السيتوكينات وتعدد أشكال الجينات الالتهابية المرتبطة بعدوى الرئة النزفية بعد النزيف التلقائي داخل الدماغ

ملخص

تقدم هذه الدراسة الاستعادية سير عمل قابل للتكرار لجمع الدم المبكر بعد الدخول، وقياس السيتوكينات في المصل ومستقبلات شبيهة ب Toll، وتحديد أنماط جينية لتعدد أشكال الجينات الالتهابية، وتقييم مخاطر العدوى لدى المرضى الذين يعانون من نزيف تلقائي داخل الدماغ.

الملخص

العدوى الرئوية الأنفية المدمية هي مضاعفات متكررة بعد النزيف التلقائي الدماغي وقد تزيد من سوء التعافي العصبي، وتطيل فترة الاستشفاء، وتزيد من العبء السريري. تقدم هذه الدراسة السريرية-المخبرية بأثر رجعي سير عمل قابل للتكرار لتقييم المؤشرات الحيوية الالتهابية والملفات المناعية الجينية للمضيف المرتبطة بعدوى الرئة الأنفية بعد النزيف التلقائي الأولي داخل الدماغ. يتم تصنيف المرضى بناء على ما إذا كانت العدوى الرئوية النزائية تحدث بعد الدخول. يتم جمع الدم الوريدي المحيطي في الفترة المبكرة بعد القبول تحت ظروف ما قبل التحليل الموحدة. يتم فصل المصل، وجمعه، وتخزينه لقياس اختبار المناعة المرتبطة بالإنزيمات لاختبارات IL-1β، IL-6، IL-10، IL-17، IFN-γ، TNF-α، TLR2، TLR4، وTLR9. بالتوازي، يتم استخراج الحمض النووي الجينومي من دم كامل مضاد التخثر ويستخدم في التنميط الجيني لتفاعل بوليميراز المتسلسل-تقييد طول الشظايا لمواقع مختارة مرتبطة بمستقبلات السيتوكينات وتول. يشمل سير العمل أيضا إجراءات مراقبة الجودة لمعالجة العينات، وقياسات ELISA المكررة، وتقييم نقاء الحمض النووي، واستدعاء النمط الجيني، وتكرار التصنيف الجيني. يشمل التحليل الإحصائي مقارنة بين المجموعات للخصائص السريرية ومستويات المؤشرات الحيوية، واختبار توازن هاردي-وينبرغ، وتحليل الانحدار اللوجستي لارتباطات النمط الجيني والأليل، وضبط المتغيرات السريرية ذات الصلة، وتصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ للمقارنات الجينية المتعددة. قد يساعد هذا السير السريري والالتهابي والمناعي الجيني في توصيف ملفات خطر العدوى بعد النزيف الدماغي التلقائي، رغم أن التحقق متعدد المراكز المستقبلي لا يزال مطلوبا قبل التطبيق السريري الروتيني.

المقدمة

النزيف الدماغي التلقائي (ICH) هو نوع فرعي شديد من السكتة الدماغية ناتج عن تمزق الأوعية الدموية الدماغية غير الرضحية، ولا يزال مصدرا رئيسيا للموت العصبي والإعاقة. سريريا، يصنف الالتهاب الداخلي الداخلي عادة إلى أولي أو ثانوي. يمثل الالتهاب الرحمي المزمنة الأولي معظم الحالات ويرتبط بشكل رئيسي باعتلال الشرايين المفرط أو اعتلال الأوعية الدموية الدماغية¹. على النقيض من ذلك، يرتبط الالتهاب الداخلي الثانوي بأسباب هيكلية أو دموية مثل تمدد الأوعية، والتشوهات الشريانية الوريدية، ومرض المويامويا، واضطرابات التخثر. على الرغم من أن ICH يمثل نسبة أقل من جميع أحداث السكتة الدماغية مقارنة بالسكتة الدماغية الإقفارية، إلا أنه يحمل معدلات وفيات قصيرة الأجل عالية بشكل غير متناسب وعبء وظيفي طويل الأمد 2,3,4,5.

من بين المضاعفات الرئيسية داخل المستشفى بعد ICH، تكون عدوى الرئة المرضية الوعائية شائعة بشكل خاص وذات أهمية سريرية. أظهرت دراسات سابقة أن العدوى الرئوية يمكن أن تحدث لدى نسبة كبيرة من المرضى الذين يدخلون المستشفى بعد السكتة الدماغية أو النزيف الدماغي، ويرتبط ذلك بفترة إقامة أطول في المستشفى، وزيادة العبء الطبي، وضعف التعافي العصبي، وزيادة الوفيات ^6,7,8. تتجاوز الأهمية السريرية لهذه المضاعفة إدارة الجهاز التنفسي فقط. انخفاض الوعي، ضعف ردود فعل البلع والسعال، التثبيت، دعم مجرى الهواء الميكانيكي، وإجراءات التصريف الغازية كلها قد تزيد من خطر الإصابة بالعدوى خلال المرحلة الحادة بعد التهوية العاطفية. وفي الوقت نفسه، قد تزيد العدوى الرئوية من الالتهاب الجهازي، وتضعف توصيل الأكسجين، وتعقد الرعاية العصبية الحرجة، مما يؤدي إلى تضخم عمليات الإصابات الثانوية.

