التخليق الأخضر لجزيئات الذهب والفضة باستخدام مستخلصات النباتات، والفلاترات الفطرية، والمزارع البكتيرية

ملخص

يصف هذا البروتوكول طرق التخليق الأخضر القابلة لإعادة الإنتاج لتصنيع جسيمات الذهب والفضة النانوية باستخدام مستخلصات النباتات، ومرشحات الفطريات، ومزارع بكتيرية، تليها تأكيد الجسيمات النانوية من خلال التحليل الطيفي فوق البنفسجي-المرئي والمجهر الإلكتروني النفاذي.

الملخص

يوفر التخليق الأخضر لجسيمات المعادن النانوية (NPs) باستخدام الأنظمة البيولوجية بديلا مستداما لطرق التصنيع الكيميائي التقليدية. يقدم هذا البروتوكول إجراءات تجريبية وتحليلية قابلة للتكرار لتخليق الذهب (Au) والفضة (Ag) باستخدام المزارع البكتيرية، ومرشحات الفطريات، ومستخلصات أوراق النبات كعوامل اختزال ومثبتة. تم تصنيع AgNPs باستخدام مستخلصات من Psidium guayaquilensis، Acanthophora spicifera، وEarliella sp.، وأظهرت نطاقات امتصاص فوق بنفسجية-مرئية (UV–Vis) مميزة بين 405 و425 نانومتر أكدت تكوين NP. تم تنفيذ نهج تصميم التجارب لتقييم تأثير العوامل البيئية، بما في ذلك ظروف الأكسجين، ودرجة الحموضة، وتركيز الأكسجين، وتركيز الخلية، ونوع المانح للإلكترون، ودرجة الحرارة، على تخليق AuNPs بواسطة Shewanella oneidensis وCupriavidus metallidurans. في ظروف مثالية (0.2 مللي مولار Au ودرجة حموضة 5)، أنتج S. oneidensis في الغالب AuNPs كروية بمتوسط حجم 43.6 ± 11.0 نانومتر وذروة امتصاص مميزة عند 520 نانومتر. تم تأكيد تكوين وشكل NP باستخدام مطيافية UV–Vis وميكروسكوب إلكتروني ناقل. يوفر هذا السير منصة قابلة للتكرار لتخليق NP البيولوجي ويدعم التطبيقات في تقنيات الاستشعار الحيوي، والمعالجة الحيوية، وتقنيات مضادات الميكروبات.

المقدمة

تمتلك الجسيمات المعدنية النانوية خصائص فيزيائية-كيميائية فريدة مرتبطة بمساحتها السطحية العالية، بما في ذلك سلوكيات إلكترونية ومغناطيسية وتحفيزية مميزة، بالإضافة إلى تفاعلية عالية. وقد عززت هذه الخصائص تطبيقها في مجالات متعددة، بما في ذلك الطب لتشخيص الأمراض وتوصيل الأدوية 1,2,3,4,5,6، مستحضرات التجميل لتركيبات واقي الشمس 7، الإلكترونيات للترانزستورات والخلايا الشمسية 8، الهندسة البيئية لمعالجة المياه ^2,9,10، والزراعة للأسمدة والمبيدات الحشرية^11،12. ينعكس التوسع المستمر لتطبيقات NP عبر التخصصات في العدد المتزايد من المنشورات ذات الصلة التي تم الإبلاغ عنها في السنوات الأخيرة^.

تتيح الطرق التركيبية للجرسيمات المعدنية التحكم الدقيق في خصائص مهمة مثل حجم الجسيمات، الشكل، والثبات، مما يجعل عملية التخليق عاملا حاسما لأداء الجسيمات المعدنية. تم تحسين طرق التخليق الكيميائي التقليدية بشكل واسع؛ ومع ذلك، غالبا ما تتضمن كواشف سامة، واستهلاك طاقة مرتفع، وتكاليف إنتاج مرتفعة ^14.15. وقد دفعت هذه القيود إلى تطوير بدائل أكثر خضرة واستدامة. تستخدم طرق التخليق الأخضر أنظمة بيولوجية مثل مستخلصات النباتات ^{16، 17}، والكائنات الدقيقة مثل الفطريات والبكتيريا¹⁸، والطحالب¹⁹ كعوامل طبيعية مختزلة ومثبتة. خلال هذه العمليات، يتم تقليل الأملاح المعدنية إلى أشكال صفرية التكافؤ، مما يولد NPs عبر مسارات صديقة للبيئة وفعالة من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تكون الNPs المركبة بيولوجيا متوافقة حيويا، مما يسهل استخدامها في التطبيقات الطبية والزراعية والبيئية ^8,14.

