مقالة منهجية

التكامل شبه الآلي لتحليل مدى الصحة الحركية وعمر البقاء باستخدام مسار FlyTrDT في *Drosophila melanogaster*

8 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70697

⸱

أكتوبر 30, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amrita University campus

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تُعد Drosophila melanogaster كائناً نموذجياً قوياً لأبحاث الشيخوخة. يوضح هذا البروتوكول الخطوات المطلوبة لإجراء قياس قائم على المجتمع وقابل للتكرار لكل من متوسط العمر والمدى الصحي الوظيفي.

الملخص

يتميز الشيخوخة بالتدهور الوظيفي التدريجي وانخفاض متوسط العمر؛ وغالباً ما يتم تقييم هذين المعيارين بشكل مستقل في الدراسات التجريبية. وفي ذبابة Drosophila melanogaster، تُستخدم اختبارات قياس طول العمر وقياسات الحركة القائمة على الانتحاء الأرضي السلبي بشكل شائع لدراسة الشيخوخة والتنكس العصبي. ومع ذلك، هناك نقص في الأطر المعيارية التي تدمج كمياً بين الأداء الحركي المبكر والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. نصف هنا سير عمل شبه مؤتمت وقابل للتكرار يجمع بين تحليل طول العمر والقياس الكمي الموضوعي للمدى الصحي الحركي في الذباب المسن.

يدمج هذا البروتوكول ظروف تربية الذباب الخاضعة للرقابة، وحسابات الوفيات، ومقاييس الانتحاء الأرضي السلبي القائمة على الفيديو باستخدام تسجيلات MP4 موحدة (بدقة لا تقل عن 1280 × 720، وبمعدل 30 إطارًا/ثانية). يتم قياس الأداء الحركي باستخدام مسار معالجة مخصص يعتمد على لغة Python ومطبق باستخدام Python 3.12.1 مع OpenCV 4.9.0 وNumPy 1.26.4 وPandas 2.2.0 وMatplotlib 3.5.2. يقوم سير العمل بكشف المركز الهندسي إطارًا بإطار، ويستخرج منحدر التسلق النشط (بكسل/ثانية) كمقياس مستمر للوظيفة الحركية. كما يتم تحليل مسارات البقاء عن طريق حساب جزء البقاء وإجراء تكامل عددي شبه منحرف للحصول على المساحة تحت المنحنى (AUC) للبقاء. وتسمح معايرة الأداء الحركي المبكر بإجراء مقارنة مباشرة بين التدهور الوظيفي وطول العمر الإجمالي.

تم تقييم سير العمل من خلال مقارنة قياسات منحدر التسلق شبه الآلية مع التقييم اليدوي التقليدي للنقاط النهائية في ذباب المجموعات الضابطة والذباب الذي يعبر عن البروتين amyloid-β، حيث كشفت كلتا الطريقتين عن تدهور حركي مرتبط بالعمر. وأظهرت مجموعات البيانات التمثيلية مسارات عمر افتراضي قابلة للتكرار في ضوابط Canton S وضعفاً حركياً مبكراً يمكن قياسه في نموذج التنكس العصبي. وتعمل هذه الطريقة على تقليل انحياز المراقب، وتعزيز القابلية للتكرار، كما تظل متوافقة مع أنظمة الحصول على الفيديو منخفضة التكلفة. ويمكن تكييف سير العمل بسهولة مع النماذج الجينية، والتدخلات الدوائية، ونماذج التنكس العصبي، مما يوفر منصة قابلة للتوسع للتنميط الظاهري المتكامل للشيخوخة في ذبابة Drosophila.

المقدمة

لا يتميز الشيخوخة بقصر مدة الحياة فحسب، بل بالتدهور التدريجي في الوظائف الفسيولوجية والسلوكية1. وفي الحالات التنكسية العصبية، غالباً ما تحدث اضطرابات مبكرة في التنسيق الحركي قبل حدوث وفيات ملحوظة، وهي تعكس خللاً وظيفياً عصبياً كامناً2,3. وقد برزت ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster كنظام نموذجي قوي لدراسة الشيخوخة والتنكس العصبي نظراً لقصر دورة حياتها، وقابليتها للتعديل الوراثي، واختباراتها السلوكية الراسخة4. ويوفر تحليل مدة الحياة في Drosophila مقياساً قوياً لبقاء الكائن الحي، بينما تُستخدم اختبارات الانتحاء الأرضي السلبي على نطاق واسع لتقييم الوظيفة الحركية والتدهور الحركي المرتبط بالعمر5,6. ومع ذلك، غالباً ما يتم تحليل هذين المقياسين بشكل مستقل، مما يحد من القدرة على الربط الكمي بين الاضطراب الوظيفي المبكر ومسارات البقاء على المدى الطويل. وقد يوفر التحليل المتكامل لفترة الصحة الحركية ومدة الحياة رؤية ميكانيكية حول ما إذا كانت التدخلات تؤثر على معدل الشيخوخة، أو تطور المرض، أو أنظمة فسيولوجية محددة. ويعد هذا النهج مناسباً بشكل خاص للنماذج الوراثية والدوائية والتنكسية العصبية التي تسبق فيها العجوزات الحركية المبكرة الوفيات الملحوظة، مما يتيح الكشف الحساس عن التدهور الوظيفي قبل ظهور فروق ملحوظة في معدلات البقاء.

تعتمد اختبارات الانتحاء الأرضي السلبي التقليدية على تقييمات قائمة على نقاط النهاية، مثل نسبة الذباب الذي يصل إلى ارتفاع محدد خلال فاصل زمني ثابت. ورغم أنها بسيطة وغير مكلفة، إلا أن التقييم اليدوي قد يؤدي إلى تحيز المراقب وقد يغفل عن الاختلافات الدقيقة في حركية المحرك. وقد تزيد القياسات المستمدة من المسار المستمر من الحساسية في الكشف عن الاعتلالات الحركية الطفيفة مقارنة بنهج التقييم التقليدية القائمة على نقاط النهاية. وبالمثل، تتطلب اختبارات مدى الحياة محاسبة دقيقة للوفيات وتوحيداً بيئياً لضمان إمكانية التكرار7. ولا تزال هناك حاجة إلى مناهج سهلة الوصول وقابلة للتكرار تدمج مقاييس الصحة الوظيفية مع بيانات البقاء على قيد الحياة ضمن المجموعة ذاتها.

نصف هنا سير عمل شبه مؤتمت يجمع بين تحليل معياري لفترة الحياة والقياس الكمي المعتمد على الفيديو للأداء الحركي في ذباب الفاكهة (Drosophila) المسن. وباستخدام أدوات حوسبة مفتوحة المصدر، يتم إجراء كشف عن المركز الهندسي (centroid) لكل إطار لاستخراج منحدر التسلق (pixels/s) كمقياس مستمر للوظيفة الحركية. وتتم معالجة بيانات البقاء عن طريق حساب كسر البقاء وإجراء تكامل عددي شبه منحرف للحصول على المساحة تحت منحنى البقاء (AUC). ومن خلال تطبيع الأداء الحركي المبكر ودمجه مع المساحة تحت منحنى البقاء، يتيح هذا البروتوكول مقارنة مباشرة بين التدهور الوظيفي وطول العمر الإجمالي. ويوفر هذا النهج إطاراً موضوعياً وفعالاً من حيث التكلفة لربط مدى الصحة الحركية بنتائج فترة الحياة، كما يسمح بتوصيف ظاهري شامل لمسارات الشيخوخة في ذباب Drosophila (الشكل 1).

