يؤسس هذا البروتوكول نظام زراعة رئة ديناميكية على شريحة يجمع بين خلايا بطانة الأوعية النفسية الدقيقة في مجرى الهواء الأولي والخلايا البطانية الميكروأوعية الدموية الرئوية لنموذجين: نموذج الصحة ونموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). يقوم النظام بإنتاج تفاعلات مجرى الهواء والأوعية الدموية تحت واجهة الهواء والسائل وتدفقها، ويوفر تقييم الحواجز، والنمذجة الظاهرية للخلايا، وتحليل الحمض النووي الريبي.
مقالة منهجية
إنشاء زراعة رئة على شريحة لزراعة الظهارة والبطانة للفحص في الحالات الصحية ومرض الانسداد الرئوي المزمن
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم تطوير نموذجين ديناميكيين للزراعة المشتركة للرئة على شريحة لإعادة إنشاء الواجهة بين مجرى الهواء والأوعية الدموية من خلال دمج خلايا بطانة الشهية الظهارية الأولية والخلايا البطانية الدقيقة الرئوية. يستخدم نموذج واحد خلايا متاحة تجاريا من متبرعين أصحاء، بينما يستخدم الآخر خلايا مشتقة من مرضى مرض انسداد رئوي مزمن (COPD)، مما يتيح المقارنة المباشرة بين الحالات الصحية والحالة المريضة تحت ظروف زراعة متطابقة. يدعم كلا النموذجين التمايز الظهاري تحت الظروف المستمرة للتروية وواجهة الهواء والسائل (ALI)، مما يؤدي إلى وجود حاجز ظهاري ذو صلة فسيولوجية مدعوم بطبقة بطانية تحتية. يشمل سير العمل طلاء المصفوفة خارج الخلية، وزرع الخلايا، وإنشاء ALI، وتقييم وظيفة الحاجز، وتركيب ظاهرة الخلية، واستخراج RNA حسب نوع الخلية. أظهرت اختبارات النفاذية سلامة الحاجز القوي في كلا النظامين، بينما أكدت الفلورة المناعية وجود توطين مستمر لزونولا أوكلودينز-1 (ZO-1) وكاديرين بطانة الأوعية الدموية (VE-كاديرين) عند وصلات الخلايا. تم تأكيد التمايز الظهاري من خلال تلوين β-التيوبولين الوريدي وتصوير ضربات الهدب. تم الحصول على RNA عالي الجودة بشكل منفصل من كل قسم، داعما للتحليلات الجزيئية الخاصة بنوع الخلية. استعاد نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن السمات الرئيسية للمرض، لا سيما زيادة إنتاج المخاط، دون المساس بوظيفة الحاجز أو قدرة الخلايا. يحافظ استخدام الخلايا الطهارية والبطانية المشتقة من المريض على خصائص مرضية فردية، مما يمكن من دراسة الآليات بين الخلايا في مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). يوفر هذا النهج بديلا فسيولوجيا ذا صلة للنماذج الثابتة في المختبر والحيوانات، ويدعم الدراسات ما قبل السريرية للأدوية المستنشقة، والتعرض للممرضات، والتفاعلات بين الظهارة والبطانة. من المهم أن نماذج الرئة الصحية ومرض الانسداد الرئوي المزمن يمكن استخدامها إما معا في الدراسات المقارنة المباشرة أو بشكل مستقل في التحقيقات الميكانيكية، والاختبارات العلاجية، واكتشاف الأدوية. يمكن أيضا تكييف النظام لحالات تنفسية أخرى تتضمن تغييرات في أقسام الظهارة أو البطانة، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات وقابلة للترجمة لأبحاث الجهاز التنفسي.
المقدمة
يعد التفاعل بين خلايا الظهارة في مجرى الهواء وخلايا البطانة الوعائية الدقيقة الرئوية ضروريا للحفاظ على توازن الرئة وتنسيق الاستجابات للإصابة والعدوى والالتهابات. معا، تشكل هذه الأنواع حاجزا وظيفيا ينظم تبادل الغازات، والمراقبة المناعية، ونفاذية الأوعية الدموية. تشمل التفاعلات الديناميكية بينهما إشارات باراكرين، وتفاعلات مباشرة بين الخلايا والخلية، والاستجابة للمحفزات الميكانيكية، وكلها ضرورية لوظيفة الرئة وسلامة البنية1.
في مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، وهو اضطراب رئوي تقدمي يتميز بالالتهاب المزمن، وإعادة تشكيل مجرى الهواء، وتدمير واجهة السنيخ الهوائية-الشعيرات الدموية، تتأثر وظيفة الحاجز لكل من ظهارة مجرى الهواء وبطانة الأوعية الدموية الرئوية وتصاحبها إفراز خلوي للسيتوكينوآليات إصلاح الأنسجة غير منظمة.. ومع ذلك، لا يزال التفاعل بين الخلايا الطهارية في مجرى الهواء والخلايا البطانية الدقيقة الرئوية غير مفهوم جيدا. يرجع هذا القيد جزئيا إلى أوجه القصور الموجودة في النماذج المخبرية والموجودة في الجسم الحي. على الرغم من أن نماذج الحيوانات قدمت رؤى مهمة حول فسيولوجيا الجهاز التنفسي والأمراض، إلا أن أهميتها محدودة بسبب اختلافات الوظائف المناعية، وبنية الرئة، وإشارات الخلايا، واستقلاب الأدوية، مما قد يعيق الترجمة إلى علم الأحياء البشري.
الأنظمة التقليدية في المختبر، مثل الزراعة ثنائية الأبعاد (2D) لخطوط الخلايا الظهارية الخالية في مجرى الهواء الخالدة، تفشل في إعادة تلخيص السمات الرئيسية لظهارة مجرى الهواء، بما في ذلك التمايز الصحيح والاستجابة البيوميكانيكية. على الرغم من أن الزراعة الأحادية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للهواء-السائل (ALI) لخلايا مجرى الهواء الظهاري الأولية تحسن الصلة الفسيولوجية، إلا أنها تظل ثابتة وتفتقر إلى التفاعل مع أنواع الخلايا الأخرى والمحفزات الميكانيكية4. الرئة عضو ديناميكي يتعرض باستمرار لتدفق الهواء، وإجهاد القص، وتيبس المصفوفة خارج الخلية، والتمدد الدوري الناتج عن التنفس. تؤثر هذه العوامل بشكل كبير على سلوك الخلايا وإعادة تشكيل الأنسجة5. لذلك، فإن النماذج الثابتة غير كافية لتكرار عمليات مثل التصاق كريات الدم البيضاء وتجارة الخلايا المناعية والاستجابات الفورية للتعرض للأدوية.
ولمعالجة هذه القيود، ظهرت منصات العضو على الشريحة كأنظمة متقدمة لنمذجة التفاعلات الخلوية المعقدة. تدمج نماذج الرئة على شريحة تقنية الميكروفلويديك مع الخلايا المشتقة من الإنسان لتكرار الميزات الهيكلية والميكانيكية الرئيسية للبيئة الدقيقة للرئة. تمكن هذه المنصات من الزراعة المشتركة لخلايا بطانة مجرى الهواء الظهارية وخلايا البطانة الوعائية الرئوية ضمن بيئة ديناميكية ثلاثية الأبعاد تشبه بشكل أوثق الحالات الحية 6. يعزز دمج حركات التنفس الفسيولوجية، وتدفق السوائل، والمراقبة الفورية دراسة التواصل بين الظهارة والبطانة تحت الحالات الطبيعية والمصاب بالأمراض من7 إلى 9.