يعتمد اختيار مسار بيولوجي مناسب لتخليق NP على التطبيق المقصود، بالإضافة إلى البنية التحتية المتاحة والمتطلبات التشغيلية. يفضل التخليق النباتي عموما للإنتاج السريع ومنخفض التكلفة من النيتل الطبيعية لأنه يتطلب معالجة معقمة قليلة؛ ومع ذلك، قد يؤثر التفاوت في تركيب المستخلصات على قابلية التكرار^20,21. يمكن أن يوفر التخليق بالفطريات إنتاجية عالية من NP وإنزيمات خارج الخلية تحسن استقرار NP ومعالجتها لاحقا، رغم أن هذا النهج يتطلب فترات زراعة أطول وظروف نمو مضبوطة²². على النقيض من ذلك، تتيح الأنظمة البكتيرية التركيب القابل للتعديل تحت ظروف أيضية محددة وإنتاج الكتلة الحيوية السريع، مما يجعلها مناسبة للدراسات الميكانيكية^{والتطبيقات المرتبطة} ب NP. ومع ذلك، غالبا ما يتطلب تخليق البكتيريا معالجة معقمة صارمة، وظروف مفاعل حيوي مضبوطة، ومعالجة إضافية لاحقة عند استرداد NPs داخل الخلية^21,22.

على الرغم من المزايا المذكورة، لا تزال طرق التخليق الأخضر تواجه تحديات مرتبطة بإمكانية التكرار والتوحيد القياسي. علاوة على ذلك، لا تزال البروتوكولات البصرية التفصيلية خطوة بخطوة لتخليق النيوت المعدنية الخضراء محدودة²³، مما يحد من قدرة الباحثين على إعادة إنتاج وتنفيذ المنهجيات الحالية بنجاح. هدف هذا العمل هو تقديم بروتوكولات تخليق خضراء قابلة للتكرار للمواد الخضراء الذهبية (Au) والفضة (Ag) باستخدام مستخلصات النباتات، والمرشيحات الفطرية، والمزارع البكتيرية. على وجه التحديد، تم استخدام مستخلصات مائية من Psidium guayaquilensis وAcanthophora spicifera، ومفلترات فطرية خارج خلايا من Earliella sp.، وأنظمة بكتيرية تشمل Shewanella oneidensis وCupriavidus metallidurans لتخليق NP. تركز البروتوكولات المقدمة على خطوات حاسمة في تحضير المستخلصات البيولوجية، وتخليق NP، والتوصيف الأولي للمستخلصات البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يدمج سير العمل تصميم التجارب، وإجراءات التحضير الموحدة، والتوصيف الخطي لدعم تخليق NP البيولوجي القابل للتكرار والتحسين.

البروتوكول

أجري البحث وفقا للإرشادات المؤسسية للمدرسة العليا السياسية للساحل (ESPOL، الإكوادور). تم جمع الكتلة الحيوية النباتية والطحالب والفطريات المستخدمة في هذه الدراسة من بيئات يمكن الوصول إليها ولم تشمل أنواعا محمية أو مناطق محظورة. وفقا للوائح المؤسسية والوطنية، لم تكن هناك حاجة لتصاريح محددة لجمع الكتلة الحيوية المتاحة بحرية في ظل هذه الظروف. راجع الشكل 1 لسير العمل التجريبي المتكامل المستخدم في التخليق الأخضر للزراعة الطبيعية وغير الطبيعيات باستخدام أنظمة بيولوجية نباتية وطحالب وفطرية وبكتيرية.

الشكل 1: سير العمل المتكامل لتخليق الفضة (Ag) والذهب (Au) النانوية (NPs) باستخدام الأنظمة البيولوجية. مخطط لسير العمل التجريبي لتخليق الزراعة الطبيعية والزراعة الطبيعية الخضراء باستخدام أنظمة نباتية وطحالب وفطرية وبكتيرية. يوضح سير العمل اختيار المصدر البيولوجي، وتحضير المستخلصات أو الكتلة الحيوية، والتفاعل مع المواد المعدنية المسبقة (AgNO₃ أو HAuCl₄)، وظروف التفاعل، وتكوين NP. تشمل الأنظمة البيولوجية مستخلص أوراق Psidium guayaquilensis ، مستخلص الطحالب Acanthophora spicifera ، Earliella sp. extracellular filtrate، ومزارع البكتيريا Shewanella oneidensis MR-1. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ملاحظة: اتبع جميع إرشادات السلامة المختبرية المؤسسية عند التعامل مع المواد الكيميائية والمواد البيولوجية. راجع بيانات السلامة لجميع المواد قبل الاستخدام.

