تبادل المخزن المؤقت والتقاط الصور عبر جميع الآبار في التجربة.
10. حماية الألواح من الضوء أثناء عمليات النقل وإعداد التصوير. تقليل الوقت الذي يقضيه خارج ظروف درجة الحرارة وCO₂ المحكومة أثناء التعامل والتقاط الصور.
    تحذير: تعامل مع الأصباغ الفلورية باستخدام القفازات وحماية العين. التخلص من السوائل التي تحتوي على الصبغة والمواد الاستهلاكية الملوثة وفقا لإجراءات السلامة الكيميائية المؤسسية.
    ملاحظة: استخدم نقطة توقف بعد الخطوة 3.9 إذا كان التصوير يتطلب ترتيب عدة صفائح. حافظ على حماية الألواح من الضوء عند 37 درجة مئوية واستأنف التصوير في أقرب وقت ممكن للحد من انحراف البقع.
    ملاحظة: إذا كان التصميم التجريبي يتضمن الأكسجين كمتغير، يجب الحفاظ على كل مجموعة تحت حالة الأكسجين المخصصة لها أثناء التلوين والحضانة، وتسجيل وقت التعامل خارج الحالة المخصصة.

4. تلوين SA-β-Gal للتحقق (اختياري)

1. استخدم تلوين SA-β-Gal كخطوة تحقق اختيارية للتأكد من أن حالة الشيخوخة العالية تظهر زيادة في نشاط SA-β-Gal مقارنة بالتحكم منخفض الشيخوخة. إجراء التحقق من صحة الآبار المتوازية المعالجة بنفس صيغة اللوحة وتحت نفس جدول التعامل مع آبار التصوير.
2. افحص التصوير الحي الكامل لآبار التحقق قبل التثبيت. عند المطابقة من قبل وبعد التثبيت المطلوبة، يرغب في مقارنات ما قبل وبعد التثبيت لنفس الحقل (الشكل 2)، سجل إحداثيات المرحلة عند الاستحواذ، وأعد تحديد موقع كل حقل يدويا بعد التثبيت والتلوين، وفحص الموقع النقطي وشكل الخلية بصريا للتأكد من تطابق الحقول المتطابقة قبل إدراجها في التحليل اللاحق.
3. تثبت الخلايا باستخدام محلول التثبيت المقدم في مجموعة التلوين SA-β-Gal المحضرة بتركيز عمل 1x الموصى به يحتوي على 2٪ فورمالديهايد و0.2٪ جلوتارالديهايد. حضن لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للمعلومية، يحتوي محلول التثبيت على 2٪ (w/v) فورمالديهيد و0.2٪ (w/v) جلوتارالديهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يحتوي محلول التلوين SA-β-Gal عند pH 6.0 على 1 ملغ/مل من X-gal (5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-D-جالاكتوبيرانوسايد) مذاب في ثنائي ميثيل فوراميد مباشرة قبل الاستخدام، و40 ملليموتر من حمض الستريك / فوسفات الصوديوم عند pH 6.0، 5 ملليمولار فيروسينيد البوتاسيوم، 5 ملليمولار فيريسيانيد البوتاسيوم، 150 ملليمولار NaCl، و2 ملليمولار MgCl^₂12,13. يمكن استخدام المجموعات التجارية التي تطابق هذه المواصفات بالتبادل، بشرط التحقق من درجة حموضة حاجز مخزن التلوين عند 6.0.
4. قم بإزالة المثبت وشطف الجيوب مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات. أضف محلول تلوين SA-β-Gal عند درجة حموضة 6.0 يحتوي على ركيزة X-جالون إلى كل بئر.
5. أغلق اللوح للحد من التبخر أثناء الحضانة. ضع اللوحة في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
6. افحص الآبار باستخدام المجهر البرايت فيلد ووثق نمط التلوين. احصل على صور ممثلة لكل حالة وأبلغ عن نسبة الخلايا الموجبة SA-β-Gal لكل بئر عند التحقق من صحة النتائج.
   تحذير: الفورمالديهايد والجلوتارالديهيد سامان ومتطايرتان. حضر واستخدم محلول تثبيت في غطاء بخار كيميائي وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك القفازات، واقي العين، ومعطف المختبر.
   ملاحظة: إذا أظهر تلوين SA-β-Gal خلفية عالية في التحكم منخفض الشيخنة أو ضعف التلوين في حالة الشيخوخة العالية، كرر التحقق بعد تعديل كثافة الطلاء ومدة التثبيت ومدة الحضانة وثبات درجة الحرارة مع الحفاظ على pH في المخزن عند 6.0.

