تم استخدام نظام تصوير ليزري للتباين بتقنية البقع لمراقبة التغيرات في تدفق الدم الميكروأوعية الدموية الكلوية أثناء فقدان التروية الكلوية الأحادي الجانب بعد استئصال الكلية اليمنى في الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يتم مراقبة التروية الوعائية الدقيقة بواسطة تصوير التباين بالليزر أثناء إصابة إقرامية الكلى وإعادة التروية في الفئران
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تصوير التباين بالليزر (LSCI) هو تقنية غير جراحية لقياس تدفق الدم السطحي على مساحات واسعة. بفضل دقته العالية في المكان-زمان، يقوم LSCI بقياس شبه التغيرات غير المتجانسة في تدفق الدم عبر مناطق مختلفة داخل المنطقة المصورة. هنا، نعرض تقنية LSCI لتسجيل تدفق الدم أثناء إصابة فقدان التروية الكلوية أحادي الجانب (IRI) في الفئران. بعد استئصال الكلى الأيمن، تم تعديل موقع الفأر ونقطة التركيز لهدف نظام LSCI لضمان وجود الكلية اليسرى في مجال الرؤية. تم إجراء فحوصات LSCI قبل وأثناء وبعد نقص تروية الكلى. علاوة على ذلك، من خلال اختيار المناطق ذات الاهتمام (ROIs)، تم مراقبة تدفق الدم في المناطق في الوقت نفسه. تتصور طريقة LSCI تدفق الدم الميكروأوعية الدموية للكلى وتسمح برسم خريطة لتدفق الدم في الوقت الحقيقي. يمكن استخدامه لمراقبة تدفق الدم الميكروأوعية الدموية وتقييم تأثير التدخل على حركية إعادة التروية والتجانس المكاني أثناء التفاعل الشعاعي الكلوي للفئران أو نماذج حيوانية مشابهة أخرى.
المقدمة
إصابة الإقمرامية وإعادة تروية الدم (IRI) هي من الأسباب الرئيسية لإصابات الكلى الحادة (AKI)، والتي ترتبط بارتفاع معدلات المرض والوفيات العالية لدى المرضى 1,2. تغير ديناميكا الدم الكلوية هو أحد العوامل الحرجة في AKI1 الناتج عن الأشعة تحت الحمراء. يعد خلل الدورة الدموية الدقيق الناتج عن الأشعة تحت الحمراء سببا رئيسيا لتطور الإصابة، مما يؤدي إلى نقص الأكسجين وخلل في وظائف الميتوكوندريا في الخلايا 3,4. لذلك، فإن مراقبة تغيرات تدفق الدم في الوقت الحقيقي هي طريقة فعالة لضمان نجاح نقص التروية أو إعادة تروية الكلى وتقييم درجة الإصابة بالالتهاب في النماذج الحيوانية للاضطراب.
هناك تقنيات متعددة لقياس تدفق الأوعية الدقيقة للأنسجة، بما في ذلك التصوير الليزري بتدفق دوبلر (LDF)5، التصوير الذاتي التألقي بنيكوتيناميد أدينين دينيوكليوتيد ديهيدروجيناز (NADH) 6,7,8، التصوير بالأشعة تحت الحمراء9، وتصوير الأوعية الدموية الأخضر الإندوسيانين (ICG)10. من بينها، يقيس التصوير بالأشعة تحت الحمراء وتصوير التألق الذاتي NADH بشكل غير مباشر تدفق الأوعية الدقيقة. LDF، باستخدام مسبار بصري، يراقب فقط تدفق الدم الإقليمي5، وLDF المسح ليس سريعا بما يكفي لمراقبة التغيرات الفورية في تدفق الدم الميكرووعي في الأنسجة تحت حالات I/R11. يمكن لتصوير الأوعية الدموية ICG أيضا تحديد الأوعية الكلوية المسدودة10 لكنه يتطلب إعطاء عامل تباين، مما يقتصر على استخدامه بعدد محدود من القياسات12. تصوير التباين بالليزر (LSCI) هو طريقة فعالة غير جراحية لمراقبة تروية الكلى الدقيقة في الوقت الحقيقي13. وقد تم استخدامه لتوليد معلومات محلية تتعلق بديناميكيات تدفق الدم. عندما يسلط شعاع متماسك على سطح خشن، تتداخل موجات الضوء المنعكسة أو المتناثرة مع بعضها البعض بسبب اختلافات المسارات الدقيقة، مما يشكل توزيعا عشوائيا لأنماط البقع الساطعة والداكنة، يعرف باسم "البقع". يقوم LSCI برسم خريطة سرعة تدفق الدم في الأنسجة السطحية من خلال تحليل درجة الضبابية في "البقعة الديناميكية" الناتجة عندما يشعاع ضوء الليزر الأنسجة 12,14,15. في هذه الدراسة، عمل نظام LSCI بطول موجي ليزر 785 نانومتر بدقة مكانية 3 ميكرومتر، ومجال رؤية قابل للتعديل بين 6.3 مم × 4.7 مم و42 مم × 31 مم، وسرعة تصوير تصل إلى 120 إطارا في الثانية، مما أتاح خرائط دقيقة عالية الدقة لتروية الأوعية الدقيقة القشرية. في ضوء هذه المزايا، تم تطبيق LSCI في مجموعة من السياقات التجريبية والسريرية لمراقبة تدفق الدم، بما في ذلك جروح الحروق16، وتروية الشبكية17، وتدفق الدم الدماغي18، والمريء19، والأمعاء20.