هذه العلاقة معقولة بيولوجيا لأن الالتهاب الداخلي الدماغي ليس فقط حدثا مركزيا للأوعية الدموية الدماغية، بل هو أيضا محفز لاضطراب المناعة الجهازية. يمكن للنزيف الدماغي الحاد أن ينشط سلاسل التهابية، ويغير الإشارات المناعية الفطرية، ويعطل التوازن بين الالتهاب العصبي ودفاع المضيف المحيطي. في هذا السياق، قد يصبح بعض المرضى أكثر عرضة للعدوى المكتسبة في المستشفيات حتى تحت إدارة سريرية مماثلة. لذلك، لا ينبغي اعتبار العدوى الرئوية بعد الإصابة بسرطان الرحم الداخلي فقط نتيجة للتعرض بجانب السرير أو الرعاية الداعمة؛ وقد يعكس أيضا اختلافات في تنشيط الالتهاب والمضيف والاستجابة المناعية.

على الرغم من الصلة السريرية لهذه المضاعفة، إلا أن الأساليب العملية لتصنيف المخاطر المبكر لا تزال محدودة⁹. تعتمد طرق تصنيف المخاطر السريرية الحالية لعدوى الرئة بعد الإصابة بسرطان الرحم الداخلي عادة على المتغيرات المرتبطة بالمرضى والدخول إلى المرضى، مثل شدة الأعصاب، والعمر، وضعف البلع، والأمراض المصاحبة، والإجراءات الغازية، ومدة التعرض للجهاز. هذه الأدوات مفيدة سريريا لأنها يمكن تطبيقها بسرعة في حالات الطوارئ أو العناية المركزة أو العناية العصبية الحرجة. ومع ذلك، قد لا تفسر المتغيرات السريرية وحدها بشكل كامل سبب اختلاف نتائج العدوى لدى المرضى ذوي الشدة العصبية المماثلة والتعرض للرعاية المشابهة. لذا قد توفر المؤشرات الحيوية الالتهابية والعوامل المناعية الجينية للمضيف معلومات إضافية حول القابلية البيولوجية، خاصة خلال فترة ما بعد القبول المبكر عندما تتخذ قرارات المراقبة الوقائية وإدارة الجهاز التنفسي.

السيتوكينات هي الوسطاء المركزيين للاستجابات المناعية والالتهابية، وتلعب مسارات مستقبلات الشبيهة بالتول (TLR) أدوارا رئيسية في التعرف على الممرضات وتنشيط المناعة الفطرية. يمكن أن توفر قياسات سايتوكين المصل وبروتينات TLR لمحة عن التنشيط الجهازي المبكر، في حين قد تعكس بعض التعددات الجينية المناعية اختلافات أكثر استقرارا في إنتاج السيتوكينات أو إشارات المستقبلات أو تنظيم الالتهابات. مقارنة بالتقييم السريري فقط، يمكن لسير عمل المؤشر الحيوي والمتعدد الأشكال أن يلتقط الحالة الالتهابية الحالية والاستجابة المناعية الأساسية لكل مريض. هذا النهج ليس بهدف استبدال التقييم السريري بجانب السرير، بل هو تكمله بإضافة معلومات مخبرية وجينية للمضيف قد تساعد في تحديد المرضى الذين يستحقون مراقبة أقرب للعدوى بعد حدوث العدوى التلقائية.

