تقييم النمو غير القابل للكشف القائم على الزراعة وتحليل مضادات الأكسدة لمستخلص جل الألوفيرا الطازج

ملخص

يصف هذا البروتوكول التحضير المعقم لمستخلص الألوفيرا الطازج من الهلام الداخلي، وقياس الرقم الهيدروجيني الجهدي، وتقييم القدرة الكاملة لمضادات الأكسدة باستخدام اختبار ألوانية آلي قائم على ABTS، وتقييم النمو غير القابل للكشف في ظروف الحضانة المحددة، والفحص الأولي لمضادات الميكروبات لألوفيرا بنسبة 70:30 (v/v).خلط اختبار /N-أسيتيل-إل-سيستين عن طريق انتشار القرص وتخفيف الأنابيب الثنائية النوعية.

الملخص

الألوة فيرا (Aloe barbadensis Miller) تستخدم على نطاق واسع في المنتجات الطبية الموضعية والمكملة. ومع ذلك، لا تزال سير العمل المخبري الموحد لتقييم السعة الكلية لمضادات الأكسدة (TAC)، وسلوك الرقم الهيدروجيني، وحالة النمو غير القابل للكشف القائمة على الزراعة تحت ظروف محددة، والفحص الأولي للمضادات الميكروبية محدودة. تم تحضير مستخلص الألوفيرا الطازج الداخلي المعقم وتركيبه بمستويات 5٪، 10٪، 15٪، و20٪ (بدون ضغط). تم قياس الرقم الهيدروجيني بشكل جهدي، وتم تحديد TAC بواسطة اختبار ألواني قائم على الكاتيون الجذري الآلي ABTS. تم إجراء تقييم نمو غير قابل للكشف قائم على الزراعة عن طريق تلقيح المستخلص على أغار الدم، وأجار الأجر الأزرق الإيوزين ميثيلين، وأجار سابورو ديكستروز، تلاها حضانة هوائية وفحص بصري بعد 24 ساعة، 48 ساعة، و72 ساعة. تم إجراء فحص مضاد ميكروبي لمزيج اختبار الألوفيرا/N-أسيتيل-L-سيستين بنسبة 70:30 (v/v) ضد السلالات المرجعية القياسية باستخدام تحليل انتشار الأقراص واختبارات التخفيف النوعية ذات الأنابيب الثنائية. اختلفت TAC بشكل كبير بين المجموعات (كروسكال-واليس، p = 0.014)، حيث لوحظت أعلى القيم في الصياغة التي بلغت 20٪. لم يلاحظ نمو بكتيريا أو فطريات مرئي تحت ظروف الزراعة المختبرة خلال فترة المراقبة التي استمرت 72 ساعة. أنتج خليط اختبار الألوفيرا/N-أسيتيل-إل-سيستين مناطق تثبيط تتراوح بين 11 مم إلى 17 مم، مع لوحظة أكبر منطقة مقابل Pseudomonas aeruginosa. يوفر هذا السير عمل مخربا عمليا لتحضير وتوصيف الألوفيرا الطازج بشكل أولي.تركيبات قائمة على -لأبحاث الطب التكميلي في المراحل المبكرة.

المقدمة

استمرت الألوفيرا في جذب اهتمام علمي كبير بسبب استخدامها الطويل في الطب التقليدي وانتشارها المتزايد في أبحاث الأدوية والطب الحيوي والتجميل وأبحاث الغذاء ^1,2,3. يحتوي هذا النبات الطبي على مجموعة متنوعة من المكونات النشطة بيولوجيا، بما في ذلك عديدات السكريات، والمركبات الفينولية، والجمرة الخبيثة، والفيتامينات، والمعادن، والإنزيمات، وغيرها من المستقلبات منخفضة الوزن الجزيئي التي قد تساهم في خصائصه العلاجية والوظيفية ^1,2,3. من بين هذه المكونات، تم التركيز على الآيسمانان بسبب إمكاناته الحيوية وأدواره المبلغة في إصلاح الأنسجة، وتعديل المناعة، والتطبيقات التجديدية^4،5. بالتوازي، ارتبطت المركبات الفينولية وغيرها من المركبات الفعالة المضادة للأكسدة بتأثيرات إزالة الجذور الحرة، والحماية، والداعمة بيولوجيا لمستحضرات الألوفيرا ^2,3.