1. تخليق المضامير الزراعية باستخدام أوراق P. guayaquilensis

1. مجموعة الأوراق
   1. اجمع الأوراق الطازجة من P. guayaquilensis خلال موسم الجفاف في غواياكيل، مقاطعة غواياس، الإكوادور (2°10′ جنوبا، 80°0′ غربا).
      ملاحظة: تم إيداع عينات قسيمة من هذا النوع المتوطن في متحف GUAY للنباتات، كلية العلوم الطبيعية، جامعة غواياكيل، الإكوادور، وفي حديقة نيويورك النباتية (NYBG) في أعشاب ستير، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. معلومات إضافية متاحة على: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. تحضير مستخلص الأوراق
   1. اغسل المادة النباتية الطازجة جيدا بالماء المقطر.
      ملاحظة: تأكد من إزالة الشوائب السطحية بالكامل.
   2. جفف الأوراق في صينية مجففة مع تدفق هواء قسري عند 40°C.
      ملاحظة: درجات حرارة التجفيف المنخفضة تقلل من تحلل المركبات العضوية الحرارية المشاركة في تقليل Ag⁺ .
   3. طحن المادة المجففة باستخدام مطحنة يدوية للحصول على مسحوق ناعم.
   4. علق 10 جرام من مسحوق المادة في 200 مل من الماء المقطر.
   5. سخن التعليق عند 70°C تحت التحريك المستمر لمدة ساعة واحدة.
   6. اترك المستخلص ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT، ~28°C).
   7. فلتر المستخلص تحت الفراغ عبر ورق مرشح نوعي (الدرجة 1، حجم المسام 11 ميكرومتر، القطر 110 مم).
      ملاحظة: قم بإزالة جميع البقايا الصلبة من مادة النبات.
   8. احتفظ بالمستخلص المفلتر عند 4°C في زجاجات كهرمانية حتى الاستخدام الإضافي.
3. تصنيع الزراعة النباتية النباتية باستخدام مستخلصات الأوراق
   ملاحظة: أثناء تجارب التحسين، قم بتغيير معلمة واحدة لكل اختبار مع الحفاظ على ثبات باقي المعلمات. تقييم تركيز نترات الفضة (AgNO₃) (1–5 ملم مول)، نسبة المستخلص (10٪–50٪ v/v)، زمن الاستجابة (0.5–1 ساعة)، ودرجة الحرارة (25°م–80°م). تحسين معلمات التوليف باستخدام منهجية سطح الاستجابة المبنية على DoE مركب مركزي. ادرس كل عامل على خمسة مستويات (-α، -1، 0، +1، و+α). استخدم طول موجة ذروة رنين البلازمون السطحي (SPR) (λ_SPR)، التي ترتبط بحجم NP، كمتغير استجابة²⁴. يتكون تصميم التجربة من 16 نقطة عاملية، و8 نقاط محورية، و5 تكرارات نقطة مركزية، مما ينتج عنه 29 تجربة إجمالية.
   1. تحضير محاليل AgNO₃ عن طريق إذابة الكتلة المناسبة ل AgNO₃ في ماء مقطر للحصول على تركيزات بين 1 و5 ملم.
      تحذير: AgNO₃ مادة تآكلية ومؤكسدة قوية قد تسبب تهيجا للجلد والعين. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات وحماية العين. تجنب التعرض للضوء والتخلص من النفايات المحتوية على الزراعة وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية.
   2. اخلط محلول AgNO₃ مع مستخلص النبات للحصول على كسور مستخلص بين 10٪ و50٪ (v/v).
   3. سخن وتحريك خليط التفاعل عند درجة الحرارة المحددة (25°C–80°C) لوقت التفاعل المطلوب (0.5–1 ساعة).
   4. دع خليط التفاعل يبقى على RT لمدة 24 ساعة.
   5. قم بطرد المركزي بخليط التفاعل البني عند 1660 × جرام لمدة 15 دقيقة عند RT. تخلص من المادة الفائقة واجمع الجزء الصلب.
   6. جفف الأقراص الطازجة المستخرجة في فرن عند 60 درجة مئوية.

2. تخليق الجرثونيفيت الطبيعية باستخدام مستخلصات الطحالب من A. spicifera

1. مجموعة الطحالب
   1. اجمع طحالب A. spicifera في فالديفيا، مقاطعة سانتا إيلينا، الإكوادور (1°57′23.91′′ جنوبا، 80°43′51.33′′ غربا).
2. تحضير مستخلص الطحالب
   1. جهز مستخلص الطحالب باتباع الإجراء الموضح في الخطوة 1.2. استبدل أوراق النبات بكتلة حيوية من الطحالب A. spicifera .
3. تصنيع الزراعة الطبيعية النفسية باستخدام مستخلصات الطحالب
   ملاحظة: قم بإجراء سلسلة من 12 تجربة عن طريق تغيير معلمة واحدة في كل مرة مع الحفاظ على ثبات المعلمات المتبقية. قيم تركيز AgNO₃ (1–5 ملميول)، نسبة المستخلص (5٪–25٪ v/v)، زمن الاستجابة (1–4 ساعات)، ودرجة الحرارة (25°C–70°C).
   1. جهز محاليل AgNO₃ ومستخلص الطحالب كما هو موضح في الخطوات 1.3.1 و2.2.
   2. اخلط محلول AgNO₃ مع مستخلص الطحالب للحصول على نسبة استخلاص تتراوح بين 5٪–25٪ (v/v). قم بتسخين وتحريك خليط التفاعل عند درجة الحرارة المحددة (25°C–70°C) لزمن الاستجابة المطلوب (1–4 ساعات).
   3. دع المحلول يبرد إلى RT لمدة 24 ساعة. اجمع الجزء الصلب بعد الطرد المركزي وجففه في فرن كما هو موضح في الخطوات 1.3.5 و1.3.6.