على الرغم من هذه التطورات، تعتمد معظم أنظمة الرئة على شريحة على خلايا مشتقة من متبرعين أصحاء10، مما يحد من قدرتها على نمذجة التفاعلات الخاصة بالأمراض. بالإضافة إلى ذلك، تفتقر العديد من المنصات إلى المرونة في دمج الخلايا المشتقة من المريض أو إعادة خلق البيئة الدقيقة المعقدة لمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). علاوة على ذلك، لا تزال البروتوكولات التفصيلية للزراعة المشتركة لخلايا الممر التنفسي الأولي الظهارية والخلايا الدقيقة الوعائية الرئوية — سواء من مصادر تجارية أو من مرضى مرض الانسداد الرئوي المزمن — باستخدام طلاءات مصفوفة خارج الخلية (ECM) الخاصة بنوع الخلية محدودة.
في هذه الدراسة، تم استخدام منصة رئة ميكروفلوئية ذات قناتين متوفرة تجاريا لإنشاء نموذجين للزراعة المشتركة يتضمنان خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة في مجرى الهواء الأولي والخلايا الوعائية الدقيقة الرئوية. تم إنشاء نموذج صحي باستخدام خلايا متاحة تجاريا مشتقة من متبرعين مختلفين، بينما تم إنشاء نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن باستخدام خلايا ظهارية وبطانة الهواء تم الحصول عليها من نفس المريض. كلا النموذجين يستخدمان طلاء ECM مخصص لنوع الخلية لمحاكاة بيئة الرئة الدقيقة في الجسم الحي. تمكن هذه الأنظمة من دراسة التفاعلات الظهارية مع البطانة تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. يمكن استخدام نماذج الصحة ومرض الانسداد الرئوي المزمن إما معا في الدراسات المقارنة المباشرة أو بشكل مستقل في التحقيقات الميكانيكية والاختبارات العلاجية.
يعكس هذا النظام التعاوني التنظيم التشريحي لظهارة مجرى الهواء والأوعية الدموية الرئوية، والتي تعمل كوحدة متكاملة بين الظهارة والبطانة. ظهارة مجرى الهواء هي طبقة شبه طبقية تتكون من خلايا قاعدية وإفراز وهدبية، تقع فوق طبقة نسيج ضامة وعائية (lamina propria) وتفصل عن البطانة بواسطة غشاء قاعدي. في هذا النموذج، يقارب طلاء ECM (الكولاجين النوع الأول، الفيبرونكتين، واللامينين) تركيب أغشية القاعدة الطهارية والبطانية. الغشاء المسامي الذي يفصل القناتين يحاكي النسيج الضام تحت الظهارة، رغم أنه يفتقر إلى تعقيد الأوعية الدموية. تساهم آليات متعددة في التواصل بين الظهارة والبطانة، بما في ذلك الإشارات الباراكرينية، والتنظيم المنسق للنفاذية، وتجنيد الخلايا المناعية، والاستجابة للمحفزات الميكانيكية مثل التمدد الناتج عن التنفس، والتي تؤثر على مقاومة الأوعية الدموية ومسارات النقل الميكانيكي.
توضح هذه الدراسة المنهجية الخطوات اللازمة لتأسيس ظهارة مجرى هوائي متمايزة بالكامل تحت ظروف واجهة هواء-سائل (ALI) مع بطانة رئوية دقيقة في الأوعية الدموية الدقيقة. يتيح النظام التقييم النوعي والوظيفي لسلامة الحواجز، محققا قيم قابلة لإعادة إنتاج النفاذية الظاهرة (Papp) ≤ 1 × 10⁻6 سم/ثانية. بالإضافة إلى ذلك، تم توفير بروتوكولات لتحديد النمط الظاهري للخلية ولاستخراج وقياس الحمض النووي الريبي من كل قسم، مما ينتج باستمرار RNA عالي الجودة (رقم سلامة RNA > 7). هذه الطريقة ليست مخصصة للتحليل الكمي للرنا الريبي أو التقييم التفصيلي لإنتاج المخاط، ولا تحقق في تأثيرات التمدد الميكانيكي، رغم أن مثل هذه التطبيقات ممكنة بهذا النظام.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع استخدامات الخلايا البشرية الأولية من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية للأبحاث في جامعة UZ Leuven (S51577/S57114/S70453). تم الحصول على خلايا ظهارية الشعب الهوائية البشرية الأولية (HBEC) وخلايا البطانة الوعائية الدقيقة الرئوية (HPMEC) المتوفرة تجاريا من متبرعين غير مدخنين (الجداول التكميلية 1، 2). تم عزل الخلايا الأولية لنموذج الانسداد الرئوي المزمن من أنسجة رئة مزروعة لثلاثة مرضى لديهم تاريخ التدخين (الجدول التكميلي 3)، وفقا لبروتوكول راسخ جيدا (الموافقة الأخلاقية S51577) وتم تخزينها في بنك BREATHE الحيوي. تم الحصول على كل من HBEC وHPMEC من نفس مريض مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD).
لتأسيس نموذج الرئة الصحي على الشريحة، تم استخدام HBEC التجاري وHPMEC. في نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، تم عزل خلايا بطانة الشعب الهوائية الأولية والخلايا البطانية الدقيقة الوعائية الرئوية من نسيج رئوي مقطوع تم الحصول عليه من نفس المريض بعد زراعة الرئة. نظام الرئة على الشريحة المستخدم في هذه الدراسة هو منصة ميكروفلويدية ثنائية القناة تتكون من قنوات هوائية متوازية (علوية) وقنوات وعائية (سفلية) مفصولة بغشاء مسام مغطى بالمصفوفة خارج الخلية (الشكل 1). تم استخدام نفس البروتوكول لبناء نماذج صحية ونماذج مرض الانسداد الرئوي المزمن معا. المواد الكيميائية والكواشف والمجموعات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في جدول المواد.
1. إنشاء نماذج الزراعة المشتركة للرئة على شريحة تحت التدفق الطبقي
- تحضير الرقائق
- ضع حامل الرقائق في طبق زراعة خلايا مربعة بحجم 120 مم، مع مواجهة الزوايا للأعلى، لضمان الاتجاه الصحيح، ثم ضع الرقائق في الحاضن. تأكد من وضع جميع الشرائح بشكل صحيح قبل خطوة التفعيل (الشكل 2).
- تحضير محلول التنشيط عن طريق إذابة مسحوق كاشف التنشيط في المخزن المقابل له، وكلاهما يزودهما المصنع، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.5 ملغ/مل.
- تنشيط الأسطح الداخلية لقنوات الشريحة لتعزيز الارتباط بالمصفوفة خارج الخلية (ECM) عن طريق إدخال حوالي 35 ميكرولتر من محلول التنشيط بحذر عبر مدخل القناة السفلية. تقطع حتى يبدأ المحلول بالخروج من مخرج القناة السفلية. كرر العملية بإدخال حوالي 50 ميكرولتر من المحلول في مدخل القناة العليا.
ملاحظة: مسحوق كاشاف التنشيط حساس للضوء. جهز محلول التفعيل مباشرة قبل الاستخدام وتخلص من أي محلول متبقي بعد ساعة من إعادة البناء. - قم بإزالة كل محلول التنشيط الزائد من سطح الشريحة عن طريق الشفط الخفيف. تأكد فقط من إزالة محلول التنشيط من سطح الشريحة — لا تسحب المحلول من القنوات.
ملاحظة: قبل تنشيط الأشعة فوق البنفسجية (UV)، فحص القنوات تحت المجهر للكشف عن الفقاعات. إذا كانت هناك أي فقاعات، قم بإزالتها بلطف بمحلول التفعيل حتى تتم إزالة جميع الفقاعات. - عرض الشرائح لمصباح UV لمدة 10 دقائق، ثم اغسل كل قناة مرتين ب 200 ميكرولتر من المخزن المقابل.
- يقوم محلول التفعيل الجديد من Pipette في كلا القناتين كما هو موضح أعلاه ويعرض الشرائح للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق إضافية.
- استنشق المحلول بالكامل من كلا القناتين، وغسل كل قناة مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المناسب، ثم غسل كل قناة مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من محلول ملحي معقم معقم بالفوسفات البارد بدون Ca2⁺ و Mg2⁺ (DPBS -/-).