النتائج

تطبيق هذا البروتوكول على الأرومات الليفية IMR-90 في ظروف الشيخوخة المنخفضة والعالية في الشيخوخة ينتج قراءات ليزوزومية كمية يمكن تلخيصها على مستوى الخلية الفردية، وعند الرغبة، على مستوى الحقل الكامل.

تستمد مجموعة البيانات الممثلة المعروضة في الأشكال والجداول من تجربة بيولوجية واحدة تقارن بين ثقافات IMR-90 في المقطع 13 (P13؛ انخفاض الشيخوخة، ~PDL 26) والمقطع 23 (P23؛ عالي الشيخوخة، ~PDL 46). تم تصوير بئرين لكل حالة، مع 44 حقلا تم الحصول عليه في كل بئر (176 حقلا ...

المناقشة

يصف هذا البروتوكول سير عمل تصوير الخلايا الحية يقيس الشيخوخة عبر إعادة تشكيل الليسوسوم، وينتج قراءات كمية لكل خلية ولكل بئر لعبء الشيخوخة. هناك عدة خطوات مهمة بشكل خاص للحصول على اختبار موثوق. أولا، يجب أن يكون النموذج البيولوجي نفسه تحت السيطرة الجيدة. يتطلب استثناء الشيخوخة المتكررة في الأرومات الليفية IMR-90 تتبعا دقيقا لتضاعف العدد والحفاظ على الثقافات المجرة المبكرة بالتوازي كمرجع غير شيخخ ^2,3,18...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
لوحة ثقافة الأنسجة ذات 24 بئر (قاع مسطح، معالجة بالثقافة الخلوية)	CellTreat Scientific Products	229124	أي لوحة ثقافة متعددة البئر ذات قاع شفاف متوافقة مع تصوير الخلايا الحية بالفلورية (على سبيل المثال، لوحات بوليسترين معالجة بالثقافة الخلوية بـ 6 أو 12 أو 24 بئر؛ قد تُفضل لوحات ذات قاع زجاجي لتصوير عالي الدقة).
مجموعة صبغة بيتا-جالاكتوسيداز (اختبار الشيخوخة)	Cell Signaling Technology	9860	أي مجموعة تجارية من SA-β-جالاكتوسيداز مع حاوية صبغة موثقة عند درجة حموضة 6.0. كمرجع، تحتوي محلول التثبيت على 2٪ فورمالدهايد و0.2٪ غلوتارالدهيد في PBS، ومحلول الصبغة يحتوي على 1 ملغ/مل X-gal في DMF، 40 ملي مولار سيترات/فوسفات عند درجة حموضة 6.0، 5 ملي مولار بوتاسيوم فيروكيانيد، 5 ملي مولار بوتاسيوم فيريكيانيد، 150 ملي مولار NaCl، 2 ملي مولار MgCl2.
BioRender (برنامج الرسوم التوضيحية العلمية)	BioRender	N/A — تطبيق ويب	يستخدم لإنشاء أشكال تخطيطية (الأشكال 1–3). https://www.biorender.com
غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2)، أسطوانة مضغوطة	Airgas (أو مورد مماثل)	N/A	ثاني أكسيد الكربون من الصف الطبي المستخدم للحفاظ على 5٪ من الغلاف الجوي في حاضنة زراعة الخلايا وغرفة التصوير على المسرح.
مصل البقر الجنيني (FBS)، غير نشط حرارياً	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	أي مصل من فئة زراعة الخلايا، غير نشط حرارياً عند 56 درجة مئوية؛ يستخدم بنسبة 10٪ حجمي في وسط الثقافة الكامل.
مجهر فلوري مع قدرة على تصوير الخلايا الحية	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	أي مجهر فلوري واسع المجال أو مجهر فلوري ليزري مع التحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون للخلايا الحية، ومجموعات فلاتر للقنوات البعيدة الحمراء (الإثارة ~647 نانومتر / الانبعاث ~670 نانومتر) وDAPI/Hoechst (الإثارة ~405 نانومتر / الانبعاث ~460 نانومتر)، وعدسة 20×-40× مع NA كافٍ لتحديد ملامح الليزوزومات. تم استخدام نظام التصوير EVOS M7000 في هذه الدراسة.