يجدر بالذكر أن LSCI يقيم بشكل أساسي التروية في الأنسجة السطحية، ويوفر قيم تدفق نسبية بدلا من مطلقة، ويمكن أن يتأثر بخصائص النسيج البصرية والحركة. تؤخذ هذه الخصائص الجوهرية في الاعتبار عند تفسير بيانات التصوير.
استخدم هذا العمل، باستخدام نموذج يتضمن استئصال الكلى الأيمن لتسهيل التعرض وتصوير الكلية المقابلة للجسم، ورصد التغيرات في التروية الدقيقة قبل وأثناء وبعد نقص التروية في نموذج فأر كلوي أحادي الجانب باستخدام LSCI، وأظهر التباين المكاني لتدفق الدم على سطح الكلى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع إجراءات الحيوانات كانت تلتزم بدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية ودليل العناية واستخدام الحيوانات المختبرية، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في كلية الطب بجامعة شانتو. لإزالة الفروق القائمة على الجنس والسلالة في تأثيرات IRI، تم استخدام الفئران الذكورية فقط من نوع C57BL/6N في الدراسة. تم مطابقة جميع الفئران في العمر والوزن لتحقيق نتائج مماثلة. تم استخدام حجم عينة n = 5، بما يتوافق مع الدراسات المنهجية السابقة التي استخدمت LSCI للتحقق التقني21. تلقت الحيوانات رعاية إنسانية وتم إعدامها بعد التجارب بواسطة استنشاقثاني أكسيد الكربون. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
قبل بدء الجراحة، شغل نظام تصوير التباين بالليزر النقطي. النظام المستخدم في هذه الدراسة يعمل بليزر 785 نانومتر. اضبط مسافة العمل على حوالي 15-20 سم فوق مجال الجراحة. يحسب النظام تدفق الدم في وحدات تروية الليزر البقع (LSPU) بناء على خوارزمية التباين المكاني. تأكد من أن الجهاز دافئ ومستقر قبل المتابعة.
1. تحضير الحيوانات وفتح البطن
- قم بتعقيم طاولة الجراحة قبل كل إجراء. جهز ووضع جميع المواد المطلوبة (أدوات معقمة ومسحات قطنية، شاش، مخدرات مخففة مسبقا، وسادة تسخين، مشبك وعائي، محلول ملحي، كريم إزالة الشعر، كرات قطن، غرز، مطهر للجلد، وخياطة السرعة) على طاولة الجراحة.
- أعط الميلوكسيكام (0.2 ملغ/كجم وزن الجسم؛ حقن تحت الجلد) للفأر قبل 30 دقيقة لتخفيف الألم.
- صب كمية معينة من المحلول الملحي المعقم في وعاء نظيف. ثم خذ قطعة من الشاش، واقطع فتحة مناسبة في المنتصف.
- تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق بنسبة 2.5٪ من تريبروموإيثانول (400 ملغ/كجم من وزن الجسم؛ مخفف سابقا في محلول ملحي معقم).
ملاحظة: تم استخدام تريبروموإيثانول كمخدر أثناء عملية استئصال الكلى الأيمن. واستخدم 1٪ إيزوفلوران للتخدير خلال الإجراءات الطويلة لمراقبة تدفق الدم. - ضع الفأر على وسادة التدفئة مع شريط لاصق واستخدم كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر من منطقة بطن الفأر. خلال فترة الجراحة، استخدم وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة المستقيم عند 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية.
