مقالة منهجية

تحديد مرشحي مكافحة السل المحتملين: دليل خطوة بخطوة للتخليق، وتحديد MIC، وتقييم سمية الخلايا في الخلايا الثديية

DOI:

10.3791/70693

⸱

مايو 22, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular and Functional Biology Research, National Institute of Science and Technology in Tuberculosis, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, 2Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, School of Health and Life Sciences, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, 3Graduate Program in Medicine and Health Sciences, School of Medicine, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا لتحديد مرشحي أدوية مضادة للسل من خلال الفحص الظاهري، يشمل التخليق الكيميائي لمركب 4-أمينوكوينولين، وتحديد تركيزه المثبط الأدنى ضد متفطرة السل، وتقييم سممية الخلايا في خطوط الخلايا الثديية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال السل أحد الأسباب الرئيسية للوفاة بسبب عامل معد واحد في العالم، مع ارتفاع معدلات مقاومة الأدوية مما يجعل تطوير العوامل العلاجية الجديدة أولوية صحية عالمية. يصف هذا البروتوكول نهج فحص ظاهري لتحديد مرشحين محتملين لأدوية مكافحة السل عبر ثلاث مراحل متكاملة. أولا، يتم تصنيع مركب من فئة 4-أمينوكوينولين عبر مسار من ثلاث خطوات ويتميز بالكامل بكروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC)، ومطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR)، ومطياف الكتلة عالية الدقة (HRMS). ثانيا، يتم تقييم النشاط المضاد للميكروبات للمركب ضد متفطرة السل باستخدام اختبار الميكرولوكتيريوم لتقليل الريزورين (REMA)، الذي يحدد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) من خلال قراءة بصرية بسيطة لتغير اللون. ثالثا، يتم تقييم سمية المركب في خطين خلويين من الثدييات، فيرو (كلية القرد الأخضر الأفريقي) وHepG2 (سرطان الخلايا الكبدية البشرية)، باستخدام اختبار MTT (3-[4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-yl]-2,5-ديفينيل تترازوليوم بروميد) واختبار الامتصاص الأحمر المحايد (NRU). هاتان الاختبارتان المكملتان تقيسان معايير خلوية مميزة، مما يتيح التحقق المتقاطع لنتائج السمية الخلوية. معا، تسمح بيانات MIC وبيانات السمية الخلوية بحساب مؤشر الانتقائية (SI) لتقييم الإمكانات العلاجية لكل مركب. يوفر هذا البروتوكول إطارا قابلا للتكرار خطوة بخطوة لتحديد حالات السل المبكرة والتقييم قبل السريري.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسببه السل بشكل رئيسي البكتيريا المتفطرة السلية (Mtb)، وهو مرض تنفسي معدي في البشر يستهدف الرئتين بشكل أساسي، رغم أن متغيرات خارج الرئة قد تحدث أيضا. ينتشر السل عبر العصيات الجبلية الجبلية المحمولة جوا التي تطلقها الأفراد المصابون بمرض نشط1. اعتمادا على تقدم المرض، قد يصاب الشخص المصاب بالسل فورا بالسل النشط. ومع ذلك، عادة ما يصاب الفرد المصاب حديثا بمرض السل الكامن، حيث تبقى خلايا Mtb ذات النشاط الأيضي المنخفض على قيد الحياة داخل الحبيبات 1,2. قد يطور الشخص المصاب بالسل الكامن في النهاية الشكل النشط للمرض، مما يظهر عليه الأعراض السريرية3. حاليا، يقدر أن ربع سكان العالم يعانون من عدوى السل الكامنة4.

على الرغم من العديد من التقدمات، لا يزال السل مشكلة صحية عامة خطيرة على مستوى العالم. تظهر بيانات التقرير العالمي الأخير للسل أن 10.7 مليون شخص أصيبوا بالمرض في عام 2024. خلال نفس العام، تم تسجيل 1.23 مليون وفاة بسبب السل حول العالم، مما جعل السل السبب الرئيسي للوفاة بسبب عامل معد واحدفقط. إلى جانب الأمراض والبيولوجيا المعقدة للجبال الضخمة، فإن الجوانب الاجتماعية والاقتصادية مثل الفقر وسوء التغذية، إلى جانب العوامل الصحية مثل التدخين والسكري والعدوى المشتركة بفيروس نقص المناعة البشرية، تجعل السيطرة على الأمراضأكثر صعوبة. يساهم هذا في استمرار مرض السل كقضية صحية عالمية دائمة.

علاوة على ذلك، فإن العلاجات الحالية للسل تعاني من قيود تعقد مكافحة المرض. ضد السلالات الحساسة من MtB، يتكون العلاج القياسي من علاج مركب يضم 4 أدوية: الإيزونيازيد (INH)، الريفامبيسين (RIF)، الإيثامبوتول (EMB)، والبيرازيناميد (PZA). تعطى هذه المضادات الحيوية لمدة لا تقل عن 6 أشهر، وتتطلب الالتزام الصارم طوال فترة العلاج. هذا النظام العلاجي، رغم فعاليته في معظم الحالات وحقق معدل نجاح حوالي 85٪، لا يزال يواجهالعديد من التحديات. من أكبر المشكلات الآثار الجانبية وطول مدة العلاج، والتي غالبا ما تؤدي إلى انقطاع مبكر من قبل المريض. هذا التوقف، إلى جانب سوء الإعطاء للمضادات الحيوية، يفضل اختيار سلالات MtB المقاومة، التي تتطلب أنظمةعلاجية أكثر سمية وتكلفة وأوسع 7،8.

وبالنظر إلى هذا السيناريو، فإن تطوير أدوية جديدة وقوية لمكافحة السل أمر عاجل. يوضح هذا البروتوكول المراحل الأولى من البحث في مرشحين جدد للأدوية باستخدام الفحص الظاهري. لتوضيح تطبيق هذا البروتوكول، اخترنا مركب 4-أمينوكوينولين مشتق من LABIO-17 للتقييم. تم تحديد LABIO-17 سابقا من قبل مجموعتنا البحثية كمثبط لإنزيم الإينويل-ACP-ريدوكتاز (InhA) في Mtb، وهو نفس الهدف الجزيئي لإيزونيازيد (INH)9,10. يشارك InhA في تخليق حمض الفطر الفطري في M. tuberculosis وهو ضروري لبقاء العصية، مما يبرز أهميته كهدف جزيئي واعد11

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التخليق الكيميائي والتوصيف

ملاحظة: يتم إجراء تخليق وتوصيف المركب الكيميائي كما هو موضح سابقا10. يجب تنفيذ جميع الخطوات من 1.1 إلى 1.4 باستخدام غطاء بخار جيد التهوية باستخدام قفازات النيتريل.