البروتوكول

أُجريت جميع التجارب باستخدام Drosophila melanogaster وفقاً لإرشادات المختبر المؤسسية . ولم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة لأن الدراسة شملت كائنات لافقارية. حافظ على تنفيذ جميع الإجراءات باتباع إرشادات الرعاية المؤسسية للحيوانات الخاصة بأبحاث اللافقاريات.

ملاحظة: تُحفظ الأغذية التجريبية عند درجة حرارة 4 °C وتُستخدم خلال أسبوع واحد، بشرط أن تظل جافة. ويتم الحفاظ على الظروف البيئية القياسية عن طريق تحضين الذباب عند درجة حرارة 25 °C تحت دورة ضوء-ظلام مدتها 12:12 h ورطوبة نسبية تبلغ 60% تقريباً.

1. تحضير غذاء الذباب القياسي

  1. تحضير الغذاء الأساسي
    1. امزج 6 g من دقيق الذرة، و5 g من الخميرة، و4 g من D-glucose، و3 g من السكروز، و1 g من مستخلص الخميرة، و1 g من الآجار، و0.25 g من مستخلص الشعير في وعاء يحتوي على 100 mL من الماء المقطر.
    2. امزج المكونات جيداً باستخدام ملعقة مسطحة (spatula) حتى يتكون معلق متجانس.
    3. سخن المزيج إلى درجة حرارة تتراوح بين 85–100 °C تقريباً باستخدام موقد حثي لمدة 12–15 min عند تحضير أحجام ≥500 mL، أو لمدة 5–10 min عند تحضير أحجام تتراوح بين 100–400 mL. استمر في التقليب أثناء التسخين.
    4. قم بتعقيم المزيج المسخن باستخدام الموصدة (autoclave) وفقاً لإجراءات التعقيم المختبرية القياسية.
    5. اترك الوسط المعقم ليبرد. راقب درجة الحرارة باستخدام مقياس حرارة حتى تصل إلى 50–55 °C.
    6. أضف 600 µL من حمض البروبيونيك و100 mg من حمض البنزويك المذاب في 1 mL من الإيثانول بتركيز 100% إلى الوسط المبرد وامزجه جيداً.
    7. تنبيه: يجب التعامل مع حمض البروبيونيك والإيثانول في منطقة جيدة التهوية مع ارتداء القفازات ونظارات واقية، لأن كلا المادتين الكيميائيتين متطايرتان وقد تسببان تهيجاً عند الاستنشاق أو ملامسة الجلد.
    8. وزع 5 mL من الغذاء في كل أنبوبة معقمة بطول 10 cm وقطر 20 mm.
    9. اترك الأنابيب مكشوفة لمدة 5–6 h على الأقل في درجة حرارة الغرفة. غطِّ الأنابيب بورق مناديل لمنع دخول الذباب الشارد. تُستخدم هذه الخطوة لتقليل التباين في قياسات طول العمر الناتج عن الاختلافات في تحضير الأوساط وظروف التخزين.
  2. تحضير الغذاء الدوائي
    1. حضّر كمية صغيرة من غذاء البالغين كما هو موضح في الخطوات 1.1.1–1.1.5.
    2. اترك الغذاء ليبرد حتى تصل درجة حرارته إلى 50–55 °C.
    3. حضّر محلولاً مركزاً (stock solution) من المركب المختبر بالتركيز المطلوب باستخدام ناقل (vehicle) مناسب، مثل الماء المقطر أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). أذب المركب المختبر في الناقل المختار لإنشاء محلول مركز، ثم أضف هذا المركز إلى الغذاء المبرد (50–55 °C) لتحقيق التركيز النهائي المطلوب، مع الحفاظ على تماثل تركيزات الناقل عبر مجموعات العلاج والمجموعات الضابطة.
    4. امزج المكونات جيداً لضمان التوزيع المتجانس.
    5. وزع 2 mL من الغذاء المحتوي على الدواء في كل أنبوبة تجريبية عن طريق وضعه كطبقة فوق سطح الغذاء الأساسي المتصلب مسبقاً.
    6. حضّر الأنابيب الضابطة عن طريق إضافة حجم مكافئ من الناقل وحده (على سبيل المثال، الماء المقطر أو DMSO بنفس التركيز النهائي المستخدم في مجموعات العلاج) إلى الغذاء الموضع فوق الغذاء الأساسي.
    7. اترك الغذاء الموضع في طبقات ليتصلب تماماً في درجة حرارة الغرفة قبل إدخال الذباب.
      ملاحظة: التعامل مع الغذاء وتخزينه: إذا تم تحضير الغذاء في المساء، اترك الأنابيب مغطاة بورق المناديل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة، ثم ضع سدادات قطنية في صباح اليوم التالي. احرص دائماً على غسل الأنابيب وتطهيرها وتعقيمها بالموصدة قبل الاستخدام. عقم لفافات القطن بالموصدة بشكل منفصل قبل التسكير. لا تضع السدادات القطنية إلا بعد أن يتصلب الغذاء تماماً لمدة 5–6 h على الأقل.

2. توليد ذباب D. melanogaster الذي يعبّر عن أميلويد-β

  1. جمع والتحقق من إناث السلالة الموجهة العذراء
    1. يتم الحفاظ على سلالة الذباب الموجهة عند 25 °C تحت دورة ضوء-ظلام تبلغ 12 h:12 h قبل جمع العذارى.
    2. تُجمع إناث الذباب التي خرجت حديثاً من شرنقتها من السلالة الموجهة مرتين يومياً، مرة في الصباح ومرة في وقت متأخر من بعد الظهر، باستخدام تخدير قصير بثاني أكسيد الكربون.
    3. تُنقل الإناث المجموعة إلى أنابيب عذراء جديدة مخصصة لجنس واحد فور جمعها لمنع التزاوج.
    4. تُحضن الأنابيب عند 25 °C لمدة 48 h إضافية للتحقق من حالة العذارى.
    5. تُفحص الأنابيب يومياً للتأكد من عدم وجود يرقات.
    6. يتم تأكيد حالة العذارى من خلال التحقق من غياب البيض أو النسل اليرقي.
    7. يتم الاحتفاظ فقط بالإناث التي لا تظهر أي دليل على إنتاج يرقات لاستخدامها في التهجين الوراثي.
  2. إعداد التهجين الوراثي
    1. تُجمع ذكور UAS-APPE693G البالغة التي خرجت حديثاً من شرنقتها باستخدام تخدير قصير بثاني أكسيد الكربون في يوم إعداد التهجين.
    2. يتم إعداد عمليات التهجين بوضع 20 أنثى عذراء من سلالة elav-GAL4 مع 10 ذكور من سلالة UAS-APPE693G في أنبوب غذاء جديد.
    3. تُحضن أنابيب التهجين عند 25 °C تحت رطوبة مضبوطة ودورة ضوء-ظلام تبلغ 12 h:12 h.
    4. يُترك الذباب للتزاوج ووضع البيض لمدة 48 h.
    5. تُنقل الحشرات البالغة إلى أنابيب جديدة إذا كانت هناك حاجة إلى نسل إضافي.
    6. تُزال الذباب الأبوية بعد وضع البيض لمنع الازدحام وتداخل الأجيال.
    7. يُترك النسل ليتطور حتى مرحلة البلوغ تحت الظروف القياسية حتى خروج الحشرات من الشرنقة.
    8. تُستخدم ذباب F1 البالغة التي تعبر عن amyloid-β في الخلايا العصبية لتجارب طول العمر والصحة اللاحقة.
      ملاحظة: يتيح الموجه elav-GAL4 تعبيراً شاملاً في جميع الخلايا العصبية لبروتين سلف الأميلويد البشري الذي يحمل طفرة E693G Arctic. ويحدث التعبير طوال فترة النمو والبلوغ تحت ظروف التربية القياسية. بالنسبة لتجارب الشيخوخة، يجب استخدام خلفيات وراثية متسقة وضوابط مناسبة. كما يجب الحفاظ على ظروف درجة حرارة ثابتة داخل كل
      تجربة. يمكن استخدام درجات حرارة تحضين أقل، مثل 18 °C، أثناء النمو لـ
      تأخير الاعتلال المرتبط بالجين المنقول قبل مرحلة البلوغ.

