النقل المزدوج للفيروسات اللينتيفيرالية لتوليد خلايا جذعية عصبية متحورة لأبحاث الورم الدبقي

ملخص

يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الجذعية العصبية للفئران الطافرة (NSCs) لأبحاث الورم الدبقي باستخدام تحويلات فيرولة عدسية متسلسلة. يتم إدخال الطفرات المسرطة أولا إلى الأنظمة العصبية الذاتية، تليها جين الإبلاغ من فيروس العدس البيسيستروني. بعد اختيار المضاد الحيوي المزدوج، تمكن الخلايا غير الحيوية المتحولة من التصوير اللحظي لنمو الورم واستجابة العلاج.

الملخص

الأورام الدبقية هي الأورام الأولية الأكثر انتشارا في البالغين، وتشير نمذجة الفأر إلى أنها قد تنشأ من طفرات مسرحية في الخلايا غير السرطانية أو في الخلايا التمايزية المبكرة. لذا، فإن نماذج الزرع التقويمي المستمدة من NSCs الطفرة لديها القدرة على توفير معلومات ما قبل سريرية قيمة حول مسببات الورم الدبقي ونتائجه واستجابة العلاج. تتطلب هذه النماذج إدخال طفرة مسرطة مسرطة في الخلايا غير السرطانية، مع تفضيل مع المراسلين للمساعدة في تحديد كفاءة النقل والانتقال ومراقبة نمو الأورام في الجسم الحي. يوضح هذا البروتوكول منهجية مزدوجة قائمة على النقل الدوائي لتوليد الخلايا غير المكتبية الطفرة المناسبة لمراقبة الأورام في الجسم الحي . في هذه التقنية، يتم أولا تحويل المكونات غير القابلة للبكرات المعزولة مع فيروسات لينتيفيروس تحتوي على جين محل اهتمام (طفرة مسرطية أو تحكم بروتين فلوري أخضر [GFP]) بالإضافة إلى عنصر مقاوم للبلاستيسيدين. بعد اختيار البلاستيسيدين، يتم نقل الخلايا ثانويا بواسطة ناقل فيروسي عدسي بيسيستروني يعبر عن اللوسيفيراز والبروتين الفلوري الأحمر (RFP)، بالإضافة إلى عنصر مقاوم للبورومايسين. بعد اختيار البوروميسين، يمكن توسيع الخلايا لإجراء اختبارات التكاثر، أو زراعة الأرثوتوب، أو تطبيقات لاحقة أخرى. يتيح هذا النهج المزدوج للنقل تقدير كفاءة النقل في مرحلتي العدوى بالإضافة إلى مراقبة تكوين الورم في الجسم الحي ونموه واستجابته للعلاج باستخدام التصوير الحيوي غير الجراحي (BLI). يمثل هذا النظام أداة مفيدة لأبحاث الورم الدبقي (glioma)، حيث يدمج الصلة البيولوجية لنمذجة الأورام المشتقة من الخلايا الجذعية العصبية للبالغين مع الفائدة العملية لقدرة التصوير اللحظي، مما يعزز في النهاية فهم بيولوجيا الورم الدبقي وتقدم أساليب علاجية جديدة.

المقدمة

الأورام الدبقية هي الشكل الأكثر انتشارا من أورام الدماغ الأولية التي تصيب البالغين، حيث تشكل حوالي 80٪ من جميع الأورام الخبيثة في هذه المجموعة¹. الغالبية العظمى من هذه الأورام الدبقية^{عالية الدرجة 2}، والتي عادة ما تكون غازية جدا وتحمل توقعات سيئة ^3,4 رغم التقدم الكبير في تقنيات جراحة الأعصاب، العلاج الإشعاعي، وطرق العلاج الكيميائي⁵. معدل الوفيات المرتفع بين المرضى المصابين بهذه الأورام يبرز الحاجة إلى أبحاث مستمرة حول تكوين وتقدم الورم الدبقي المزمن.

يمكن تحفيز تكوين الأورام الدبقية في الجهاز العصبي المركزي عن طريق إدخال طفرات مسرحية في الخلايا العصبية 6,7,8,9 أو نسلها المبكر 10,11,12 في دراسات نمذجة الفئران. ومن الجدير بالذكر أن هذه الدراسات أظهرت أن نفس الطفرات المسرطة غالبا ما تفشل في إنتاج أورام عند إدخالها إلى الخلايا الأكثر تمايزا¹³، مما يؤسس تسلسلا هرميا للخلية الأصلية حيث يرتبط تقييد السلالة بانخفاض القابلية للتحول¹⁴. لذلك، تستخدم الورم الدبقي المعدل وراثيا عادة لتوليد نماذج متعددة الاستخدامات وذات صلة بيولوجية بالورم الدبقي باستخدام تقنيات التحويل الوراثي أو طرق الزرع الأورثوتوبي¹⁵. كلا النهجين يسمحان بدراسة تكوين الورم الجديد في بيئة الدماغ الأصلية من خلية غير متحولة. تسمح النماذج المعدلة وراثيا بإجراء هذه الدراسة في الحيوانات التي تمتلك جهاز مناعي سليم، وغالبا ما تحاكي بشكل أفضل الأنسجة وعدم التجانس الخلوي الذي لوحظ في أورام بشرية¹⁶. ومع ذلك، فإن إنتاج هذه النماذج يتطلب جهدا وتكلفة، وغالبا ما تظهر أوقات تأخير طويلة وتكرار تكوين أورام منخفض¹⁶. على النقيض من ذلك، فإن نماذج NSC المتنوعة أكثر سهولة في التلاعب وأكثر فعالية من حيث التكلفة. يمكن توليد الخلايا غير القابلة للطيور الطافرة من خلايا أولية أو خالدة من فئران أو بشر، بناء على الاحتياجات التجريبية، وهي مناسبة أيضا للتجارب المختبرية ^16,17. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه النماذج القدرة على ضبط مرحلة التطور بدقة لكل من الجرأة غير القابلة للطاقة والفئران المستقبلة، بالإضافة إلى تحديد الموقع المكاني الذي اشتقت منه هذه الفئران وتم تقديمها إليها. وهذا يمكن الباحثين من دراسة كيفية تأثير العمر ومناطق الدماغ المحددة على تكون الأورام المدفوعة بطفرات معينة¹⁷.

