مقالة منهجية

منصة ثلاثية الأبعاد لزراعة العظام باستخدام الخلايا العظمية البشرية والمصفوفة خارج الخلايا غير المنفصلة لنمذجة أمراض الجهاز العضلي الهيكلي

DOI:

10.3791/70782

⸱

يونيو 23, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Facultad de Odontología, Universidad San Sebastián, 2Laboratorio de Biotecnología y Biofarmacia, Departamento de Fisiopatología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, 3Hospital Traumatológico de Concepción, Servicio Salud Concepción

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تصنيع هياكل عظمية ثلاثية الأبعاد باستخدام خلايا عظمية بشرية مدمجة في هيدروجيلاتين ميثاكريلاتي (GelMA) مع مصفوفة خارج خلايا مفككة الخلية. الطريقة منخفضة التكلفة، قابلة للتوسع، ومتوافقة مع المعدات المختبرية الأساسية، مما يوفر منصة ترجمية لدراسة عمليات أمراض الجهاز العضلي الهيكلي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب نمذجة أمراض الجهاز العضلي الهيكلي مثل هشاشة العظام منصات في المختبر تعكس بدقة ميزات رئيسية في بيولوجيا العظام البشرية. توفر أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد التقليدية رؤى قيمة حول تفاعلات الخلية والخلية ومصفوفة، لكن اعتمادها على مواد باهظة الثمن أو الطابعات الحيوية أو البنية التحتية المتخصصة يحد من اعتمادها الأوسع. هنا، نصف بروتوكولا قويا وفعالا من حيث التكلفة لتوليد تراكيب عظمية ثلاثية الأبعاد باستخدام الخلايا العظمية المشتقة من الإنسان المدمجة في هيدروجيل GelMA، مع إضافة مصفوفة خارج خلايا مفككة الخلايا (dECM) تم الحصول عليها من رؤوس عظم الفخذ المتبرع بها. تتيح هذه الطريقة المعتمدة على التوصيل من تصنيع هياكل عظمية قابلة للتكرار عند درجة حرارة فسيولوجية (37 درجة مئوية)، باستخدام معدات مختبرية قياسية.

تحافظ الهياكل الناتجة على قابلية عالية للجدوى وسلامة هيكلية، تدعم التطبيقات اللاحقة مثل التصوير المناعي الفلوري والاختبارات الجزيئية. يعزز دمج dECM المستخرج من المريض من الصلة الانتقالية من خلال عكس إعادة تشكيل العظام البشرية وتطور المرض بشكل أفضل. يوفر هذا النهج منصة سهلة الوصول وقابلة للتوسع لاختبار المخدرات، والطب التجديدي، والدراسات الميكانيكية لبيولوجيا العظام. بشكل عام، يقدم البروتوكول بديلا عمليا لتقنيات الطباعة الحيوية عالية التكلفة ويمكن تكييفه بسهولة مع مصادر dECM الخاصة بالأنسجة الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تهدف هذه الطريقة إلى إنشاء منصة فعالة من حيث التكلفة وقابلة لتكرار زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لنمذجة أمراض الجهاز العضلي الهيكلي، بما في ذلك هشاشة العظام، من خلال دمج GelMA مع dECM المستخرج من أنسجة عظم الإنسان. تمكن هذه الاستراتيجية من توليد تراكيب شبيهة بالعظام تحاكي البيئة الفسيولوجية الدقيقة بشكل أقرب مقارنة بالثقافات ثنائية الأبعاد التقليدية، مما يدعم دراسة تفاعلات الخلية والخلية ومصفوفة الخلية تحت ظروف ذات صلة بيولوجية1. استخدام الخلايا العظمية المشتقة من المريض وإزالة الحساسية المبكرة السريرية من رؤوس الفخذ يعزز القيمة الانتقالية ويوفر رابطا عمليا بين التجارب في المختبر واحتياجات البحث السريري2.

تم تطوير هذه الطريقة لمعالجة القيود الرئيسية لأنظمة الزراعة والتصنيع الحيوي ثلاثية الأبعاد الحالية، والتي غالبا ما تتطلب طابعات حيوية، أو مواد حيوية مملوكة لك، أو مستهلكات باهظة الثمن (مثل Matrigel)، مما يحد من إمكانية الوصول في العديد منأنظمة 3,4. علاوة على ذلك، غالبا ما تفشل الهيدروجيلات الصناعية في إعادة تلخيص التعقيد الكيميائي الحيوي لمصفوفة الخلايا الخارجية للعظام المعدنية أو سلوك الخلايا العظمية المقيمة5. على النقيض من ذلك، يدمج هذا البروتوكول dECM المستخرج من العظام البشرية، مع الحفاظ على المحتوى المعدني، والبروتينات الأصلية، وجزيئات الإشارات مع تجنب متطلبات البنية التحتية المرتبطة بتقنيات التصنيع الإضافي6.