وبناء على هذا الأساس، افترضنا أن المرضى المصابين بالتهاب الرحم الداخلي الداخلي العفوي الذين يصابون بعدوى رئوية في المستنفي سيظهرون ملفا التهابيا مميزا مع توزيع مختلف لبعض التعددات الجينية المناعية مقارنة بالمرضى الذين لا يزالون خالين من العدوى. لاختبار هذه الفرضية، حللت الدراسة السريرية والمختبرية الحالية السابقة السيتوكينات في المصل بعد القبول المبكر، ومستويات بروتينات المصل ل TLR2 وTLR4 وTLR9، واختارت تعدد أشكال الجينات الالتهابية لدى المرضى الذين يعانون من التداخل الذاتي الأولي. يستخدم سير العمل الدم المحيطي الذي تم جمعه أثناء الاستشفاء الحاد، وقياس البروتين باستخدام ELISA، والتصنيف الجيني المعتمد على PCR-RFLP، والمقارنة الإحصائية بين المرضى الذين يعانون من عدوى رئوية مريضة وبدون مرضى. كان الهدف هو توفير إطار قابل للتكرار لتوصيف الملفات الالتهابية والجينية للمضيف المرتبطة بخطر العدوى، مما يدعم التعرف المبكر على المرضى ذوي الخطورة العالية في بيئة المستشفيات الحادة.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى التابع لجامعة جياشينغ، المستشفى الأول في جياشينغ، جياشينغ، تشجيانغ، الصين (رقم الموافقة 2025-LP-599). تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمتطلبات المؤسسية ومبادئ إعلان هلسنكي. تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة لجمع الدم واستخدام البيانات من جميع المشاركين و/أو ممثليهم المصرح لهم قانونيا قبل جمع العينات.

جميع المجموعات التجارية، والكواشف، والمستهلكات، والأدوات، والبرمجيات، والمصنعين، وأرقام الكتالوج، والمواصفات الرئيسية المستخدمة في هذا سير العمل مدرجة في جدول المواد.

نطاق الدراسة، الأهلية، وتجميع المرضى

أجريت هذه الدراسة كتحليل جماعي سريري-مختبر بأثر رجعي من مركز واحد لمرضى نزيف دماغي تلقائي أولي تم إدخالهم إلى مركز الطوارئ والعناية الحرجة أو وحدة العناية المركزة في مستشفى جامعة جياشينغ التابع، المستشفى الأول في جياشينغ، جياشينغ، تشجيانغ، الصين، بين مايو 2019 وسبتمبر 2024. تم تأكيد تشخيص النزيف الدماغي المحوسب من خلال التصوير المقطعي المحوسب للجمجمة أو التصوير بالرنين المغناطيسي وفقا للإرشادات الصينية لتشخيص وعلاج النزيف الدماغي (2019)¹⁰.

كان المرضى مؤهلين إذا كان لديهم اضطراب التداخلي الذاتي الأولي المؤكد بالتصوير، وتم قبولهم خلال 3 أيام من ظهور الأعراض، وكان لديهم متغيرات سريرية رئيسية كاملة، إلى جانب عينات دم محيطية متاحة لقياس المؤشرات الالتهابية والتحليل الجيني. تم استبعاد المرضى إذا كان لديهم نزيف داخل الجمجمة رضحي، أو نزيف ثانوي في الفراغ، أو عدوى رئوية موجودة قبل القبول أو خلال 48 ساعة بعد الدخول، أو خروجهم رغم نصيحة طبية، أو وفاة خلال 48 ساعة من الدخول، أو تاريخ من الأورام الخبيثة أو أمراض المناعة الذاتية، أو سجلات سريرية أو مختبرية أو جينوتي غير مكتملة. بعد الفحص، استوفت 360 مريضا معايير الأهلية وتم تضمينهم في التحليل النهائي. من بينهم، أصيب 180 مريضا بعدوى رئوية في الأنفسية أثناء الاستشفاء، ولم يصاب 180 مريضا بعدوى رئوية في الأنفس. تم تعيين المرضى إلى مجموعة العدوى الرئوية أو مجموعة عدم وجود عدوى رئوية بناء على ما إذا كانت العدوى الرئوية المرضية قد حدثت بعد الدخول.

قبل التجميع النهائي، تم فحص التشخيص بالتصوير، ووقت الدخول، وتوقيت العدوى، وتوفر عينات الدم، واكتمال السجلات السريرية والمخبرية. تم استخدام هذه الخطوة لتقليل التصنيف الخاطئ وضمان أن جميع الحالات المشمولة لديها بيانات كاملة للمقارنة السريرية، وقياس العلامات الالتهابية، والتصنيف الجيني.

تعريف العدوى الرئوية المرضية الوعائية

تم تعريف العدوى الرئوية الأنفية المريضة بناء على الأدلة الإشعاعية مع المعايير^{السريرية 11}. تطلب التأكيد الإشعاعي وجود آفة جديدة أو تدريجية أو تسربية أو موحدة أو زجاجية أرضية في التصوير الشعاعي للصدر أو التصوير المقطعي المحوسب. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون هناك معياران على الأقل من المعايير التالية: درجة حرارة الجسم > 38 درجة مئوية، إفرازات تنفسية قيزية، أو عدد خلايا الدم البيضاء المحيطية غير الطبيعي مع وجود خلايا الدم البيضاء البيضاء < 4 × 10⁹/لتر أو > 10 ×^{10 9}/لتر.