يوضح هذا البروتوكول منهجية توليد مراكز الفئران الطافرة من الزراعة الأولية، والتي تناسب التطبيقات التجريبية في المختبر وفي الجسم الحي (الشكل 1). يتكون البروتوكول من مرحلتين مميزتين للتحويل تحدثان في تسلسل زمني محدد. في مرحلة النقل الأولية، تصاب الجرعات غير الطبيعية في الفأر المعزولة بفيروسات لينتي-مؤتلفة تحمل البنية الجينية المستهدفة، إما طفرة مسرحية أو بروتين فلوري أخضر (GFP)، إلى جانب شريط مقاومة للبلاستيسيدين. بعد ذلك، يتم تطبيق ضغط انتقاء المضاد الحيوي باستخدام بلاستيسيدين، مما يسمح فقط للخلايا المتحولة المتبقية بالانتقال إلى حدث نقل ثانوي. يستخدم هذا الحدث الثانوي تركيب فيروسي عدسي بيسيستروني يشفر جينات تقرير لوسيفيراز اليراعة والبروتين الفلوري الأحمر (RFP)، مع عناصر مقاومة للبوروميسين للاختيار لاحقا. بعد الانتقاء باستخدام البورومايسين، يتم توسيع تجمعات الخلايا العصبية المختلطة الناتجة في المختبر. قبل إجراء تجارب لاحقة. يقدم هذا النهج التسلسلي للنقل عدة مزايا منهجية: (1) يسهل تقييما كميا لكفاءة النقل في كل خطوة¹⁸، (2) يؤسس خطوط خلايا تقريرية مستقرة مناسبة للتتبع الطولي، و(3) يتيح المراقبة غير الجراحية لبدء الورم، حركيات التقدم، والاستجابات العلاجية من خلال منهجيات BLI 18,19,20. يمكن أيضا استخدامه مع المؤتمرات الوطنية الأساسية أو المخلصة 21,22,23.

يعالج البروتوكول المعروض هنا الحاجة الملحة لنهج موحد وفعال وذو صلة بيولوجية لتوليد نماذج الورم الدبقي المشتقة من NSC من الحيوانات البالغة ذات القدرات التصويرية المتكاملة. من المتوقع أن تقدم النماذج الناتجة رؤى ذات صلة سريرية بخصوص مسببات الورم الدبقية، وتسهل تحديد أهداف علاجية جديدة، وتوفر منصات قوية لتقييم استراتيجيات العلاج الناشئة قبل السريرية.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة وفقا للمعايير الأخلاقية والإرشادات التنظيمية التي وضعتها جامعة واشنطن في سانت لويس. لهذا البروتوكول، تم تشريح قشرة الفئران البالغة بشكل دقيق وفقا للتقنية الموصوفة سابقا في مختبر بروسير²⁴، واستخدمت لعزل الخلايا غير الصلبة الأولية للفئران لتوسيعها لاحقا في الثقافة غير الملتصقة وفقا للبروتوكول^{المعتمد 24,25,26}. جميع الكواشف المستخدمة في الزراعة إما تزود بصيغة معقمة أو تمر عبر مرشح غشاء بحجم 0.2 ميكرومولار لضمان التعقيم. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. عزل الخلايا الجذعية العصبية من الأنسجة المفصلة الدقيقة

1. حضر وسط التفكك (DM) ووسط هضم التربسين (TDM)، كما هو موضح في الشكل 2.
   1. أضف 200 ميكرولتر من وسط هضم التربسين إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل وابق على الثلاجة لمدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل الاستخدام. يمكن ترك DM في درجة حرارة الغرفة للمراحل القادمة في البروتوكول.
   2. أثناء تبريد الأنابيب مسبقا، حضر وسط الخلايا الجذعية العصبية الأساسي (NSC؛ الوصفة الموضحة في الشكل 2) وضع ال NSC ومصل البقر الجيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في حمام ماء أو خرز لتسخينها مسبقا. ضع كميات من المكملات (B27, N2) وعوامل النمو (EGF, FGF) في دلو ثلج لتذوب ببطء.
      ملاحظة: يجب تحضير TDM طازجا في كل مرة قبل الاستخدام، رغم أنه يمكن تخزين NSC وDM عند 4 درجات مئوية بين الاستخدامات؛ الوصفات موضحة في الشكل 2. يجب أن يتم جمع مخزونات N2 وB27 وEGF وFGF وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام؛ تجنب تكرار تجميد ذوبان المخزونات المعاد تشكيلها (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل عند إعداد مخزونات EGF وFGF).
2. بعد تبريد أنابيب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على TDM بشكل كاف، يتم التشريح الدقيق للأنسجة كما وصف سابقا²⁴. بعد كل تشريح دقيق، ضع النسيج في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أعد الأنبوب إلى الثلج حتى يكتمل جميع عمليات التشريح، حيث أن أي تسخين للأنسجة قد يبدأ عملية الهضم الإنزيمية مبكرا ويؤدي إلى فرط هضم.
3. حضن أنبوب أو أنابيب الطرد المركزي الدقيق عند حرارة 37 درجة مئوية في حمام ماء أو خرزات لمدة 15 دقيقة لبدء الهضم الإنزيمي. أثناء الحضانة، جهز 10٪ من FBS في NSC بإضافة 0.5 مل FBS إلى 4.5 مل NSC.
   1. بعد الحضانة، قم بأخذ عينات أو عينات من الماصة بلطف 5–10 مرات باستخدام ميكروبايبت بحجم 1 مل لتفكيك الخلايا بشكل أكبر، ثم تعادلها بإضافة 200 ميكرولتر من 10٪ FBS في NSC لكل عينة. ارفع وينزل برفق لخلطها.
      ملاحظة: من الضروري اتباع الوقت الموصى به للحضانة عند 37 درجة مئوية. قد يؤدي الإفراط في التريبسين إلى موت الخلية، بينما قد يجعل نقص التريبسينية العينة صعبة التفكك (انظر الجدول 1، النقاط 1–2 لهذا ونصائح أخرى لحل المشكلة).
      ملاحظة: يمكن استخدام حمام مائي أو حمام خرز لاحتضان العينات؛ الأخير قد يقلل من خطر التلوث²⁷، لكنه قد يصاحب خطر نقل الحرارة الأقل كفاءة²⁸.
4. قم بتدوير الخلايا الأولية المعزولة عند 630 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتانت، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا في قاع البئر. اغسل الخلايا بإضافة 2.5 مل DM إلى حبيبة الخلية وأعد تعليقها بلطف للأعلى والأسفل 3–4 مرات. قم بتدوير السوبرناتانت مرة أخرى عند 630 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، واسحب السوبرناتانت بحذر.
5. كرر الخطوة 1.3 لإجراء غسل ثان. خلال الغسل النهائي، أضف B27 وN2 وFGF وEGF إلى وسط NSC الأساسي المسخن مسبقا لإنشاء وسط NSC كامل ( الوصفة موضحة في الشكل 2).
6. استنشق السوبرناتان. أضف 2 مل من وسط NSC الدافئ الكامل لكل حبيبة خلية، ثم أعد تعليقها بلطف للأعلى والأسفل 3–4 مرات. ضع الخلايا المعلقة في بئر واحد من صفيحة منخفضة التثبيت مكونة من 6 آبار وحضن عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: على الرغم من أن وسط NSC الأساسي يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية بين الاستخدامات، إلا أن المكملات وعوامل النمو قد تتعرض للتحلل عند هذه الحرارة. لذا، يجب إضافة B27 وN2 وFGF وEGF إلى وسط NSC لإنشاء وسط NSC كامل قبل الاستخدام مباشرة.