3. جمع الذباب

  1.  جمع الذباب لاختبار الانتحاء الأرضي السلبي
    1. يتم الحفاظ على جميع سلالات الذباب على غذاء الذباب القياسي عند درجة حرارة 25 °C، ورطوبة نسبية تبلغ حوالي 60%، ودورة ضوء-ظلام مدتها 12 h:12 h قبل الإعداد التجريبي.
    2. يتم جمع الذباب الذكري البالغ حديث الخروج خلال نافذة زمنية تتراوح بين 2-3 أيام باستخدام تخدير قصير بثاني أكسيد الكربون.
    3. يُنقل الذباب الذكري إما إلى أنابيب غذاء تحتوي على العقار أو أنابيب غذاء ضابطة، وذلك حسب الحالة التجريبية.
    4. يُستبدل الغذاء كل 3 أيام أو في وقت أبكر إذا تدهورت جودة الغذاء.
    5. يتم الحفاظ على الذباب في ظل هذه الظروف حتى وصولهم إلى الأعمار المحددة لتقييم الانتحاء الأرضي السلبي.
      ملاحظة: يُستخدم الذباب الذكري فقط في اختبار الانتحاء الأرضي السلبي لتجنب التباين الناتج عن الاختلافات المحددة للجنس في الأداء الحركي والشيخوخة.
  2. جمع الذباب لاختبار مدى الحياة
    1. يتم تخدير مجموعات صغيرة من الذباب لفترة وجيزة على وسادة تخدير.
    2. يتم تحديد الذباب الذكري باستخدام فرشاة رسم ناعمة.
    3. يقلل التعرض لثاني أكسيد الكربون أثناء الفرز لمنع التأثيرات الفسيولوجية طويلة الأمد التي قد تربك قياسات مدى الحياة.
    4. يُوضع 10 ذباب ذكري و10 ذباب أنثوي، بنسبة جنسية 1:1، في كل أنبوب غذاء جديد، وذلك حسب التصميم التجريبي.
    5. يتم إكمال الفرز والتقسيم في غضون 3-4 min لكل دفعة.
    6. يجب التأكد من أن إجمالي مدة التعرض للتخدير لا تتجاوز 9-10 min.
    7. تحذير: يجب تطبيق التخدير بثاني أكسيد الكربون باستخدام منظمات مناسبة وتهوية مختبرية كافية لتقليل تعرض المشغل ومنع الإجهاد الفسيولوجي الممتد الناجم عن التخدير في الذباب.
    8. تُكرر الخطوات من 3.2.1 إلى 3.2.6 حتى يتم تجهيز 4-6 أنابيب مكررة لكل حالة تجريبية.

4. تجربة طول العمر

  1. نقل الذباب وصيانته
    1. يتم الحفاظ على الذباب في ظروف قياسية.
    2. يُنقل الذباب إلى قوارير غذاء جديدة على فترات منتظمة لمنع الاكتظاظ، والتلوث اليرقي، وتلف الغذاء.
    3. يُنقل الذباب إلى غذاء جديد كل 3 أيام.
    4. يُستخدم تواتر النقل هذا لتقليل اضطراب ظروف التغذية عن طريق منع نمو اليرقات في القارورة.
    5. تُجرى جميع عمليات النقل دون تخدير.
      ملاحظة: تجنب استخدام التخدير أثناء تجارب مدى الحياة لأنه قد يؤدي إلى وفيات حادة، خاصة في الذباب المسن.
  2. تقييم الوفيات أثناء عمليات النقل
    1. يُسجل عمر المجموعة بالأيام عند كل عملية نقل.
    2. تُفحص القارورة القديمة بعناية.
    3. يُعد ويُسجل عدد الذباب الميت المتبقي في القارورة القديمة.
    4. يُعد ويُسجل عدد الذباب الميت الذي نُقل إلى القارورة الجديدة.
    5. تُسجل هذه القيم بشكل منفصل لمنع التكرار في العد.
    6. يُحسب إجمالي عدد الوفيات لكل عملية نقل باستخدام المعادلة التالية:
      إجمالي الوفيات = الذباب الميت في القارورة القديمة + الذباب الميت المنقول إلى القارورة الجديدة.
    7. يُحدد عدد الوفيات الجديدة منذ عملية النقل السابقة عن طريق طرح عدد الذباب المسجل كـ "منقول" في عملية النقل السابقة من إجمالي الوفيات في عملية النقل الحالية.
    8. تُستخدم هذه العملية الحسابية لضمان عدم عد الذباب المنقول بين القوارير عدة مرات.
  3. تحديد الذباب الحي غير النشط
    1. يُنقر بلطف على جانب القارورة قبل اعتبار الذبابة ميتة عندما يبدو الذباب المسن غير متحرك أو مستلقياً على ظهره.
    2. تتم ملاحظة ما إذا كانت هناك أي حركة تحدث.
    3. تعتبر الذباب الذي يظهر حركة عند التحفيز حياً.
    4. لا يُسجل الذباب الذي يظهر حركة عند التحفيز كذباب ميت.
    5. يُنقر بلطف على القارورة لإزاحة أي ذباب حي ملتصق بسطح الغذاء في القارورة القديمة.
    6. يُنقل الذباب الحي المزاح إلى القارورة الجديدة.
    7. لا يُسجل الذباب الحي المزاح كذباب ميت.
      ملاحظة: يعد التمييز الدقيق بين الذباب الميت وغير النشط أمراً بالغ الأهمية في مراحل الحياة المتأخرة. يجب دائماً استخدام التحفيز الميكانيكي اللطيف قبل تحديد حالة الوفاة.
  4. معايير الرقابة (Censoring)
    1. تعتبر الذبابة خاضعة للرقابة اليمنى (right-censored) إذا خرجت من التجربة قبل الوفاة الطبيعية بسبب الهروب من القارورة، أو الإصابة العرضية، أو مشكلات في المناولة.
    2. يُسجل الذباب الخاضع للرقابة في عمود منفصل في اليوم الذي تخرج فيه الذبابة من التجربة.
    3. لا يُسجل الذباب الخاضع للرقابة كذباب ميت.
    4. يُستبعد الذباب الخاضع للرقابة من حسابات الوفيات في تحليل البقاء.
    5. يتم استخدام الرقابة بشكل تحفظي لأن الرقابة المفرطة قد تؤدي إلى تحيز تجريبي.
      ملاحظة: إن الفصل بين الذباب "الميت" و"المنقول" أثناء إدخال البيانات يمنع تضخم أعداد الوفيات ويضمن إعادة بناء منحنى البقاء بشكل صحيح.
  5. متابعة المقايسة
    1. تُكرر الخطوات 4.1–4.4 طوال فترة التجربة.
    2. تستمر المقايسة حتى موت آخر ذبابة باقية على قيد الحياة.