  1. تحضير الكواشف
    1. تحضير MeOH/CH₃CN (1:1) مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪
      1. قم بقياس أحجام متساوية من الميثانول (MeOH) والأسيتونيتريل (CH₃CN) لتحضير خليط بنسبة 1:1 (v/v) (درجة HPLC).
      2. ادمج المذيبات في وعاء نظيف وجاف (مثل قارورة حجمية). أضف حمض الفورميك لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 0.1٪ (v/v) (مثلا، أضف 1 مل من حمض الفورميك إلى 1 لتر من خليط المذيبات).
      3. اخلط جيدا عن طريق التحريك أو التحريك اللطيف. احتفظ به في وعاء مغلق بإحكام في درجة حرارة الغرفة، محميا من الضوء.
    2. تحضير حمض الخليك بنسبة 1٪ (v/v) في ماء فائق النقي
      1. اشطف القارورة الحجمية بماء فائق النقي، ثم ضعها على المنضدة. أضف ~80٪ من حجم الماء فائق النقاء النهائي إلى القارورة (أي 80 مل لقارورة 100 مل؛ 800 مل لقارورة 1 لتر).
      2. باستخدام ماصة معايرة، أضف حمض الخليك الجليدي لتحقيق 1٪ (v/v): لحجم نهائي 100 مل → أضف 1.0 مل حمض الأسيتيك؛ لحجم نهائي 1 لتر → أضف 10.0 مل حمض الخليك.
      3. اخلط جيدا عن طريق التدوير أو التحريك. املأ القارورة حتى العلامة النهائية بماء فائق النقي وامزج.
      4. قم بإزالة الغاز من المحلول عن طريق التصويب باستخدام منظف فوق صوتي (تردد الخزان ~40 كيلوهرتز) مضبوط على وضع إزالة الغازات لمدة 20 دقيقة عند درجة الحرارة المحيطة.
      5. انقل إلى زجاجة كهرمانية تحمل علامة (الملصق: المحتوى، التركيز، درجة المذيب، التاريخ، المعد). خزن مغلقا بإحكام في درجة حرارة الغرفة.
    3. تحضير الأسيتونيتريل :الميثانول (1:1، v/v)، درجة HPLC
      1. قس أحجام متساوية من الأسيتونيتريل والميثانول: لحجم نهائي 100 مل → 50.0 مل أسيتونونتريل + 50.0 مل ميثانول؛ لحجم نهائي 1 لتر → 500 مل أسيتونونتريل + 500 مل ميثانول.
      2. ادمج المذيبات في قارورة أو زجاجة حجم نظيفة وامزج عن طريق الانقلاب أو التحريك. قم بترشيح الخليط عبر فلتر بحجم 0.45 ميكرومتر إلى وعاء نظيف لإزالة الجسيمات.
      3. قم بإزالة الغاز من المحلول عن طريق التصويب باستخدام منظف فوق صوتي (تردد الخزان ~40 كيلوهرتز) مضبوط على وضع إزالة الغازات لمدة 20 دقيقة عند درجة الحرارة المحيطة.
      4. الانتقال إلى زجاجة كهرمانية تحمل علامة (الملصق: تركيب، درجة المذيب، التاريخ، التحضير). خزن مغلقا بإحكام في درجة حرارة الغرفة، بعيدا عن الحرارة والضوء.
    4. تحضير محلول هيكسان/إيثيل أسيتات بنسبة 7:3 (v/v) للكروماتوغرافيا العمودية
      1. قم بقياس 70٪ من الحجم النهائي بالهيكسان. مثال: للحجم النهائي 100 مل → 70 مل هكسان.
      2. قم بقياس 30٪ من الحجم النهائي بأسيتات الإيثيلي. مثال: بالنسبة ل 100 مل حجم نهائي → 30 مل من أسيتات الإيثيل.
      3. ادمج كلا المذيبين في وعاء نظيف وجاف (مثل قارورة حجمية أو زجاجة).
      4. اخلط جيدا عن طريق العكس أو التحريك حتى يصبح متجانسا. ضع علامة على الحاوية بالتركيب، التاريخ، درجة المذيب، وجهاز التحضير.
    5. تحضير محلول هيكسان/إيثيل أسيتات بنسبة 1:1 (v/v) للكروماتوغرافيا العمودية
      1. قم بقياس 50٪ من الحجم النهائي بالهيكسان. مثال: للحجم النهائي 100 مل → 50 مل هيكسان.
      2. قم بقياس 50٪ من الحجم النهائي بأسيتات الإيثيلي. مثال: للحجم النهائي 100 مل → 50 مل من أسيتات الإيثيلي.
      3. ادمج كلا المذيبين في وعاء نظيف وجاف (مثل قارورة حجمية أو زجاجة). اخلط جيدا عن طريق العكس أو التحريك حتى يصبح متجانسا.
      4. ضع علامة على الحاوية بالتركيب، التاريخ، درجة المذيب، وجهاز التحضير.
    6. تحضير محلول بيكربونات الصوديوم المشبع (NaHCO₃)
      1. وزن كمية زائدة من بيكربونات الصوديوم (NaHCO₃) (حوالي 15–20 جرام لكل 100 مل من الماء).
      2. أضف بيكربونات الصوديوم إلى كأس نظيف يحتوي على حجم معروف من الماء المقطر (على سبيل المثال، 100 مل). حرك الخليط باستمرار في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) باستخدام محرك مغناطيسي أو قضيب زجاجي.
      3. استمر في التحريك حتى لا يذوب الصلب ويبقى كمية صغيرة من بيكربونات الصوديوم غير المذابة في القاع — وهذا يشير إلى أن المحلول مشبع.
      4. اترك التعليق يستقر لمدة 10–15 دقيقة ليستقر المادة الصلبة غير المذابة. قم بتصفية الخليط عبر فلتر ورقي أو قمع زجاجي مبلل لإزالة الفائض من البيكربونات غير المذابة.
      5. اجمع محلول الترشيح الشفاف، وهو محلول بيكربونات الصوديوم المشبع.
      6. احتفظ بالمحلول في زجاجة مغلقة بإحكام، تحمل اسم المركب، وتركيزها (مشبع)، وتاريخ التحضير، وحروف اسمك.
      7. حافظ على المحلول في درجة حرارة الغرفة وحضره طازجا عند الحاجة، لأن ثاني أكسيد الكربونيمكن أن يتسرب ببطء ويغير تركيزه مع الوقت.
  2. تخليق 6-برومو-2-ميثيلكينولين-4-أول (3)
    1. حضر محلولا يحتوي على 4-برومونيلين (1.2 جم، 7.3 ملليمول) وكبريتات المغنيسيوم اللامائية (1.08 جم، 9.0 ملليمول) في الإيثانول (15 مل).
    2. أضف حمض الخليك الجليدي (0.33 مل) وإيثيل أسيتو أسيتات (1.8 مل، 14.1 ملليمول) إلى المحلول. حرك خليط التفاعل على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    3. فلتر خليط التفاعل عبر السليلوز، واحتفاظ ب 11 ميكرومتر، وورق ترشيح نوعي لإزالة كبريتات المغنيسيوم المعلق.
    4. تبخر الإيثانول باستخدام مبخر دوار للحصول على وسيط الأكريلات.
    5. سخن الوسيط باستخدام حمام زيت مناسب يحتوي على سائل نقل حرارة صناعي عالي الأداء (انظر جدول المواد) (15 مل) عند 230–250 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإكمال التفاعل.
    6. برد الخليط إلى درجة حرارة الغرفة. قم بترشيح الراسب المتكون واغسله بالهيكسان والكلوروفورم.
    7. تركيز المنتج النهائي تحت ضغط منخفض باستخدام مبخر دوار حتى تتم إزالة جميع المذيبات المتبقية (انظر جدول المواد).