- حضر محلول طلاء ECM في DPBS (-/-) يحتوي على كولاجين بشري من النوع الأول (100 ميكروغرام/مل)، وفيبرونكتين بشري (50 ميكروغرام/مل)، ولامينين بشري (50 ميكروغرام/مل). استخدم 100 ميكرولتر من المحلول كحجم مرجعي لكل شريحة.
- أضف 50 ميكرولتر إلى القناة العلوية و35 ميكرولتر إلى القناة السفلية، مع استنشاق التدفق الخارج عبر منافذ المخرج.
ملاحظة: افحص القنوات تحت المجهر للكشف عن أي فقاعات. إذا كانت موجودة، اغسله بلطف باستخدام محلول ECM لإزالتها. - اترك قطرات صغيرة من محلول ECM على منفذي القناة وفتحة الخروج لمنع التبخر أثناء الحضانة الليلية (ON).
- حضن الرقائق على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، استنشق محلول ECM وغسل القناتين ب 200 ميكرولتر من DPBS المسخن مسبقا (-/-) عند 37 درجة مئوية.
- البذر الخلوي والزراعة المغمورة
توسيع HBEC في قوارير T25 سم2 مغطاة بالكولاجين البشري من النوع الرابع (150 ميكروغرام/مل في DPBS (-/-)) باستخدام وسط تمدد خلايا الظهارة في مجرى الهواء حتى يصل إلى 60٪–70٪ من التقاء الجسم.
بالتوازي، قم بتوسيع HPMEC في قوارير T75 سم2 مغطاة بالجيلاتين (2 ملغ/مل في DPBS (-/-)) باستخدام وسط نمو الخلايا البطانية (EC) حتى يتم الوصول إلى 90٪–100٪ التلاقي.
راجع الجدول التكميلي 4 لتركيب المواد الكيميائية الرئيسية ووسائط الثقافة. - زرع HPMEC
- استنشق الوسيط. غسل الخلايا ب 10 مل DPBS (-/-).
- أضف 3 مل من TRYPSIN-EDTA بنسبة 0.25٪ (1X). حضن لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة (RT).
- أضف 12 مل من وسط نمو EC (4× حجم التربسين المستخدم) لتعطيل التربسين. أضف 5 مل من وسط نمو EC لجمع أي خلايا متبقية (الحجم النهائي = 20 مل).
- أكد الانفصال الكامل للخلايا تحت المجهر.
- خذ ~20 ميكرولتر لعد الخلايا الحية باستخدام تريبان بلو.
- قم بعمل جهاز تعليق خلية الحمل بالطرد المركزي عند 900 × جرام لمدة 5 دقائق عند RT في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل.
- أعد تعليق الحبيبات في وسط نمو EC. عدل إلى 7 × 10خلايا /مل.
- البذور HPMEC (الممر 5) إلى القناة السفلية (~20 ميكرولتر؛ 1.4 × 105 خلايا/قناة).
- اقلب الرقائق فورا واحتضن لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ (الشكل 3).
- أعد الشرائح إلى الوضع الأصلي.
- اغسله بوسط نمو EC دافئ بسعة 200 ميكرولتر (37°م).
- تحقق من التثبيت تحت المجهر. قم بتمديد فترة الحضانة إذا لزم الأمر.
- زرع HBEC
- استنشق الوسيط. اغسل ب 5 مل DPBS دافئ (-/-).
- أضف 1 مل من التربسين. حضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
- راقب الانفصال تحت المجهر.
- أضف مثبط التربسين المحدد بمقدار 1 مل بنسبة 1:1 لتعطل التربسين.
- أضف وسط تمدد خلايا الظهارة بطول 8 مل (الحجم النهائي = 10 مل).
- انقله إلى أنبوب بسعة 50 مل.
- خذ ~20 ميكرولتر لعد الخلايا باستخدام تريبان بلو.
- قم بجهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية المتبقي عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق عند RT.
- تخلص من السوبرناتانت.
- أعد تعليق الحبيبة في وسط تمدد خلايا الظهارة في مجرى التنفس. عدل إلى 3.5 × 106 خلايا/مل.
- قم بإضافة حمض الريتينويك الصناعي المستقر للضوء بقوة 50 نانوميل وعامل نمو بشري بشري مؤتلف (rhEGF) في وسط تمدد خلايا الظهارة في مجرى الهواء بقوة 50 نانوملتر وعامل نمو بشري بشري مؤتلف (rhEGF).
- بذرة HBEC (الممر 2) إلى القناة العليا (~35 ميكرولتر؛ 1.2 × 105 خلايا/قناة).
- الحضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (الشكل 4).
- استبدل الوسط في كلا القناتين.
- حضن البيت طوال الليل تحت ظروف ثابتة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، استخدم فقط الوسط المزيل من الغازات في جميع الخطوات. يجب إجراء إزالة الغازات باستخدام وحدة ستيري فليب متصلة بنظام فراغ لتقليل خطر تكون الفقاعات في الشريحة.
- الاتصال بالتدفق
- أضف وسط تمدد ظهاري دافئ (37°C) مع إضافة حمض الريتينويك الصناعي المستقر للضوء وrhEGF إلى خزان المدخل العلوي.
- أضف وسط نمو EC دافئ (37°C) إلى خزان المدخل السفلي.
- املأ كل خزان مدخل بمتوسط 3 مل وكل خزان مخرج بسعة 300 ميكرولتر.
- ضع الوحدات المحمولة داخل وحدة الزراعة (الشكل 5).
- اضغط على القرص لتحديد دورة "برايم" باستخدام القرص الدوار.
- اضغط على القرص لبدء الدورة.
- اترك الدورة تعمل (~1 دقيقة).
- افحص قاع كل وحدة بحثا عن قطرات في جميع المنافذ السائلة الأربعة.
- كرر دورة "برايم" إذا لم تكن القطرات مرئية.
- اغسل قناتي الشريحة مرة واحدة بالوسط المناسب.
- اترك قطرة على كل مدخل ومخرج لمنع تكون الفقاعات.
- أمسك الشريحة في اليد المسيطرة والوحدة المحمولة في اليد الأخرى.
- قم بإدخال الشريحة في القضبان حتى تستقر تماما.
- ضع الوحدة المجمعة في وحدة الزراعة.
- اضبط معدل التدفق إلى 30 ميكرولتر/س لكلا القناتين باستخدام القرص الدوار.
- الحفاظ على ظروف الواجهة بين السائل والسائل (LLI).
- حافظ على الشرائح في الوحدة تحت واجهة سائل-سائل (LLI) للسماح بتكوين الطبقات الظهارية والبطانية بشكل منتظم
- استبدل المتوسط كل 3 أيام. وسط سحب من خزانات المخرج. أضف 3 مل من الوسط الطازج إلى كل خزان مدخل.
ملاحظة: راقب الفقاعات تحت المجهر. إذا كان موجودا، افصل الشريحة، وقم بغسل القنوات بالوسط، ثم أعد توصيله.
- تمايز الخلايا الظهارية وزراعة واجهة سائل الهواء
- راقب الخلايا يوميا تحت المجهر.
- تأكيد تكوين طبقة خلايا ظهارية متجانسة بدون فجوات (عادة 3–5 أيام).
- إنشاء واجهة الهواء والسائل (ALI).
- استنشق وسط من خزانات المدخل والخروج العلوية.
- قم بتنظيف الوسط المتبقي من القناة العلوية عن طريق زيادة معدل التدفق إلى 600 ميكرولتر/ساعة باستخدام قرص القرص الدوار
- الوسط السريع من خزانات المخرج العلوية.
- سحب وسط من خزانات السحب السفلية.
- أضف 3 مل وسط تمايز ظهاري مع مكمل 10 نانوغرام/مل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) و1 ميكروغرام/مل فيتامين C.