3. تخليق مضادات الزراعة الطبيعية باستخدام Earliella sp.

1. جمع وصيانة الثقافة
   1. نقل شظايا الميسيليوم النامية بنشاط من Earliella sp. إلى صفائح البطاطس Dextrose Agar.
      ملاحظة: تم عزل السلالة الفطرية المستخدمة في هذه الدراسة من عينات بيئية جمعت في حرم ESPOL في الإكوادور. تم تحديد العزل تصنيفيا بناء على الخصائص الشكلية وحفظه في مجموعة الزراعة في مركز أبحاث التكنولوجيا الحيوية في الإكوادور (CIBE, ESPOL) تحت الرمز الداخلي E2. وبما أن هذا النوع محفوظ في مجموعة مؤسسية ولم يتم إيداعه في مستودع دولي، فلا يتوفر رقم RRID أو رقم وصول خارجي.
   2. حضن الصفائح عند 28°م لمدة 48 ساعة.
   3. انقل قطعة ميسيليوم إلى مرق ديكستروز البطاطس وحضن الزراعة تحت تحريك مستمر بسرعة 150 دورة في الدقيقة لمدة 5 أيام.
      ملاحظة: تعزز هذه الخطوة إنتاج الكتلة الحيوية وإفراز المستقلبات خارج الخلية.
   4. قم بتصفية الزراعة الفطرية عبر ورق مرشح معقم لفصل الكتلة الحيوية الميسيلية عن المرق خارج الخلية. اجمع الفلترة لتخليق NP لاحقا.
      ملاحظة: يحتوي المرق خارج الخلوي على جزيئات حيوية تعمل كعوامل مختزلة ومثبتة أثناء تخليق AgNP.
2. تصنيع الزراعة الزائدة الزرية الجينية
   ملاحظة: توليد 14 حالة تجريبية عن طريق تغيير معامل واحد لكل اختبار مع الحفاظ على نسب حجم ثابتة بين مرق الفطريات ومحلول AgNO₃ . قيم تركيز AgNO₃ (1–10 ملم مول)، الرقم الهيدروجيني (4–10 معدل باستخدام HCl أو NaOH)، زمن الاستجابة (1–4 ساعات)، ودرجة الحرارة (25°C–70°C).
   تحذير: حمض الهيدروكلوريك (HCl) وهيدروكسيد الصوديوم (NaOH) يسببان التآكل الشديد. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة وقم بضبط الرقم الهيدروجيني ببطء تحت التحريك المستمر لتجنب الرش وارتفاع درجة الحرارة الموضعية. استخدم محاليل حمضية أو قاعدية بحجم 1 M أثناء ضبط الرقم الهيدروجيني.
   1. اخلط المرق الفطري خارج الخلية مع محلول AgNO₃ عند التركيز المطلوب (1–10 ملليمو) باستخدام نسبة حجم بين 2.5٪ و10٪ (v/v) للحصول على حجم تفاعل نهائي يبلغ 50 مل. اضبط حجم التفاعل النهائي وفقا للحالة التجريبية التي يتم اختبارها.
   2. حرك خليط التفاعل عند درجة الحرارة المحددة (25°م–70°م) لزمن التفاعل المطلوب (1–4 ساعات). دع المحلول يبرد إلى RT لمدة 24 ساعة. اجمع الجزء الصلب بعد الطرد المركزي وجففه في فرن كما هو موضح في الخطوات 1.3.5 و1.3.6.