  3. تخليق 6-برومو-4-كلورو-2-ميثيلكوينولين (4)
    1. حضر محلول من 6-برومو-2-ميثيلكينولين-4-أول (0.65 جم، 2.8 ملليمول) في تولوين (10 مل). أضف أوكسي كلوريد الفوسفور(V) (0.65 مل، 6.9 ملليمول) إلى المحلول.
    2. حرك خليط التفاعل على حرارة 110 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بإزالة أوكسي كلوريد الفوسفور(V) الزائد باستخدام مبخر دوار.
    3. برد البقايا في حمام ثلج. قم بتحييد خليط التفاعل باستخدام محلول بيكربونات الصوديوم المشبع.
    4. استخرج المنتج باستخدام أسيتات الإيثيل (3 × 50 مل). ادمج الأطوار العضوية وجففها فوق كبريتات الصوديوم اللامائي.
    5. تبخر المذيب باستخدام مبخر دوار للحصول على بقايا صلبة. جفف المادة الصلبة الناتجة باستخدام مبخر دوار لتوفير المنتج الخام.
    6. قم بتنقية المركب باستخدام الكروماتوغرافيا الفلاش على هلام السيليكا (35–70 شبكة) باستخدام الهكسان:أسيتات الإيثيل (7:3) كمحلول مشلل.
  4. تخليق 6-برومو-2-ميثيل-ن-(4-(بيبريدين-1-إيل)فينيل)كينولين-4-أمين (6)
    1. حضر خليط تفاعل يحتوي على 6-برومو-4-كلورو-2-ميثيلكينولين (0.53 جم، 2 ملليمول)، 4-(بيبريدين-1-إيل)أنيلين (0.57 جم، 3 ملليمول)، بيريدين (0.24 مل)، وHCl بنسبة 37٪ (0.2 مل) في إيزوبروبانول (20 مل).
    2. حرك خليط التفاعل على درجة حرارة 85 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. قم بإزالة المذيب باستخدام مبخر دوار.
    3. عالج البقايا بمحلول بيكربونات الصوديوم المشبع.
    4. قم بترشيح المادة الصلبة الناتجة عبر ورق ترشيح نوعي للاحتفاظ بسعة 11 ميكرومتر من السليلوز وإذابه في الكلوروفورم (50 مل).
    5. اغسل محلول الكلوروفورم بالماء (3 × 15 مل). جفف الطور العضوي فوق كبريتات الصوديوم اللامائية.
    6. تبخر المذيب باستخدام مبخر دوار للحصول على مادة صلبة خضراء. قم بتنقية المنتج بغسلات متتالية باستخدام السكسان الساخن (4 × 10 مل).
    7. قم بالتنقيية النهائية باستخدام الكروماتوغرافيا الفلاش على هلام السيليكا (35–70 شبكة) باستخدام الهكسان:أسيتات الإيثيل (1:1) كمحلول تنظير.
  5. الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (TLC)
    1. راقب تقدم التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على ألواح TLC Silica gel 60 F254.
    2. استخدم المادة الابتدائية 4 كمرجع لمراقبة التفاعل وتقييم استهلاكه.
  6. نقطة الانصهار (عضو البرلمان)
    1. أضف طرف الملعقة من المركب إلى جهاز نقطة الانصهار. سجل نطاق نقطة الانصهار.
    2. لا تطبق أي تصحيحات على القيم المقاسة. قم بإجراء التجربة بثلاث نسخ.
  7. الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)
    1. يزن 1–2 ملغ من المركب 6. جهز محلول مخزوني للمركب بتركيز 1.0 ملغ/مل في أسيتونيتريل/ميثانول (1:1، فولت/فولت).
    2. قم بتخفيف محلول المخزون إلى 0.5 ملغ/مل للتحليل. تحليل العينات باستخدام نظام HPLC (انظر جدول المواد) مزود بمضخة مزدوجة، وحقنة أوتوماتيكية، وكاشف للأشعة فوق البنفسجية.
    3. جمع ومعالجة البيانات باستخدام برامج جمع بيانات الكروماتوغرافيا (انظر جدول المواد).
    4. اضبط الظروف الكروماتوغرافية كما يلي: استخدم عمود C18 عكسي الطور، 5 ميكرومتر (250 × 4.6 مم) (انظر جدول المواد). اضبط معدل التدفق إلى 1.5 مل/دقيقة وراقب اكتشاف الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر. حافظ على الطور المتحرك عند 100٪ ماء (0.1٪ حمض الخليك) من 0 إلى 7 دقائق؛ تطبيق تدرج خطي من 100٪ ماء (0.1٪ حمض الخليك) إلى 90٪ أسيتونيتريل / ميثانول (1:1، فولت/فولت) من 7 إلى 15 دقيقة؛ أعد إلى الماء بنسبة 100٪ (0.1٪ حمض الخليك) خلال 5 دقائق واحتفظ به لمدة 10 دقائق إضافية.
  8. الرنين المغناطيسي النووي (1H, 13C)
    1. ازن 15–20 ملغ من المركب 6 داخل أنبوب NMR. أضفDMSO-d 6 كمذيب.
    2. الحصول على أطياف بالرنين المغناطيسي النووي بتردد 1H و13Cعلى مطياف NMR (انظر جدول المواد) باستخدام تسلسلات نبضات قياسية.
    3. تشغيل الجهاز عند 400 ميجاهرتز لنوى 1H و100 ميجاهرتز لنوى 13C. استخدم التتراميثيلسيلان (TMS) كمرجع داخلي.
    4. تعبر عن التحولات الكيميائية (δ) بأجزاء في مليون (جزء في المليون). استخدم ملف FID المستخرج من التجربة لتصوير ومعالجة بيانات الرنين المغناطيسي النووي.
  9. مطيافية الكتلة عالية الدقة (HRMS)
    1. يزن 1–2 ملغ من المركب 6. جهز العينة في خليط بنسبة 1:1 من MeOH/CH 3CN يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك.
    2. قم بالتحليل على مطياف كتلة أوربيراب عالي الدقة (انظر جدول المواد)، الذي يجمع بين مطياف كتلة مصيدة أيونية خطية ومحلل كتلة أوربيتراب.
    3. يتم إدخال العينة عن طريق التسريب المباشر بمعدل تدفق 10 ميكرولتر/دقيقة في وضع الأيون الموجب باستخدام التأين بالرش الكهربائي (ESI).
    4. حدد تركيب العناصر باستخدام أداة تركيب العناصر في برنامج تحليل بيانات مطيافية الكتلة (انظر جدول المواد).
  10. كروماتوغرافيا الأعمدة – المركب 4
    1. جهز عمود من هلام السيليكا باستخدام هلام السيليكا بطول 60 أونغستروم (70–230 شبكة، 0.063–0.200 مم). املأ العمود بشكل مناسب بجل السيليكا.
    2. استخدم أسيتات الهكسان/الإيثيل (7:3، v/v) كطور متحرك. حمل المركب الخام 4 على العمود. قم بإخراج المركب وجمع الكسور.
    3. راقب الكسور حسب العناية ودمج تلك التي تحتوي على المنتج النقي.
  11. كروماتوغرافيا الأعمدة – المركب 6
    1. جهز عمود من هلام السيليكا باستخدام هلام السيليكا بطول 60 أونغستروم (70–230 شبكة، 0.063–0.200 مم). املأ العمود بشكل مناسب بجل السيليكا.
    2. استخدم أسيتات الهكسان/الإيثيل (1:1، v/v) كطور متحرك. حمل المركب الخامي 6 على العمود. قم بإخراج المركب وجمع الكسور.
    3. راقب الكسور حسب العناية ودمج تلك التي تحتوي على المنتج النقي.