- اضبط القناة العلوية على "الهواء" باستخدام القرص الدوار.
- اضبط معدل تدفق القناة السفلية إلى 30 ميكرولتر/ساعة.
- حافظ على ثقافة ALI لمدة أسبوعين.
- راقب تطور التمايز الظهاري تحت المجهر.
- تأكيد تكوين ظهارة شبه طبقية. راقب ضربات الأهداب وإنتاج المخاط.
- مراقبة شكل خلايا البطانة في مناطق الدخول والمخرج.
الشكل 1: منصة الرئة الميكروفلويدية على الشريحة. المقطع العرضي (اليسار) والمنظر العلوي (يمين) لجهاز الرئة الميكروفلويدية ذو القناتين على شريحة. تم توفير الرسوم التوضيحية لأغراض توضيحية فقط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: وضع الشريحة في حامل الشريحة. صورة تمثيلية تظهر الاتجاه الصحيح لحاملة الشريحة ومكان الشريحة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: بذور الخلايا البطانية في شريحة الميكروفلويد. صور مميزة تمثيلية لخلايا البطانة الوعائية الدقيقة الرئوية مباشرة بعد البذر (A) وبعد ساعتين من الحضانة (B). شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: بذر خلايا الظهارة في المجرى الهوائي في الشريحة الميكروفلويدية.
صور مميزة لخلايا ظهارية مجرى الهواء مباشرة بعد البذر (A) وبعد 4 ساعات من الحضانة (B). شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تكوين نظام الرئة الميكروفلويدية على الشريحة.
يظهر الجزء العلوي من الشكل الوحدة المحمولة التي تحتوي على أربعة خزانات (مدخلان ومخربان) تستخدم لتوفير المصادر المتوسطة وجمع المياه. الجهاز الميكروفلويديك متصل بوحدة زراعة تنظم معدلات التدفق وإلى وحدة محور توفر الغاز والهواء والطاقة. يتم توفير التمثيل التخطيطي لأغراض توضيحية فقط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2. تقييم سلامة الحاجز
تم تقييم سلامة الحاجز بطريقتين: أولا، وظيفيا، من خلال تقييم نفاذية الدكستران الموسوم بالفلورية مع مرور الوقت (قبل ALI وبعد 10 أيام من ALI)، وثانيا، نوعيا، من خلال الكشف المناعي عن Zonula Occludens-1 (ZO-1) في ظهارة الشعب الهوائية وكاديرين البطانة الوعائية (VE-cadherin) في بطانة الأوعية الدموية الرئوية.
- دالة الحاجز
- تحت التدفق الطبقي، أضف 1 مل من وسط التمايز الظهاري مع تغذية VEGF وفيتامين C ويحتوي على 100 ميكروغرام/مل دكستران موسوم بالفلورية إلى خزان المدخل العلوي لقناة الهواء. في الوقت نفسه، أضف 1 مل من وسط خال من التتبع إلى خزان السحب السفلي للقناة الوعائية.
- أدخل الوسط الذي يحتوي على التتبع إلى القناة العلوية. باستخدام قرص الدوران، اضبط معدل التدفق في كلا القناتين إلى 600 ميكرولتر/ساعة لمدة 3 دقائق، ثم استنشق وسط من خزانات المخرج العلوي والسفلي.
- ضع الشريحة، المتصلة بالوحدة المحمولة، مرة أخرى في وحدة الزراعة. باستخدام القرص الدوار، ضبط كلتا القناتين على معدل تدفق 45 ميكرولتر/ساعة وحافظ على معدل التدفق هذا لمدة 3 ساعات.
- اجمع 100 ميكرولتر من الوسط من خزانات المخارج العلوية والسفلية وقس شدة الفلورة باستخدام قارئ اللوحات.
- احسب النفاذية الظاهرة (Papp) باستخدام معادلة النفاذية:
حيث تمثل SA مساحة سطح قناة الزراعة المشتركة (0.17 سم2)، وQR و QD تشير إلى معدلات تدفق السائل في قنوات الجرعة والاستقبال على التوالي (سم3/ث) وCR,0 و CD,0 تتوافق مع التركيزات المستخرجة في قنوات الجرعة والاستقبال على التوالي.
ملاحظة: قيمة Papp أقل من 1 × 10-6 سم/ث تشير إلى سلامة الحاجز القوية، مما يعكس نفاذية منخفضة لطبقة الظهارة على المتتبع. يتم تحديد هذا الحد من قبل مصنع النظام كإجراء داخلي لمراقبة الجودة.
- الكشف المناعي للوصلات الضيقة والالتصقة
- بعد أسبوعين من ALI، قم بإزالة الشريحة بعناية من الوحدة المحمولة.
- ثبت الخلايا بإضافة 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) إلى القناتين لمدة 20 دقيقة عند RT.
تحذير: PFA سام؛ قم بجميع الخطوات باستخدام غطاء بخار كيميائي معتمد. - اغسل القناتين مرتين ب 200 ميكرولتر من DPBS (-/-) واحتفظ بالرقائق عند 4 درجات مئوية حتى تصبغ.
- قم بنفخ الخلايا بإضافة 50 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 في DPBS (-/-) لمدة 5 دقائق عند RT. ثم أقوم بكتلة ب 50 ميكرولتر 0.1٪ Triton X-100 في DPBS (-/-) يحتوي على 10٪ مصل ماعز، لكل قناة لمدة ساعة واحدة في RT.
- حضن القناة العلوية (الظهارية القصبية) ب 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي وحيد النسيلة المضاد للإنسان ZO-1 (1:100)، وفي القناة السفلية (بطانة الأوعية الدموية الرئوية) ب 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي وحادي النسيلة للأرنب المضاد للإنسان VE-كاديرين (1:600).
- تخفيف كلاهما في محلول الأجسام المضادة (0.1٪ ترايتون X-100 في PBS (-/-) مع 1٪ مصل ماعز) وحضن ON عند 4°C تحت ظروف ثابتة.
- اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من DPBS (-/-). ثم حضن كل قناة لمدة ساعة واحدة في RT مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المتقاربة بالفلوروفور المخففة في محلول الأجسام المضادة (1:500): الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر للماعز في القناة العلوية والأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب في القناة السفلية.
- اغسل القناتين ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر DPBS (-/-). قم بإجراء تلوين نووي ب 50 ميكرولتر لكل قناة من 4′,6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI، 1 ميكروغرام/مل في DPBS (-/-)) لمدة 10 دقائق عند RT.
- قم بغسل نهائي ب 200 ميكرولتر من DPBS (-/-) وتخزين الشريحة في DPBS (-/-) عند 4°C في الظلام حتى التصوير.
- صور الشرائح على أغطية الغطاء (20x60 مم بسماكة 0.16-0.19 مم) باستخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بوحدة قرص دوارة، وكاميرا عالية الحساسية، وهدف 20X (NA 0.8). استخدم برامج التقاط وتحليل الصور المناسبة للمعالجة اللاحقة.
3. التصنيف الظاهري
- تحضير أقسام الرقائق
- أصلح الشرائح بنسبة 4٪ PFA كما هو موضح في القسم 2.2.2.
- اقطع البولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) المحيط من الشريحة باستخدام شفرة حلاقة.
- املأ القناتين ب 50 ميكرولتر من أجاروز منخفض الانصهار بنسبة 2٪ في DPBS (-/-)، ودع الأغاروز يتصلب عند RT.
- اقطع الشريحة عرضيا إلى نصفين باستخدام شفرة حلاقة، وغرس كل نصف في وسط تثبيت بدرجة حرارة القطع المثلى (OCT) وخزن عند −80 درجة مئوية حتى يتم تقسيمه.
- التجميد
- جهز كريوستات واقطع مقاطع تجميد بطول 200 ميكرومتر من أنصاف الشرائح.