2. تأسيس وتوسع ثقافة الغلاف العصبي

1. أعط 0.5–1 مل من وسط تغذية الحزمة الطازج (الوصفة موضحة في الشكل 2) لكل بئر من ثقافات NSC كل 3 أيام.
2. راقب تكوين الغلاف العصبي. عندما تكون الكرات الصغيرة مكتملة التكوين مرئية، تكون الزراعة جاهزة للمرور (عادة بعد 5–10 أيام من الطلاء الأولي).
   ملاحظة: تنمو الخلايا بشكل أفضل عندما تمر بشكل متكرر وعندما تكون لا تزال في مرحلة النمو اللوغاريتمي. الفضاءات العصبية الأكبر أصعب في التفكك وأكثر عرضة لموت الخلايا خلال هذه العملية. لذا، يوصى بالانتقال المبكر والأكثر تكرارا لتعزيز صحة الخلايا. عندما تكون جاهزة للمرور، ستكون الكرة العصبية المعزولة بقطر ~100–200 ميكرومتر مع خلايا محكمة وحدود ناعمة ومحددة جيدا تحت مجهر الحقل الساطع. لن تظهر المجالات العصبية إسقاطات أو امتدادات غير منتظمة. سيكون مركز الكرة العصبية أغمق قليلا من الحواف الخارجية، ولكن ليس بشكل مفرط؛ غالبا ما تنتج النوى الداكنة بشكل مفرط نتيجة نخر الخلايا المركزية بسبب نقص العناصر الغذائية عندما تكون الطبقات العصبية مفرطة النمو. غالبا ما يؤدي انتقال الكرات العصبية المتضخمة إلى ارتفاع معدلات موت الخلايا، مما قد يؤثر على التطبيقات التالية. انظر الجدول 1، النقاط 3–4 لهذا ونصائح أخرى لحل المشكلة.
3. قم بتسخين وسط NSC مسبقا وDM و0.05٪ تريبسين-EDTA، ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي أو خرز. ضع مخزونات B27 وN2 وFGF وEGF وFBS على الثلاجة حتى الحاجة.
4. للمرور، انقل الفضاءات العصبية النموة جيدا إلى أنبوب مخروطي معقم بحجم 15 مل باستخدام ماصة مصلية. الطرد المركزي عند 630 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية لاستقرار الفضاءات العصبية. الشفق الفائق، الحرص على تجنب إزعاج الكرة العصبية الحبيبية. غسل الخلايا بإعادة تعليقها في PBS معقم 1x، ثم الطرد المركزي مرة أخرى عند 630 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وسحب السوبرناتان.
5. أضف 1 مل من 0.05٪ تريبسين/EDTA إلى حبيبات الخلية. قم بالتقطيع للأعلى والأسفل 3–5 مرات باستخدام ميكروبايبت بسعة 1 مل للخلط، ثم حضن على حرارة 37 درجة مئوية في حمام ماء أو خرزات لمدة 5–6 دقائق.
   1. بعد الحضانة، قم بعمل ماصة بلطف صعودا وهبوطا 5–10 مرات باستخدام ميكروبايبت بحجم 1 مل لتفكيك المساحات العصبية. تحيد التربسين بإضافة 1 مل 10٪ FBS في وسط NSC؛ استخدم الماصة بلطف لتخلطها.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في التربسين و/أو الحقن القوي جدا في الغلاف العصبي، لأنه قد يضر الخلايا العصبية ويؤثر على بقاء الخلايا.
6. أضف 2.5 مل من DM وجهاز طرد مركزي عند 630 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتان. كرر خطوة الغسيل بكمية 2.5 مل DM أخرى، تليها الطرد المركزي واستنشاق السوبرناتان، لإزالة آثار FBS في الوسط.
7. أعد تعليق الخلايا في وسط NSC طازج بحجم 1 مل. تعليق خلية الفلتر بوضع فلتر معقم بقطر 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 50 مل، ثم إضافة محلول الخلية إلى أعلى الفلتر والسماح للجاذبية بتصريف المحلول إلى الأنبوب. أي خلايا غير مفككمة متبقية سيتم التقاطها بواسطة الفلتر، بينما ستنتقل الخلايا المفردة إلى المحلول أدناه.
8. من الخلايا المعلقة والمفلترة، خذ 10 ميكرولتر لعد الخلايا وامزج مع 10 ميكرولتر من تريبان بلو. باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي اليدوي، قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة وعد الخلايا الصالحة (أي الخلايا غير الزرقاء) وفقا للممارسة^{القياسية 29}. بدلا من ذلك، يمكن استخدام عداد خلوي آلي، رغم أنه قد يكون أقل دقة في وجود حطام خلوي أو تجمعات^30,31.
   ملاحظة: بشكل عام، أقل من 10٪–15٪ من إجمالي الخلايا يجب أن تظهر علامات موت الخلية (مثل، عدم القدرة على استبعاد التريبان بلو). قد تنتج معدلات موت الخلايا الأعلى عن فرط التريبسين، أو القوة الميكانيكية المفرطة في فصل الخلايا، أو سوء الصحة العامة للزراعة قبل التريبسين (انظر الجدول 1، النقاط 1–3). ونظرا لأن ذلك قد يؤثر سلبا على التطبيقات اللاحقة، ينصح بإعادة طلاء الخلايا (الخطوة 2.9) وتوسيعها مرة أخرى (مثلا، تكرار الخطوات 2.1–2.9) إذا لوحظت معدلات موت خلايا مرتفعة بدلا من الانتقال إلى التحويل.
9. قم بتخفيف 5 ×¹⁰ خلايا 5 إلى وسط NSC كامل طازج بسعة 2 مل وطبقها في بئر واحد من صفيحة ذات 6 آبار منخفضة الوصلات. أعط 0.5–1 مل من تغذية NSC الطازجة لكل بئر كل ثلاثة أيام لضمان صحة الزراعة المثلى. عندما تكون الكرات الصحية مكتملة التكوين (انظر الجدول 1، النقطة رقم 4)، تكون الثقافة جاهزة للاستخدام في الخطوة 3 أو 4.
   ملاحظة: يمكن تخزين NSCs إضافية في هذه المرحلة عن طريق تعليق مليون NSCs في 1 مل من وسط تجميد خلية خالية من المصل في مبرد بسعة 1.5 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. يمكن أيضا توسيع NSCs أكثر إذا لزم الأمر عن طريق طلاء خلايا إضافية في آبار إضافية من صفيحة ال 6 آبار أو الطلاء في قوارير T-25.