figure-protocol-1
الشكل 1. المواد الكيميائية والشروط: i = MgSO4، AcOH، EtOH، 90 °C، 16 ساعة؛ ii = C12H10، C12H10O، 230-250 °C، 15 دقيقة؛ iii =POCl 3، تولوين، 110 °C، 2 ساعة؛ iv = بيريدين، HCl، (الفصل3)2CHOH، 85 °C، 16 ساعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط

  1. التصميم التجريبي وتخطيط الألواح
    1. تقييم المركبات لقدرتها على تثبيط نمو M. tuberculosis باستخدام اختبار الميكرولوكتر لتقليل الريزورين (REMA) لتحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC)، كما هو موضح سابقا 11,12,13.
    2. قم بإجراء ثلاث تجارب مستقلة (ثلاث نسخ بيولوجية) لكل مركب تم اختباره بدون نسخ تقنية (صف واحد لكل مركب ولوح واحد لكل تجربة).
    3. قيم المركبات التي تعمل كعوامل تحكم إيجابية مع مركبات الاختبار لضمان أن ظروف الاختبار تسمح بتثبيط النمو.
    4. اختبار الإيزونيازيد (INH) والريفامبيسين (RIF) كعوامل تحكم إيجابية.
    5. خصص الصفين A و B للمركبات الضابطة (INH و RIF على التوالي).
    6. خصص الصفوف التالية لمركبات الاختبار (المركبات من A إلى F في الشكل 2).
    7. جهز الأعمدة من 1 إلى 10 بتخفيفات تسلسلية مزدوجة من المركبات الضابطة والاختبارية، حيث يشغل كل مركب صفا واحدا، مع التركيز الأعلى في العمود 10 والتركيز الأقل في العمود 1.
    8. جهز العمود 11 كأداة تحكم قابلة للحياة تحتوي على وسط نمو وبكتيريا بتركيز نهائي ل DMSO يبلغ 2.5٪، دون إضافة أي مركب تحكم أو اختبار.
    9. تحضير العمود 12 كوسيلة تحكم في التعقيم عن طريق إضافة مركبات تحكم أو اختبار عند تركيز أعلى من التخفيف التسلسلي (نفس العمود 10) إلى وسط نمو بدون خلايا بكتيرية.
    10. راجع الشكل 2 لترتيب تمثيلي للوحة MIC.
  2. تحضير الكواشف
    1. تحضير مرق ميدلبروك 7H9 مع إضافة حمض الأوليك، الألبومين، الدكستروز والكاتالاز (OADC).
      1. إلى زجاجة زجاجية بسعة 200 مل تحتوي على 90 مل من الماء فائق النقي، أضف 0.47 جرام من مسحوق 7H9، و0.24 مل من 85٪ جلسرول، و0.5 مل من 10٪ Tween-80.
      2. استخدم جهاز الوسط لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 121 درجة مئوية و98.07 كيلو باسكال.
      3. اترك الوسط ليبرد حتى يصبح دافئا عند اللمس (حوالي 45–50 درجة مئوية).
      4. أضف 10 مل من OADC (نستخدم OADC المتوفر تجاريا؛ راجع جدول المواد للتفاصيل).
      5. تخزين عند 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: جهز الكمية المناسبة للتجربة، مع الأخذ في الاعتبار نسب المواد الكيميائية.
    2. تحضير مرق ميدلبروك 7H9 مع ADC
      1. إلى زجاجة زجاجية بسعة 200 مل تحتوي على 90 مل من الماء فائق النقي، أضف 0.47 جرام من مسحوق 7H9. استخدم جهاز الوسط لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 121 درجة مئوية و98.07 كيلو باسكال.
      2. اترك الوسط ليبرد حتى يصبح دافئا عند اللمس (حوالي 45–50 درجة مئوية). أضف 10 مل من ADC. تخزين عند 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: جهز الكمية المناسبة للتجربة، مع الحفاظ على نسب المواد الكيميائية.
    3. تحضير محاليل المخزون المركب
      1. جهز محلول مخزوني لكل مركب بتركيز 2 ملغ/مل مذاب في DMSO.
      2. تخزين عند –20 درجة مئوية.
        ملاحظة: قبل التجربة، يتم تحديد أقصى تركيز للاختبار بناء على تقييم الذوبانية. لتحديد حد الذوبانية، افحص المحاليل بصريا بحثا عن وجود بلورات. إذا تم رصد بلورات، يتم تخفيف الزيادة إلى نصف التركيز السابق. قم بإجراء هذا التقييم باستخدام 5٪ DMSO.
    4. تحضير المحاليل المركبة العاملة
      ملاحظة: يجب تحضير المحاليل العاملة حديثا وقت التجربة عن طريق تخفيف المركبات المركبة في مرق 7H9 مع 10٪ من ADC. يجب أن يكون تركيز DMSO النهائي في محلول العمل 5٪، ويجب أن يكون تركيز المركب ضعف أعلى تركيز اختبار مقصود. ومن الجدير بالذكر أن التركيز النهائي ل DMSO الذي تتعرض له البكتيريا أثناء الاختبار هو 2.5٪، حيث يتضاعف الحجم بعد إضافة التعليق البكتيري (انظر القسم 2.3، الخطوة 2.3.8).
      ملاحظة: DMSO بنسبة 2.5٪ تتحمل السلالات البكتيرية المستخدمة في مختبرنا (M. tuberculosis H37Ra، H37Rv والعازلات السريرية). إذا كنت تعمل مع سلالات أخرى أو أنواع بكتيرية أخرى، قم بإجراء تجربة أولية لتقنية MIC باستخدام DMSO كمركب اختبار لتحديد أعلى تركيزات DMSO التي يمكن استخدامها دون تعزيز تثبيط النمو.
    5. تحضير محلول ريزازورين
      1. حضر محلول ريزازورين بنسبة 0.01٪ عن طريق إذابة 1 ملغ من الريازورين في 10 مل من الماء فائق النقي.
      2. تعقيم المحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
        ملاحظة: يمكن تخزين ريزازورين المعقم بالفلتر عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع14. ومع ذلك، حضر هذا الحل مباشرة قبل استخدامه كإجراء قياسي.
  3. تحضير الفطريات
    1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من M. tuberculosis في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل يحتوي على 10 مل من مرق 7H9 مع مكمل 10٪ OADC، 0.2٪ جلسريول، و0.05٪ Tween-80.
    2. حضن الزراعة مع هز مستمر (100 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية حتى تصل الزراعة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD600) تتراوح بين 0.6 إلى 0.8 (حوالي 3 إلى 4 أسابيع).
      تحذير: يصنف M. tuberculosis H37Rv كمسبب ممرض من فئة الخطر 3، قادر على الانتقال جويا والتسبب في أمراض قاتلة محتملة للبشر. إجراء جميع العمليات في خزانة سلامة حيوية معتمدة داخل مختبر السلامة البيولوجية المستوى 3 (BSL-3)، باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).
    3. قم بتجانس الثقافة البكتيرية عن طريق الدوامة باستخدام خرز زجاجي معقم (1 مم) لمدة 3 دقائق.
    4. اترك التعليق يستريح لمدة 15 دقيقة لتثبيت الكتل.
    5. قس OD600 من المادة الفائقة وتخزين الأليكوات عند −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: في التجارب، قم بتخفيف التعليق البكتيري إلى ODنظريا 600 بقيمة 0.006 في مرق 7H9 طازج مع 10٪ ADC. قم بتوزيع 100 ميكرولتر لكل بئر في صفائح ذات 96 بئر أثناء الاختبار.
  4. تحضير ألواح بئر 96
    1. أضف 100 ميكرولتر من مرق 7H9 مع 10٪ ADC إلى العمود 12.
    2. أضف 100 ميكرولتر من مرق 7H9 مع 10٪ ADC (يحتوي على 5٪ DMSO) إلى الأعمدة 11 و9 إلى 1.
    3. أضف 200 ميكرولتر من المحلول المركب (المعد بضعف أعلى تركيز اختباري) إلى العمود 10 (خصص صفا واحدا لكل مركب).
    4. أضف 100 ميكرولتر من المحلول المركب إلى العمود 12. قم بتخفيف تسلسلي مزدوج: نقل 100 ميكرولتر من العمود 10 إلى العمود 9 وامزجه جيدا عن طريق التوصيل.
    5. استمر في التخفيف التسلسلي من العمود 9 إلى العمود 1. تخلص من ال 100 ميكرولتر النهائي من العمود 1.
    6. أضف 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري (OD600 النظري بقيمة 0.006) إلى الأعمدة من 11 إلى 1.
    7. غط اللوحة، وأغلق بطبقة باراغليم، وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
      ملاحظة: الشكل 2 هو تخطيط تمثيلي للوحة MIC. راجع هذا الشكل لتفسير الخطوات 2.3.1 إلى 2.3.9.
  5. إضافة ريزازورين وتحليل البيانات
    1. أضف 60 ميكرولتر من محلول ريزازورين بنسبة 0.01٪ إلى كل بئر في الصفيحة. غط اللوحة، وأغلق بطبقة باراغليم، ثم حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    2. لاحظ تغير اللون من الأزرق (تثبيط النمو) إلى الوردي (نمو بكتيريا).
      ملاحظة: في بعض التجارب، يؤدي تغير اللون غير الكامل إلى بئر بنفسجي. فسر هذا على أنه نمو بكتيريا.

figure-protocol-2
الشكل 2. تمثيل تخطيطي للوحة تخفيف المرق الدقيقة المستخدمة لتحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC). تم توزيع التخفيف التسلسلي المزدوج للمركبات المختبرة عبر الأعمدة 1–10، ويتم إجراء التخفيف التالي بالتتابع من العمود 10 إلى العمود 1، مع أعلى تركيز مركب في العمود 10. الصفان A و B هما الصفان الإيجابيان المضابطان الذي يحتوي على أدوية مرجعية إيزونيازيد وريفامبيسين على التوالي. الصفوف C–H تتوافق مع المركبات المختبرة. يمثل العمود 11 التحكم في القابلية للحياة (وسط يحتوي على 2.5٪ من لقاح DMSO واللقاح البكتيري)، بينما يمثل العمود 12 مادة التحكم في العقم (وسط يحتوي على المركبات في غياب اللقاح البكتيري). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تقييم السمية الخلوية في خطوط الخلايا الثديية

ملاحظة: إجراء جميع عمليات التلاعب بزراعة الخلايا تحت ظروف معقمة في خزانة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية معتمدة.