- قم بتعقيم الجلد في منطقة الجراحة أولا بنسبة 75٪ كحول ثم باستخدام اليودوفور باستخدام مسحة قطنية.
- استخدم الملقط لقرص إصبع فأر. بمجرد أن لا يظهر الفأر أي استجابة للألم، قم بعمل شق عمودي على طول منتصف البطن باستخدام المقص. افصل الجلد عن الصفاق بلطف، ثم افتح الصفاق وادخل تجويف البطن.
- ضع مشاشا على الفأرة لتحسين الرؤية وتغطية المجال الجراحي بالشاش، مع محاذاة الفجوة على الشاش مع تجويف البطن، ورطبها بالمحلول الملحي.
2. استئصال الكلى الأيمن
- استخدم مسحة قطنية لدفع الأمعاء بلطف نحو جانب واحد من الشاش، مما يكشف عن الكلية اليمنى والأنسجة المحيطة. اطو الشاش لتغطية الأمعاء ورطبها بمحلول ملحي عادي لمنع جفاف الأمعاء.
- استخدم ملقط مائل لرفع الحالب الأيمن. مرر خيطي خياطة بحجم 6-0 عبر الحالب وقم بالربط في موضعين.
- اقطع الحالبين بين الرباط باستخدام المقص المجهري.
- بعد ترطيب كرات القطن بالمحلول الملحي العادي، استخدم ملقطا دقيقا لالتقاط كرات القطن، ودفع الكبد بلطف إلى الأعلى، وثبته بكرات القطن، لكشف الكلى والأوعية الدموية على الجانب الأيمن.
- استخدم ملقطا مائلا لفصل وسادات الدهون في منطقة العجان على جانب الكلية اليمنى بشكل غير مباشر حتى يتعرض الشريان الكلوي والوريد بالكامل.
ملاحظة: افصل في نفس الوقت كتلة نسيج الغدة الكظرية الموجودة فوق الكلى. - قم بتحريك ملقط مائل بحذر تحت الشريان الكلوي والوريد لإنشاء قناة. ثم مرر خياطة حريرية مضفرة بحجم 6-0 حول الأوعية لربطهما معا.
- قطع الشريان الكلوي والوريد المسدودين بالقرب من الكلية. قم بإزالة الكلية مع الأنسجة الملتصقة المتبقية.
- أزل كرة القطن المستخدمة لحمل الكبد.
3. مراقبة تدفق الدم الكلوي باستخدام تصوير التباين بالليزر (LSCI) أثناء نقص التروية وإعادة تروية الدم
- شغل نظام LSCI وبرنامج الآلة المخصص.
- انقر على الصورة الأصلية والمعاينة لعرض الصورة الخام غير المعالجة لمجال الجراحة.
- غير وضع الفئران، حافظ على التخدير باستخدام 1٪ إيزوفلوران يعطى بسرعة 600 مل/دقيقة عبر مخروط أنف، وضبط تكبير الكاميرا أثناء مراقبة الصورة الأصلية لتحقيق رؤية واضحة للكلية المستهدفة.
- انقر على العرض المتزامن لعرض صورة تدفق الدم في الوقت الحقيقي. اضبط التكبير على 2.5× واختر ضبط تدفق الدم التلقائي لتحسين الصورة. ثم قم بتثبيت معايير تدفق الدم. بالإضافة إلى ذلك، قم بضبط إطار واحد من الصورة كل 5000 مللي ثانية.
ملاحظة: يمكن استخدام كرات القطن المبللة لضمان استقرار الكلية وإبعاد الأعضاء والأنسجة المحيطة عنها، مما يعزز التمييز بين منطقة الكلى والخلفية. - اضبط حجم معلمات المساحة المربعة إلى 112 ورتب المساحات المربعة الخمس بشكل موحد في اتجاه ثابت على منظور الكلى. انقر على تسجيل الصور في الوقت الحقيقي والتسجيل لبدء تسجيل بيانات تدفق الدم.