3. منحنى قتل بلاستيسيدين في الخلايا الأم

ملاحظة: بمجرد أن تشكل الخلايا غير العصبية الممزوجة بمراتها نوايا عصبية صحية، تكون الخلايا جاهزة للتجارب اللاحقة. قبل التحويل، من الضروري تحديد التركيز الأمثل للمضاد الحيوي الانتقائي (بلاستيسيدين، في هذه الحالة). يجب إجراء ذلك تجريبيا، حيث قد تختلف حساسية مجموعات المضادات الحيوية. إذا تم تحديد هذا بالفعل لنوع الخلية المعطا، تخطي إلى الخطوة 4.

1. قم بتدفئة الوسط الأساسي NSC، DM، 0.05٪ تريبسين-EDTA، وPBS عند 37 درجة مئوية. ذوبان مخزونات B27، N2، FGF، EGF، FBS، وبلاستيسيدين. قبل البدء أو أثناء خطوات الحضانة أدناه، قم بصنع وسط NSC جديد كامل و10٪ FBS في وسط NSC كما هو موضح أعلاه.
2. باستخدام المجالات العصبية الموسعة حديثا (بعد الزراعة من الخطوة 2.9 أعلاه)، قم بالتريبسين ثم التقسيم حسب الخطوات 2.5–2.6، ثم أعد تعليقها في 1 مل من NSC طازج للعد. تقوم الخلايا بترشيح عبر مرشح معقم بحجم 40 ميكرومتر كما هو موضح أعلاه لإزالة الخلايا غير المفككة، ثم يعد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.8.
3. أعد تعليق 25,000 خلية صالحة إلى 2.5 مل من الخلايا السليمة الطازجة الكاملة في مخروطات بحجم 15 مل، مع تحضير 1 أليكوت لكل تركيز مضاد حيوي لاختباره. أخطط لاختبار ما لا يقل عن 4–6 تركيزات مختلفة، رغم أنه يمكن اختبار المزيد إذا رغبت في ذلك.
4. أضف الكمية المناسبة من البلاسيكيديدين إلى كل 2.5 مل أليكوت لتحقيق التركيز النهائي المطلوب (انظر حسابات العينة في الجدول 2). صفيحة بسعة 500 ميكرولتر من الخلايا المعلقة (5,000 خلية) لكل بئر في صفيحة تثبيت منخفضة جدا ذات 24 بئر، مع كل تركيز مطلية على شكل رباعي الطبقات.
   ملاحظة: لتحقيق التركيز النهائي الصحيح، قد يحتاج مخزون البلاستيسيدين إلى تخفيف الكمية قبل إضافته إلى الوسط. يمكن تخفيف البلاستيسيدين في وسط NSC أو PBS؛ بالنسبة لمخزون مخفف بنسبة 1:1000 (10 ملغ/مل)، أضف 1 مل من مخزون بلاستيسيدين غير مخفف (10 ملغ/مل) إلى 999 مل من NSC أو PBS. يوصى بأن يقوم الباحثون بجميع الحسابات اللازمة لتحقيق التركيزات المطلوبة أثناء تسخين المواد في الخطوة 3.1؛ الحسابات النموذجية الموضحة في الجدول 2.
5. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية. افحص الخلايا بعناية باستخدام مجهر برايت فيلد كل 24 ساعة للبحث عن تغيرات في الشكل الخلوي وموت الخلايا أو الغلاف العصبي. يتم تغذية الخلايا كل 3 أيام بإضافة 0.5–1 مل من وسط تغذية NSC طازج مع تركيز صحيح من بلاستيسيدين.
6. تحديد التركيز المناسب لاختيار البلاستيسيدين لاحقا من خلال تحديد أدنى تركيز للبلاستيسيدين الذي يقتل الخلايا غير المحولة بين 72–120 ساعة بعد الطبق.
   ملاحظة: بالنسبة لمخلوقات الميكروبات غير النشطة للفئران البالغة، تم تحديد 1000 نانوغرام/مل (1 ملغ/مل) من بلاستيسيدين كأفضل تركيز لاختيار المضادات الحيوية (الشكل 3). يتم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام بلاستيسيدين بهذا التركيز. يجدر بالذكر أن التركيز الأمثل لبلاستيسيدين يمكن أن يختلف بشكل كبير بين تحضيرات الخلايا، عادة ما يتراوح من 0.5 إلى 10 ميكروغرام/مل حسب نوع العينة، وعدد الممر، وظروف الزراعة^32,33؛ لذلك، فإن منحنيات القتل التجريبية ضرورية وليست اختيارية لكل نوع خلية جديد. راجع الجدول 1، النقطة رقم 5 لمزيد من نصائح استكشاف المشكلة.

4. أول تحويل فيروسي عدسي

ملاحظة: قبل المضي قدما في عملية التحويل، من الضروري معرفة تعدد العدوى الأمثل (MOI) لنقل جسيمات الفيروسات العدسية (LVPs). يجب تحديد ذلك تجريبيا لأنواع الخلايا المختلفة؛ وقد تم وصف الطرق اللازمة لذلك سابقا^{بشكل جيد 34,35}. في النتائج التوضيحية الموضحة، تم استخدام MOI بمقدار 20 بناء على الخبرة السابقة في تحويل الخلايا غير الدقيقة للفئران الأولية.