لم تصنف العدوى الرئوية التي كانت موجودة قبل القبول أو التي تم تشخيصها خلال أول 48 ساعة بعد القبول كعدوى رئوية في الأنف. تم التحقق من تصنيف العدوى باستخدام تقارير الإشعاع، وسجلات درجة حرارة الجسم، وتوثيق الإفرازات التنفسية، ونتائج عد الدم المحيطي، وسجلات التشخيص السريري.

السلامة البيولوجية والتخلص من النفايات

تم التعامل مع دم الإنسان والسيروم والحمض النووي المشتق من الدم وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية القياسية المستوى 2. ارتدى موظفو المختبر قفازات ومعاطف مختبر وأقنعة ونظارات واقية أثناء معالجة الدم، وتحليل المصل، واختبار ELISA، واستخراج الحمض النووي، وتحضير PCR، والرحلان الكهربائي الهلامي، والهضم التقييدي، والتصوير بالأشعة فوق البنفسجية. تم فحص أنابيب الدم بحثا عن تسرب أو كسر قبل المعالجة. تم إجراء الطرد المركزي باستخدام أنابيب مغطاة أو، حيثما توفرت، دلاء طرد مركزي محكمة الإغلاق.

تم التخلص من القطع الحادة فورا في حاويات الحاد المعتمدة. تم التخلص من الأنابيب الملوثة بالدم، وأطراف الماصات، والقفازات، وألواح ELISA، وغيرها من المواد الاستهلاكية التي يمكن التخلص منها كنفايات مختبرية بيولوجية. تم تعقيم النفايات البيولوجية السائلة وفقا للإجراءات المؤسسية قبل التخلص منها. تم التخلص من هلام الأغاروز، وهلام البولي أكريلاميد، ومواد التلوين، والمواد المرتبطة بالرحلان الكهربائي وفقا لمتطلبات النفايات الكيميائية والمختبرية المؤسسية.

تم فصل تحضير كاشف PCR، وإضافة قالب الحمض النووي، ومناولة المنتجات المضخمة، والهضم التقييدي، والرحلان الكهربائي الهلامي قدر الإمكان لتقليل التلوث. تم استخدام رؤوس الماصات المقاومة للرذاذ في معالجة PCR والحمض النووي. تم إجراء التصوير بالأشعة فوق البنفسجية فقط باستخدام درع واق أو نظام توثيق هلام، وتم تجنب التعرض المباشر للعين أو الجلد للأشعة فوق البنفسجية.

جمع الدم المحيطي ومعالجة العينات

لتقليل التنوع قبل التحليل، تم جمع 10 مل من الدم الوريدي المحيطي في الساعة 08:00 صباح اليوم التالي للدخول، بعد صيام ليلي لا يقل عن 12 ساعة. تم سحب 5 مل من الدم في أنبوب تفريغ بسيط لتحضير المصل، و5 مل المتبقية في أنبوب هيبارين لاستخراج الحمض النووي الجيني.

قبل المعالجة، تم فحص كل أنبوب لمعرفة تعريف المريض، ووقت الجمع، ونوع الأنبوب، وحجم الدم، والتسرب، والتجلط المرئي، وتحلل الدم الكبير. تم استبعاد العينات التي تحتوي على وسم غير صحيح، أو حجم دم غير كاف، أو تسرب أنبوب، أو تجلط مرئي في الأنبوب المضاد للتخثر من التحليل اللاحق. تم السماح للدم في الأنبوب العادي بالتجثر في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة، ثم تم تقطيعه في 1500 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم نقل المادة الفائقة في المصل إلى أنابيب بولي بروبيلين معقمة منخفضة الارتباط بالبروتين دون الإزعاج في طبقة الخلية، وتم تقسيمها إلى أجزاء بحجم 0.5 مل، وتخزينها عند −80 درجة مئوية حتى التحليل.

تم استبعاد العينات التي أظهرت انحلالا دمويا متوسطا أو شديدا مرئيا من القياس القائم على ELISA. تم تسجيل عينات خفيفة تحلل الدم ولم تستخدم في التحليل الأولي للسيتوكين. تم الإبلاغ عن العينات التي تحتوي على عكارة ظاهرة، أو دهون دمية واضحة، أو حجم متبقي غير كاف، أو تعرض متكرر للتجميد والذوبان قبل الاختبار. لم يخضع أي مصب أليكوت لأكثر من دورة تجمد وذوبان واحدة قبل التحليل.

قياس كمية السيتوكين بواسطة ELISA

تم قياس تركيزات IL-1β وIL-6 وIL-10 وIL-17 وIFN-γ وTNF-α في المصل باستخدام مجموعات ELISA ساندويتش متوفرة تجاريا للبشر، تم التحقق منها لعينات المصل. تم إذابة أليكوت المصل، وخلطها برفق، وفحصها بحثا عن تحلل الدم، العكارة، الدهون في الدم، حجم غير كاف، وتاريخ التجميد والذوبان قبل التحميل.