4. تخليق AuNPs باستخدام C. metallidurans وS. oneidensis

1. جمع وصيانة الثقافة
   1. تلقيح مخزونات الخلايا المجمدة المحفوظة في 20٪ جليسرول عند −80°C من إما C. metallidurans CH34 أو S. oneidensis MR-1 على صفائح الصويا التريبتيكية تحت ظروف هوائية. حضن الصفائح على حرارة 28°C لمدة 24 ساعة.
   2. اختر مستعمرة فردية من كل طبق وقم بتلقيحها في 250 مل من مرق الصويا التريبتيكي تحت ظروف هوائية. حضن الثقافة عند 28°C في جهاز هزاز دوار يعمل بسرعة 120 دورة في الدقيقة.
   3. احصد الخلايا في المرحلة الثابتة بعد 72 ساعة من الحضانة، عندما تصل الكثافة البصرية عند 610 نانومتر (OD₆₁₀) إلى حوالي 1. قم بالطرد المركزي على حرارة 10000 × جرام لمدة 10 دقائق عند ~20°C.
   4. اغسل الحبيبات المجمعة مرتين بمحلول NaCl معقم بنسبة 0.9٪ (بدون زجاج). ركز الخلايا المغسولة إلى قيمة OD₆₁₀ تقريبا 7.
   5. توليد مخزونات خلايا مركزة خالية من الأكسجين عن طريق إزالة الغازات من المعلقات وملء الفراغ الرأسي بغاز_N2 .
2. تصنيع AuNPs البكتيرية
   ملاحظة: استخدم مصفوفة العوامل الكسرية لتقييم تأثير العوامل البيئية على تخليق AuNP²⁵. بناء المصفوفة باستخدام 7 عوامل على مستويين تم اختيارهما وفقا للدراسات السابقة^26,27. ترتيب التجارب في مصفوفة متعامدة وترتيب التجارب عشوائيا لتقليل تحيز التجارب والتركيبات. يتم عرض ترتيب التجارب الناتج في الجدول 1.
   1. إذابة ثلاثي هيدرات كلوريد الذهب (HAuCl₄) في ماء منزوع الأيونات لتحضير محلول مخزون بقوة 5 جرام L⁻¹.
      تحذير: HAuCl₄ سام وعامل مؤكسد قوي. تعامل مع جميع المحاليل داخل غطاء بخار كيميائي معتمد وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة. تجنب ملامسة المواد العضوية والتخلص من النفايات وفقا لبروتوكولات النفايات الخطرة المؤسسية.
   2. تحضير المفاعلات التجريبية عن طريق تخفيف المحلول الأصلي إلى التركيز المستهدف في محلول NaCl بنسبة 0.9٪ (w/v) وضبط الرقم الهيدروجيني وفقا للظروف التجريبية المدرجة في الجدول 1.
   3. قم بصرف 50 مل من المحلول المعدني المحضر في زجاجات مصل نظيفة بسعة 120 مل. أغلق كل زجاجة فورا باستخدام سدادة مطاطية من البوتيل.
   4. ثبت السدادة باستخدام ختم تجعيد من الألمنيوم وجهاز تجعيد يدوي. قم بتعقيم زجاجات المصل المغلقة عن طريق التداخل عند 121 درجة مئوية لمدة 21 دقيقة.
   5. دع الزجاجات تبرد لتتجه إلى RT وفحص كل زجاجة بصريا بحثا عن هطول الأمطار الآن.
      ملاحظة: تخلص من أي زجاجات تظهر عليها هطول مرئي وحضر مفاعلات بديلة.
   6. تأسيس ظروف نقص الأكسدة
      1. قم بتوصيل كل زجاجة مصل معقمة بنظام مشعب غاز مزود بمصدر نيتروجين عالي النقاء (_N2) ومضخة تفريغ.
      2. توليد مساحة رأس خالية من الأكسجين عن طريق تنفيذ 21 دورة تطهير متتالية لكل مفاعل يتطلب شروط فقدان الأكسجين وفقا للجدول 1. خلال كل دورة، يتم تطبيق الفراغ متبوعا بملء النيتروجين لمدة تقارب 30 ثانية حتى يعود الضغط الداخلي إلى ضغط الغلاف الجوي تقريبا (~1 atm).
         ملاحظة: لا يتطلب التحقق المباشر من حالات نقص الأكسجة؛ ومع ذلك، يمكن استخدام تحليل الغازات في المساحة الرأسية، مثل كروماتوغرافيا الغاز، لتأكيد إزالة الأكسجين عند الضرورة.
         تحذير: قد يؤدي غاز النيتروجين إلى إزاحة الأكسجين وخلق خطر اختناق في الأماكن المغلقة. تأكد من وجود تهوية كافية في المختبر وتحقق من وصلات خطوط الغاز الآمنة قبل الاستخدام.
      3. حافظ على المفاعلات تحت ضغط_N2 إيجابي طفيف بعد دورة التطهير النهائية.
      4. قم بتسمية المفاعلات من 1 إلى 8 حسب ترتيب التجارب. على سبيل المثال، ضع علامة على الشرط التجريبي الخامس ك R5.
   7. إضافة معطي الإلكترونات والتطعيم
      1. حقن الحجم المطلوب من محلول الإلكترون السائل الخالي من الأكسجين المعقم، مثل لاكتات الصوديوم، في الطور السائل للمفاعلات المخصصة وفقا للجدول 1 باستخدام حقنة وإبرة معقمة.
      2. حقن الحجم المطلوب من المانح الإلكتروني الغازي، مثل H₂، في مساحة الرأس المخصصة للمفاعل باستخدام حقنة محكمة الإغلاق للغاز.
      3. تلقيح جميع المفاعلات الحيوية عن طريق حقن كمية التخزين الميكروبية المركزة الخالية من الأكسجين بشكل معقم في الطور السائل.
         ملاحظة: تخزين الزراعة المركزة عند 4°C قبل التلقيح للحفاظ على حيوية الخلايا.
   8. إعداد تجارب التحكم
      1. جهز جهاز مكافحة غير حيوي باتباع جميع الخطوات الموضحة في الخطوة 4.2 مع استبدال اللقاح الميكروبي بحجم مكافئ من وسط الزراعة المعقم أو العزل اللاحيوي.
      2. جهز جهاز التحكم في الخلايا الميتة باتباع جميع الخطوات الموضحة في الخطوة 4.2 باستخدام تلقيح معقم عن طريق التعقيم الجسدي.
         ملاحظة: استخدم أدوات التحكم لأخذ الاختزال والامتصاص الحيوي للمعادن اللاحيوية في الاعتبار. جهز التحكم في الخلايا الميتة عن طريق تعقيم مخزونات الخلايا الحية عند 121°C لمدة 21 دقيقة لتقييم مساهمة الآليات الميكروبية النشطة.
   9. الحضانة ووقت التفاعل
      1. ضع جميع زجاجات المصل في حاضنات تحكم في درجة الحرارة.
      2. اضبط درجة حرارة الحضانة وفقا للظروف التجريبية المحددة في الجدول 1.
      3. ضع الحاضنات على منصات هزاز دوارة وحضن المفاعلات بسرعة 120 دورة في الدقيقة.
      4. دع التفاعلات تستمر لمدة 72 ساعة.
         ملاحظة: أوقف التجربة مؤقتا بعد الحضانة واحتفظ بزجاجات المصل عند 4°C حتى يتم معالجة العينة.
         ملاحظة: اختياريا قياس كمية المعدن المذاب المتبقي بعد تخليق NP الحيوي باستخدام مطيافية الانبعاث البصري المرتبط بالبلازما الحثية لتقييم كفاءة إزالة المعادن والتمييز بين تكوين NP والأنواع المذابة المتبقية.
3. تكرار الظروف المثلى
   1. حدد حالة المفاعل المرتبطة بأقصى إزالة للمعادن بعد الفحص الأولي وتحليل البيانات.
   2. تكرار الحالة المثلى المختارة في ثلاث زجاجات مفاعلات مستقلة لتأكيد قابلية التكرار.
   3. إجراء إجراءات التحضير، وإعداد المفاعل، والحضانة لتجارب التحقق الثلاثية وفقا للخطوتين 4.1 و4.2.
      ملاحظة: بعد الانتهاء من التجارب، يتم تخزين ووضع علامة مؤقتة على جميع المحاليل المذابة كنفايات مائية حتى يتم التخلص منها من قبل شركات إدارة النفايات المعتمدة وفقا للمدونة العضوية الوطنية للبيئة والإرشادات الفنية المؤسسية.