يوفر الجمع بين GelMA وdECM عدة مزايا. يدعم جيل إم إي التصاق الخلوي، وقابلية البقاء، والتمايز، ويمكن معالجته عند 37 درجة مئوية، مما يمكن من تغليف الخلايا دون الحاجة إلى معدات متخصصة. يزيد الربط المتقاطع باستخدام مصادر الأشعة فوق البنفسجية منخفضة التكلفة (365 نانومتر) من إمكانية الوصولأكثر 7. تثري مكملات dECM التركيب بإشارات خاصة بالأنسجة التي لا توجد في البدائل الصناعية، مما يحسن التوافق مع العظام ويسهل الفحوصات اللاحقة مثل التألق المناعي والتحليل الجزيئي8.

تتماشى هذه الطريقة مع الجهود الحالية لتطوير نماذج عظمية ذات صلة بالبشر تقلل الاعتماد على الدراسات الحيوانية، التي غالبا ما تكون دقتها في الترجمة محدودة بالفروق بين الأنواع 1,9,10. يتوافق البروتوكول مع مبادئ 3Rs11، ويمكن تكييفه لتوليد تراكيب باستخدام أنظمة dECM خاصة بالأنسجة الأخرى، مما يوسع التطبيقات المحتملة لتشمل هندسة الغضاريف والجلد والأنسجة القلبيةالدموية 12.

بشكل عام، توفر هذه التقنية منصة سهلة الوصول وقابلة للتوسع لدراسة بيولوجيا العظام في الحالات الفسيولوجية ذات الصلة. توافقه مع البنية التحتية المختبرية الروتينية وقدرته على دمج عينات سريرية بشرية يجعله مناسبا بشكل خاص للمجموعات البحثية الأكاديمية والمستشفيات. تدعم هذه الطريقة ليس فقط منصة لمزيد من الدراسات العظمية لعمليات العظام، بل يمكن أن تكون أيضا نقطة انطلاق لتطبيقات أكثر ترجمة في الطب التجديدي والتطوير العلاجي الشخصي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات العلمية في خدمة كونسيبسيون الصحية. تم الحصول على نسيج عظمي بشري من رؤوس عظم الفخذ التي تبرع بها المرضى الذين خضعوا لجراحة استبدال الورك في مستشفى الإصابات في كونسيبسيون، تشيلي، بعد موافقة مكتوبة مستنيرة. تم تخزين العينات عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام. جميع الإجراءات امتثلت للإرشادات المؤسسية للاستخدام الأخلاقي للأنسجة البشرية في الأبحاث. تم الحصول على جميع أنسجة عظم الإنسان من رؤوس عظم الفخذ التي تبرع بها المرضى في مستشفى الصدمات في كونسيبسيون، تشيلي، بعد موافقة مستنيرة وبموافقة لجنة الأخلاقيات العلمية في خدمة كونسيبسيون الصحية. جميع الإجراءات تلتزم بالإرشادات المؤسسية لاستخدام الأنسجة البشرية.

1. تخليق GelMA

  1. قم بإذابة 10 جرام من الجيلاتين من النوع A A في 100 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS، pH 7.5) عند 60 درجة مئوية تحت تحريك مستمر.
  2. خفض درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية وأضف 5 مل من أنهيدريد الميثاكريليك بمعدل 0.5 مل/دقيقة مع التحريك الخفيف لمدة 1–3 ساعات.
  3. قم بتخفيف خليط التفاعل 5× مع تسخين PBS مسبقا عند 40 درجة مئوية لإيقاف التفاعل.
  4. قم بتحليل المحلول باستخدام غشاء بقوة 12–14 كيلو دالتون مقابل 3–5 لتر من الماء المقطر عند 40 درجة مئوية لمدة 5–7 أيام، مع استبدال الماء يوميا.
    ملاحظة: (خطوة حاسمة) تأكد من استبدال الماء يوميا بالكامل لإزالة أنهيدريد الميثاكريلك غير المتفاعل.
  5. قم بتحويل المحلول المحلل لمدة 24 ساعة وتخزين المحلول الليوفيلي GelMA عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