1. ابدأ بالخلايا غير العصبية المتوسعة غير المحولة التي تشكل كرة عصبية صحية (تتولد بعد توسع الخلايا في الخطوة 2.9 أعلاه). تقسيم وإعادة تعليق وتصفية وعدد الخلايا كما في الخطوات 2.3–2.8 أعلاه، ثم قم بتقسيم الخلايا بكثافة 1.5 × 10⁶ خلايا لكل بئر إلى بئرين (واحد للفيروس المسرم، وآخر للسيطرة) من صفيحة ذات 6 آبار منخفضة الالتصاق للغاية. حضن الصحون طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
2. في اليوم التالي، افحص الزنزانات. تكون الخلايا غير القابلة للعدوى جاهزة للعدوى إذا كانت تتكون من كتل صغيرة.
3. قبل إصابة الخلايا، قم بإذابة الليكوت الفيروسي العدسي على الثلج بعناية، مما يسمح بإذابة تدريجية. من الضروري عدم التسرع في هذه العملية.
   ملاحظة: لأغراض توضيحية، يصف هذا البروتوكول تحويل الفيروسات العدسية باستخدام بنيتين ممثلتين: (1) ناقل تحكم يعبر عن GFP تحت محفز EF1-α مع مقاومة للبلاستيسيدين، و(2) ناقل تجريبي يعبر عن طفرة مسرحية BRAF V600E مسببة للسرطان بعلامة HA تحت محفز EF1-α، أيضا بمقاومة بلاستيسيدين. توليد فيروسات اللينتي خارج نطاق هذا البروتوكول لكنه تم وصفه سابقا بشكل جيد^36,37.
4. بعد الذوبان، قم بتدفئة الفيروس لفترة وجيزة إلى 37 درجة مئوية مباشرة قبل الإصابة. حدد حجم LVP الذي يجب إضافته إلى كل بئر، باستخدام صيغة MOI x عدد خلايا/عيار الفيروس. باستخدام ميكروبايبت مضبوطة على الحجم المحسوب، أضف LVP ببطء قطرة إلى الخلايا المزروعة. حرك الطبق برفق لتوزيعه، مع الحرص على عدم دفع الوسائط إلى الآبار المجاورة. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   ملاحظة: بمجرد إذابة العليكوت الفيروسي إلى درجة حرارة الغرفة، لا يمكن إعادة تجميده ويجب استخدامه خلال 24 ساعة. بمجرد تسخين العليكوت إلى 37 درجة مئوية، يجب استخدامه خلال فترة زمنية مدتها 30 دقيقة.
5. بعد فترة الحضانة هذه، قم بالطرد المركزي في المجالات العصبية عند 630 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم استنشاق السوبرناتينت. أعد تعليق في 2 مل من القرص النووي الكامل الطازج، بدون أي فيروس أو مضاد حيوي، وقم بوضع طبقة منخفضة التثبيت من 6 آبار.
6. في اليوم التالي، قيم كفاءة التحويل في خلايا التحكم في GFP من خلال تحديد نسبة الخلايا/الكتل الموسومة بالفلورية إلى الخلايا/الكتل الكلية باستخدام مجهر التألق في مجالات متعددة. يجب أن يكون التعبير المتوقع للمراسل (GFP) أكثر من 80٪ لتحقيق نجاح التحويل.
   ملاحظة: إذا لوحظت كفاءة تحويل غير مثالية، يمكن إجراء جولة ثانية من العدوى (تكرار الخطوات 4.4–4.6). إذا لم تتحسن الكفاءة، فكر في إعادة تحسين MOI أو تجربة تحضير مختلف من اللينتيفيروس. راجع الجدول 1، النقطة رقم 6 لهذه النصائح وغيرها من نصائح استكشاف المشكلة.
7. عند ملاحظة أن المجالات العصبية النامية تبدو صحية وأن هناك أدلة على العدوى (GFP إيجابية؛ ~80٪)، تابع تقسيم الخلايا حسب الخطوات 2.3–2.6 أعلاه. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسط NSC الكامل الذي يحتوي على التركيز المناسب من البلاستيسيدين (1000 نانوغرام/مل)، ثم قم بتصفية عبر مرشحات معقمة بعمق 40 ميكرومتر للقضاء على تجمعات الخلايا. عد الخلايا، ثم قم بوضع الألواح بحجم حوالي 5 × 10⁴ خلايا/مل في قوارير T-25 منخفضة الوصلات.
   ملاحظة: بعد الإضافة الأولية للمضاد الحيوي، قد يكون هناك معدل مرتفع لموت الخلايا مع موت الخلايا غير المحولة؛ وهذا متوقع، ويجب أن يتحسن مع الاختيار المستمر.
8. وسع الخلايا عن طريق التغذية كل 3 أيام بمكمل تغذية يحتوي على بلاستيسيدين. عندما تكون الكرات الصحية مكتملة الشكل، عادة بعد 5–10 أيام من الانقسام، تكون الثقافة جاهزة للاستخدام في الخطوة 5 أو 6.
   ملاحظة: بعد توسع إضافي للنسخ المقاومة، يمكن جمع الخلايا لإجراء البلوت الغربي (الموضح في الخطوة 7) للتحقق من أن البنية المسرحية غير الموسومة بالفلورية والمميزة ب HA يتم التعبير عنها بشكل مناسب. إذا تم إجراء الطلاء الغربي في هذه الخطوة، فلا يزال يوصى بفحص التعبير^{بعد التحويل} الثاني (في الخطوة 7)، لضمان استمرار التعبير المناسب.

5. منحنى القتل للبوروميسين في الخلايا غير القابلة للقتل المقاومة للمسيدات

ملاحظة: يجب أيضا تحديد تركيز الانتقاء الأمثل للتحويل الثاني تجريبيا. تستخدم الخلايا المحولة المقاومة للبلاستيسيدين في هذه الخطوة، وتحافظ الخلايا على انتقاء بلاستيسيدين (1000 نانوغرام/مل) طوال الوقت، حيث قد يؤدي التحويل واختيار الباستيسيدين المتزامن إلى تغيير الحساسية للبورومايسين.