  1. تحضير خطوط الخلايا الثديية
    1. زراعة سرطان الكبد البشري (HepG2) وخطوط خلايا القرد الأخضر الأفريقي (Vero) في وسط النسر المعدل (DMEM) في دولبيكو.
    2. أضف إلى الوسط 1.8 جرام/لتر بيكربونات الصوديوم، و10٪ مصل البقر الجيني (FBS)، و1٪ بنسلين/ستربتومايسين، و0.1٪ أمفوتريسين B (ويشار إليه كوسط كامل).
    3. حضن المزارع الخلوية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    4. احصد الخلايا تحت التلاصق (70٪–80٪) عن طريق معالجتها بمحلول تربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ لمدة 5–10 دقائق.
    5. قم بتحييد التربسين بإضافة حجم متساو من الوسط الكامل. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 200 × جرام لمدة 5 دقائق.
    6. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط كامل طازج.
    7. تحديد تركيز الخلية وقابليتها للبقاء باستخدام عداد خلوي آلي أو مقياس خلية الدم مع استبعاد التريبان الأزرق.
      ملاحظة: لاستبعاد التريبان الأزرق، اخلط 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من محلول 0.4٪ من تريبان بلو وحمل على جهاز قياس الدم (أو شريحة العد). تظهر الخلايا الميتة أو المضررة من الغشاء باللون الأزرق، بينما تبقى الخلايا الحية غير مصبوغة. احسب الجدوى كنسبة ٪ من القابلية للبقاء = (الخلايا غير المصبوغة / إجمالي الخلايا) × 100. تابع البذر فقط إذا كانت صلاحية العيش ≥ 90٪.
    8. قم بتخفيف تعليق الخلية إلى كثافة البذر المستهدفة. زرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من الأعمدة 2 إلى 12 من صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا.
      كثافات البذر: 4000 خلية/بئر لخلايا فيرو؛ 5000 خلية/بئر لخلايا HepG2.
      ملاحظة: قم بتحسين هذه الكثافات لضمان بقاء الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي وعدم الوصول إلى 100٪ التقاء قبل نقطة النهاية التي تبلغ 48 ساعة.
    9. املأ العمود 1 ب 100 ميكرولتر من الوسط الكامل (بدون خلايا) ليكون فراغا لقياسات الامتصاص.
    10. جهز أربع ألواح متطابقة لكل خط خلوي: اثنتان لاختبار MTT واثنتان لاختبار NRU.
    11. حضن الصفائح لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربونللسماح بتثبيت الخلايا.
  2. تخفيف المركبات ومعالجة الخلايا
    1. تحضير محاليل مخزون لكل مركب اختبار في محلول ملحي مخزن الفوسفات من دولبيكو (DPBS) أو مذيب مناسب (مثل ثنائي ميثيل كبريتوكسيد؛ DMSO).
      ملاحظة: تحقق من أن المركب قابل للذوبان في وسط زراعة الخلايا وأن تركيز المذيب غير سام (مثلا <0.1٪ v/v ل DMSO) قبل الاختبار.
    2. صمم تخطيط اللوحة ليشمل الفراغات، وأدوات التحكم المناسبة، والنسخ التقنية. يظهر الشكل 3 مخطط تمثيلي لاختبار ما يصل إلى 9 مركبات عبر 8 تركيزات.
    3. تحضير مخففات تسلسلية لمركب الاختبار في وسط كامل لتغطية نطاق التركيز المقصود. تأكد من تجهيز حجم كاف لجميع الألواح المكررة.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم مذيبا (مثل DMSO)، قم بإضافة وسط التخفيف بحيث يبقى تركيز المذيب النهائي ثابتا عبر سلسلة التخفيف التسلسلية بأكملها.
      ملاحظة: الآبار المعالجة بالمذيب (التحكم في المركبات) تعمل كأداة تحكم سلبية وظيفية، حيث تحدد جدوى الخلايا بنسبة 100٪ التي يتم تطبيع الآبار المعالجة بالمركبات عليها. للتحقق من صحة الاختبار، أضف مركبا مرجعيا ساما خلويا (مثل 0.1٪ تريتون X-100 أو 1 ملليمولاوات كبريتات الصوديوم الدوديسيل) بتركيز معروف بأنه يسبب موت خلوي كامل (0٪ قابلية للبقاء (0). يجب ألا تختلف قيم الامتصاص في هذه الآبار الإيجابية عن الآبار الفارغة، مما يؤكد أن صلاحية الحمل 0٪.
    4. بعد فترة تثبيت الخلايا التي تستمر 24 ساعة، يتم فحص الصفائح بصريا تحت المجهر المقلوب للتأكد من أن الخلايا ملتصقة وتنتشر وتغطي حوالي 70٪–80٪ من سطح البئر مع التقاء متجانس. تخلص من الألواح التي تظهر تلوثا أو عدم كفاية التوصيل.
    5. قم بسحب وسط الزراعة بعناية باستخدام رأس ماصة، مع توجيه الطرف إلى جانب كل بئر لتجنب إزعاج طبقة الخلية الأحادية. معالجة الألواح على شكل أقسام لمنع الجفاف.
    6. أضف فورا 100 ميكرولتر من مخففات المركبات أو وسط التحكم المناسب إلى الآبار المقابلة.
    7. حضن الألواح المعالجة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. بروتوكول اختبار MTT
    1. حضر محلول MTT بسعة 0.5 ملغ/مل في DMEM خال من المصل. قم بالترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر واقتفاه من الضوء.
    2. بعد العلاج الذي استمر 48 ساعة، قم بفحص الخلايا بصريا لتأكيد تأثيرات العلاج المتوقعة.
    3. استنشق الوسط بعناية من ألواح MTT. أضف 50 ميكرولتر من محلول MTT العامل بقوة 0.5 ملغ/مل إلى كل بئر.
    4. الحضانة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، محمي من الضوء.
      ملاحظة: بينما 2–4 ساعات شائعة، عادة ما تكون حضانة 3 ساعات كافية لخلايا فيرو وهب جي2. قم بتحسين اللعبة إذا لزم الأمر.
    5. أضف 100 ميكرولتر من DMSO بنسبة 100٪ إلى كل بئر لإذابة بلورات الفورمازان. ضع الألواح على جهاز هزاز مداري بسرعة 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة، محميا من الضوء. افحص آبار التحكم لضمان ذوبان البلورات بالكامل. اقرأ الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبلايت. إذا كان ذلك متاحا، اضبط طول موجة مرجعي بين 630–690 نانومتر.
  4. بروتوكول اختبار الامتصاص الأحمر المحايد (NRU)
    1. جهز محلول أحمر محايد (NR) بقوة 40 ميكروغرام/مل في DMEM وفلتر خال من المصل. حضر محلول الامتصاص المقاوم الطبيعي: 1٪ (v/v) حمض الخليك الجليدي، 49٪ (v/v) إيثانول، و50٪ (v/v) ماء فائق النقي.
      تحذير: حمض الخليك الجليدي يسبب التآكل؛ مقبض في غطاء بخار.
    2. بعد العلاج الذي استمر 48 ساعة، افحص الخلايا بصريا. استنشق الوسط بعناية من صفائح NRU.
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول NR العامل بقوة 40 ميكروغرام/مل إلى كل بئر. حضن لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: حضانة لمدة ساعتين كافية لأقصى امتصاص للصبغة في هذه الخطوط الخلوية.
    4. استنشق حل NR العامل. اشطف كل بئر بلطف مرة واحدة ب 150 ميكرولتر من PBS المعقم.
    5. أضف 150 ميكرولتر من محلول الامتصاص NR إلى كل بئر. ضعها على هزاز مداري بسرعة 150 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة لاستخراج الصبغة.
    6. افحص آبار التحكم لضمان استخراج الصبغة بالكامل. اقرأ الامتصاص عند 540 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوتين.
  5. تحليل البيانات
    1. قم بطرح الخلفية بحساب متوسط امتصاص الأعمدة الفارغة وطرح هذه القيمة من جميع الآبار.
    2. قم بإجراء فحص سمية المذيب من خلال مقارنة آبار التحكم بالمذيبات مع الضوابط غير المعالجة. إذا كانت القابلية للعيش أقل من حد محدد (مثلا 80٪)، فكر في سمية الخلايا للمذيب.
    3. احسب نسبة الجدوى بالنسبة لآبار التحكم في المذيبات:
      ٪ قابلية الصلاحية = (امتصاص المعالج جيدا / متوسط امتصاص التحكم في المذيب) × 100.
    4. رسم ٪ الجدوى (المحور y) مقابل لوغاريتيم10 من تركيز المركب (محور x). استخدم نموذج انحدار غير خطي (استجابة جرعة سيغمويدية، ميل متغير) لتحديد CC50.
    5. احسب مؤشر الانتقائية (SI) بقسمة CC50 على MIC.