تم تحميل عينات المعايير، والآبار الفارغة، وعينات المصل بشكل مكرر. تم توليد منحنيات قياسية على كل لوحة باستخدام تخفيف تسلسلي بتركيزات قياسية وتحكم فارغ، وفقا لتعليمات المجموعة. تم قياس الكثافة الضوئية عند 450 نانومتر، مع تصحيح مرجعي عند 570 نانومتر، باستخدام قارئ ميكرولوح معاير. تم حساب التكثفات باستخدام ملاءمة منحنى لوجستي مكون من أربعة معاملات.

تم قبول نتائج الاختبار فقط عندما أظهر المنحنى القياسي نمط تركيز واستجابة مناسب، وأظهرت الآبار الفارغة خلفية منخفضة، وكان معامل التباين في العينة المكررة ≤ 10٪. تم إعادة فحص العينات التي تحتوي على CV مكررة > 10٪ من أليكوت المصل الأصلي عندما توفرت كمية كافية. كانت العينات خارج نطاق المنحنى القياسي الموثوق تخفف أو تكرر وفقا لتعليمات المجموعة. تم تكرار الألواح التي تظهر معايير غير متسقة، أو خلفية مفرطة، أو تأثيرات حواف واضحة.

كانت حدود الكشف التحليلي الأدنى المستخدمة لقبول البيانات هي 2.0 بيغرام/مل ل IL-1β، 1.5 بيغم/مل ل IL-6، 2.0 بيغم/مل ل IL-10، 3.0 بيغرام/مل ل IL-17، 4.0 بيغرام/مل ل IFN-γ، و2.5 بيغم/مل ل TNF-α. تم التحقق من القيم النهائية للسيتوكين مع معرفات العينات، وخرائط اللوحات، وسجلات القراءات المكررة، وملاحظات جودة العينة قبل التحليل الإحصائي.

قياس كمية مصل TLR2 وTLR4 وTLR9 بواسطة ELISA

تم قياس مستويات بروتينات TLR2 وTLR4 وTLR9 في المصل باستخدام مجموعات ELISA البشرية المتوفرة تجاريا تم التحقق منها لعينات المصل. تم إذابة عينات المصل، وخلطها برفق، وفحصها باستخدام نفس معايير جودة العينة المطبقة على قياس السيتوكينات.

تم تحليل المعايير، والآبار الفارغة، وعينات المصل بشكل مكرر. تمت قراءة الألواح عند 450 نانومتر مع تصحيح مرجعي عند 570 نانومتر، وتم حساب التكثفات باستخدام الانحدار اللوجستي المكون من أربعة معاملات. تم قبول النتائج عندما كان المنحنى القياسي صالحا، وكانت الآبار الفارغة ضمن النطاق المتوقع، وكانت الرؤية المزدوجة ≤ 10٪. تم إعادة اختبار العينات التي تتجاوز هذا الحد التكراري للعينة القلبية عندما تبقى عدد كاف من العينات.

كانت حدود الكشف التحليلي الأدنى المستخدمة لقبول النتائج 0.10 نانوغرام/مل ل TLR2، و0.12 نانوغرام/مل ل TLR4، و0.15 نانوغرام/مل ل TLR9. تم التحقق من القيم النهائية ل TLR2 وTLR4 وTLR9 مقابل معرفات العينة، وخرائط اللوحات، وسجلات القراءات المكررة، وملاحظات جودة العينة قبل التحليل الإحصائي.

استخراج الحمض النووي الجيني

تم استخراج الحمض النووي الجيني من دم كامل مضاد للهيبارين باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومية المعتمدة على عمود السيليكا. قبل الاستخلاص، تم فحص عينات الدم المضادة للتخثر للتأكد من صحة الملصقات، والحجم الكافي، والتجلط المرئي، والتسرب، وحالة التخزين.

تم تقييم نقاء وتركيز الحمض النووي باستخدام القياس الطيفي الضوئي (spectrophotometry). تم قبول العينات التي تتراوح نسبة A260/A280 بين 1.80 و2.00 فقط لتضخيم PCR في المراحل النهائية. تم إعادة قياس العينات خارج هذا النطاق بعد الخلط اللطيف. إذا استمرت نسبة النقاء غير الطبيعية، كان يتم تكرار استخراج الحمض النووي عندما يبقى دم كامل كاف.

تم تخفيف الحمض النووي بماء خال من النوكلياز إلى تركيز عمل 50 نانوغرام/ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى تضخيم PCR. قبل إعداد PCR، تم فحص كل عينة DNA من حيث التركيز والنقاء، ومعرف العينة، وتاريخ التجميد والذوبان.