1. قم بتدفئة الوسط الأساسي NSC، DM، 0.05٪ تريبسين-EDTA، وPBS عند 37 درجة مئوية. ذوبان مخزونات B27، N2، FGF، EGF، FBS، BLASTICIDIN، وبورومايسين. قبل البدء أو أثناء خطوات الحضانة أدناه، قم بصنع وسط NSC جديد كامل و10٪ FBS في وسط NSC كما هو موضح أعلاه.
2. باستخدام الكرات العصبية المقاومة للبلاستيسيدين، قم بالتربسين ثم التقسيم حسب الخطوات 2.5–2.7، مع إعادة تعليق 1 مل من NSC طازج للعد والترشيح لإزالة الكتل. عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.8، ثم أعد تعليق 25,000 خلية صالحة إلى 2.5 مل من القطع الطازجة الكاملة في 15 مل مخروطية، مع تحضير 1 أليكوت لكل تركيز مضاد حيوي للاختبار. أخطط لاختبار ما لا يقل عن 4–6 تركيزات مختلفة، رغم أنه يمكن اختبار المزيد إذا رغبت في ذلك.
3. أضف بلاستيسيدين لتحقيق التركيز الأمثل سابقا (1000 نانوغرام/مل = 0.25 مل من المخزون غير المخفف / 2.5 مل أليكوت). ثم تضيف الكمية المناسبة من البيوروميسين إلى كل أنبوب لتحقيق التركيز النهائي المطلوب (انظر حسابات العينة في الجدول 2).
4. صفيحة بسعة 500 ميكرولتر من الخلايا المعلقة (5,000 خلية) لكل بئر في صفيحة تثبيت منخفضة جدا ذات 24 بئر، مع كل تركيز مطلية على شكل رباعي الطبقات.
5. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية. افحص الخلايا بعناية باستخدام مجهر برايت فيلد كل 24 ساعة للبحث عن تغيرات في الشكل الخلوي وموت الخلايا أو الغلاف العصبي. تغذية الخلايا كل 3 أيام بإضافة 0.25 مل من وسط تغذية NSC طازج مع مكمل بلاستيسيدين وتركيز صحيح من البيوروميسين.
6. تحديد التركيز المناسب لاختيار بوروميسين لاحقا من خلال تحديد أدنى تركيز بوروميسين يقتل الخلايا بين 72–120 ساعة بعد الطلاء الداخلي.
   ملاحظة: بالنسبة لجرعات الميكروفون النارية البالغة المحولة مع GFP و/أو فيروسات BRAF-V600E، تم تحديد 100 نانوغرام/مل بوروميسين كأفضل تركيز لاختيار المضادات الحيوية (الشكل 4). بالنسبة للتحويلات المثالية، تم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام 1000 نانوغرام/مل بلاستيسيدين (من الخطوة 3 أعلاه) و100 نانوغرام/مل بوروميسين (من الخطوة 5 أعلاه). راجع الجدول 1، النقطة رقم 5 للحصول على نصائح لحل المشكلة.

6. النقل الفيروسي الثاني

ملاحظة: تبقى الخلايا في وسط يحتوي على بلاستيسيدين خلال المرحلة الثانية من النقل لضمان الحفاظ على البنية المسرطنة أو التحكم في GFP الذي تم إدخالها في مرحلة النقل الأولى داخل الخلايا.

1. ابدأ العملية باستخدام منشطات غير متصاعدة مقاومة للبلاستيسيدينات ومحولة بشكل مستقر (يتم إنتاجها في الخطوة 4). ابدأ بفصل الناقلات الصلبة إلى تعليق خلية واحدة (الخطوات 2.3–2.7) لضمان التجانس أثناء الطلاء الطبقي.
2. خلايا الصفائح بكثافة 1.5 × 10⁶ خلايا لكل بئر في وسط NSC كامل مع بلاستيسيدين (1000 نانوغرام/مل، كما تم تحديده في الخطوة 3) إلى صفيحة ذات 6 آبار منخفضة الالتصاق للغاية. حضن الصحون طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
3. في اليوم التالي، ستكون الخلايا جاهزة للتحويل إذا شكلت كتلات صغيرة. قم بإذابة فيروس العدس البيسيستروني (الذي يحتوي على لوسيفيراز وRFP) على الثلج، ثم دفئه لفترة وجيزة إلى 37 درجة مئوية مباشرة قبل العدوى. تحديد حجم LVP الذي يجب إضافته إلى كل بئر، باستخدام الصيغة MOI x عدد خلايا/عيار الفيروس؛ يستخدم هنا MOI بقيمة 20.
   1. باستخدام ميكروبايبت مضبوطة على الحجم المحسوب، أضف LVP ببطء قطرة إلى الخلايا المزروعة. حرك الطبق برفق لتوزيعه، مع الحرص على عدم دفع الوسائط إلى الآبار المجاورة. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
4. في اليوم التالي، قم بطرد المركزي للمناطق العصبية عند 630 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإعادة تغطيتها بطبقة جديدة من NSC يحتوي على بلاستيسيدين (1000 نانوغرام/مل، وفقا للخطوة 3).
5. في اليوم التالي، قيم كفاءة الخطوة الثانية للتحويل عن طريق تحديد نسبة الخلايا/الكتل الإيجابية لRFP إلى إجمالي الخلايا/الكتل بواسطة مجهر الفلورية في عدة حقول، بكفاءة مثلى ~60٪.
6. عند ملاحظة أن المجالات العصبية تبدو صحية وأن الخطوة الثانية للنقل كانت فعالة (مثلا، الغالبية العظمى من تجمعات الخلايا هي RFP+)، تكون الخلايا جاهزة للاختيار المزدوج. ابدأ بتفكيك الخلايا الصلبة إلى تعليق خلية واحدة (الخطوات 2.3–2.7)، ثم أعد الطلاء عند حوالي 5 ×^{10 4} خلايا/مل في قوارير T-25 منخفضة الارتباط في NSC كاملة تحتوي على بلاستيسيدين (1000 نانوغرام/مل) وبوروميسين (100 نانوغرام/مل).
   ملاحظة: كما في الخطوة 4.6 أعلاه، إذا لوحظت كفاءة النقل غير المثالية، يمكن إجراء جولة ثانية من العدوى (تكرار الخطوات 6.3–6.6). راجع الجدول 1 لمزيد من نصائح استكشاف المشكلة.
7. تغذية الخلايا كل 3 أيام بمكمل تغذية يحتوي على بلاستيسيدين وبورومايسين.
   ملاحظة: المراقبة اليقظة للثقافات ضرورية لتحديد النسخ المقاومة المزدوجة، والتي ستتميز ببقائها على قيد الحياة تحت الضغوط الانتقائية. عندما تكون الكرات الصحية مكتملة الشكل، عادة بعد 5–10 أيام من الانقسام، تكون الثقافة جاهزة لمزيد من التحقق (الخطوة 7).

7. التحقق من صحة وتوصيف الأنظمة الاستخباراتية القابلة للتحويل المزدوج

ملاحظة: قبل إجراء المزيد من التجارب في المختبر أو في الجسم الحي، يوصى بالتحقق الإضافي لضمان التعبير المناسب عن البنى المميزة ب HA واللوسيفيراز بشكل مناسب.