- اجمع مقاطع الرقائق باستخدام الملقط في آبار من صفيحة مكونة من 48 بئر مملوءة ب DPBS (-/-) وخزنها عند 4 درجات مئوية حتى تصبح مصبوغة المناعة.
- التلوين المناعي الفلوري
ملاحظة: قم بتنفيذ كل خطوة في صفيحة ال48 بئرا، باستخدام 400 ميكرولتر كحجم مرجعي.- قم بنفاذ الخلايا ومنع الارتباط غير النوعي كما هو موضح سابقا في القسم 2.2.4.
- حضن كل قسم ON عند 4°C مع الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالخلايا الهدبية الظهارية (β-tubulin IV، 1:2000) أو لخلايا البطانة (CD31، 1:25)، مخففة في محلول الأجسام المضادة (0.1٪ Triton X-100 في DPBS مع 1٪ مصل الماعز).
- اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام DPBS (-/-).
- حضن مقاطع لمدة ساعة واحدة في العلاج التدريجي مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة للفأر الماعز المتقاربة بالفلور (1:500) ل β-توبولين IV وCD31، مخففة في محلول أجسام مضادة محمية من الضوء.
- اغسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام DPBS (-/-)، وقم بالتلوين النووي باستخدام DAPI (1 ميكروغرام/مل في DPBS (-/-)) لمدة 10 دقائق عند RT.
- اغسل الأقسام مرة واحدة باستخدام DPBS (-/-) قبل التركيب.
- باستخدام الملقط، ضع فاصلا واحدا على كل شريحة مجهر، ثم ضع قسما في المنتصف. أضف 1–2 قطرة من وسط التثبيت وضع غطاء دائري.
- اتركها تجف في الظلام عند RT، ثم أغلقي حواف الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
- خزن الشرائح عند 4°C في الظلام حتى يتم تصويرها.
- صور أقسام الشرائح باستخدام مجهر فلوري مقلوب، مزود بوحدة قرص دوارة، وكاميرا عالية الحساسية، وهدف 40X (NA 1.25). معالجة الصور باستخدام برامج المجهر المناسبة.
4. استخراج الحمض النووي الريبي وقياسه
- جمع الخلايا من الشرائح تحت التدفق الطبقي
- بعد أسبوعين من زراعة ALI، افصل الشرائح عن الوحدات المحمولة، وغسل القناتين مرتين ب 200 ميكرولتر من DPBS (-/-) مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
- أضف 35 ميكرولتر من 0.25٪ من تريبسين-إيدتا (1X) إلى خلايا البطانة في القناة السفلية وحضن لمدة تقارب 30 ثانية عند القناة الطبيعية.
- افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من الانفصال الكامل. ثم اجمع تعليق الخلية في أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 900 × جرام لمدة 5 دقائق عند RT.
- أعد تعليق حبيبة الخلية في 50 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي المعتمد على الفينول وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
- أضف 50 ميكرولتر من كاشف عزل RNA المعتمد على الفينول مباشرة إلى القناة العلوية لتحليل الخلايا الظهارية، وإغلاق المنافذ بالأطراف، وحضن على الثلج لمدة 3-4 دقائق.
- استخدم الماصة بلطف لضمان التحلل الكامل، ثم اجمع التحلل في أنبوب، وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
- افحص القناتين تحت المجهر للتأكد من تجميع الخلايا بالكامل.
- استخراج الحمض النووي الريبي
- أضف الكلوروفورم (0.2 حجم لكل حجم واحد من مادة عزل RNA المعتمد على الفينول المستخدمة في التحليل؛ 10 ميكرولتر لكل عينة)، وامزج الأنابيب جيدا عن طريق الرج وحضن الثلج لمدة 2-3 دقائق.
- الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لفصل الأطوار ونقل الطور المائي العلوي بعناية إلى أنبوب جديد دون إزعاج الطور البيني. ثم أضف 5 ميكروغرام من الجليكوجين الخالي من الحمض النووي الريبي إلى الطور المائي كحامل.
- أضف الأيزوبروبانول (0.5 حجم لكل 1 حجم من مادة التحلل؛ 25 ميكرولتر لكل عينة)، وحضن العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الفائقة مع الاحتفاظ بحبيبة RNA.
- غسل وإعادة تعليق الحمض النووي الريبي
- غسل حبيبة RNA بنسبة 75٪ إيثانول (حجم واحد لكل حجم واحد من مادة التحليل المشترك؛ 50 ميكرولتر لكل عينة)، ثم استخدم الدوامة لفترة وجيزة وجهاز الطرد المركزي عند 7,500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الفائقة واترك الحبيبة لتجف في الهواء لمدة 5–10 دقائق.
- أعد تعليق الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من الرينازات عن طريق التوصيل اللطيف وتخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.
- تقييم سلامة الحمض النووي الريبي وقياسه باستخدام نظام فصل الأحماض النووية المعتمد على شريحة ميكروفلويديك.
النتائج
تأسيس نماذج الزراعة المشتركة للرئة على الشريحة
كشف تصوير برايتفيلد عن التصاق الخلايا ونموها مع مرور الوقت في نظام الزراعة المشتركة للرئة على الشريحة. تكاثرت خلايا مجرى الهواء الظهاري في مزرعة مغمورة عند واجهة السائل والسائل (LLI)، مكونة طبقة موحدة على طول القناة العلوية (الشكل 6A)، بينما توسعت خلايا البطانة الوعائية الرئوية لتغطي القناة السفلية بأكملها، مكونة طبقة أحادية متلافقة (الشكل 6B).
بمجرد تأسيس الزراعة المشتركة، تم مراقبة الخلايا البطانية في مناطق الدخول والخروج من القناة السفلية، وهي المناطق الوحيدة المتاحة للفحص المجهري. كما هو موضح في الشكل 7، ظلت الخلايا البطانية قابلة للحياة وأظهرت شكلا ممدودا متزامنا مع اتجاه التدفق. بعد 14 يوما من زراعة ALI، أظهرت طبقة الظهارة في كل من النماذج الصحية ونماذج مرض الانسداد الرئوي المزمن خفقات هدبية واضحة (فيديو تكميلي). كما هو متوقع، أظهر نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن زيادة ملحوظة في إنتاج المخاط مقارنة بالنموذج الصحي (الشكل 8)، مما يعيد عكس السمات الرئيسية لأمراض مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD).
الشكل 6: الزراعة المشتركة لخلايا مجرى الهواء الظهاري والبطانة في الجهاز الميكروفلويد.
صور تمثيلية لخلايا الظهارة الأولية في الشعب الهوائية على السطح العلوي (A) وخلايا البطانة الميكروأوعية الدموية الرئوية الأولية على السطح السفلي (B) للغشاء المسامي تحت ظروف الواجهة السائلة-السائلة (LLI). شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: الخلايا البطانية في القناة الميكروفلويدية السفلية السفلية أثناء واجهة الهواء والسائل.
صور ممثلة للسطوع تظهر خلايا البطانة الميكروأوعية الرئوية عند المدخل (العلوي) والمخرج (السفلي) من القناة السفلية أثناء الواجهة الهوائية-السائلية (ALI). شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: تراكم المخاط في قناة مجرى الهواء.
صور تمثيلية تظهر إنتاج المخاط بعد 14 يوما من واجهة الهواء والسائل (ALI) في نماذج الزراعة المشتركة الصحية (A) وCOPD (B). الطبقة البنية في حجرة مجرى الهواء تمثل تراكم المخاط. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
التقييم الكمي لسلامة الحاجز
أظهر التقييم الوظيفي لسلامة الحاجز نفاذية ظاهرية أقل (Papp) في كل من النماذج الصحية ونماذج مرض الانسداد الرئوي المزمن مقارنة بالنموذج الضابط الإيجابي (شريحة مغطاة ب ECM بدون خلايا) (الشكل 9).