figure-protocol-3
الشكل 3. مثال تصميم الصفائح لاختبار حيوية خلايا MTT/NRU وإعداد فحص مبكر لاختبار سمية الخلايا لما يصل إلى 9 مركبات. (أ) مخطط تصميم اللوحة. يتم تعيين "فراغ" للعمود 1 بدون خلايا، ومملوء ب DPBS أو وسط كامل. يتم زرع الخلايا في العمودين 2 و12 ومعالجتين بوسائط كاملة ("التحكم غير المعالج") أو الوسط الكامل بالمذيب ("التحكم بالمذيب"). يتم زرع الخلايا في الأعمدة من 3 إلى 11 ومعالجتها بتخفيفات متسلسلة من المركبات التي يتم اختبارها، حتى 9 مركبات مع تكرار واحد لكل تركيز يتم اختباره لكل مركب. (ب) صور تمثيلية للوحة فيرو NRU (أعلاه) ولوحة فيرو MTT (في الأسفل) بعد معالجة 48 ساعة وخطوات الفحص النهائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسفر التخليق عن المركب المستهدف 6 كمادة صلبة خضراء فاتحة (0.53 جم، 67٪ إنتاجية). يظهر المركب نقطة انصهار بين 227–229 درجة مئوية ونقاء UHPLC بنسبة 99٪ (tR = 14.11 دقيقة) (الشكل 4). تم تأكيد البنية الكيميائية من خلال مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ومطياف الكتلة عالية الدقة (HRMS). أظهر طيف الرنين المغناطيسي النووي بحجم 1ساعة (الشكل 5) إشارات تتوافق مع جزء البيبريدين بين 1.50 و3.13 جزء في المليون. ظهرت مجموعة الميثيل عند الموضع 2 كمنفردة نموذجية عند 2.38 جزء في المليون. ظهر الهيدروجين عند الموضع الثالث ككتلة فردية عند 6.56 جزء في المليون. عرض حلقة الفينيلز زوجين مزدوجين عند 6.97 و7.17 جزء في المليون، مع ثابت اقتران 8.9 هرتز. كان الهيدروجين عند المواضع 7 و8 يولد مضاعفة عند 7.63–7.75 جزء في المليون، بينما أنتج الهيدروجين في الموضع الخامس للب الكينولين دوبليت عند 8.59 جزء في المليون (J = 2.0 هرتز). لوحظ الهيدروجين الأمين ككتلة فردية عند 8.66 جزء في المليون. أظهر طيف الرنين المغناطيسي النووي بقيمة 13مئوية (الشكل 6) إشارة عند 23.81 جزء في المليون نسبت إلى مجموعة الميثيل عند الموضع 2، بينما كانت الإشارات بين 24.85 و49.70 جزء في المليون تتوافق مع جزء البيبريدين. ظهر الكربون عند الوضع الثالث عند 100.52 جزء في المليون. تم نسب الإشارات المتبقية في الميدان إلى نواة الكينولين وكربونات حلقة الفينيل. أكد HRMS الصيغة الجزيئية للمركب 6، حيث أظهر وجود أيون [M+H]+ عند m/z 396.1063 (حساب C21H23BrN3: 396.1070).

figure-results-1
الشكل 4. كروماتوغرام HPLC وأطياف الأشعة فوق البنفسجية للمركب 6. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 5. 1H NMR (400 ميجاهرتز، DMSO-d6) من أطياف المركب 6. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 6. 13C NMR (101 ميجاهرتز، DMSO-d6) من أطياف المركب 6. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تقييم النشاط التثبيطي للمركب ضد M. tuberculosis من خلال تحديد MIC، الذي يعرف بأنه أدنى تركيز من المركب يمنع تماما نمو البكتيريا المرئي. في اختبار REMA، يشير غياب تغير اللون (بقاء اللون الأزرق) إلى تثبيط النمو، بينما يشير التحول إلى اللون الوردي إلى نمو البكتيريا. عمل الإيزونيازيد (INH) والريفامبيسين (RIF) كمواد ضيقة للأدوية. تعرض النتائج في الشكل 7. تضمنت كل لوحة جهاز تحكم في النمو (العمود 11، بدون أدوية) ونظام تحكم في العقم (العمود 12، بدون البكتيريا الفطرية). تم تخفيف المركبات بشكل تسلسلي من العمود 10 (أعلى تركيز) إلى العمود 1 (أدنى تركيز). كما هو موضح في الشكل 7، تلاحظ قيمة MIC للمركب في الصف A (الإيزونيازيد) في العمود 4، بينما تلاحظ قيم MIC للمركبات في الصفين B (ريفامبيسين) وC (المركب المصنوع) في العمود 5. في أيدينا، قيم MIC ل INH هي 0.31 ميكروغرام/مل لجهد H37Rv و0.16 ميكروغرام/مل ل H37Ra، بينما بالنسبة ل RIF نحصل على 0.08 ميكروغرام/مل ل H37Rv و0.01 ميكروغرام/مل لجهد H37Ra.

figure-results-4
الشكل 7. تحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) في متفطرة السل باستخدام اختبار الصفائح الدقيقة للريزازين (REMA). الصفوف A – C، الأعمدة 1–10: تخفيف متسلسلين من الإيزونيازيد (الصف A)، والريفامبيسين (الصف B)، والمركب المركب (الصف C). العمود 11: التحكم في القابلية للحياة (وسط يحتوي على 2.5٪ DMSO + بكتيريا). العمود 12: التحكم في العقم (متوسط + مركب). اللون الأزرق يشير إلى تثبيط نمو البكتيريا، بينما يشير اللون الوردي إلى القدرة على البكتيريا بسبب تقليل ريزازورين إلى ريسوروفين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لوحة تمثيلية ب 96 بئر لكل من اختبارات NRU (فيرو، الأعلى) وMTT (فيرو، الأسفل) موضحة في الشكل 3B. في لوحة MTT، يظهر تدرج لوني واضح، يتغير من شفاف (لا توجد خلايا قابلة للحياة) عند تركيزات مركبة عالية إلى بنفسجي عميق (حيوية عالية للخلايا) عند تركيزات منخفضة. وبالمثل، تظهر صفيحة NRU تدرجا من الشفاف إلى الوردي العميق، مما يشير إلى امتصاص الصبغة الحمراء المحايدة إلى الليسوسومات للخلايا القابلة للحياة.

يوفر المجهر تأكيدا بصريا لحالة الاختبار بعد فترة الحضانة التي استمرت 48 ساعة (الشكل 8). يقارن الشكل 8A الخلايا الضابطة الصحية غير المعالجة (فيرو وHepG2) بالخلايا المعالجة بتركيز سام للمركب في الخلايا السامة. تبدو الخلايا المعالجة مستديرة ومنفصلة وغير صالحة للحياة. يوفر الشكل 8B نقطة تحقق بصرية حاسمة قبل الخطوة النهائية للذوبان. يظهر التكوين المتوقع لبلورات الفورمازان البنفسجية الداكنة داخل الخلايا الحية (اختبار MTT) وتراكم الصبغة الحمراء داخل الليسوسومات (اختبار NRU) في كلا النوعين من الخلايا.

تم تطبيع بيانات الامتصاص الخام إلى وحدة التحكم في المركبة وتحليلها عبر الانحدار غير الخطي لتوليد منحنيات استجابة الجرعة كما هو موضح في خطوة البروتوكول 3.5. بالنسبة للمركب المستهدف 6 (المشتق من LABIO-17)، أسفر هذا التحليل عن CC50 بقوة 12.2 ميكرومولار (Vero) و18.3 ميكرومولار (HepG2) في اختبار NRU، وCC50 >20 ميكرومولار لكلا خطي الخلايا في اختبار MTT. أدى ذلك إلى مؤشر انتقائي (SI) يتراوح بين 30.5 إلى >50، كما تم الإبلاغ سابقاعن 10.

figure-results-5
الشكل 8. صور مجهرية تمثيلية لاختبارات السمية الخلوية في خلايا فيرو وHepG2. تم التقاط جميع الصور بتكبير 100x. (أ) مقارنة شكل الخلايا بعد 48 ساعة من العلاج. تظهر آبار التحكم غير المعالجة لخلايا فيرو (الأعلى) وHepG2 (السفلية) طبقة أحادية صحية متقاربة. في المقابل، الخلايا المعالجة بتركيز سام من مركب ما تبدو مستديرة ومصغرة ومنفصلة عن سطح الصفيحة. (ب) نقاط التحقق البصرية الحرجة بعد إضافة الكواشف وقبل الذوبان. في اختبار MTT (الألواح اليسرى لكل خط خلوي)، تحتوي الخلايا الحية على بلورات فورمازان بنفسجية داكنة مرئية. في اختبار NRU (اللوحات اليمنى لكل خط خلوي)، تظهر الخلايا الحية تراكما للصبغة الحمراء داخل الليسوسومات السليمة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نهج الفحص الظاهري، الذي يعتمد على نشاط الخلايا الكاملة بدلا من الإنزيمات المعزولة، استراتيجية فعالة لتحديد المركبات الفعالة ضد المتوسلكس السل. هنا، وصفنا الخطوات الأولية لهذا النهج، والتي شملت التخليق الكيميائي لمركب مرشح، وتقييم نشاطه المثبط عبر تحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC)، وتقييم سمية الخلايا في خلايا الثدييات (Vero وHepG2) باستخدام اختبارات MTT وNRU.