التصنيف الجيني PCR-RFLP واستدعاء الأنماط الجينية

تم إجراء التصنيف الجيني باستخدام تعدد أشكال طول شظايا تفاعل تقييد البوليميراز (PCR-RFLP) ل IL-1B +3954 C/T، IL-10-1082 G/A، IL-10-819 T/C، TNF-α-308 G/A، TLR2-196 إلى 174 بوصة/دل، TLR4 Asp299Gly، TLR4 Thr399Ile، TLR9 rs187084، IFN-γ +874 A/T، وIFN-γ +2108 A/G. تم توفير تسلسلات البرايمر الخاصة باللوكوس، وأحجام الأمبليكون المتوقعة، وإنزيمات التقييد، وأنماط الهضم الخاصة بالنمط الجيني في الجدول التكميلي 1.

تم تضخيم PCR في حجم تفاعل نهائي قدره 25 ميكرولتر يحتوي على 2.5 ميكرولتر من 10 مخزنا ×، و2.0 ميكرولتر من خليط dNTP بمقدار 2.5 مللي مول، و1.0 ميكرولتر من البرايمر الأمامي عند 10 ميكرومول، و1.0 ميكرولتر من البرايمر العكسي عند 10 ميكرومول، و0.25 ميكرولتر من بوليميراز DNA تاك عند 5 ميكرومولتر، و2.0 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني عند 50 نانوغرام/ميكرولتر. و16.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. تم تحضير خليط PCR الرئيسي في منطقة نظيفة قبل PCR، وتمت إضافة قالب الحمض النووي في النهاية. تم تضمين تحكم سلبي بدون قالب في كل تشغيل PCR.

تكون الملف الحراري من إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تلتها 35 دورة إزالة طبيعية عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والتلدين عند 58–62 درجة مئوية لمدة 30 ثانية حسب زوج البرايمر، وتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، مع تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تم تأكيد منتجات PCR أولا على جل أغاروز بنسبة 1.5٪ قبل الهضم التقييدي.

تم قبول تضخيم PCR فقط عندما كان نطاق المضخمات المتوقع مرئيا، ولم يظهر التحكم بدون قالب أي تضخيم. تم تكرار ردود فعل تظهر نطاقات ضعيفة، تضخيم غير نوعي، تداخل برايمر-دايمر، أو تلوث في الضابط السلبي من قالب الحمض النووي الأصلي.

تم هضم منتجات PCR مع النيوكلياز التقييدي المقابل عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في حجم هضم إجمالي قدره 15 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم حل الشظايا المهاضمة باستخدام جل أغاروز بنسبة 2.5٪ لمعظم المواقع. تم حل TLR2-196 إلى -174 بوصة/ديل لوكوس على هلام بولي أكريلاميد 8٪ لتحسين التمييز بين الشظايا.

تم قبول الهضم التقييدي فقط عندما تتطابق أنماط الشظايا مع ملف الهضم المتوقع الخاص بالنمط الجيني. تكررت ردود فعل تظهر هضم غير مكتمل، أو أشرطة ملطخة، أو أحجام شظايا غير متوقعة، أو انفصال غير واضح. تم تصور الأشرطة تحت الإضاءة فوق البنفسجية بعد التلوين بحمض النووي. تم حفظ صور الجل مع معرف العينة، واسم الموقع، وتاريخ التشغيل، ورقم الهلام.

تم إجراء تعيين النمط الجيني بشكل مستقل من قبل باحثين مختبريين أعمى. تمت مراجعة النداءات الجينية غير المتنافرة أو الغامضة باستخدام الصورة الهلامية الأصلية وأعيد استخدامها من تضخيم PCR عند الحاجة. تم إعادة تصنيف عشرة بالمئة من العينات المختارة عشوائيا لأغراض مراقبة الجودة، وبلغ معدل التوافق 99.2٪. تم إدخال بيانات النمط الجيني النهائي في مجموعة بيانات التحليل فقط بعد فحص معرفات العينات، وأسماء المواقع، واستدعاءات النمط الجيني، وسجلات مراقبة الجودة.

التحليل الإحصائي

تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج تحليل إحصائي مناسب. تم دمج مجموعات البيانات السريرية، وELISA، والجينوتايبيب باستخدام رموز المرضى غير المحددة الهوية. تم فحص رموز المرضى للتأكد من التكرار وعدم التوافق والقيم المفقودة قبل التحليل. تم استخدام استراتيجية الحالة الكاملة لأن جميع المرضى المشاركين كان لديهم بيانات سريرية والتهابية وجينية رئيسية متاحة.