2. تحضير الهيدروجيل من GelMA

  1. حضر دفعات بحجم 10 مل من هيدروجل GelMA عند 5 أو 10 أو 15 مع نسبة الجهد الذهبي.
  2. قم بإذابة 0.5 أو 1.0 أو 1.5 جرام من GelMA المحمر بالليوفيل في 9.5 مل من الماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 50 درجة مئوية.
  3. برد المحلول إلى 37 درجة مئوية.
  4. أضف 0.5 مل من محلول البادئ الضوئي Irgacure 2959 (0.5 واط/فولت في الإيثانول المطلق).
  5. اخلط المحلول بلطف وحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يتم الترشيح المعقم عبر مرشح غشاء أسيتات السليلوز بحجم 0.22 ميكرومتر.

3. انفصال الخلايا العظمية

  1. تذيب رؤوس الفخذ تدريجيا حتى تصل إلى 25 درجة مئوية. اقطع كل رأس فخذ إلى نصفين ثم إلى قطع أصغر.
  2. اغمر القطع في ماء مقطر معقم عند 60 درجة مئوية وقم بتشغيل القطع لمدة 15 دقيقة (40 كيلوهرتز، بشكل مستمر).
  3. اغسل العينات في 300 مل من الماء المقطر المسخن مسبقا عند 60 درجة مئوية مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  4. الطرد المركزي عند 1850 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية. كرر خطوات الغسيل والطرد المركزي ثلاث مرات.
  5. تعقيم النسيج عن طريق السونيكيشن (40 كيلوهرتز، مستمر) لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية في محلول يحتوي على 3٪ بيروكسيد الهيدروجين و0.02٪ حمض بيروكسي أسيتيك.
  6. انقل النسيج إلى 300 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ ثم استخدم سونيكات (40 كيلوهرتز، مستمر) لمدة 10 دقائق عند 21 درجة مئوية.
  7. اغسل العينات مرتين بماء مقطر بسعة 300 مل، ثم اهز على 200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية، وجهاز الطرد المركزي عند 1850 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  8. أولا، قم بتجميد العظم مسبقا عند -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات، ثم قم بتجميد العظم المفكك للخلية لمدة 24 ساعة في قاعدة عريضة لضمان جفاف متساو وتجنب ارتفاع العينة المفرط عند 0.05 ملي بار عند -40 إلى -60 درجة مئوية.
    ملاحظة: (خطوة حرجة) تأكد من أن العينة لا تتجاوز ارتفاعها من 2–3 سم داخل الحاوية لمنع الليفوليبيا غير الكامل.

4. تحضير الجسيمات الدقيقة العظمية

  1. ضع شظايا العظام المفككة في قوارير إرلينماير بسعة 250 مل في محلول التعقيم وقم بالتجانس باستخدام متجانس حتى يتم الحصول على محلول أبيض موحد (الفيديو التكميلي 1).
  2. استخدم الطرد المركزي عند 1850 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية، تخلص من السوبرناتان، واغسل الحبيبة مرتين بماء مقطر بسعة 300 مل على حرارة 25 درجة مئوية تحت التحريك عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. أجر عملية طرد مركزية نهائية عند 1850 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  3. الليفيليز (0.05 ملبار عند -40 إلى -60 درجة مئوية) المادة الناتجة لمدة 48 ساعة وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. قم بطحن العظم القشري أو النخاعي المحمر ميكانيكيا باستخدام ملاط خزفي معقم حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم (الشكل 1).
  5. مرر المسحوق عبر شبكة أو منخل بحجم 200 ميكرومتر، ووزن المادة النهائية، وخزن عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: (خطوة حرجة) تأكد من أن المسحوق جاف تماما قبل الغربلة لمنع التجمع وعدم تحديد حجم الجسيمات بشكل غير دقيق.