المفاعل / البكتيريا	درجة الحرارة (°C)	الغلاف الجوي	مانح الإلكترونات	الكثافة الضوئية (OD610)	الرقم الهيدروجيني	[ذهب] (م)
1 / CMC	37	رقم2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	رقم2	C3H5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	رقم2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	رقم2	C3H5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

الجدول 1: تصميم التجارب الجزئية العامل المستخدم لتخليق AuNP البكتيريوجيني. يلخص هذا الجدول الظروف التجريبية التي تم تقييمها لتخليق AuNP باستخدام S. oneidensis MR-1 (SOM) أو C. metallidurans CH34 (CMC). شملت المتغيرات درجة حرارة الحضانة، وجو المساحة الرأسية، ومعطي الإلكترون، وكثافة اللقاح البصرية (OD₆₁₀)، ودرجة الحموضة في المحلول، وتركيز أولي^{من Au 3+} .

5. توصيف AgNPs وAuNPs

ملاحظة: استخدم التحليل الطيفي فوق البنفسجي-المرئي (UV–Vis) كطريقة متاحة لتأكيد تكوين NP من خلال رنين البلازمون السطحية. استخدم المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) لتقييم شكل وحجم NP بشكل مباشر. يمكن إجراء توصيف فيزيائي-كيميائي إضافي باستخدام تقنيات تكميلية مثل تشتت الضوء الديناميكي (DLS)، حيود الأشعة السينية (XRD)، مطيافية الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه (FTIR)، والتحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDS) لتقييم توزيع الحجم، والتبلور، وكيمياء السطح، وتركيب العناصر عندما يتطلب الأمر توصيفا أكثر شمولا^28,29.