5. تجربة الانتحاء الأرضي السالب

  1. تحضير الذباب
    1. جمع الذباب من أنابيب الغذاء التجريبية دون استخدام التخدير بـ CO₂.
    2. نقل الذباب برفق إلى أنبوب تسلق نظيف، أو أنبوب الانتحاء الأرضي السلبي، باستخدام قمع صغير لمنع الهروب.
    3. ترك الذباب يتأقلم في غرفة الاختبار لمدة 5 min قبل بدء المقايسة.
    4. إجراء جميع مقايسات التسلق في نفس الوقت من اليوم، مثل فترة بعد الظهر، لتقليل التباين في الإيقاع اليوماوي.
      ملاحظة: تجنب ضوء الشمس المباشر أثناء الاختبار، حيث يمكن أن تؤدي شدة الضوء إلى تغيير السلوك الحركي.
  2. إعداد أنبوب التسلق
    1. استخدام أنبوب تسلق أسطواني شفاف يبلغ ارتفاعه 12 cm وقطره 2 cm.
    2. تحديد خط أفقي على بعد 10 cm من قاعدة الأنبوب.
    3. وضع الأنبوب عموديًا مقابل خلفية بيضاء موحدة لتسهيل التتبع بالفيديو.
    4. تثبيت هاتف ذكي أو كاميرا رقمية على حامل مستقر.
    5. التأكد من أن الأنبوب بالكامل يقع ضمن إطار التصوير.
  3. إجراء المقايسة
    1. النقر على الأنبوب بقوة ثلاث مرات على وسادة رغوية أو وسادة فأرة موضوعة على سطح صلب بحيث تسقط جميع الذباب إلى القاع في آن واحد.
    2. بدء تسجيل الفيديو فورًا لمدة 10–12 s بمعدل 30 frames/s تقريبًا.
    3. ترك الذباب يتسلق بحرية لمدة 10 s.
    4. تسجيل ثلاث تجارب مستقلة على الأقل لكل أنبوب.
    5. ترك فترة راحة مدتها 10 min بين التجارب.
    6. إجراء المقايسة لكل حالة تجريبية، مثل مجموعات التحكم، والمجموعات المعالجة بالعقار، ومجموعات التحكم بالمذيب.
    7. عد عدد الذباب الذي يصل إلى علامة 10 cm أو يتجاوزها خلال 10 s.
    8. تسجيل E كعدد الذباب الذي وصل إلى 10 cm.
    9. تسجيل T كإجمالي عدد الذباب الحي الذي تم اختباره.
    10. حساب نسبة نشاط التسلق كـ (E/T) × 100.
    11. حساب متوسط القيم عبر ثلاث تجارب.
    12. إبلاغ القيم كـ mean ± SD.
  4. التحليل شبه الآلي للتسلق باستخدام سكريبت Python
    1. الحصول على الفيديو
      1. تسجيل مقايسات الانتحاء الأرضي السلبي باستخدام كاميرا هاتف ذكي موضوعة بشكل عمودي على أنبوب تسلق شفاف يبلغ ارتفاعه 12 cm وقطره 2 cm. تسجيل الفيديوهات باستخدام هاتف ذكي أو كاميرا رقمية بمعدل 30 frames/s تقريبًا وبدقة لا تقل عن 1280 × 720 pixels. وضع الكاميرا على مسافة ثابتة تبلغ 15–20 cm تقريبًا من أنبوب التسلق والحفاظ على نفس هندسة الالتقاط في جميع التسجيلات. استخدام ارتفاع الأنبوب المعروف (12 cm) كمرجع معايرة مكانية داخلي للقياسات القائمة على البكسل.
      2. وضع الأنبوب مقابل خلفية بيضاء موحدة.
      3. تسجيل الفيديوهات لمدة 10–12 s.
      4. الحفاظ على ظروف إضاءة ثابتة في جميع التسجيلات.
      5. الحفاظ على مسافة الكاميرا ثابتة في جميع التسجيلات.
      6. الحفاظ على وضعية الأنبوب ثابتة في جميع التسجيلات.
      7. تقليل التباين في اكتشاف المركز الهندسي (centroid).
      8. حفظ الفيديوهات المسجلة بصيغة .mp4.
      9. نقل الفيديوهات المسجلة إلى جهاز كمبيوتر مكتبي للتحليل.
    2. معالجة الفيديو القائمة على Python
      1. تحليل الفيديوهات باستخدام سكريبت Python مخصص تم توفيره في Supplementary File 1. إجراء جميع التحليلات باستخدام Python 3.12.1 مع OpenCV (cv2) الإصدار 4.9.0، وNumPy الإصدار 1.26.4، وPandas الإصدار 2.2.0، وMatplotlib الإصدار 3.5.2، وScikit-learn الإصدار 1.4.2.
        1. تحديد مسار فيديو الإدخال ودليل المخرجات داخل Supplementary File 1 قبل تنفيذ السكريبت من بيئة Python أو واجهة سطر الأوامر.
        2. تشغيل السكريبت باستخدام python climbing_analysis.py بعد تحرير متغيرات VIDEO_PATH و OUTPUT_CSV.
      2. استخدام OpenCV، أو cv2، لمعالجة الإطارات واكتشاف الكائنات.
      3. استخدام NumPy للحسابات العددية.
      4. استخدام Pandas لتصدير البيانات.
      5. استخدام Matplotlib للتصور البياني.
      6. معالجة كل فيديو إطارًا تلو الآخر.
      7. قراءة الفيديو باستخدام دالة VideoCapture الخاصة بـ OpenCV.
      8. معالجة الإطارات الفردية بالتتابع.
      9. تحويل الإطارات إلى التدرج الرمادي.
      10. تطبيق تمويه Gaussian لتقليل ضوضاء الخلفية.
      11. تطبيق عتبة Otsu في وضع العكس الثنائي لفصل الذباب عن الخلفية.
      12. إجراء عمليات الفتح والإغلاق المورفولوجية لإزالة الشوائب الصغيرة وملء الفجوات في المحيط.
      13. تحديد المحيطات التي تتجاوز الحد الأدنى لمساحة المحيط البالغة 60 pixels2 لاستبعاد شوائب الخلفية وجزيئات الضوضاء الصغيرة.
      14. حساب العزوم المكانية لكل محيط صالح.
      15. تحديد إحداثيات المركز الهندسي، x و y، لكل محيط صالح.
      16. حساب متوسط إحداثيات المركز الهندسي عند اكتشاف ذباب متعدد في الإطار الواحد.
      17. الحصول على موضع متوسط واحد للمجموعة لكل إطار.
    3. تقييم مراقبة الجودة
      1. التحقق من نجاح فصل الذباب من خلال التأكد من أن المحيطات المكتشفة تتوافق مع الذباب المرئي طوال فترة التسجيل.
      2. ضمان وجود تباين كافٍ بين الذباب والخلفية باستخدام خلفية بيضاء موحدة وظروف إضاءة مستقرة.
      3. استبعاد الفيديوهات التي تحتوي على وهج مفرط، أو ظلال، أو حركة في الأنبوب، أو تداخل شديد بين الذباب، أو عدم ظهور الأنبوب بشكل كامل.
      4. اعتبار الفيديوهات غير مناسبة للتحليل عندما يفشل تتبع المركز الهندسي في أجزاء كبيرة من التسجيل أو عندما تنتج عملية التحديد عتبات تؤدي إلى ظهور شوائب خلفية مستمرة.
    4. استخراج مقاييس التسلق
      1. حساب درجة التسلق يدويًا كما هو موضح في الخطوة 5.3.7.
      2. حساب ارتفاع التسلق بالبكسل كفرق بين موضعي المركز الهندسي الرأسيين الأولي والنهائي.
      3. حساب متوسط السرعة بـ pixels/s كطول المسار الإجمالي مقسومًا على مدة التسجيل.
      4. حساب ذروة السرعة بـ pixels/s كأقصى إزاحة لحظية بين الإطارات المتتالية.
      5. حساب طول المسار بالبكسل كالمسافة التراكمية المقطوعة عبر الإطارات.
      6. حساب مساحة المسار بـ pixels2 كمساحة الغلاف المحدب الذي يحيط بجميع مواضع المركز الهندسي.
      7. حساب عدد الالتفافات كعدد التغييرات في الاتجاه الأفقي.
      8. حساب عدد التوقفات كعدد الإطارات التي تظل فيها إزاحة المركز الهندسي أقل من عتبة مسافة التوقف البالغة 3 pixels بين الإطارات المتتالية.
      9. رسم الموضع الرأسي كدالة في الزمن للحصول على مقياس موضوعي لأداء التسلق النشط.
      10. حساب منحدر التسلق بالبكسل في الثانية باستخدام نافذة انحدار خطي متحركة لمدة ثانية واحدة خلال مرحلة التسلق النشط من التسجيل.
      11. استخدام قيمة المنحدر كمقياس أساسي للأداء الحركي للتكامل مع تحليل البقاء.
      12. تصدير المقاييس الحركية المكممة، بما في ذلك ارتفاع التسلق، ومتوسط السرعة، وذروة السرعة، وطول المسار، ومساحة المسار، وعدد الالتفافات، وعدد التوقفات، ومنحدر التسلق، في ملفات بصيغة .csv. حفظ مخططات تصور المنحدر كملفات صور بصيغة .png للتحقق من الجودة والتحليلات اللاحقة.