في غياب الخلايا، أشارت قيم Papp العالية إلى تكون الحواجز بشكل طفيف. على النقيض من ذلك، في وجود طبقات ظهارية وبطانة، لم يعبر متتبع الفلورية الدكستران ECM، مما أدى إلى انخفاض كبير في النفاذية ويشير إلى حاجز قوي. لوحظ هذا التأثير قبل ALI وبعد 10 أيام من ALI، مما يثبت أن وظيفة الحاجز تثبت مبكرا أثناء التمايز.
كما هو موضح في الشكل 10، في النموذج الصحي، كانت متوسط قيم Papp قبل ALI بالفعل أقل من العتبة التي تدل على سلامة الحاجز المتين (1 × 10⁻6 سم/ثانية) وانخفضت أكثر خلال زراعة ALI. في نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، كانت قيم Papp المتوسطة أيضا ضمن نطاق الحاجز القوي قبل ALI، وعلى الرغم من زيادة طفيفة بعد 10 أيام من ALI، إلا أن سلامة الحواجز بقيت قوية.
الشكل 9: تقييم وظيفة الحاجز في نموذج الرئة على الشريحة.
النفاذية الظاهرة (Papp) المقاسة في الشرائح المغطاة ب ECM بدون خلايا (تحكم إيجابي للتسرب؛ أسود)، وفي نماذج الزراعة المشتركة الصحية (الوردية) وCOPD (الخضراء) قبل وبعد 10 أيام من واجهة الهواء والسائل (ALI). كل نقطة تمثل شريحة فردية. يشمل النموذج الصحي خلايا من متبرعين منفصلين، بينما يستخدم نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن خلايا مشتقة من مريض واحد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 10: مقارنة وظيفة الحاجز في نماذج الصحة ونماذج مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD).
تم قياس النفاذية الظاهرة (Papp) قبل وبعد 10 أيام من واجهة الهواء والسائل (ALI) في نماذج الزراعة المشتركة الصحية (اليسار) وCOPD (اليمنى). كل نقطة تمثل شريحة فردية. القيم متوسطة ± SD. يشمل نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن خلايا من ثلاثة مرضى، بينما يجمع النموذج الصحي خلايا من متبرعين مختلفين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الكشف المناعي للوصلات الضيقة والالتصقة
أكد تحليل التألق المناعي التنظيم البنيوي للبروتينات الوصلية. أظهر ZO-1 توطينا مستمرا على طول حدود خلايا الظهارة القصباتية، مما يشير إلى وجود حاجز ظهاري سليم (الشكل 11A). وبالمثل، كشف تلوين VE-cadherin عن توزيع منتظم عند وصلات البطانة، بما يتوافق مع طبقة بطانية متزامنة مع طبقة واحدة. أظهرت الخلايا البطانية شكلا ممدودا متوافقا مع اتجاه التدفق (الشكل 11B).
لم تلاحظ أي فروق بين النماذج الصحية ونماذج مرض الانسداد الرئوي المزمن في تحديد مواقع بروتينات التوصيل الضيق والبروتينات الملتصقة. تتوافق هذه النتائج مع بيانات الحاجز الوظيفي، وتدعم وجود واجهة فسيولوجية بين الظهارة والبطانة مع الحفاظ على سلامة الوصلات في كلا النموذجين.
الشكل 11: تعبير البروتين الوصلة في نموذج الزراعة المشتركة للرئة على الشريحة.
صور التوهج المناعي من العرض العلوي تم الحصول عليها بعد 14 يوما من واجهة الهواء والسائل (ALI) تظهر تحديد موقع ZO-1 في قسم الظهارة في مجرى الهواء (A) وتحديد موقع VE-cadherin في قسم البطانة (B). تصبغ النوى بتقنية DAPI. يشير السهم إلى اتجاه التدفق. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
التصنيف الظاهري
كشفت التلوين المناعي الفلوري في الشقوق الجليدية عن خلايا موجبة β-توبولين IV على الجانب القمي من الغشاء، مما يشير إلى تمايز خلايا ظهارة مجرى الهواء إلى خلايا مهدبة، وهي سمة مميزة لظهارة الشعب الهوائية الناضجة (الشكل 12A). أكد تلوين CD31 وجود طبقة أحادية بطانية متزامنة على الجانب القاعدي للغشاء (الشكل 12B). تظهر هذه النتائج أن نظام الزراعة المشتركة يدعم تأسيس أنماط ظهارية وبطانية ذات صلة فسيولوجية في كلا النموذجين.
الشكل 12: صور الفلورة المناعية لمقطع الرئة على الشريحة. صبغة فلورية مناعية تمثيلية لمقاطع الرقائق بعد 14 يوما من واجهة الهواء-السائل (ALI) تظهر تعبيرا عن β-الأنبوب الوريدي في قسم الظهارة (A) وتعبير CD31 في الحجرة البطانية (B). تصبغ النوى بتقنية DAPI. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
استخراج وقياس الحمض النووي الريبي
أظهر الحمض النووي الريبي المعزول من خلايا ظهارية مجرى الهواء تركيزات تتراوح بين 59 إلى 135 نانوغرام/ميكرولتر، مع أرقام سلامة RNA (RIN)11 تتراوح بين 7.4–9.6، بينما تراوحت RNA من خلايا البطانة الدقيقة الوعائية بين 12 إلى 46 نانوغرام/ميكرولتر، مع قيم RIN بين 9.6–10، في كلا النموذجين. أشارت البيانات إلى أن كلا النموذجين حققا كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة، وهو مناسب للتحليلات الجزيئية في مراحل لاحقة.
الجدول التكميلي 1: معلومات المتبرع لخلايا الظهارة في مجرى الهواء الهوائي. يمثل الجدول خلايا ظهارية مجرى الهواء الهوائية المستخدمة في النموذج الصحي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 2: معلومات المتبرع لخلايا بطانة الأوعية الوعائية الدقيقة الرئوية. معلومات عن المتبرعين لخلايا البطانة الوعائية الدقيقة الرئوية المستخدمة في النموذج الصحي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 3: معلومات المرضى. يمثل الجدول معلومات عن خلايا البطانة الظهارية في مجرى الهواء والخلايا البطانية الدقيقة الوعائية الرئوية المستخدمة في نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 4: نظرة عامة على المواد الأساسية ووسائط الثقافة المستخدمة في البروتوكول.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الفيديو الإضافي 1: ضربات الأهداب في قناة مجرى الهواء (نموذج صحي).
فيديو تمثيلي يظهر ضربات الأهداب بعد 14 يوما من واجهة الهواء-السائل (ALI). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الفيديو الإضافي 2: ضربات الأهداب في قناة الهواء (نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD).
فيديو تمثيلي يظهر ضربات الأهداب بعد 14 يوما من واجهة الهواء-السائل (ALI). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لإنشاء نظام زراعة مشتركة للرئة على شريحة لتوليد نموذج صحي، باستخدام خلايا بطانة الشعب الهوائية الظهارية والخلايا الدقيقة الوعائية الرئوية المتوفرة تجاريا، ونموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن باستخدام خلايا مشتقة من المرضى من رئتين مقطوعة. في كلا النموذجين، يفصل نوعي الخلايا غشية مسامية قابلة للتمدد مغطى بمصفوفة خارج الخلية الخاصة بنوع الخلية (ECM)، مما يتيح بيئة دقيقة تشبه الرئة في الجسم الحي . يتضمن البروتوكول أيضا طرقا لتقييم سلامة الحاجز، والتنمذة الظاهرية للخلايا، واستخراج الحمض النووي الريبي من كل قسم. تم الحفاظ على كلا النموذجين بنجاح تحت شروط التروية الديناميكية وواجهة الهواء-السائل (ALI)، مما أدى إلى وجود حاجز ظهاري-بطاني ذو صلة فسيولوجية مع ظهارة مجرى الهواء شبه طبقية متمايزة بالكامل. كانت الخلايا البطانية مصطفة مع اتجاه التدفق، كما لوحظ في الجسم الحي، وتم الحصول على RNA عالي الجودة من كلا الحزينتين.