ملاحظة: يقوم الجهاز تلقائيا بتسجيل وحدات تدفق الدم بالليزر (LSPU)، والتي تمثل وحدات تدفق الدم في الوقت الحقيقي في مؤشرات العائد ويمكن استخدامها للتحليلات. خلال عملية الكشف، قد تتسبب التغيرات المتعلقة بالحركة أو البيئة المرتبطة بالتنفس في تغير مجال الرؤية. إذا أشار النظام إلى ذلك في منطقة الكشف، يجب إيقاف تسجيل التيار. ثم انقر على تسجيل الصورة في الوقت الحقيقي وسجل مرة أخرى. - بعد تسجيل خط أساس لمدة 30 دقيقة، افصل الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الكلوية اليسرى. استخدم الملقط الدموي للإمساك بمشبك دقيق ووضعه عبر الشريان الكلوي الأيسر والوريد بالقرب من الهيلوم. استمر في المراقبة الفورية لمدة 30 دقيقة أخرى.
- حرر المشبك الدقيق لبدء إعادة التروية. راقب وسجل تعافي تدفق الدم الميكرووعائي الكلوي في الوقت الفعلي.
- بمجرد مراقبة إعادة تروية الدم لمدة لا تقل عن 60 دقيقة، توقف عن المراقبة وخيط الشق البطني بخياطة حريرية مضفرة بحجم 7-0.
4. التعافي والرعاية بعد العملية
- أعط السوائل مع حقنة ملحية داخل الصفاق بمقدار 1 مل من محلول ملحي لمنع الجفاف بعد الجراحة.
- أبق الفأرة على وسادة التسخين. راقب الفئران بعناية حتى تستعيد وعيها وتبدو متيقظة وتتمكن من استعادة توازنها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هدف هذا المقال إلى اكتشاف التغيرات في تدفق الدم الكلوي أثناء AKI الناتج عن الأشعة تحت الحمراء. لذلك، استخدمنا نموذج فأر شائع يتضمن استئصال الكلى الأيمن (الشكل 1A) يليه إجراء IR على الجانب المقابل للكلية (الشكل 1B). نظرا لأن مراقبة تدفق الدم في الوقت الحقيقي أثناء الالتهاب كان مطلوبا، فقد تم إجراء جميع التعديلات على الفئران في منطقة الجهاز طوال العملية (الشكل 1C).
بعد تحدي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا العمل تطبيق نظام LSCI لتصوير ديناميكيات تدفق الدم الميكرووعية الكلوية في الوقت الحقيقي وعالي الدقة أثناء التعرض لأشعة الدم الداخلي في الفئران. يقدم البروتوكول ميزة كبيرة مقارنة بقياسات النقاط النهائية التقليدية أو الطرق ذات الدقة المكانية المحدودة، مثل LDF، من خلال توفير خريطة تروية ثنائية الأبعاد تلتقط التباين الإقليمي داخل الدورة الدموية الدقيقة للكلى. تعد كفاءة وقابلية استخدام LSCI للمراقبة الفورية أثناء العمليات من نقاط القوة الرئيسية لهذه الطريقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج البحث الجماعي المبتكر لجامعات مقاطعة قوانغدونغ (2022KCXTD009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| علبة امتصاص (للتخدير) | شركة شنتشن لايوي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، الصين | 10-0210 | |
| الكحول، الطب (75٪) | هينغليا، شينجيانغ، الصين | لا يوجد | مطهر الجلد |
| جهاز تبخير مخدر | منتصف العلامة | https://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer | |
| عواد القطن | شركة تشينغداو هاينوو للهندسة البيولوجية المحدودة، الصين | https://www.hainuocn.com/index/detail/448.html | |
| كريم إزالة الشعر | VEET | https://www.veet.com.cn/jingchun/whx | |
| ضمادة الشاش | شركة وينر الطبية المحدودة، شنتشن، الصين | https://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html | |
| وسادة التدفئة | شركة رينتشيو دينغشنغ لمعدات التدفئة المحدودة، الصين | HD-1902 | للحفاظ على درجة حرارة الجسم |
| محلول يودوفور | تايشينكانغ، جينشيان، الصين | https://www.11467.com/nanchang/co/120661.htm | مطهر الجلد |
| إيزوفلوران | شركة RWD لايف ساينس المحدودة، الصين | R510-22-10 | مخدر استنشاق |
| نظام تصوير التباين بالليزر (LSCI) | شركة هوبي شونوي لتقنية البصريات الإلكترونية، الصين | سيم BFI HR PRO | نظام MoorFLPI-2 المكافئ |
| ميلوكسيكام | شركة تشيلو لمنتجات صحة الحيوان المحدودة، الصين | https://en.qiludb.com/companion_animal/500.html | 0.2 ملغ لكل كجم من وزن الجسم؛ مسكنات الألم |
| الميكرو-مشبك | مجموعة شنغهاي الطبية للأدوات المحدودة، الصين | W40140 | المشبك الوعائي |
| محلول ملحي عادي (كلوريد الصوديوم 0.9٪) | شركة سيزن للأدوية، الصين | https://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62 | |
| خياطة مضفرة بالحرير (6-0) | شركة يانغتشو فودا للأجهزة الطبية، الصين | http://www.fdma.com.cn/products_detail/12.html | لربط الأوعية |
| خياطة مضفرة بالحرير (7-0) | شركة ويغو تيرومو (ويهاي) للمنتجات الطبية، الصين | https://www.weigaoholding.com/ | لإغلاق الجرح، الغرز الجراحية غير القابلة للامتصاص باستخدام الإبرة المنحنية |
| حقنة (1 مل) | شركة شاندونغ أندي للأجهزة الصحية المحدودة، الصين | https://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.html | بإبرة 26 جيلون |
| تريبروموإيثانول | سيغما-ألدرتش | T48402-100G | محلول 2.5٪؛ مخدر قابل للحقن |
المراجع
- Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. Renal ischaemia-reperfusion injury. Br J Surg. 83 (2), 162-170 (1996).
- Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. Acute renal failure: Definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy. J Clin Invest. 114 (1), 5-14 (2004).
- Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
- Legrand, M., Mik, E. G., Johannes, T., Payen, D., Ince, C. Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney. Mol Med. 14 (7-8), 502-516 (2008).
- Zhu, X., et al. Ischemic preconditioning prevents in vivo hyperoxygenation in postischemic myocardium with preservation of mitochondrial oxygen consumption. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1442-H1450 (2007).
- Coremans, J. M. C. C., et al. Pretransplantation assessment of renal viability with NADH fluorimetry. Kidney Int. 57 (2), 671-683 (2000).
- Fitzgerald, J. T., Demos, S., Michalopoulou, A., Pierce, J. L., Troppmann, C. Assessment of renal ischemia by optical spectroscopy. J Surg Res. 122 (1), 21-28 (2004).
- Raman, R. N., Pivetti, C. D., Matthews, D. L., Troppmann, C., Demos, S. G. A non-contact method and instrumentation to monitor renal ischemia and reperfusion with optical spectroscopy. Opt Express. 17 (2), 894(2009).
- Gorbach, A. M., et al. Assessment of critical renal ischemia with real-time infrared imaging. J Surg Res. 149 (2), 310-318 (2008).
- Ietto, G., et al. Indocyanine green angiography for quality assessment of the kidney during transplantation: An outcome predictor prospective study. Transplant Proc. 53 (6), 1892-1896 (2021).
- Bezemer, R., et al. Real-time assessment of renal cortical microvascular perfusion heterogeneities using near-infrared laser speckle imaging. Opt Express. 18 (14), 15054(2010).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Ann Biomed Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Heeman, W., et al. Real-time visualization of renal microperfusion using laser speckle contrast imaging. J Biomed Opt. 26 (05), 056004(2021).
- Briers, J. D. Laser speckle contrast analysis (LASCA): A nonscanning, full-field technique for monitoring capillary blood flow. J Biomed Opt. 1 (2), 174(1996).
- Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2010).
- Stewart, C. J., et al. A comparison of two laser-based methods for determination of burn scar perfusion: Laser Doppler versus laser speckle imaging. Burns. 31 (6), 744-752 (2005).
- Tamaki, Y., Araie, M., Kawamoto, E., Eguchi, S., Fujii, H. Noncontact, two-dimensional measurement of retinal microcirculation using laser speckle phenomenon. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (11), 3825-3834 (1994).
- Kazmi, S. S., Richards, L. M., Schrandt, C. J., Davis, M. A., Dunn, A. K. Expanding applications, accuracy, and interpretation of laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (7), 1076-1084 (2015).
- Ambrus, R., et al. Evaluation of gastric microcirculation by laser speckle contrast imaging during esophagectomy. J Am Coll Surg. 225 (3), 395-402 (2017).
- Knudsen, K., et al. Laser speckle contrast imaging to evaluate bowel lesions in neonates with NEC. Eur J Pediatr Surg Rep. 5 (1), e43-e46 (2017).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neurosci. 23 (1), 80(2022).
- Hren, R., Brezar, S. K., Marhl, U., Sersa, G. Laser speckle contrast imaging of perfusion in oncological clinical applications: A literature review. Radiol Oncol. 58 (3), 326-334 (2024).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