1. طياف الأشعة فوق البنفسجية–الرؤية-البصرية
   1. إعداد الآلات
      1. شغل مطياف الأشعة فوق البنفسجية–البصرية ودع الجهاز يسخن لمدة لا تقل عن 15 دقيقة لضمان استقرار الإشارة.
      2. اختر وضع المسح الطيفي وقم بضبط نطاق الأطوال الموجية من 300 إلى 800 نانومتر باستخدام فترة بيانات 1 نانومتر.
2. تحضير العينة
   1. اجمع كميات من تعليقات AgNP أو AuNP المركبة حديثا. تخفيف العينات بالماء المقطر عند الحاجة للحفاظ على قيم الامتصاص ضمن نطاق الكشف الخطي.
3. قياس UV–Vis للنقاط غير القابلة للرؤية
   1. قم بتصحيح خط الأساس باستخدام الماء المقطر كمحلول فارغ.
   2. انقل العينة المحضرة إلى كوفيت، وضع الكوفيت في حامل العينة، وسجل طيف الأشعة فوق البنفسجية–البصرية على نطاق 300–800 نانومتر.
   3. حدد نطاق SPR المقابل لتكوين NP.
      ملاحظة: عادة ما تظهر نطاقات SPR بين 405 و425 نانومتر، بينما تظهر AuNPs عادة نطاقات SPR بين 520 و550 نانومتر.
4. المجهر الإلكتروني الناقل
   ملاحظة: تحليل شكل وحجم NP باستخدام TEM يعمل بجهد 80 كيلو فولت ومجهز بكاميرا رقمية عالية الدقة.
   1. انقل 1.5 مل من تعليق NP إلى أنبوب طرد مركزي وجهاز طرد مركزي عند 5000 × جرام لمدة 5 دقائق عند RT.
   2. تخلص من المادة الفائقة واحتفظ بالحبيبة.
   3. أضف 1 مل من محلول التثبيت الذي يحتوي على 4٪ بارافورمالديهيد و5٪ جلوتارالديهيد معد في محلول كاكوديلات بعمق 0.1 مليون إلى الحبيبة. حضن العينة لمدة 25 ساعة عند RT. ثم اغسل الحبيبة طوال الليل باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مل.
   4. قم بعمل الطرد المركزي للعينة عند 5000 × جرام لمدة 5 دقائق وتخلص من السوبرناتانت.
   5. أضف 1 مل من رباعي أكسيد الأوزميوم (أوزيوم₄) بنسبة 1٪ (بدون وزن الزجاج) معد في محلول كاكوديلات الصوديوم بمقدار 0.1 متر للتثبيت لمدة 3 ساعات.
      تحذير: OsO₄ شديد السمية ومتقلب. تعامل مع جميع الحلول حصريا داخل غطاء بخار كيميائي معتمد وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر، القفازات، ونظارات السلامة.
   6. قم بعمل الطرد المركزي للعينة عند 5000 × جرام لمدة 5 دقائق وتخلص من السوبرناتانت.
   7. جفف العينة باستخدام سلسلة إيثانول متدرجة. أضف 50٪ إيثانول، ثم حضن لمدة 15 دقيقة. كرر العملية بالتتابع باستخدام 70٪ و90٪. تجفيف كامل مع ثلاث حضانات متتالية في الإيثانول المطلق لمدة 30 دقيقة في كل حضانة.
   8. قم بإدخال الحبيبة في راتنج الإيبوكسي في RT حسب تعليمات الشركة المصنعة.
   9. جهز مقاطع شبه رقيقة (~1 ميكرومتر) وصبغ الأقسام باللون الأزرق التولويديني للملاحظة الأولية.
   10. اقطع مقاطع فائقة الرقة (~60 نانومتر) باستخدام سكين ألماس وصبغ الأقسام بأسيتات اليورانيل تليها سترات الرصاص.
   11. قم بتركيب الأقسام على شبكات TEM وتحميلها في مجهر الإلكترونات الناقلة.
   12. احصل على صور TEM لتقييم شكل وحجم NP.

النتائج

تم تصنيع جرال NPs بنجاح عبر طرق خضراء وبيولوجية صناعية باستخدام عوامل بيولوجية مختزلة مختلفة، وتم تحديد ظروف تخليق مثالية لكل طريقة. في التخليق الأخضر الذي تم توسيطه مستخلص أوراق P. guayaquilensis ، تكونت الظروف المثلى من تركيز AgNO₃ بمقدار 5 ملليمولار، ونسبة محلول من المستخلصات إلى المعدن 25٪ (v/v)، ودرجة حرارة تفاعل 80°C، وزمن تحريك 60 دقيقة تليها فترة راحة 24 ساعة. في ظل هذه الظروف، أظهر مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-البصرية نطاق SPR محدد جيدا يتمركز بين 416 و425 نا...