تكون المسار الصناعي من ثلاث خطوات رئيسية (الشكل 1)، توفر المركب المستهدف بنقاء عالي باستخدام تحويلات تشغيلية مباشرة. تم تحديد عدة خطوات حاسمة كعوامل محددة لقابلية التكرار والكفاءة. يتطلب التكثف الأولي تحكما دقيقا في القياس الصوتي وارتجاع مستمر لضمان تكوين وسيط كامل. قد يؤثر الإزالة غير الكاملة للمذيبات قبل الدورة الحرارية سلبا على كفاءة إغلاق الحلقة. تتطلب خطوة التدوير نفسها تحكما صارما في درجة الحرارة، حيث يؤدي نقص التسخين إلى عدم اكتمال العطر، بينما قد يؤدي التسخين المفرط أو المطول إلى تكوين المنتجات الثانوية. أثناء الكلور، ينصح بالتحكم الدقيق في درجة حرارة التفاعل والإضافة التدريجية لكلوريد الفوسفوريل لتقليل التفاعلات الجانبية وضمان التنشيط الانتقائي في الوضعية الرابعة. خلال تحسين الأساليب، حسنت التعديلات الإجرائية الطفيفة المتانة. في حالات الهطول غير الكامل بعد الدورة، فإن التبريد التدريجي بدلا من التبريد السريع يعزز استعادة الصلبة. إذا لوحظت انخفاض في العوائد في خطوة الاستبدال النوكليوفيلي، فإن تمديد وقت التفاعل أو التحقق من نقاء الأمين كان مفيدا.

القيود الرئيسية للطريقة هي الحاجة إلى دورة عالية الحرارة وكواشف مكلورة تآكلية مثل كلوريد الفوسفوريل، مما يتطلب بنية تحتية مختبرية وسلامة محددة. قد تتطلب التأثيرات الإلكترونية البديلة إعادة تحسين لأنواع مختلفة من الأنيلينز أو الأمينات، مما يحد من تنوع السقالات الواسع دون تعديل. ومع ذلك، فإن نهج كونراد-ليمباخ أبسط تشغيليا من التخليقات من نوع سكروب (المؤكسدات القاسية) أو البروتوكولات المحفزة بالمعادن الانتقالية (المحفزات المتخصصة/الأجواء الخاملة). تنتج هذه الاستراتيجية الخالية من المعادن بكفاءة وسيط كينولين وظيفي للكيمياء الطبية.

البروتوكول المستخدم لتحديد MIC هو اختبار لوني يعتمد على الفحص البصري. تحد محتمل في هذه الطريقة هو تغير اللون غير الكامل، مما يؤدي إلى بئر بنفسجي بدلا من الأزرق المميز (التثبيط) أو الوردي (النمو). إذا حدث ذلك، يجب تفسيره على أنه فشل في تثبيط نمو الفطريات. بالإضافة إلى ذلك، بما أن المركب يقيم من خلال التخفيف التسلسلي، فإن الحد الأقصى للتركيز القابل للاختبار يتحدد بناء على ذوبانية المركب. وبالتالي، في بعض الحالات، قد تكون النتيجة غير حاسمة إذا لم يلاحظ تثبيط عند أقصى تركيز قابل للذوبان. علاوة على ذلك، من المهم الاعتراف بأن مختبرات أخرى قد تتكيف مع بعض خطوات البروتوكول لتناسب حالتها الخاصة، مما قد يؤدي إلى اختلافات في النتائج التي تم الحصول عليها. لزيادة معدل الإنتاجية، يمكن تكييف هذا البروتوكول ليتناسب مع الأتمتة. تطبيق أنظمة معالجة السوائل لتحضير ألواح 96 بئر سيقلل من أخطاء التصويب، مما يحسن الدقة وقابلية التكرار.

يستخدم بروتوكول تقييم السمية الخلوية خطين خلويين مميزين للثدييات (فيرو وHepG2) واختبارين تكميليين للبقاء (MTT وNRU). تعد عدة خطوات ضمن هذا البروتوكول ضرورية لضمان قابلية تكرار البيانات ودقتها، ويجب على كل مختبر إجراء التحقق الخاص. على سبيل المثال، يجب تحسين كثافة البذر الأولية للخلايا بعناية، حيث أن الإفراط في التقاء قد يؤدي إلى تثبيط التلامس وتغير الحالات الأيضية، مما يربك النتائج، بينما يمكن أن يجعل التقليل من البذور الخلايا أكثر عرضة للإساءات الطفيفة، مما قد يبالغ في تقدير السمية15. علاوة على ذلك، فإن أعلى تركيز تم اختباره غالبا ما يكون محدودا بذوبانية المركبات، ويمكن أن يؤدي الهطول إلى نتائج غير دقيقة. أيضا، تم تصميم اللوحة المقترحة (الشكل 3A) للفحص الأولي، مع تعظيم عدد المركبات المختبرة من خلال التخلي عن النسخ التقنية وتجاهل تأثيرات الحواف لصالح التحقق من خلال النسخ البيولوجية المستقلة.

من نقاط القوة الرئيسية لهذا البروتوكول التنفيذ المتوازي لكل من اختبارات MTT وNRU. على الرغم من أن كلاهما راسخ جيدا، إلا أنهما يقيسان معايير خلوية مختلفة. يقوم اختبار MTT بقياس النشاط الأيضي لديهيدروجيناز الميتوكوندريا، والذي يرتبط عموما بحيوية الخلية16. ومع ذلك، فإن هذا الاختبار عرضة للتداخل من المركبات ذات الخصائص المختزلة أو المؤكسدة أو تلك التي تعيق التنفس الميتوكوندري، مما يؤدي إلى نتائج خاطئة محتملة15. تشغيل اختبار NRU بالتوازي يساعد في استكشاف مثل هذه العيوب الأثرية. يقيس اختبار NRU قدرة الخلايا الحية على الحفاظ على سلامة الليسوسوم وتدرجات الحموضة المطلوبة لامتصاص الصبغة17. يمكن أن تكشف الفروقات بين نتائج MTT وNRU عن آليات سمية محددة، مثل خلل الميتوكوندريا، مما يستدعي المزيد من التحقيق.

باختصار، يوضح هذا البروتوكول الخطوات الأساسية لتحديد المرشحين المحتملين لأدوية مضادات السل. يمكن لاحقا تطوير المركبات التي تظهر انتقائية وفعالية واعدة، إلى نماذج عدوى أكثر تعقيدا، مثل الدراسات في الجسم الحي .