6. دمج تحليل الصحة الحركية المبكرة وتحليل البقاء

  1. تصدير بيانات البقاء على قيد الحياة كملف .csv يحتوي على أعمدة للمجموعة، واليوم، وعدد الذباب الحي.
  2. حساب جزء البقاء لكل مجموعة عند كل نقطة زمنية عن طريق قسمة عدد الذباب الحي على حجم المجموعة الأولي.
  3. حساب المساحة تحت منحنى البقاء، أو AUC، باستخدام التكامل العددي شبه المنحرف لجزء البقاء مقابل الزمن.
  4. تصدير بيانات الأداء الحركي كملف .csv يحتوي على منحدر التسلق في اليوم 7 لكل مجموعة.
  5. تنميط الأداء الحركي في اليوم 7 بالنسبة لمجموعة الضبط، Canton S، عن طريق قسمة قيمة منحدر اليوم 7 لكل مجموعة على منحدر الضبط المقابل.
  6. دمج قيم الأداء الحركي المنمطة لليوم 7 مع قيم AUC المقابلة للبقاء لكل نمط جيني.
  7. إجراء مقارنة وصفية للأداء الحركي المنمط في اليوم 7 وAUC البقاء لتقييم العلاقة بين التدهور الحركي المبكر ونتائج البقاء.
  8. إنشاء تمثيل رسومي لقيم الأداء الحركي المنمطة في اليوم 7 وقيم AUC البقاء (الملف التكميلي 2).
    ملاحظة: يتم إجراء جميع تحليلات التكامل بين البقاء والأداء الحركي باستخدام نص Python البرمجي المخصص المتوفر في الملف التكميلي 2. استخدم Pandas لمعالجة البيانات ودمج المجموعات، وNumPy للتكامل العددي شبه المنحرف، وMatplotlib للتمثيل الرسومي.

7. التحليل الإحصائي

  1. عرض قياسات الحركة والبقاء كمجموعات بيانات ممثلة تم الحصول عليها من قوارير مكررة بيولوجياً.
  2. تقديم قياسات الحركة كقيم متوسطة محسوبة من تجارب تسلق مستقلة.
  3. استخدام التصوير الرسومي لمنحدر التسلق (pixels/s) وقيم AUC للبقاء لتوضيح العلاقات الممثلة بين الأداء الحركي ونتائج البقاء.

النتائج

ملفات تعريف عمر افتراضي قابلة للتكرار تحت ظروف تربية معيارية
عندما تم الحفاظ على الذباب تحت ظروف بيئية مضبوطة (25 °C، ورطوبة 60%، ودورة ضوء-ظلام 12 h:12 h) باستخدام غذاء معياري مُحضّر حديثاً، أظهرت مجموعات الضبط مسارات بقاء متسقة عبر تجارب مستقلة. أظهر ذباب الضبط من سلالة Canton S متوسط عمر افتراضي يتراوح بين 65–72 يوماً تقريباً، مع وصول الحد الأقصى للبقاء إلى 75 يوماً (الشكل 2). أُجريت تجارب العمر الافتراضي باستخدام مكررين بيولوجيين لكل حالة، حيث احتوى كل مكرر على 20 ذبابة. وأظهرت مسارات البقاء التمثيلية التي تم الحصول عليها تحت ظروف بيئية وغذائية معيارية ملفات تعريف لعمر افتراضي قابلة للتكرار في مجموعات الضبط.

في المقابل، أظهرت الذباب التي تعبر عن amyloid-β في جميع الخلايا العصبية انخفاضاً في معدلات البقاء مقارنة بضوابط Canton S، وهو ما يتفق مع الأنماط الظاهرية للتنكس العصبي التي تم الإبلاغ عنها سابقاً في نماذج مرض الزهايمر في Drosophila4,5,6.

قد تحدث نتائج غير مثالية في طول العمر عندما تتدهور جودة الغذاء أو عندما تكون ظروف المناولة غير متسقة. وتحت هذه الظروف، تم رصد ارتفاعات في معدلات الوفاة المبكرة خلال أول 7–10 أيام وزيادة في التباين بين الأنابيب (>25%)، مما يشير إلى تضرر إمكانية تكرار التجربة وانخفاض الاتساق عبر المكررات البيولوجية.