شهدت السنوات الأخيرة اهتماما متزايدا بدمج الألوفيرا في أنظمة التركيب المتقدمة والمواد النشطة حيويا. تم دراسة الهيدروجيل المعتمد على الألوفيرا، وأحبار المواد الحيوية، والمركبات النانوية، والسقالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد لتطبيقات شفاء الجروح ودعم الأنسجة بسبب قدرتها العالية على الترطيب، والتوافق الحيوي، وخصائصها البيولوجية متعددة الوظائف 4,6,8,9,10,11. أظهرت الدراسات التجريبية أن المواد التي تحتوي على الألوفيرا قد تدعم إدارة الجروح من خلال المساهمة في بيئة رطبة، وتحسين الخصائص الفيزيائية والكيميائية للتركيبة، وتوفير دعم مضاد للأكسدة أو مضادات الميكروبات في ظروف مختارة مختارة في المختبر، وفي الجسم الحي، والحالات المعتمدة على التركيبة 4,7,8,9,10,11. بالإضافة إلى ذلك، تم استكشاف الألوة فيرا في تطبيقات حفظ وتركيب الأغذية، حيث ارتبطت الطلاءات الهلامية والأنظمة ذات الصلة بتحسين الاستقرار التأكسدي، وجودة حسية أفضل، ^وأداء ميكروبيولوجي محسن^. تشير هذه التطورات إلى أن الألوة فيرا تعتبر بشكل متزايد ليس فقط منتجا عشبيا تقليديا، بل أيضا كمادة طبيعية متعددة الوظائف ذات إمكانات واسعة موجهة للتركيب 2,3,12,13.

تمتد الأهمية البيولوجية للألوة فيرا أيضا إلى التطبيقات المضادة للميكروبات والموجهة للميكروبيولوجيا. وصفت دراسات حديثة تأثيرات مثبطة للألوة فيرا أو التحضيرات التي تحتوي على الألوة فيرا ضد الكائنات الدقيقة المهمة سريريا، بما في ذلك حب الشباب بروبيونيبكتيريوم، وEnterococcus faecalis، وأنواع الكانديدا، والعزلات السريرية المعزولة من عدوى الجروح 14,15,16,17. أظهرت الأدلة المخبرية السابقة أيضا نشاطا لألوفيرا الهلامية الداخلية ضد سلالات مرجعية ومعزولات سريرية¹⁸. علاوة على ذلك، أبلغ أن أنظمة الهجين المحتوية على الألوفيرا تظهر قدرات مشتركة مضادة للميكروبات ومضادات أكسدة وشفاء الجروح، مما يدعم الطبيعة متعددة الوظائف لهذه المادة النباتية^{المشتقة 19}. ومع ذلك، يتأثر الأداء البيولوجي للألوة فيرا بعدة عوامل منهجية، بما في ذلك نسبة النبات المستخدمة، وإجراءات الاستخلاص، والتركيز، وظروف التعامل، ونضارة الهلام، وما إذا كان التحضير المختبر يحتوي فقط على الجل الداخلي أو يحتوي على مكونات مرتبطة باللاتكس ^2,20. هذه العوامل مهمة بشكل خاص لأن أجزاء الهلام الداخلي والخارجية تختلف في التركيب والملف السموي²⁰.

على الرغم من تزايد حجم الأدبيات، لا تزال هناك فجوات منهجية مهمة. في العديد من الدراسات المنشورة، يتم تقييم سلوك مضادات الأكسدة، والخصائص الفيزيائية الكيميائية، والتقييم الميكروبيولوجي، وأداء المضادات الميكروبية بشكل منفصل بدلا من أن يكون ضمن سير عمل متكامل واحد. أما بالنسبة للأبحاث التي تركز على الصياغة، فهذه المعايير مرتبطة ارتباطا وثيقا. قد يظهر التحضير نشاطا مضادا للأكسدة إيجابيا لكنه لا يزال يتطلب تقييما ميكروبيولوجيا دقيقا وتوصيفا فيزيائيائيا كيميائيا قبل اعتباره مناسبا لتطوير تجريبي إضافي. لذلك، قد توفر سير العمل المخبري الذي يجمع بين التقييم المرتبط بالأكسدة والاختزال، وتقييم الرقم الهيدروجيني، واختبارات النمو غير القابل للكشف عبر الزراعة، وفحص أولي لمضادات الميكروبات أساسا أكثر عملية ومعلوماتية لتوصيف المراحل المبكرة لتركيبات الألوة فيرا الطازجة.