هناك عدة خطوات حاسمة ضرورية لتأسيس هذا النظام التعاوني بنجاح. يتطلب الأمر بذر الخلايا الظهارية بدقة لتحقيق تغطية موحدة، حيث أن التوزيع غير المنتظم قد يؤدي إلى تغطية سطحية غير مكتملة وتكون الحواجز بشكل ضعيف. في مثل هذه الحالات، يجب استنشاق الحجرة القمية بلطف، وإعادة زرع الخلايا الطهارية. يجب إجراء تأسيس ALI فقط عندما تتشكل كل من الطبقتين الظهارية والبطانة طبقتين أحاديات مستمرة، حيث قد يؤدي التعرض المبكر للALI إلى تسرب الوسط الوعائي إلى حجرة مجرى الهواء وضعف التمايز. إذا لم يتم التقاء الجميع، يجب تأجيل تأسيس ALI.
قد يؤدي الإزالة غير الكاملة للوسط القمي أو التعرض غير المتسق لتحليل الظهارة إلى نضج ظهاري غير متجانس. يمكن إزالة الوسط المتبقي في القناة العلوية عن طريق زيادة معدل التدفق إلى 600 ميكرولتر/ساعة لمدة 3–4 دقائق. قد يحدث تكوين الفقاعات، الذي يعطل التروية ويؤثر على بقاء الخلية، بسبب عدم كفاية التوازن. يمكن إزالة الفقاعات عن طريق زيادة التدفق مؤقتا إلى 600 ميكرولتر/س لمدة 3-4 دقائق أو، إذا استمرت، عن طريق فصل الشريحة وإزالتها يدويا باستخدام ماصحة. في نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، قد يؤدي الإنتاج المفرط للمخاط إلى انسداد مجرى الهواء ويؤثر على التروية؛ في مثل هذه الحالات، ينصح بالغسيل اللطيف باستخدام DPBS ثم إعادة تركيب ALI.
تعتمد معظم أنظمة الزراعة المشتركة الحالية التي تجمع بين خلايا الممرات الهوائية الظهارية وخلايا البطانة الرئوية على الخلايا الأولية المتوفرة تجاريا وطلاءات ECM العامة مثل الكولاجين أو الفيبرونكتين 10,12. بينما تدعم هذه الالتصاق، إلا أنها تعيد إنتاج الخصائص الكيميائية الحيوية والميكانيكية لواجهة مجرى الهواء والأوعية الدموية جزئيا فقط. على النقيض من ذلك، يستخدم النظام الحالي طلاءات ECM الخاصة بنوع الخلية، مما يوفر بيئة دقيقة تشبه بشكل أقرب نسيج الرئة البشري13.
عادة ما يتم تقييم وظيفة الحاجز باستخدام المقاومة الكهربائية عبر الظهارة/عبر البطانة (TEER)، رغم أن هذه الطريقة يمكن أن تتأثر بتنظيم الطبقات المتعددة للظهارة14. في هذه الدراسة، تم استخدام نفاذية الدكستران لتقييم السلامة الوظيفية. كانت قيم Papp المرصودة أقل من الحد الأدنى لسلامة الحاجز القوي (1 × 10⁻6 سم/ث)، مما يشير إلى وجود واجهة ظهارية وبطانة قوية قوية. أظهرت ظهارة مجرى الهواء سمات تمايز تشمل الخفقان الهدبي وإنتاج المخاط، إلى جانب التموقع المستمر ل ZO-1 وVE-cadherin عند نقاط الاتصالات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على RNA عالي الجودة بشكل متسق من كلا القسمين، مما مكن من إجراء تحليلات لاحقة خاصة بنوع الخلية.
من أبرز تقدمات هذا العمل تطوير نموذج الرئة على شريحة لمرض الانسداد الرئوي المزمن حيث يتم اشتقاق كل من الخلايا الظهارية والبطانة من نفس المريض. حسب المعرفة الحديثة، لم يتم الإبلاغ عن مثل هذا الثقافة المشتركة المطابقة للمرضى من قبل. دراسات سابقة أدرجت خلايا ظهارية مشتقة من مرض الانسداد الرئوي المزمن،لكنها اعتمدت على خلايا بطانة بطانية مصدرها تجاريا، مما حد من التحقيق في التفاعلات الظهارية مع البطانة الخاصة بالمرض. يتغلب النموذج الحالي على هذا القيد من خلال الحفاظ على التفاعلات الخلوية الخاصة بالمرضى.
استعاد نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن ميزات رئيسية للمرض، بما في ذلك زيادة إنتاج المخاط3، مع الحفاظ على محاذاة البطانة وسلامة الوصلات أثناء التدفق. ومن المهم أن الزراعة المشتركة بين الخلايا الطهارية والبطانة المشتقة من المرضى لم تؤثر على وظيفة الحاجز أو قابليتها للبقاء، رغم زيادة إنتاج المخاط. ظل النظام مستقرا تحت ظروف ALI والتروية المستمرة، مما دعم استخدامه في الدراسات طويلة الأمد. بالإضافة إلى ذلك، تسمح المنصة بالتمدد الميكانيكي، مما يعزز أهميتها الفسيولوجية.
من نقاط القوة المهمة لهذا السير هو القدرة على تقييم الحالات الصحية وحالات الانسداد الرئوي المزمن ضمن نفس المنصة تحت معايير تجريبية مماثلة. يتيح ذلك التقييم المباشر للفروق المرتبطة بالمرض في تمايز الظهارة، وظيفة البطانة، وسلامة الحواجز. يمكن أيضا استخدام النماذج بشكل مستقل، حسب سؤال البحث. النموذج الصحي مناسب للدراسات الميكانيكية وتعديل المسارات، بينما يوفر نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن منصة للتقييم العلاجي واختبار المخدرات. تمكن القدرة على استخراج RNA عالي الجودة من كل قسم بشكل منفصل من التنميط الجزيئي الخاص بنوع الخلية. استخدام الخلايا المتطابقة مع المرضى في نموذج مرض الانسداد الرئوي المزمن يحافظ على التفاعلات المتعلقة بالأمراض التي كانت ستفقد عند دمج مصادر خلايا غير مرتبطة.
على الرغم من هذه المزايا، يجب النظر في عدة قيود. يتطلب استخدام أنظمة الرئة على شريحة معدات متخصصة وخبرة فنية، مما قد يحد من سهولة الوصول. بالإضافة إلى ذلك، لا يشمل النموذج حاليا أنواعا أخرى من خلايا الرئة ذات الصلة، مثل الخلايا المناعية أو الخلايا البمثيرة، التي قد تؤثر على استجابات مسببات الأمراض والأدوية. ومع ذلك، يمكن تكييف المنصة لدمج الخلايا المناعية المتداولة، مما يمكن من دراسة تفاعلاتها مع أقسام الظهارة والبطانة. قد يكون الوصول إلى مواد مرض الانسداد الرئوي المزمن المستمد من المريض محدودا أيضا، وقد يؤثر التفاوت بين المرضى على قابلية التكرار. علاوة على ذلك، قد يؤثر الإنتاج المفرط على المخاط مع التروية.
لم يتم دراسة تأثير التمدد الميكانيكي الدوري في هذه الدراسة، لكنه يمثل اتجاها مستقبليا مهما. يسمح الغشاء القابل للتمدد بمحاكاة القوى الميكانيكية المرتبطة بالتنفس، والتي من المعروف أنها تؤثر على وظيفة الخلية وإصلاحها والتوازن الخلوي 15,16. أظهرت دراسات سابقة أن الإجهاد الميكانيكي يمكن أن يعزز امتصاص الجسيمات النانوية ونقلها عبر الحاجز الطلائي.10.