تدهور حركي مرتبط بالعمر تم رصده عبر تحليل التسلق شبه الآلي
كشف التقييم اليدوي التقليدي لسلوك الانتحاء الأرضي السلبي عن تدهور في القدرة الحركية مرتبط بالعمر في الذباب الذي يعبر عن amyloid-β مقارنة بمجموعات التحكم من سلالة Canton S (الشكل 3). في اليوم 7، ظل أداء التسلق متقارباً بشكل عام بين المجموعات، بينما أظهر الذباب الذي يعبر عن amyloid-β انخفاضاً في نشاط التسلق بحلول اليوم 28 مقارنة بذباب التحكم. وحافظت مجموعات التحكم على أداء تسلق مستقر نسبياً عبر النقاط الزمنية للتقدم في السن. وتوافقت هذه الاتجاهات السلوكية المسجلة يدوياً مع انخفاض قيم منحدر التسلق المستخرجة من مسار FlyTrDT شبه الآلي، مما أظهر اتجاهات مرتبطة بالعمر تشبه تلك الناتجة عن التقييم التقليدي للنقاط النهائية وسير عمل التتبع الحسابي (الشكل 4). ويتسق التدهور الحركي الملحوظ في الذباب الذي يعبر عن amyloid-β مع الاضطراب السلوكي المرتبط بالعمر والمعروف في نماذج التنكس العصبي في Drosophila باستخدام مقاييس الانتحاء الأرضي السلبي التقليدية6,7.

كشف تحليل التسلق شبه الآلي باستخدام FlyTrDT عن الحفاظ على الوظائف الحركية المبكرة في ذباب المجموعة الضابطة. وفي اليوم 7، أظهر ذباب المجموعة الضابطة متوسط ميل تسلق بلغ 86.64 pixels/s، مما يعكس استمرار الإزاحة للأعلى خلال مرحلة التسلق النشطة (الشكل 4). وبحلول اليوم 28، اقترب الميل من الصفر (−1.50 pixels/s)، وهو ما يتوافق مع التباطؤ المرتبط بالعمر.

في المقابل، أظهرت الذباب التي تعبر عن amyloid-β ضعفاً مبكراً في الوظائف الحركية. ففي اليوم 7، انخفض منحدر التسلق إلى 34.25 pixels/s، وهو ما يمثل حوالي 39% من أداء المجموعة الضابطة بعد التسوية. وبحلول اليوم 28، انخفض منحدر التسلق بشكل ملحوظ إلى −72.25 pixels/s، مما يشير إلى ضعف في أداء الحركة التصاعدية.

يلتقط المقياس القائم على الميل شريحة التسلق النشطة ويقلل من المساهمات الناتجة عن فترة كمون الفزع الأولية، ومراحل الثبات، والشوائب الناتجة عن الحركات العشوائية. وتشير الميول الموجبة إلى حركة صافية صعوداً، بينما تشير الميول القريبة من الصفر إلى إزاحة عمودية محدودة، وتشير الميول السالبة إلى إزاحة صافية نزولاً. وتوضح هذه المسارات التمثيلية التدهور الحركي التدريجي في الذباب الذي يعبر عن amyloid-β مقارنة بمجموعات الضبط المتوافقة في العمر.

في ظل ظروف تسجيل مثالية، أنتج مسار عمل FlyTrDT مسارات متصلة للمراكز الثقلية مع تجزئة مستقرة للحدود وملفات إزاحة رأسية متسقة (الشكل 4A). وقد انعكس انخفاض الأداء الحركي في الذباب الذي يعبر عن amyloid-β من خلال مسارات صاعدة أقل استدامة وقيم ميل أقل (الشكل 4B–D). أما مقاطع الفيديو التي تم تسجيلها مع وجود وهج مفرط، أو وضعية غير مستقرة للأنبوب، أو إضاءة غير متسقة، أو تباين غير كافٍ في الخلفية، فقد أنتجت مسارات غير متصلة للمراكز الثقلية وتدخلات تتبع متقطعة، وتم استبعادها أثناء تقييم مراقبة الجودة.

الارتباط بين الأداء الحركي المبكر ونتائج البقاء على قيد الحياة
لفحص الارتباطات بين الأداء الحركي المبكر ونتائج البقاء على قيد الحياة، تمت مقارنة قيم منحدر التسلق المعيارية في اليوم 7 مع المساحة تحت المنحنى (AUC) للبقاء على قيد الحياة عبر الأنماط الجينية (الشكل 5). أظهرت ذباب السيطرة التي حافظت على أداء حركي مبكر (مؤشر حركي معياري = 1.0) قيم AUC أعلى للبقاء على قيد الحياة (48.2)، بينما أظهر الذباب الذي يعبر عن amyloid-β مع انخفاض في الأداء الحركي المبكر (مؤشر حركي معياري = 0.395) قيم AUC أقل للبقاء على قيد الحياة (24.65). تم إنشاء مجموعات بيانات حركية تمثيلية من قارورتين مكررتين بيولوجياً لكل حالة. وتشير مجموعات البيانات التمثيلية هذه إلى وجود ارتباط بين انخفاض الأداء الحركي المبكر وقصر مدة البقاء على قيد الحياة في نموذج مرض amyloid-β. ونظراً لأنه تم تحليل نمطين جينيين تمثيليين فقط، فقد عُرضت هذه النتائج بشكل وصفي بدلاً من كونها ارتباطاً تنبؤياً ذا قوة إحصائية.