وبناء عليه، هدفت هذه الدراسة إلى تقييم تركيبات مستخلص الألوفيرا الهلامية الداخلية الطازجة المحضرة بتركيزات مختلفة من حيث خصائص الرقم الهيدروجيني، والقدرة الكلية لمضادات الأكسدة، وحالة النمو غير القابلة للكشف القائمة على الزراعة تحت ظروف مختبرية محددة، والفحص الأولي لمضادات الميكروبات عن طريق انتشار القرص وتخفيف الأنابيب النوعية المزدوجة. من خلال دمج هذه التقييمات ضمن سير عمل تجريبي واحد، صممت الدراسة لتوفير نهج عملي أساسي للتوصيف الأولي للألوة فيرا.تركيبات قائمة على -مخصصة لأبحاث الطب التكميلي.

البروتوكول

1. تحضير مستخلص الألوفيرا وسلسلة التخفيف

1. احصد أوراق نبات الألوة فيرا الناضجة التي تنمو في درجة حرارة الغرفة وشطفها جيدا تحت الماء الجاري لإزالة أي بقايا.
2. في خزانة السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2)، قم بتعقيم سطح الورقة بنسبة 70٪ إيثانول باستخدام قفازات معقمة. بعد تطبيق 70٪ إيثانول، اترك سطح الورقة يجف تماما في الهواء لمدة لا تقل عن دقيقتين قبل الشق المعقم.
3. باستخدام مشرط معقم، قم بإزالة الطرف البعيد وحواف الورقة، ودع إفرازات اللاتكس الأصفر تصرف بالكامل لمدة تقارب 30 دقيقة، ثم قم بتقشير الورقة طوليا. افصل بعناية واجمع فقط الجل الشفاف الداخلي، متجنبا القشرة الخارجية وطبقة اللاتكس المتبقية.
4. انقل جل الألوة فيرا الداخلي بعناية إلى وعاء معقم وقم بالتجانس عن طريق الدوامات المتقطعة لمدة تقارب 5-10 دقائق عند حوالي 2500 دورة في الدقيقة (أو إعداد دوامة متوسطة إلى عالية مكافئة)؛ نفذ الإجراء في درجة حرارة الغرفة ما لم تكن هناك حاجة للتحكم في درجة الحرارة للأداة المحددة.
5. في ظروف معهرة، جهز تركيبات مستخلص الألوة فيرا الطازجة بدرجة 5٪، 10٪، 15٪، و20٪ (مع الزجاج) باستخدام ماء مقطر معقم؛ على سبيل المثال، حضر 5٪ (بالضبط/الجهل) عندما يصل جل 5 جرام إلى الحجم النهائي 100 مل، ثم قم بضبط التركيزات المتبقية بشكل مماثل.

2. قياس الرقم الهيدروجيني

1. قم بإجراء معايرة مقياس الرقم الهيدروجيني بثلاث نقاط باستخدام حلول التخزين الاحتياطي القياسية pH 4.01 و7.00 و10.01 مع تتبع NIST قبل كل سلسلة قياس.
2. قس الرقم الهيدروجيني لكل تركيز عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية)؛ يسجل على الأقل ثلاث نسخ تقنية لكل تركيز.

3. قياس السعة الكلية لمضادات الأكسدة (TAC)

1. استخدم تركيبات مستخلص الألوة فيرا المحضرة في الخطوة الأولى (5٪، 10٪، 15٪، و20٪) لقياس TAC.
2. رفع جميع المواد والكواشف والعينات إلى درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) قبل التحليل لضمان الاتساق التحليلي.
3. قم بمعايرة المحلل الكيميائي الحيوي الآلي (اختبار Rel، تركيا) وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للمصنع قبل بدء الاختبار.
4. تحميل كواشف السعة الكلية لمضادات الأكسدة (TAC) المبنية على طريقة إيريل في حجرات الكواشف المحللة.
5. بيبت الألوة فيرا. تستخرج العينات في أكواب العينات المناسبة أو آبار التفاعل باستخدام ميكروبايبتات معايرة. (حجم العينة: 5 ميكرولتر)
6. ابدأ اختبار TAC باستخدام بروتوكول المحلل المبرمج لطريقة ABTS المعتمدة على الكاتيونات الجذرية، باتباع أحجام الكواشف وإعدادات الحضانة التي يحددها المصنع.
7. تسمح للتفاعل بالسير تلقائيا، حيث تقلل مضادات الأكسدة الموجودة في العينة من كاتيون جذور ABTS الملونة، مما يؤدي إلى انخفاض في الامتصاص.
8. قس التغير في الامتصاص مطيافا فوتومترية عند الطول الموجي المحدد بالطريقة TAC. (الطول الموجي: 660 نانومتر)
9. احسب قيم السعة الكلية لمضادات الأكسدة باستخدام برنامج المحلل من خلال مقارنة تغيرات امتصاص العينة مع منحنى معايرة ترولوكس المكافئ.
10. تنتج Express TAC مكافئات ترولوكس MMOL / لتر لكل وحدة حجم من المستخلص.
11. قم بإجراء جميع القياسات بشكل مكرر لضمان الموثوقية التحليلية.