في الختام، توفر نماذج الرئة الصحية ومرض الانسداد الرئوي المزمن المعروضة هنا منصة فسيولوجية ذات صلة لدراسة التفاعلات الظهارية مع البطانة في الصحة والمرض. تمكن الطبيعة الديناميكية للنظام من التحكم الدقيق في ظروف التدفق وتدعم تطبيقات مثل اختبار المخدرات ودراسات التعرض للممرضات. يقدم هذا البروتوكول بديلا قويا للنماذج التقليدية في المختبر والحيوانات، ويمثل أداة قيمة لتعزيز أبحاث الجهاز التنفسي الانتقالي.
الإفصاحات
لا يوجد أي مؤلف لديه تضارب مصالح.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بحثية (G065221N) من مؤسسة البحوث في فلاندرز.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) (for endothelial cells) | Gibco | 25200-056 | Used for enzymatic detachment of pulmonary microvascular endothelial cells. |
| 120 mm x 120 mm square cell culture dish | VWR | 688161 | Used to hold chip cradle during chip preparation and handling. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939A | Used to assess RNA quality and integrity. |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | Used to precipitate RNA during extraction. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Used to stain cell nuclei during immunofluorescence. |
| 50 mL conical tubes | Cellstar | 227261 | Used for cell collection, centrifugation, and preparation of cell suspensions. |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Used for RNA quality analysis with the Bioanalyzer. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Used to prevent fungal contamination during cell culture. |
| Automatic cell counter | NanoEntek | EVE PLUS | Used to determine cell concentration and viability prior to seeding. |
| Cell culture multiwell plates, 48 well, sterile | Falcon | 353078 | Used to hold cross-sections during staining procedures. |
| Centrifuge | Hettich | 320R | Used to pellet cells prior to seeding. |
| Chip Cradle | Emulate | support@emulatebio.com | Used to support and hold chips during surface activation, coating, and cell seeding. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | Used for phase separation during RNA extraction. |
| Cicero spinning disk module | CrestOptics S.p.A. | Used to perform high-speed confocal fluorescence imaging. | |
| Cover slips | Epredia | BB02400600AC13MNZ0 | Used to support chips during confocal imaging. Desciption: 24 x 60 mm, #1.5 |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | NX70 | Used to section OCT-embedded samples. |
| Culture module (Zoë-CM) | Emulate | support@emulatebio.com | Used to control environmental conditions for cell culture within the microfluidic system. |
| Define trypsin inhibitor (DTI) | Thermo Fisher | R007100 | Used to neutralize trypsin activity after epithelial cell detachment. |
| Dextran Cascade Blue 3KDa | Thermo Fisher | D7132 | Used as a fluorescent tracer to assess barrier permeability. |
| Endothelial cells Growth Medium MV2 kit | PromoCell | C-22022 | Used for maintenance and expansion of pulmonary microvascular endothelial cells. |
| ER-1 surface activation reagent (light-sensitive activation reagent powder) | Emulate | support@emulatebio.com | Used to activate chip surfaces for subsequent coating. |
| ER-2 surface activation reagent (buffer) | Emulate | support@emulatebio.com | Used as a buffer during surface activation of the chip. |
| Ethanol absolute | Thermo Fisher Scientific | 437433T | Used to wash RNA pellets during extraction. |
| Fluorescent plate reader | Agilent | BioTek Sinergy H1 microplate reader | Used to measure fluorescence intensity for permeability assays. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9391 | Used to coat culture surfaces to promote endothelial cell adhesion. |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 (for ZO-1 and β-tubulin IV) | Thermo Fisher | A11001 | Used to detect mouse primary antibodies with green fluorescence. |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 (for CD31) | Thermo Fisher | A11005 | Used to detect mouse primary antibodies with red fluorescence. |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (for VE-cadherin) | Thermo Fisher | A21429 | Used to detect rabbit primary antibodies with orange-red fluorescence. |
| Hub module (Orb-HM) | Emulate | support@emulatebio.com | Used to supply gas and power to the culture module. |
| Human Bronchial Epithelial Cells (HBEC) | Lonza | CC-2540S | Used as airway epithelial cells to establish the healthy co-culture model. |
| Human Collagen IV | Sigma | C5533 | Used to coat T25 flasks to promote epithelial cell attachment. |
| Human Collagen type I | Advanced Biomatrix | 5007 | Used as a component of the extracellular matrix solution for chip coating. |
| Human Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Used as a component of the extracellular matrix solution for chip coating. |
| Human Laminin | Sigma -Aldrich | L4544 | Used as a component of the extracellular matrix solution for chip coating. |
| Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (HPMEC) | PromoCell | C-12281 | Used as pulmonary microvascular endothelial cells to establish the healthy co-culture model. |
| human recombinant epidermal growth factor (hrEGF) | PromoCell | C-60182 | Used to promote epithelial cell proliferation. |
| Hydrocortisone stock solution | StemCell Technologies | 7925 | Used as a supplement in culture media to support airway epithelial cell differentiation. |
| ImageJ | Fiji software | version ImageJ 1.54p | Used to process and analyze acquired images. |
| Inverted microscope for cell culture | Leica Microsystems | DMi1 | Used to monitor cell morphology and confluency during culture. |
| iSpacer | SUNJin Lab | IS307 | Used to create a defined chamber for sample mounting during imaging. Thickness: 0.3 mm. |
| Kinetix camera | Teledyne Photometrics | Used to capture high-resolution fluorescence images. | |
| Microscope Camera | Leica Microsystems | FLEXA CAM C1 | Used to capture images of cells during culture and experiments. |
| Microscope cover glass circular | Marienfeld | 0111620 | Used for covering chip sections on glass slides. Description: 22 mm  |
| Monoclonal Mouse Anti Human CD31 - clone JC70A | Agilent | M082329-2 | Used to detect endothelial cell marker CD31. |
| Monoclonal Mouse Anti ZO-1 - clone ZO1-1A12 | Invitrogen | 33-9100 (100µg) | Used to detect tight junction protein ZO-1. |
| Monoclonal Mouse Anti β-tubulin IV antibody - clone ONS.1A6 | Sigma-Aldrich | T7941 (0.2 mL) | Used to detect ciliated epithelial cells. |
| Monoclonal Rabbit Anti VE-Cadherin | Cell Signaling Tech. | D87F2 | Used to detect endothelial junction protein VE-cadherin. |
| Mounting medium | Ibidi | 50001 | Used to mount samples and preserve fluorescence signal during imaging. |
| Nikon Ti2 inverted microscope | Nikon | Used to image chip samples under fluorescence conditions. | |
| NIS-Elements | Nikon Instruments Europe B.V. | version 6.10. |
المراجع
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immun Inflamm Dis. , (2017).
- Sakao, S., Voelkel, N. F., Tatsumi, K. The vascular bed in COPD: pulmonary hypertension and pulmonary vascular alterations. Eur Respir Rev. , (2014).
- Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease: smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. , (2014).
- Blume, C., Davies, D. E. In vitro and ex vivo models of human asthma. Eur J Pharm Biopharm. , (2013).
- Lin, C., et al. Mechanotransduction regulates the interplays between alveolar epithelial and vascular endothelial cells in lung. Front Physiol. , (2022).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Crit Rev Biotechnol. , (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Methods. , (2016).
- Benam, K. H., et al. Matched-comparative modeling of normal and diseased human airway responses using a microengineered breathing lung chip. Cell Syst. , (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. J Cyst Fibros. , (2022).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. , (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. , (2006).
- Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab Chip. , (2015).
- Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung. Eur Respir J. , (2017).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. , (2015).
- Fang, Y., Wu, D., Birukov, K. G. Mechanosensing and mechanoregulation of endothelial cell functions. Compr Physiol. , (2019).
- Santus, P., et al. The airways' mechanical stress in lung disease: implications for COPD pathophysiology and treatment evaluation. Can Respir J. , (2019).