مقايسة تسلق ذبابة Drosophila المعدلة وراثياً؛ مخطط صندوقي ومنحنى كابلان-ماير لدراسة مرض الزهايمر.
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل مسار FlyTrDT شبه الآلي الذي يدمج مقاييس فترة الصحة الحركية مع تحليل البقاء على قيد الحياة. يتضمن سير العمل تربية الذباب وتحليل فترة الحياة بشكل معياري، وتقييم الانتحاء الأرضي السلبي يدوياً وبشكل شبه آلي، واستخراج المركز الهندسي لكل إطار من فيديوهات التسلق، وحساب ميل التسلق (pixels/s)، وتحليل المساحة تحت المنحنى (AUC) للبقاء على قيد الحياة، ودمج الأداء الحركي مع نتائج البقاء على قيد الحياة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رسم بياني لتحليل البقاء يقارن بين مجموعة Canton S الضابطة ومجموعات Aβ؛ الاحتمالية على مدار الأيام.
الشكل 2: تحليل كابلان-ماير للبقاء لذباب Canton S الضابط والذباب الذي يعبر عن amyloid-β. توضح منحنيات البقاء مسارات طول العمر في ظل ظروف بيئية وغذائية موحدة. أظهر ذباب Canton S الضابط بقاءً ممتداً مقارنة بالذباب الذي يعبر عن amyloid-β في جميع العصبونات، والذي أظهر انخفاضاً في طول العمر عبر النقاط الزمنية للشيخوخة. تمثل البيانات مسارات بقاء نموذجية تم الحصول عليها من قارورتين مكررتين بيولوجياً لكل حالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نتائج اختبار تسلق ذبابة الفاكهة (Drosophila)؛ تقارن المخططات الصندوقية بين مجموعة CS ومجموعة elav-Gal4/UAS-Aβ42 في اليومين 7 و28.
الشكل 3: أداء الانتحاء الأرضي السالب اليدوي في ذباب المجموعات الضابطة والذباب الذي يعبر عن البروتين الأميلويدي-بيتا في اليوم السابع واليوم الثامن والعشرين. تُظهر المخططات الصندوقية قياسات تمثيلية لنشاط التسلق مُعبراً عنها كنسبة مئوية للذباب الذي اجتاز عتبة الـ 10 سم خلال 10 ثوانٍ. حافظ ذباب التحكم من سلالة Canton S (CS) على نشاط تسلق مستقر نسبياً عبر النقاط الزمنية للشيخوخة، بينما أظهر الذباب الذي يعبر عن بروتين amyloid-β انخفاضاً في أداء التسلق بحلول اليوم 28. تمثل كل نقطة قياساً فردياً لكل قارورة. وقد استُمدت مجموعات البيانات التمثيلية من قارورتين مكررتين بيولوجياً لكل حالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل ارتفاع التسلق؛ توضح الرسوم البيانية A-D منحدرات البيكسل/ثانية؛ مخططات الوقت مقابل الارتفاع؛ اتجاهات البيانات.
الشكل 4: الاستخراج شبه الآلي لمسارات التسلق ومنحدر التسلق النشط في ذباب المجموعة الضابطة والذباب الذي يعبر عن amyloid-β. تم استخراج مسارات متوسط الموضع العمودي التمثيلية من فيديوهات الانتحاء الأرضي السلبي باستخدام خط معالجة التتبع FlyTrDT. تمثل الآثار الزرقاء متوسط الموضع المركزي العمودي لكل إطار للذباب المكتشف بمرور الوقت، وتشير القطع الحمراء إلى قطعة تسلق نشطة تمثيلية تم تحديدها باستخدام نافذة انحدار خطي متدحرجة. يتم التعبير عن قيم المنحدر بوحدة pixels/s. (A) ذباب Canton S الضابط في اليوم 7. (B) الذباب الذي يعبر عن amyloid-β في اليوم 7. (C) ذباب Canton S الضابط في اليوم 28. (D) الذباب الذي يعبر عن amyloid-β في اليوم 28. تم إنشاء المسارات التمثيلية من قارورتين من المكررات البيولوجية لكل حالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رسم بياني للصحة الحركية المبكرة مقابل البقاء على قيد الحياة؛ تظهر المحاور الصحة الحركية المقيسة في اليوم 7 والمساحة تحت المنحنى (AUC) للبقاء على قيد الحياة.
الشكل 5: الارتباط بين الأداء الحركي المبكر ونتائج البقاء على قيد الحياة في نموذج Drosophila لسمية amyloid-β. تم تمثيل قيم ميل التسلق المقيسة في اليوم 7 مقابل المساحة تحت منحنى (AUC) البقاء على قيد الحياة لذباب التحكم من سلالة Canton S (CS) والذباب المعبر عن amyloid-β (AD) (العدد = 2). أظهر ذباب التحكم أداءً حركياً مبكراً أعلى وقيم AUC أعلى للبقاء على قيد الحياة مقارنة بالذباب المعبر عن amyloid-β. توضح هذه المجموعات البيانية التمثيلية وجود ارتباط بين الأداء الحركي المبكر ونتائج البقاء على قيد الحياة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: نص برمجي لتحليل التسلق FlyTrDT قائم على لغة Python، يُستخدم للتقدير الكمي شبه الآلي للحركة الموضعية من مقاطع فيديو الانتحاء الأرضي السلبي. يقوم النص البرمجي بمعالجة الصور إطاراً بإطار، والكشف عن المركز الهندسي، واستخراج المسار، وحساب مقاييس التسلق، بما في ذلك منحدر التسلق، والسرعة، وطول المسار، ومساحة المسار، وعدد مرات التوقف، وعدد مرات الدوران.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: نص برمجي بلغة Python لدمج بيانات مدى الصحة الحركية وفترة الحياة. يقوم النص البرمجي بحساب كسر البقاء، وتحليل المساحة تحت المنحنى (AUC) باستخدام طريقة شبه المنحرف، ومعايرة قيم ميل التسلق في اليوم 7، ودمج مجموعات البيانات، والتمثيل الرسومي للأداء الحركي ونتائج البقاء.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

نقدم هنا بروتوكولاً يدمج تحليل مدى الحياة مع التحديد الكمي شبه الآلي لفترة الصحة الحركية في ذبابة *Drosophila melanogaster*. يعتمد التكامل الموثوق لقياسات مدى الحياة والقدرة الحركية بشكل قوي على الاتساق البيئي، وجودة الغذاء، وإجراءات المناولة الموحدة عبر المكررات البيولوجية7. إن التباين في جفاف الغذاء، أو التأخر في عمليات النقل، أو عدم الاتساق في رصد الوفيات قد يؤدي إلى حدوث طفرات مبكرة في معدلات الوفيات وزيادة التباين بين الأنابيب، مما يؤثر بالتالي على إعادة بناء منحنيات البقاء والتفسير اللاحق للأنماط الظاهرية للشيخوخة.

خلال اختبار الانتحاء الأرضي السلبي، يلزم توفير ظروف إضاءة ثابتة، ووضعية دقيقة للكاميرا، ومحاذاة دقيقة للأنبوب لضمان الكشف الموثوق عن المركز الهندسي (centroid) أثناء معالجة الفيديو. يجب تقليل التعرض المفرط لـ CO₂ أثناء عملية الفرز، حيث يمكن أن يؤثر التخدير على كل من متوسط العمر والأداء الحركي. عند إجراء قياسات سلوكية متكررة على نفس المجموعة، يجب إجراء الاختبارات في نفس الوقت من اليوم لتقليل التباين المرتبط بالإيقاع اليوماوي. قد يؤدي التباين غير الكافي للخلفية أو الإضاءة غير المتسقة إلى إعاقة عمليات تحديد العتبة (thresholding) وكشف الخطوط المحيطية أثناء التحليل الآلي. في حالة ملاحظة تفتت في الخطوط المحيطية أو مسارات غير مستقرة للمركز الهندسي أثناء معالجة الفيديو، يجب تحسين تباين الخلفية، وتقليل الوهج، وتثبيت وضعية الكاميرا، والحفاظ على إضاءة موحدة عبر جميع التسجيلات. كما يمكن تقليل عيوب تحديد العتبة المستمرة عن طريق ضبط زاوية التسجيل، أو تقليل الظلال، أو التأكد من أن أنبوب التسلق بالكامل يظل مرئيًا باستمرار داخل الإطار. قد يؤدي تكتل الذباب المفرط داخل الأنبوب إلى إعاقة التقدير الدقيق للمركز الهندسي، ويجب تقليل ذلك من خلال الحفاظ على أحجام مجموعات متسقة عبر التجارب.