4. تقييم النمو غير القابل للكشف القائم على الثقافة للجل الداخلي لألوفيرا

1. قم بتلقيح 10 ميكرولتر من كل مستخلص على أجار الدم، وأجار الأجر الأزرق الإيوزين ميثيلين، وأجار سابورو ديكستروز باستخدام حلقة معايرة (10 ميكرولتر) (طريقة عد المستعمرات).
2. لتقييم النمو غير القابل للكشف القائم على الثقافة، يتم توزيع أليكوت معقيم بسعة 50 ميكرولتر باستخدام ميكروبايبت معايرة على صفائح أغار الدم، وأجار الإيوسين ميثيلين الأزرق، وألواح سابورو ديكستروز ووزعها بلطف باستخدام حلقة معقمة قابلة للتخلص (10 ميكرولتر) (تقييم التكاثر القائم على الزراعة باستخدام طريقة التنقيط المباشر).
3. حضن صفائح الأجار الأجر الدموي والأجار الأزرق الإيوزين الميثيلين بشكل هوائي عند 37 درجة مئوية وألواح سابورو ديكستروز الأجار هوائية عند 25–28 درجة مئوية، ثم فحص الصفائح بصريا للنمو عند 24 و48 و72 ساعة. حضن صفيحة واحدة غير ملقحة من كل وسط بشكل متوازي كأداة تحكم سالبة.

5. تقييم النشاط المضاد للميكروبات لمزيج اختبار الألوة فيرا

1. في ظروف معقمة، جهز محلول اختبار متجانس عن طريق خلط مستخلص جل الألوفيرا المعقم بنسبة 70٪ مع محلول N-أسيتيل-L-سيستين بنسبة 30٪ (10٪ w/v في ماء معقم).
   ملاحظة: يقلل هذا الخليط من اللزوجة العالية للجل المأخوذ من الورقة ويحصل على قوام أكثر سلاسة. اعتبر هذه التركيبة المركبة خليطا للفحص الأولي. لذا، فسر النتائج المضادة للميكروبات لتعكس النشاط المشترك لكلا المكونين.
2. قم بتدوير الخليط المتجانس بشكل كامل حتى يتم الحصول على محلول موحد.
3. الزراعة الفرعية للمخزونات البكتيرية القياسية التي كانت محفوظة سابقا بالتبريد مثل Enterococcus faecalis ATCC 29212، Staphylococcus aureus ATCC 29213، Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853، والإشريكية القولونية. ATCC 25922، المخزن عند -80 درجة مئوية، على أجار الدم القياسي (للبكتيريا الموجبة جرام) والأجار الأزرق الإيوزين الميثيلين القياسي (للبكتيريا سالبة الجرام)، ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
4. في نهاية الحضانة، جهز معلقات بكتيرية مضبوطة إلى عكارة ماكفارلاند 0.5 باستخدام محلول ملحي معقم من المستعمرات المزروعة، وفقا لتوصيات تحضير اللقاح القياسية لاختبار الحساسية المضادة للميكروبات³⁸.
5. قم بتطعيم صفائح مولر-هينتون الأجار بشكل موحد مع كل تعليق بكتيري موحد باستخدام مسحة معقمة.
6. تطبيق حجم معياري قدره 15 ميكرولتر من خليط اختبار الألوفيرا/NAC المعقم على كل قرص مضاد ميكروبي معقم بقطر 6 مم باستخدام ميكروبايبت معايرة. تم تطبيق نفس حجم التحميل، ووقت الامتصاص (على الأقل دقيقتين)، ووقت التجفيف بالهواء (حوالي 5 دقائق) على جميع الأقراص عبر النسخ لضمان الاتساق الإجرائي. تم اختيار هذا الحجم ككمية تحميل عملية لأقراص 6 مم في فحص انتشار الأقراص المعتمد على مستخلصات النباتات، وتم الحفاظ عليه ثابتا لجميع التجارب.
7. ضع الأقراص المشبعة بالمستخلص على سطح ألواح الأجار الملقحة باستخدام ملقط معقم.
8. حضن الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 18–24 ساعة تحت ظروف هوائية.
9. بعد الحضانة، قم بقياس قطر كل منطقة تثبيط يدويا، بما في ذلك قطر القرص، إلى أقرب مليمتر باستخدام مسطرة. قم بإجراء التجربة كقياس وصفي واحد، مع الإبلاغ عن أقطار المناطق المسجلة كقيم ملاحظة فردية. قم بالقياسات من خلال فحص الألواح بصريا وفقا لتوصيات قراءة انتشار القرص القياسية³⁸.
10. حضر تخفيفات تسلسلية مزدوجة (1/2، 1/4، 1/8، و1/16) من خليط اختبار الألوفيرا/NAC بنسبة 70:30 (v/v) في مرق مولر-هينتون.
11. تلقيح كل أنبوب ب 500 ميكرولتر من تعليق بكتيري معياري من ماكفارلاند 0.5 محضر في محلول ملحي معقم. جهز سلسلة تخفيف منفصلة لكل سلالة مرجعية وحضن الأنابيب الملقحة تحت الشروط المحددة أدناه.
12. حضن الأنابيب الملقحة عند 37 درجة مئوية لمدة 18–24 ساعة.
13. تقييم نمو الميكروبات بصريا من خلال العكارة مقارنة بالتحكم في المرق؛ تفسير الاختبار بشكل نوعي بدلا من كونه تحديد رسمي.
14. استخدم قرص سيبروفلوكساسين (5 ميكروغرام) كأداة تحكم إيجابية بالتوازي مع الأقراص المشبعة بالألوفيرا/NAC. طبق نفس قرص التحكم الإيجابي لديكوكس المعوي البري ATCC 29212، والمكورات العنقودية الذهبية ATCC 29213، وPseudomonas aeruginosa ATCC 27853، والإشريكية القولونية ATCC 25922 لتأكيد القابلية للإصابة في ظروف انتشار القرص.
    ملاحظة: قم بإجراء جميع الإجراءات الميكروبيولوجية تحت ظروف BSL-2 وتسجيل جميع ملاحظات قطر المنطقة وعكارتها مباشرة بعد الحضانة لتحليلها الوصفي لاحقا. يجمع هذا البروتوكول بين تحضير معقم لألمانية أ. فيرا.مستخلصها مع اختبارات كيميائية حيوية وميكروبيولوجية مكملة لدعم تطوير تركيبات نباتية للاستخدام الموضعي والطبي التكميلي. تم تصميم سير العمل ليكون عمليا في المختبرات الروتينية: يمكن إجراء فحص الرقم الهيدروجيني والأكسدة الاختزال (TAC) جنبا إلى جنب مع زراعة التعقيم واثنين من اختبارين مضادين للميكروبات شائعين (انتشار القرص وتخفيف الأنبوب).