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإبلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح من قبل المؤلفين.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا حول السل (MCTI/CNPq/SECTICS/MS/CAPES/FAPERGS، رقم 404838/2024-0)، وCNPq/MCTI رقم 44/2024 – يونيفرسال (رقم منحة 420934/2025-1) وFAPERGS 06/2025 – PqG (رقم 25/2551-00002734-9). C.V.B (CNPq، المنحة رقم 311949/2019-3)، L.A.B. (CNPq، منحة رقم 303499/2021-4)، وP.M. (CNPq، منحة رقم 310888/2022-0) هم من الحاصلين على جوائز مهنة البحث من CNPq. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل مجلس المعالجة في بيسوال دي نيفيل سوبيريور – البرازيل (CAPES)، كود المالية 001.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خطوط الخلايا
HepG2 (سرطان الكبد الكبدي البشري)ATCCHB-8065خط خلايا سرطان الكبد البشري
Mycobacterium tuberculosis H37RaATCC25177
Mycobacterium tuberculosis H37RvATCC27294
Vero (كلى قرد أخضر أفريقي)ATCCCCL-81خط خلايا ظهارية كلوية لقرود
المواد الكيميائية – التوليف
4-(Piperidin-1-yl)anilineSigma-AldrichTCI: P0887سلف الأمينة للمركب 5/6
4-BromoanilineSigma-Aldrich108-67-8مادة أولية لتخليق الكينولین
حمض الأسيتيك (الجليدي)Sigma-Aldrich695092متفاعل في التخليق وتحضير المرحلة المتحركة
الأسيتونيتريل (درجة HPLC)Sigma-Aldrich34967مكون للمرحلة المتحركة في HPLC ومُذيب NMR
الكلوروفورمSigma-AldrichC2432مُذيب لاستخلاص المنتج
DMSO-d6 (مؤصل)Sigma-Aldrich175641مُذيب NMR
Dowtherm A (سائل نقل الحرارة)Sigma-Aldrich / SolutiaTBDمُذيب ذو درجة غليان عالية لتفاعل التدوير الحراري (230–250 °C)؛ كان يُذكر سابقًا باسم Dowtherm® A
الإيثانول (المطهر)Sigma-Aldrich459836متفاعل في خطوة Conrad–Limpach
أسيتات الإيثيل (درجة HPLC)Sigma-Aldrich270989مكون للمذيب المتدفق
إيثيل أسيتو أسيتيتSigma-AldrichE12806مُذيب بيتا كيتو إستير لتشكل حلقة الكينولین
حمض الفورميك (درجة HPLC)Sigma-AldrichF0507مادة مضافة بنسبة 0.1٪ في المرحلة المتحركة لHPLC وHRMS
خرز زجاجي (1 مم، معقم)Sigma-AldrichG8772للمجانسة لقلبية M. tuberculosis
HCl (حمض الهيدروكلوريك، 37٪)Sigma-Aldrich320331متفاعل حمضي في الاستبدال النووي
الهكسان (درجة HPLC)Sigma-Aldrich34859مذيب غير قطبي لمرحلة اللوني
الإيزوبروبانولSigma-Aldrich278475متفاعل في تخليق المركب 6
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4، عديمة الماء)Sigma-AldrichM7506عامل تجفيف ومحفز للتفاعل
الميثانول (درجة HPLC)Sigma-Aldrich34860مرحلة متحركة في HPLC ومُذيب NMR
أكسيد الفوسفور (V) الكلور (POCl3)Sigma-Aldrich201170متفاعل كلور لتخليق الوسيط 4
البيریدینSigma-Aldrich270970محفز قاعدي في الاستبدال النووي
السيليكا جل (35–70 شبكة) للترشيح الفوريMacherey-Nagel815349مرحلة ثابتة لخطوات اللوني الفوري
السيليكا جل 60 Å (70–230 شبكة) للترشيح اللونيMacherey-Nagel815381مرحلة ثابتة للترشيح اللوني
كبريتات الصوديوم (Na2SO4، عديمة الماء)Sigma-Aldrich239313عامل تجفيف للمرحلة العضوية
صفائح الترشيح الرقيقة بالسيليكا جل 60 F254Merck1.05554مراقبة الترشيح الرقيقة
التولوينSigma-Aldrich244511مُذيب لخطوة الكلورة
ماء فائق النقاءMillipore / المعادلN/Aيُستخدم في تحضير المرحلة المتحركة؛ كان يُشار إليه سابقًا باسم ماء Milli-Q في النص
المعدات والأجهزة
فلتر حقنة 0.22 ميكرومترMillipore / أيSLGP033RSتعقيم محلول الريزورین (2.1.4)؛ ترشيح محلول MTT العامل (3.3)؛ ترشيح محلول Neutral Red العامل (3.4)
فلتر حقنة 0.45 ميكرومترMillipore / أيSLHA033SSترشيح محاليل المرحلة المتحركة
أنبوب مخروطي 15 مل (معقم)Falcon / أي352097 أو ما يعادلهجمع وترسيب تعليق الخلايا بعد المعالجة بالتريبسین
لوحة 96 بئر (أرضية مسطحة، معالجة لزراعة الأنسجة)Corning / أي3596لاختبارات السمية الخلوية وMIC
ورق الألمنيومأي—حماية الألواح من الضوء أثناء خطوات حضانة MTT وNRU وهزها
أوتوكلافأي—تعقيم الوسط (121 °C، 98.07 kPa، 10 دقائق)
مكتب أمان بيولوجي (الفئة II، معتمد)أي (معتمد من BSL-3)—مطلوب للتلاعب بـ M. tuberculosis (BSL-3)
عداد خلايا (آلي) أو عداد الخلاياعلى سبيل المثال، Bio-Rad TC20 / NeubauerTBDلتحديد تركيز الخلايا وصلاحيتها
الطرد المركزي (قادر على 200 × g)أي—خطوة ترسيب الخلايا
حاضنة CO2 (37 °C، 5٪ CO2، رطوبة)أي—حضانة زراعة الخلايا وعلاجها
مغزل تسخينFisotom 12Mمغزل تسخين متحكم فيه بالحرارة مع Dowtherm® A
نظام HPLC (Dionex UltiMate 3000)Thermo Fisher Scientific5035.9200مضخة مزدوجة، حاقن أوتوماتيكي، كاشف UV؛ لتحليل نقاء المركب 6
مجهر مقلوب (أو ما يعادله)أي—التفتيش البصري للخلايا عند الالتصاق (3.2)، أثناء نقطة فحص العلاج (3.3، 3.4)، وللتحقق من حالة الاختبار
مذيب مغناطيسي / لوحة ساخنةأي—تحضير المحلول وخلط التفاعل
مقياس الكتلة (LTQ Orbitrap Discovery)Thermo Fisher Scientific—Orbitrap عالي الدقة مع

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pai, M. Tuberculosis. Nat Rev Dis Primers. 2, 16076(2016).
  2. Salgame, P., Geadas, C., Collins, L., Jones-López, E., Ellner, J. J. Latent tuberculosis infection – Revisiting and revising concepts. Tuberculosis. 95 (4), 373-384 (2015).
  3. Lyon, S. M., Rossman, M. D. Pulmonary tuberculosis. Microbiol Spectr. 5 (1), (2017).
  4. Houben, R. M., Dodd, P. J. The global burden of latent tuberculosis infection: a re-estimation using mathematical modelling. PLoS Med. 13 (10), e1002152(2016).
  5. Global tuberculosis report 2025. , World Health Organization. (2025).
  6. Larkins-Ford, J., et al. Systematic measurement of combination-drug landscapes to predict in vivo treatment outcomes for tuberculosis. Cell Syst. 12 (11), 1046-1063.e7 (2021).
  7. Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. Drug resistant Tuberculosis: A review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 24 (6), 101574(2021).
  8. Alsayed, S. S. R., Gunosewoyo, H. Tuberculosis: Pathogenesis, Current Treatment Regimens and New Drug Targets. Int J Mol Sci. 24 (6), 5202(2023).
  9. Pauli, I. Discovery of new inhibitors of Mycobacterium tuberculosis InhA enzyme using virtual screening and a 3D-pharmacophore-based approach. J Chem Inf Model. 53 (9), 2390-2401 (2013).
  10. Paz, J. D., et al. Novel 4-aminoquinolines: Synthesis, inhibition of the Mycobacterium tuberculosis enoyl-acyl carrier protein reductase, antitubercular activity, SAR, and preclinical evaluation. J Med Chem. 245 (Pt 1), 114908(2023).
  11. Quemard, A., et al. Enzymatic characterization of the target for isoniazid in tuberculosis. Biochemistry. 34, 8235-8241 (1995).
  12. Parish,, Tanya,, Roberts,, David, M. Mycobacteria Protocols. , Third edition, Humana Press. New York. (2015).
  13. Franzblau, S. G., DeGroote, M. A., Cho, S. H., Andries, K., Nuermberger, E., Orme, I. M., Mdluli, K., Angulo-Barturen, I., Dick, T., Dartois, V., Lenaerts, A. J. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinburgh, Scotland). 92 (6), 453-488 (2012).
  14. Palomino, J. C., Martin, A., Camacho, M., Guerra, H., Swings, J., Portaels, F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  15. Riss, T. L. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2016).
  16. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  17. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nat Protoc. 3 (7), 1125-1131 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

4 MTT Mycobacterium tuberculosis

مقالات ذات صلة