صبغة هوشست 33342 النووية	Thermo Fisher Scientific	H3570	صبغة DNA قابلة للاختراق الخلوي لصبغة النواة الحية (تألق أزرق، الإثارة ~405 نانومتر). غير قابلة للتبديل مع DAPI، التي ليست قابلة للاختراق الخلوي تحت الظروف الفسيولوجية.
برنامج تحليل الصور	مؤسسة برمجيات Python	N/A	أي بيئة حسابية علمية تدعم فصل النواة، وتوسيع منطقة النواة إلى الخلية، وتحديد العتبة الشديدة، والإحصائيات الأساسية للصورة (على سبيل المثال، Python مع scikit-image، MATLAB، ImageJ/Fiji، CellProfiler). تم تطوير خط أنابيب SenTrack (انظر الملف التكميلي S1) لهذه الدراسة.
خلايا ليفية رئوية بشرية IMR-90 (سلالة خلوية)	ATCC	CCL-186	سلالة خلوية ليفية جنينية ثنائية العدد طبيعية من الرئة البشرية المستخدمة لنمذجة الشيخوخة التكاثرية؛ يمكن استبدال أي سلالة ليفية بشرية مميزة مماثلة.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	صبغة فلورية حمضية لصبغة الخلايا الحية للأعضاء الحمضية؛ مقدمة كتركيز 1 ملي مولار في DMSO. التركيز الفعّال هو 75 نانو مولار في وسط ثقافة الخلايا المُعد. الانبعاث البعيد الأحمر (الإثارة 647 نانومتر / الانبعاث 668 نانومتر) يقلل من التداخل مع التألق الذاتي للليبوفوسين لكنه لا يزيله.
المتوسط الأساسي الأدنى (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	وسط زراعة أساسي للخلايا الليفية IMR-90؛ مضاف إليه 10٪ FBS و1٪ بنسلين-ستربتومايسين. يمكن استبداله بأي تركيبة قياسية من وسط Eagle الأدنى الأساسي مع ملح Earle وL-جلوتامين.
محلول البنسلين-ستربتومايسين (100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	مكمل مضاد حيوي للوسط الثقافي الكامل؛ يستخدم بنسبة 1٪ حجمي (التركيز النهائي 100 وحدة/مل بنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين). يمكن استبداله بأي محلول بنسلين-ستربتومايسين قياسي.
وسط تصوير خالٍ من الفينول الأحمر	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	DMEM أو HBSS خالٍ من الفينول الأحمر يستخدم لتصوير الخلايا الحية لتقليل التألق الخلفيّ أثناء التصوير. FluoroBrite DMEM هو أحد الخيارات الشائعة الاستخدام؛ يمكن استبداله بأي عازل تصوير خالٍ من الفينول المضاف إليه 10٪ FBS.
محلول فوسفات عازل (PBS)، درجة حموضة 7.4 (1×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	محلول عازل متساوي التوتر لتنظيف الخلايا وتخفيف الكواشف؛ يمكن استبداله بأي PBS 1× معقم عند درجة حموضة 7.4.
SenTrackLite v0.5.0 (برنامج)	مصدر مفتوح (Estrada / Melendez Lab)	v0.5.0	تطبيق Python / Tkinter مفتوح المصدر بملف واحد لتحليل صورة الشيخوخة الليزوزومية. يوزع كملف تكميلي S1. مؤرشف في Zenodo، doi:10.5281/zenodo.19701255. رخصة MIT. المصدر: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
غرفة بيئية على المسرح	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	غرفة بيئية للتصوير الحي على المجهر مع التحكم في درجة الحرارة (37 درجة مئوية) وثاني أكسيد الكربون (5٪). تم استخدام حاضنة EVOS Onstage في هذه الدراسة؛ يمكن استبدالها بأي حاضنة مكافئة على المسرح.