النتائج

قيم الرقم الهيدروجيني لمستخلص الألوة فيرا عند تركيزات مختلفة

أظهر ملف الرقم الهيدروجيني نمطا غير رتيبا عبر التركيزات. كانت متوسط قيم الحموضة 6.47، 6.60، 6.26، و6.28 للتركيبات 5٪، 10٪، 15٪، و20٪ على التوالي. كانت الفروق العامة في المجموعة ذات دلالة إحصائية (p = 0.024). أظهرت تركيبات 5٪ و10٪ قيم حموضة أعلى نسبيا، بينما تجمعت تركيبات 15٪ و20٪ عند قيم حموضة أقل (p < 0.05) (الجدول 1 والجدول 2).

المناقشة

توفر الدراسة الحالية سير عمل مختبري متكامل للتوصيف الأولي لتركيبات مستخلص الألوة فيرا الهلامية الداخلية الطازجة من خلال دمج قياس الرقم الهيدروجيني، وتحليل السعة الكلية لمضادات الأكسدة (TAC)، وتقييم النمو غير القابل للكشف القائم على الثقافة، والفحص الوصفي لمضادات الميكروبات. ارتبطت زيادة تركيزات الألوة فيرا الهلامية الطازجة بقيم TAC أعلى، بينما لم يلاحظ نمو بكتيريا أو فطريات مرئي أثناء مراقبة الزراعة قصيرة المدى تحت ظروف المختبر المحددة. يجب تفسير هذه النتائج كدليل على ن...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
(-)80 C Deep Freezer	Thermofisher/USA	تخزين العينات	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	تحضير العينات	88882010
Blood Agar	RTA/Turkey	تطعيم الثقافة	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turkey	تطعيم الثقافة	2010
SDA Agar	RTA/Turkey	تطعيم الثقافة	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turkey	تطعيم الثقافة	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turkey	تخفيف الثقافة	1018
Pipettes	Thermofisher/USA	تحضير العينات	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPAN	تحليلات العينات	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turkey)	تحليلات TAC للعينات	M201 (Smart Model)
TAC Kits	Rel Assay(Turkey)	المجموعة	RL0017