في برنامج تحليل إحصائي مناسب، تم ترميز حالة العدوى الرئوية كمتغير التجميع، مع استخدام مجموعة عدم وجود عدوى رئوية كفئة مرجعية. تم اختبار المتغيرات المستمرة لأول مرة للطبيعة باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. تم التعبير عن المتغيرات المستمرة الموزعة بشكل طبيعي كمتوسط ± انحراف معياري ومقارنتها باستخدام اختبار t الطالب المستقل للعينات. تم الإبلاغ عن المتغيرات المستمرة غير الموزعة بشكل طبيعي كوسطات ذات نطاقات رباعية وتمت مقارنتها باستخدام اختبار مان-ويتني U. تم التعبير عن المتغيرات التصنيفية كعداد ونسب مئوية وتمت مقارنتها باستخدام اختبار كاي-تربيع أو اختبار فيشر الدقيق، حسب الحاجة.

تم تقييم توزيع الأنماط الجينية في مجموعة عدم وجود عدوى رئوية لتوازن هاردي-وينبرغ قبل تحليل الارتباط. تم تلخيص النمط الجيني وتكرارات الأليل على n (٪). تم تقدير نسب الاحتمالات وفترات الثقة 95٪ لمخاطر العدوى الرئوية باستخدام نماذج الانحدار اللوجستي متعددة المتغيرات. تم إدخال حالة العدوى الرئوية كمتغير تابع. تم إدخال متغيرات النمط الجيني، الأليل، أو العلامة الحيوية كمتغيرات مستقلة كما هو محدد لكل تحليل.

تم إدخال العمر والجنس في النموذج الأساسي مسبقا. تم إدخال مؤشر كتلة الجسم، وأمراض الانسداد الرئوي المزمن، وأمراض القلب، وتسرب السائل الدماغي الشوكي، ووقت البقاء في التصريف، وفئة مقياس غيبوبة غلاسكو للقبول في نفس الوقت في النموذج المعدل بالكامل لأن هذه المتغيرات كانت ذات صلة سريرية أو أظهرت اختلال في الأساس بين المجموعات. تم تقييم التعدد التعاوني باستخدام عوامل التباين للتباين (VIFs)، واعتبرت مؤشرات التوازن المتعددة <5.0 مقبولة.

نظرا لاختبار تعدد أشكال متعددة، تم تطبيق تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ بنجاميني-هوشبرغ على تحليلات الارتباط الجيني¹². تم تصنيف قيم P من اختبارات الارتباط الجيني من الأصغر إلى الأكبر، وتم تحديد الدلالة المصححة وفقا لإجراء بنجاميني-هوشبرغ. كانت جميع الاختبارات ثنائية الجانب، واعتبر P <0.05 ذات دلالة إحصائية ما لم يتم تحديد خلاف ذلك بعد تعديل متعدد المقارنات.

تم التحقق من المخرجات النهائية مقابل مجموعة البيانات المصدر، وسجلات مراقبة الجودة ELISA، وسجلات استدعاء النمط الجيني، وقيم الجداول قبل إعداد المخطوطة. تم تفسير النتائج على أنها ارتباطات وليس تأثيرات سببية لأن الدراسة استخدمت تصميما رصديا بأثر رجعي.

النتائج

المؤشرات السريرية

تلخص الخصائص السريرية الأساسية في الجدول 1. تم تضمين ما مجموعه 360 مريضا يعانون من نزيف دماغي تلقائي في التحليل النهائي، شمل 180 مريضا أصيبوا بعدوى رئوية في المستشفى أثناء الاستشفاء و180 مريضا لم يصابوا بذلك. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في العمر (62.4 سنة ± 6.8 سنة مقابل 63.6 سنة ± 7.0 سنوات، النسبة المئوية > 0.05)، توزيع الجنس (142/180، 78.9٪ مقابل 137/180، 76.1٪، نسبة السعر...