1. البلوط الغربي للتحقق من تعبير البناء الموسوم ب HA
   1. مراكز الزراعة الوطنية (التحكم في GFP وBRAF الموسوم ب HA). V600E، في المثال المقدم) في قوارير T-25 منخفضة الالتصاق للغاية حتى تكون جاهزة للانقسام (كما في الخطوة 2.2).
      ملاحظة: قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، يوصى بفحص المزارع مرة أخرى للتعبير المستمر عن GFP (في خلايا التحكم في GFP) وتعبير RFP (في جميع الخلايا).
   2. قم بإزالة نصف الزراعة وقسمها حسب الخطوات 2.2–2.7، ثم أعد الطلاء في وسط NSC طازج كامل مع بلاستيسيدين (1000 نانوغرام/مل) وبوروميسين (100 نانوغرام/مل) لتوسيع الزراعة المستمر. قم بتدوير بقية الفضاءات العصبية إلى الأسفل عند 630 × جرام عند 4 درجات مئوية، ثم استنشق السوبرناتانت.
   3. بعد ذلك، غسل الأقراص الصلبة المغلقة مرتين باستخدام PBS بارد جدا، والدوران إلى 630 × جرام عند 4 درجات مئوية وسحب الفائق بعد كل غسل. أضف حوالي 200 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA البارد مع مكمل مثبطات البروتياز والفوسفاتاز إلى كل عينة.
   4. دع الليزات تحتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة، مع ضمان حدوث دوامات متقطعة كل 10 دقائق. قم بطرد العينات على حرارة 14,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل بعناية السوبرناتانت، المعروف باسم الليستات المصفو، إلى أنبوب مبرد مسبقا جديد. احتفظ بالمواد المهيبطة عند -80 درجة مئوية في فريزر عميق.
   5. يمكن بعد ذلك استخدام الليسات في البلوتينغ الغربي (للتحقق من تعبير البنى) وفقا للبروتوكولات السابقة³⁸.
      ملاحظة: إذا لم تستخدم فورا، خزن الليزات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان للحفاظ على سلامة العينة (انظر الجدول 1، النقطة رقم 7).
2. شدة التلألؤ الحيوي (BLI) للتحقق من التعبير المناسب لإزيم لوسيفيراز اليراعات
   ملاحظة: يقوم هذا البروتوكول بالتحقق من تعبير اللوسيفيراز باستخدام مراقبة BLI للخلايا الحية باستخدام أجهزة وبرمجيات محددة (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل). إذا تم استخدام نظام مختلف للكشف عن BLI وقياسه، فقد تختلف المنهجية.
   1. قسم الخلايا العصبية وقم بقياسها حسب الخطوات 2.2–2.8 أعلاه، ثم تخفيف الخلايا في وسط ولوحة NSC كاملة بتركيزات متفاوتة (مثل 2.5 ×^{10 4} خلايا، 1 ×^{10 5} خلايا/بئر) في صفيحة منخفضة الالتصاق فائقة الالتصاق ب 24 بئر (500 مل/بئر)، مع طلاء كل تركيز خلية في رباعية. تحافظ الخلايا على وسط كامل من NSC يحتوي على بلاستيسيدين (1000 نانوغرام/مل) وبوروميسين (100 نانوغرام/مل).
      ملاحظة: لمنع تسرب شدة التوهج المفرز باللوسيفيراز في أحد الآبار إلى الآبار المجاورة أثناء القياس، تجنب طلاء المضامير السطحية في الآبار المجاورة.
   2. شغل نظام التصوير قبل 30 دقيقة على الأقل للسماح لكاميرا الجهاز المرتبطة بالشحنة بالتبريد إلى درجة حرارة التشغيل المثلى (حوالي -90 درجة مئوية). ابدأ برنامج القياس القياسي، وقم بتعقيم غرفة التصوير باستخدام إيثانول بنسبة 70٪، مما يسمح لها بالجفاف تماما قبل الاستخدام.
      ملاحظة: حافظ على درجة حرارة غرفة التصوير عند 37 درجة مئوية لضمان بقاء الخلية خلال جلسات التصوير الطويلة.
   3. قم بإذابة الكميات الأصلية من D-luciferin، لضمان حمايتها من التعرض للضوء. أضف حجم 5 ميكرولتر من محلول D-luciferin العامل بسعة 15 ملغ/مل، واستخدم برفق إلى كل خلية تحتوي على بئر لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 150 ملغ/مل. حرك اللوحة بخفة لضمان توزيع المحلول بشكل متساو.
   4. حضن الصفيحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتسهيل انتشار الركيزة في الخلايا، مما يعزز إنتاج الضوء الأكبر.
   5. ضع اللوح داخل نظام التصوير الحيوي الحساس للتلألئ. ضع شبكة فوق اللوحة. اختر وضع التصوير المضيء ، مع بدء التعريض التلقائي لوقت التعريض. اضبط الوضع على المتوسط، واضبط التوقيف على 1 لتحسين جمع الضوء.
      1. اضبط مجال الرؤية على 'D' لألواح 24 بئرا، وثبت ارتفاع الموضوع عند 1.5 سم. احصل على الصور باستخدام برنامج التصوير. إذا بدا أن الإشارة منخفضة، يمكن ضبط زمن التعريض يدويا (انظر نقطة استكشاف الأخطاء رقم 8).
   6. إجراء تصحيح خلفية ضد آبار التحكم وقياس وحدات الضوء النسبية حسب الحاجة للتحليل اللاحق باستخدام برنامج التصوير.
      ملاحظة: بعد التحقق من BLI، يمكن زرع الخلايا بشكل تقويمي في أدمغة فئران صناعية أو ضعيفة المناعة، وفقا للبروتوكولات السابقة¹⁹.

النتائج

تم عزل الخلايا العصبية البالغة من قشرة فئران C57BL/6 البالغة ونمت في مزرعة غير ملتصقة³⁹، مما أدى إلى تكوين الفضاءات العصبية الأولية (20 – 250 ميكرومتر) خلال 7 إلى 10 أيام (الشكل 1). ثم تم توسيع الخلايا في المختبر. ثم تم تنفيذ تحسين اختيار البلاستيسيدين في مراكز غير محولة (الخطوة 3). بعد 24 ساعة من الاختيار، أدت تركيزات عند أو أكثر من 1000 نانوغرام/مل (1 ميكروغرام/مل) من بلاستيسيدين إلى تقليل حجم الغلاف العصبي (