عادةً ما تقوم اختبارات الانتحاء الأرضي السلبي التقليدية بقياس نسبة الذباب الذي يصل إلى ارتفاع محدد مسبقاً خلال فاصل زمني ثابت، وتُستخدم على نطاق واسع لتقييم التدهور الحركي أثناء الشيخوخة والتنكس العصبي5,6. وفي المقابل، يقوم سير العمل شبه الآلي الحالي باستخلاص مرحلة تسلق نشطة من الحركة الصاعدة وحساب منحدر التسلق النشط (pixels/s) من مسارات المركز الهندسي لكل إطار. ونظراً لأن مواضع المركز الهندسي يتم حساب متوسطها لجميع الذباب المكتشف داخل كل إطار، فإن المسارات الحركية الفردية والتباين السلوكي بين ذبابة وأخرى لا يتم تحديدهما. يقلل هذا النهج من تأثيرات زمن استجابة الجفل، والتوقفات العابرة، وسلوك التكتل التي تؤثر على التسجيل اليدوي القائم على نقاط النهاية. وعلى عكس التسجيل التقليدي القائم على نقاط النهاية، يوفر سير العمل الحالي أيضاً قياسات مستمرة لمنحدر الصعود (pixels/s) والتي تتيح مقارنة كمية للتدهور الحركي عبر العمر والنمط الجيني. وقد تم تطبيق مناهج تتبع حاسوبية مماثلة بشكل متزايد لتحسين الموضوعية والاتساق في التحليل السلوكي لـ Drosophila باستخدام منصات القياس الحركي الآلية8,9,10,11,12.

يجب مراعاة عدة قيود إضافية؛ حيث تعتمد قياسات منحدر التسلق القائمة على البكسل (pixels/s) على ثبات معايرة الكاميرا وهندسة التسجيل عبر جميع التجارب. وقد تؤثر الاختلافات في مسافة الكاميرا أو دقتها على قيم المنحدر المطلقة، مما يستدعي إجراء معايرة (normalization) وفقًا لضوابط داخلية. علاوة على ذلك، ورغم أن التدهور الحركي المبكر ارتبط نوعياً بانخفاض معدلات البقاء في نموذج amyloid-β المعروض هنا، فإن التحقق على نطاق أوسع عبر أنماط جينية إضافية، أو تدخلات، أو علاجات دوائية من شأنه أن يعزز تفسير العلاقة بين الأداء الحركي ونتائج البقاء. إن مجموعات البيانات التمثيلية المعروضة هنا تهدف إلى توضيح تنفيذ سير العمل وتفسيره بدلاً من إنشاء نموذج تنبؤي معمّم عبر سياقات المرض المختلفة.

على الرغم من هذه القيود، يوفر هذا البروتوكول إطار عمل قابلاً للتكرار وفعالاً من حيث التكلفة لربط مقاييس مدى الصحة الوظيفية بنتائج البقاء على قيد الحياة في دراسات الشيخوخة. وتعد هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة مع التلاعبات الجينية، ونماذج فحص الأدوية، ونماذج التحلل العصبي التي يسبق فيها التدهور الوظيفي الوفاة. ومن خلال دمج التكميم الموضوعي لمنحدر التسلق (pixels/s) مع تحليل البقاء القياسي، يسهل هذا النهج التنميط الظاهري الشامل لمسارات الشيخوخة في ذباب Drosophila. وقد تؤدي الدراسات المستقبلية التي تدمج أنماطاً جينية إضافية للتحلل العصبي، وتدخلات دوائية، ومجموعات بيانات سلوكية طولية إلى تعزيز فائدة سير العمل هذا لتحليل مدى الصحة المتكامل13,14.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بتمويل من مدرسة أمريتا للتكنولوجيا الحيوية، جامعة أمريتا فيشوا فيديابيثام، أمريتابوري.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجارHimedia GRM666عامل تصلب
حمض البنزويكHimediaGRM488مادة حافظة مضادة للميكروبات
Canton-SBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #1سلالة مرجعية من النوع البري
أنبوب تسلقصناعة خاصةN/Aأنبوب أسطواني شفاف، بارتفاع 12 cm × قطر 2 cm، من البلاستيك الشفاف أو الزجاج
دقيق الذرةمورد محلي N/Aتحضير غذاء الذباب
كمبيوتر مكتبي/محمولأي شركة مصنعةيحدده المستخدممعالج ثنائي النواة كحد أدنى، ≥8 GB RAM، نظام تشغيل متوافق مع Python 3.x
D-glucoseHimediaMB037مكون غذاء الذباب
elav-GAL4Bloomington Drosophila Stock CenterBDSC #458محرك GAL4 عصبي شامل
Matplotlibمكتبة مفتوحة المصدرVersion 3.5.2الرسم البياني والتصور المرئي
NumPyمكتبة مفتوحة المصدرVersion 1.26.4الحسابات العددية
OpenCVمكتبة مفتوحة المصدرVersion 4.9.0معالجة الفيديو
Pandasمكتبة مفتوحة المصدرVersion 2.2.0معالجة البيانات
حمض البروبيونيكHimediaGRM3658مادة حافظة مضادة للفطريات
PythonPython Software Foundation Version 3.12.1بيئة التحليل
Scikit-learnمكتبة مفتوحة المصدرVersion 1.4.2تحليل الانحدار الخطي
كاميرا هاتف ذكي / كاميرا رقميةأي شركة مصنعةيحدده المستخدمتسجيل بحد أدنى 30 إطاراً/ثانية، تركيز ثابت، وضعية عمودية، دقة 1280 × 720 كحد أدنى
السكروزHimediaGRM601مكون غذاء الذباب
UAS-APP.Aβ.E693GBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #33774نموذج طفرة Arctic لبروتين APP البشري
خميرةHimediaRM027مكمل غذائي

المراجع

  1. López-Otín C, et al. The hallmarks of aging. Cell. 2013;153(6):1194-217.
  2. Caligiore D, Giocondo F, Silvetti M. The Neurodegenerative Elderly Syndrome (NES) hypothesis: Alzheimer and Parkinson are two faces of the same disease. IBRO Neurosci Rep. 2022;13:330-43.
  3. Buchman AS, Bennett DA. Loss of motor function in preclinical Alzheimer’s disease. Expert Rev Neurother. 2011;11(5):665-76.
  4. Sivanantharajah L, Mudher A, Shepherd D. An evaluation of Drosophila as a model system for studying tauopathies such as Alzheimer’s disease. J Neurosci Methods. 2019;319:77-88.
  5. Jones MA, Grotewiel M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Exp Gerontol. 2011;46(5):320-5.
  6. Gargano JW, Martin I, Bhandari P, Grotewiel MS. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 2005;40(5):386-95.
  7. Linford NJ, Bilgir C, Ro J, Pletcher SD. Measurement of lifespan in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. 2013;(71):50068.
  8. Spierer AN, Yoon D, Zhu CT, Rand DM. FreeClimber: automated quantification of climbing performance in Drosophila. J Exp Biol. 2021;224(2).
  9. Taylor MJ, Tuxworth RI. Continuous tracking of startled Drosophila as an alternative to the negative geotaxis climbing assay. J Neurogenet. 2019;33(3):190-8.
  10. Cao W, et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. J Vis Exp. 2017;(127):56507.
  11. Liu H, et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Aβ42-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 2015;31(5):541-9.
  12. Rhodenizer D, et al. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp Gerontol. 2008;43(8):739-48.
  13. Tsintzas E, Niccoli T. Using Drosophila amyloid toxicity models to study Alzheimer’s disease. Ann Hum Genet. 2024;88(5):149-65.
  14. O’Keefe L, Denton D. Using Drosophila models of amyloid toxicity to study autophagy in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2018;2018:5195416.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الانتحاء الأرضي السالبالأداء الحركيمسارات البقاءالمقايسة القائمة على الفيديوكشف المركز الهندسيمنحدر التسلقنموذج التنكس العصبي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.