المناقشة

يظل النزيف الدماغي التلقائي (ICH) واحدا من أشد أنواع السكتة الدماغية شدة ولا يزال يفرض أعباء كبيرة على الوفيات المبكرة والإعاقة طويلة الأمد.¹³. في الممارسة السريرية، يكون المرضى المصابون ب ICH عرضة بشكل خاص للمضاعفات داخل المستشفيات لأن الإصابة العصبية يمكن أن تضعف حماية مجرى الهواء، وتقلل من فعالية السعال، وتقيد الحركة، وتزيد من التعرض للإجراءات الداعمة الغازية. من بين هذه المضاعفات، تعد عدوى الرئة المستشفية مهمة بشكل خاص لأنها قد تطيل فترة الاستشفاء، وتزيد من اس...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Human TNF-α ELISA Kit	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	KHC3011	مجموعة ELISA لقياس الكمي لـ TNF-α البشري في المصل.
Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit	Sigma-Aldrich / Merck	RAB0744-1KT	مجموعة ELISA 96-well لقياس TLR2 البشري في عينات المصل أو البلازما.
Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric	Novus Biologicals / Bio-Techne	NBP3-11807	مجموعة ELISA colorimetric sandwich لقياس TLR4 البشري في المصل، البلازما، أو سوائل حيوية أخرى.
Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric	Novus Biologicals / Bio-Techne	NBP2-76574	مجموعة ELISA colorimetric لقياس TLR9 البشري في عينات المصل.
Absorbance microplate reader	Agilent BioTek	800 TS	قارئ لوحة مصغرة لقياس الكثافة الضوئية في ELISA عند 450 نانومتر مع تصحيح المرجع عند 570 نانومتر.
QIAamp DNA Blood Mini Kit	QIAGEN	51104	مجموعة أساسية مستندة إلى غشاء سيليكا لاستخراج الحمض النووي الجينومي من الدم الكامل المضاد للتخثر.
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W	مقياس طيف الأشعة فوق البنفسجية للحجم الدقيق لتركيز الحمض النووي وتقييم نقاء A260/A280.
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	A24811	جهاز تدوير حراري يستخدم لتضخيم PCR في نهاية المرحلة في تنميط النمط النووي المعتمد على RFLP.
PCR Master Mix, 2X	Thermo Scientific	K0171	مُركَّب PCR مُخَلَّط مسبقًا يحتوي على إنزيم Taq DNA polymerase، dNTPs، MgCl2، ومُركِّز التفاعل؛ يُستخدم لتضخيم PCR التقليدي.
Recombinant Taq DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0401	مصدر إنزيم بديل لتفاعلات PCR المحددة للموقع عند استخدام مكونات PCR منفصلة بدلاً من مُركَّز Master Mix 2X.
Nuclease-free water	Thermo Scientific	R0581	ماء من فئة البيولوجيا الجزيئية المستخدم في إعداد PCR، تخفيف الحمض النووي، والضوابط بدون قالب.
Custom DNA primers	Sangon Biotech	Custom synthesis	مُبرِّمات الحمض النووي المحددة للموقع لجينوتيب PCR-RFLP؛ تُدرج تسلسلات المُبرِّمات في الجدول التكميلي S1.
Restriction endonucleases for PCR-RFLP	Thermo Scientific / New England Biolabs	Enzymes specific for the locus listed in Supplementary Table S1	إنزيمات التقييد المستخدمة في الهضم النوعي للأنماط الجينية لمنتجات PCR. يجب أن يتطابق الإنزيم المحدد لكل موقع مع نمط الهضم المدرج في الجدول التكميلي S1.
Agarose I, molecular biology grade	Thermo Scientific	17850	أجاروز لتحضير جل 1.5٪ و2.5٪ المستخدم لتأكيد منتجات PCR وحل معظم شظايا RFLP.
GeneRuler 50 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0371	علامة حجم الحمض النووي لتقدير حجم منتجات PCR وشظايا RFLP.
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	S33102	صبغة هلام الحمض النووي لرؤية الحمض النووي في أجاروز أو جل الأكريلاميد؛ تُستخدم كبديل ذي خطورة منخفضة لبروميد الإيثيديوم.
Horizontal agarose gel electrophoresis system	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base	نظام الكهربائي للهلام الأجاروز لفصل منتجات PCR وRFLP.
Vertical PAGE electrophoresis system	Bio-Rad	Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001	نظام الكهربائي العمودي لفصل جل البولي أكريلاميد 8٪ عندما تكون هناك حاجة لتمييز أعلى دقة للشظايا.
Gel documentation system with UV or blue-light transillumination	Bio-Rad / equivalent laboratory system	Gel Doc XR+ or equivalent	نظام التصوير لتوثيق نطاقات الحمض النووي المصبغة بعد الكهربائي الهلامي. استخدم وقاية الأشعة فوق البنفسجية أو وضع الضوء الأزرق عند توفره.
Refrigerated centrifuge	Eppendorf / equivalent laboratory centrifuge	5424 R or equivalent	الطرد المركزي المبرد المستخدم لفصل المصل عند 1,500 × g و4 درجات مئوية.
−80 °C ultra-low temperature freezer	Thermo Scientific / equivalent laboratory freezer	Forma 900 Series or equivalent	تخزين أجزاء المصل قبل تحليل ELISA.
IBM SPSS Statistics	IBM	Version 25.0	برنامج إحصائي يستخدم للإحصائيات الوصفية، اختبار التوزيع الطبيعي، المقارنات بين المجموعات، الانحدار اللوجستي، وتصدير مخرجات النموذج.
Spreadsheet software	Microsoft	Excel for Microsoft 365	يُستخدم للتحقق من البيانات، وتنظيم خرائط الألواح، ومراجعة القيم المكررة، وإعداد ملفات التحليل المدمجة قبل تحليل SPSS.