المناقشة

نجحت هذه الطريقة المكونة من خطوتين في نقل الفيروسات العدسية إلى توليد شبكات غير مجهزة وراثيا مناسبة لأبحاث الأورام. هنا، تم توضيح دمج فعال للطفرة المسرحية BRAF V600E المسرحية (الموجودة في مجموعة فرعية من الأورام الدبقية عالية الدرجة البالغة وتستخدم هنا كدليل مفهومي) أو التحكم في GFP مع أنظمة الإبلاغ المزدوج لتصوير التلألؤ الحيوي (لوسيفيراز) والكشف عن المجهر الفلوري (RFP). أدى النقل المتتابع عند MOI ثابت يبلغ 20، إلى جانب نظام اختيار مزدوج للمضاد الحيوي باستخدام البلاستيسيدين متب...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
β-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-25ML	استخدم داخل خزانة السلامة البيولوجية. اصنع مخزون 50 ملي مولار بإضافة 35 ملليلتر BME إلى 10 ملليلتر DMEM منخفض الجلوكوز، قم بالترشيح بشكل معقم وقسّم إلى 500 ملليلتر لقسط الاستخدام في تحضير الوسط.
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signal Technology	7076	يستخدم بتخفيف 1:2000 في 1% حليب خالي من الدسم
B-27 Supplement (50X)،	Gibco	17504-044	عند الاستخدام الأول، قم بإذابة وصنع 1 ملليلتر من القسائم لاستخدامها في المستقبل؛ قم بتخزين القسائم في -20 درجة مئوية. احتفظ بالمكملات على الثلج بعد إذابتها حتى تكون جاهزًا لإضافتها إلى الوسط
Blasticidin S HCl (10 ملغ/مل)	Gibco	A1113903	اصنع قسائم من مخزون 10 ملغ/مل؛ ضعها في أنابيب صغيرة 200 ملليلتر وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	يستخدم بنسبة 10% BSA بالوزن/الحجم في 1x PBS. BSA لزج؛ تأكد من وزنه بشكل صحيح وإضافة حجم مناسب من المخفف لصنع الحل الدقيق.
Cell Strainer (40 ميكرومتر)	Midsci	40ICS	معقم مسبقًا وملفوف بشكل فردي. يجب فتحه داخل خزانة السلامة البيولوجية. لا تلمسه باليد العارية
D-Luciferin, Potassium Salt	Gold Biotechnology	eLUCK-100	اصنع محلول تشغيل 15 ملغ/ملليلتر (مخفف في ماء من درجة جودة الجزيئية) وقم بالترشيح المعقم قبل الاستخدام. قم بإعداد مخزون جديد كل مرة وأضفه مباشرة إلى الوسط لتحقيق التركيز التشغيلي النهائي 150 ملغ/ملليلتر (مثلاً 5 ملليلتر من محلول التشغيل لكل 500 ملليلتر من الثقافة)
DMEM, Low-Glucose	Gibco	11885-084	يستخدم لتحضير وسط NSC الأساسي
Epidermal Growth Factor (EGF)	Corning	354001	يُقدم كمحلول معقم مجفف؛ لإعادة تكوين المخزون 1000X، أضف 4.95 ملليلتر PBS و50 ميكرولتر 10% BSA (في 1x PBS) إلى 100 ميكروغرام من مسحوق EGF المجفف، وحرّك بالماصة لخلطها. اصنع قسائم 500 ميكرولتر أو أقل في أنابيب صغيرة وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام لمرحلة NSC الكاملة ومرحلة تغذية NSC. تجنب التجميد والذوبان المتكرر.
Fibroblast Growth Factor, Basic (FGF)	R&D systems	233-FB	يُقدم كمحلول معقم مجفف؛ لإعادة تكوين المخزون 1000X، أضف 1.24 ملليلتر PBS و12.5 ميكرولتر 10% BSA (في 1x PBS) إلى 25 ميكروغرام من مسحوق FGF المجفف، وحرّك بالماصة لخلطها. اصنع قسائم 500 ميكرولتر أو أقل في أنابيب صغيرة وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام لمرحلة NSC الكاملة ومرحلة تغذية NSC. تجنب التجميد والذوبان المتكرر.
Glucose, 45%	Corning	25-037-CI	يُقدم كمحلول معقم. لا تفتح خارج خزانة السلامة البيولوجية
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	3724	يستخدم بتخفيف 1: 1000 في 3% ألبومين مصل البقر (Western blotting، للتحقق من التعبير عن علامة HA)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	يُقدم كمحلول معقم. لا تفتح خارج خزانة السلامة البيولوجية
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	يُقدم كمحلول معقم. لا تفتح خارج خزانة السلامة البيولوجية
IVIS 50	PerkinElmer		يجب أن يتم تشغيل الجهاز لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام للسماح للكاميرا بالتبريد إلى درجة الحرارة المثلى. يتم استخدام برامج Living Image (الإصدار 4.3.1) للقياس الكمي.
Lentivirus-Luciferase (Firefly)-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	يجب تقسيم LVP وتخزينها في الثلاجة -80 درجة مئوية
L-Glutamine, 200 ملي مولار	Corning	25-005-CI	يُقدم كمحلول معقم. لا تفتح خارج خزانة السلامة البيولوجية
Molecular-Grade Water	Corning	46-000-CM	يُقدم كمحلول معقم. لا تفتح خارج خزانة السلامة البيولوجية
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048	عند الاستخدام الأول، قم بإذابة وصنع 1 ملليلتر من القسائم لاستخدامها في المستقبل؛ قم بتخزين القسائم في -20 درجة مئوية. احتفظ بالمكملات على الثلج بعد إذابتها حتى تكون جاهزًا لإضافتها إلى الوسط
Nestin (E5C7I) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	89529	يستخدم بتخفيف 1: 1000 في 3% ألبومين مصل البقر (Western blotting، للتحقق من التعبير عن علامة NSC)
Neurobasal Media	Gibco	21103-049	يُستخدم لتحضير وسط NSC الأساسي
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	يُقدم كمحلول معقم؛ قم بتقسيمه وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS)	Corning	MT21040CV	يُقدم كمحلول معقم. لا تفتح خارج خزانة السلامة البيولوجية
Protease/Phosphatase inhibitor	Cell Signal Technology	5872S	يجب تخزينه في -20 درجة مئوية
Puromycin Dihydrochloride	Gibco	A1113803	اصنع قسائم من مخزون 10 ملغ/ملليلتر؛ ضعها في أنابيب صغيرة 200 ملليلتر وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
RIPA Lysis Buffer, 10x	Millipore-Sigma	20-188	قم بتخزينه في -80 درجة مئوية واصنع قسائم من 1x في ماء مزدوج التقطير معقم
Serum-Free Cell Freezing Medium	Bambanker (Nippon Genetics)	CS-04-001/BB02	قم بتخفيف الخلايا في 1 ملليلتر من وسط التجميد لكل قارورة تبريد لتخزين NSCs. بعد إضافة وسط التجميد إلى الخلايا، يمكن وضع الخلايا في -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد؛ لا حاجة للتبريد البطيء أو التخزين في النيتروجين السائل.
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Corning