المناقشة

عند مقارنة مسارات التخليق المقيمة من حيث الجدوى، والتحكم في حجم NP، وتكلفة التشغيل، وقابلية التكرار، وكفاءة العملية بشكل عام، أظهر التخليق النباتي باستخدام مستخلص أوراق P. guayaquilensis التوازن الأكثر إيجابية بين طرق تخليق AgNP التي تم دراستها. وفر هذا البروتوكول تحكما محسنا في حجم الNP من خلال التحسين المنهجي والتوصيف المجهري المباشر أثناء العمل في ظروف معتدلة دون زراعة بيولوجية مطولة. بالإضافة إلى ذلك، مكنت الطريقة من تكوين AgNPs موحدة نسبيا تحت ظروف تجريبية قابلة للتكرار. مث...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Absolute ethanol	Merck	E7023	سلسلة تجفيف TEM
Aluminum crimp seals	Dwk Wheaton	224178-01	لزجاجات المصل
Amber glass bottles	Duran	2180154	تخزين محمي من الضوء
ATR-FTIR spectrometer	Thermo Scientific	Nicolet iS10	المدى الطيفي: 300–3600 cm-1
Autoclave	Yamato	SM300	التعقيم عند 121 °C
Butyl rubber stoppers	Dwk Kimble	73827-21	إغلاق محكم للغاز
Centrifuge	BIOBASE	BKC-TH20RL	الطرد المركزي على سطح المكتب
Chloroauric acid trihydrate (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	سابق الذهب
Diamond knife	Aurion	Dyatom 45	قطع أقسام TEM رقيقة جداً
Distilled or deionized water	Methrom	N/A	تحضير المحلول
Epoxy resin (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	وسط تعبيد TEM
Filter paper, qualitative Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	حجم المسام: 11 µm؛ القطر: 110 mm
Fourier transform infrared spectrometer (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	المدى الطيفي: 300–3600 cm-1
Gas manifold system	Custom-built	N/A	لدورات التطهير
Gas-tight syringe	Hamilton	1001 RN	1 مل
Glutaraldehyde	VWR	219859510	5% غلوتارالديهايد، 4% بارافورمالديهايد في 0.1 M بوتاسيوم كاكوديليك
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	حفظ 20%
Handheld crimper	Biomed	USYGQ-20Z	إغلاق زجاجات المصل بالضغط
Hand mill/grinder	Corona	L10000	طحن الكتلة الحيوية النباتية
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	320331	تعديل درجة الحموضة
Hydrogen (H2) gas	Linde	Industrial grade	غاز متبرع بالإلكترون
ICP-OES system	Varian	Vista-MPX	تحديد كمية المعادن
Incubator	Memmert	SM 400	حضانة بتحكم في درجة الحرارة
Laboratory oven	Barnstead	M100	تجفيف النانو جزيئات
Lead citrate	Merck	7398	تلوين TEM
Nitric acid (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	كاشف حمض
Nitrogen (N2) gas	Linde	Industrial grade	ظروف لاهوائية
Osmium tetroxide (OsO4)	Merck	201030	تثبيت TEM
Paraformaldehyde	VWR	101176-014	5% غلوتارالديهايد، 4% بارافورمالديهايد في 0.1 M بوتاسيوم كاكوديليك
Potato Dextrose Agar (PDA)	Merck	110130	زراعة الفطريات
Potato Dextrose Broth (PDB)	Merck	P6685	وسط ميكروبيولوجي
Rotary shaker	JoanLab	OS-20Pro	حضانة مع تحريك متحكم فيه
Serum bottles (120 mL)	Wheaton	223748	زجاج بورسليكات
Silver nitrate (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	كاشف ACS، ≥99.0%
Sodium cacodylate buffer	VWR	11650	5% غلوتارالديهايد، 4% بارافورمالديهايد في 0.1 M بوتاسيوم كاكوديليك
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	3957.1	محلول غسل 0.9%
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	تعديل درجة الحموضة
Sodium lactate	Sigma-Aldrich	L7022	متبرع بالإلكترون/مصدر للكربون
Sterile syringes and needles	BD	Various	التعامل مع السوائل المعقمة
Stirring hot plate	Biologix	01-310X	التسخين والتحريك
Toluidine blue	EMS	DcU-10	تلوين أقسام شبه رقيقة
Transmission electron microscope (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	مجهز بكاميرا رقمية عالية الدقة
Tray dryer with forced airflow	Handmade	N/A	تجفيف الكتلة الحيوية عند 40 °C
Tryptic Soy Agar (TSA)	Oxoid	CM01301	وسط ميكروبيولوجي
Tryptic Soy Broth (TSB)	Carl Roth	X938.1	وسط ميكروبيولوجي
Uranyl acetate	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	تلوين TEM
UV–Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 10S	تحليل طيف UV–Vis
Vacuum pump	KNF or equivalent	N 820 G	للظروف اللاهوائية
المواد البيولوجية
المادة البيولوجية	المصدر	المعرف	التعليقات/الوصف
Acanthophora spicifera	مجموعة محلية	N/A	كتلة حيوية طحالب بحرية
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	سليلة بكتيرية
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	مجموعة فطريات مؤسسة
Psidium guayaquilensis	مجموعة محلية	N/A	كتلة حيوية نباتية برية
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	سليلة من مجموعة ثقافية