الفيديو التكميلي 1: إجراء توحيد العظام. توحيد شظايا العظم المنزوعة باستخدام جهاز تجانس حتى يتم إنتاج تعليق أبيض موحد. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

figure-protocol-1
الشكل 1: تحضير الجسيمات الدقيقة العظمية. (أ) شظايا العظام المفككة بعد التجانس باستخدام متجانس OV5 وتخزينها عند -80 درجة مئوية. (B,C) ملاط خزفي معقم يستخدم لطحن العظم المفكك إلى مسحوق ناعم. (د) الجسيمات الدقيقة العظمية المفككة في النهاية بعد الغربلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. تصنيع جل العظام

  1. جهز 10 جرام مع نسبة جيلي ما عن طريق إذابة 1 جرام من جيلما في مياه منزوع الأيونات بسعة 9.5 مل عند درجة حرارة 50 درجة مئوية.
  2. قم بتبريد المحلول إلى 37 درجة مئوية وأضف محلول البادر الضوئي Irgacure 2959.
  3. حافظ على المحلول عند 37 درجة مئوية وقم بالترشيح المعقم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
  4. أضف جسيمات العظام الدقيقة المنعزلة للخلايا (DBMP) عند 1٪ مع الجهد الكهربائي.
  5. اخلط واستخدم الماصة للأعلى والأسفل بحذر، مع تجنب تكوين فقاعات، عند 40 درجة مئوية حتى يتم الحصول على تعليق متجانس لتكوين هلام العظم (BG).
  6. احتفظ بحرارة السكر عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    ملاحظة: (خطوة حرجة) حافظ على درجة حرارة الهيدروجيل فوق درجة حرارة التجل (≥37 درجة مئوية) قبل دمج الخلية لتجنب التصلب المبكر.

6. الزراعة الأولية للخلايا العظمية

  1. استخراج نخاع العظم والغسل الأولي
    1. استخراج وتفكيك نسيج نخاع العظم من داخل رأس الفخذ باستخدام أدوات جراحية معقمة (الشكل 2).
    2. انقل النسيج المفروم إلى طبق بترى معقم.
    3. غسل النسيج ثلاث مرات باستخدام وسط زراعة α-MEM مع محلول مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100 ميكروغرام/مل بنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستريبتومايسين، 0.25 ميكروغرام/مل أمفوتريسين).
    4. اشطف مرة واحدة بمحلول الملح المتوازن هانك (HBSS).
      ملاحظة: (خطوة حرجة) تقليل الوقت بين استخراج الأنسجة ومعالجتها للحفاظ على بقاء الخلايا.
  2. الهضم الإنزيمي
    1. حضن الأنسجة في محلول الكولاجناز النوع الأول لمدة 25 دقيقة عند حرارة 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف.
    2. اغسله ب HBSS.
    3. كرر الخطوات 6.2.1–6.2.2 مرتين إضافيتين (ثلاث عمليات هضم كولاجناز).
    4. حضن النسيج بحمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) بسعة 0.5 مللي مولار لمدة 25 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    5. اغسلي ب HBSS وكرري خطوة EDTA مرتين إضافيتين.
    6. قم بإجراء عملية هضم أخيرة من نوع الكولاجناز الأول (25 دقيقة عند 37 درجة مئوية)، تليها غسل HBSS.
      ملاحظة: (حل المشكلة) قد يؤدي الهضم غير الكامل إلى انخفاض إنتاج الخلايا؛ تمديد فترة الحضانة الإنزيمية بمقدار 5–10 دقائق إذا لزم الأمر.
  3. استعادة الخلايا والزراعة
    1. اجمع محلول الكولاجناز، وانقل الغسيل النهائي من HBSS إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل.
    2. الطرد المركزي بحرارة 1000 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 2 مل من α-MEM الكامل.
    4. قم بزرع تعليق الخلية في قارورتين من زراعة T75 واحتضن عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
      ملاحظة: استبدال وسط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى يتم تحقيق التقاء كاف (الشكل 3).

figure-protocol-2
الشكل 2: استخراج أنسجة نخاع العظم. (أ) رأس الفخذ المأخوذ من جراحة استبدال الورك، يظهر المنطقة النخاعية المستخدمة لعزل الخلايا. (ب) قطع عظم النخاع المفروم توضع في طبق بتري معقم قبل الهضم الإنزيمي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-3
الشكل 3: زراعة الخلايا العظمية الأولية. تلتصق الخلايا العظمية وتتكاثر في طبقة أحادية داخل T75 بعد العزل عن عظم النخاع البشري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

7. 3D زراعة الخلايا

  1. قم بتسخين كمية الهيدروجيل BG عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: (خطوة حاسمة) تأكد من أن منطقة العمل خالية من المسودات؛ التبريد يسرع التجلي المبكر.
  2. فصل الخلايا العظمية المزروعة وجهاز الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق في أنبوب بحجم 15 مل.
  3. أعد تعليق الحبيبة في 200 ميكرولتر من وسط الزراعة وامزجه مع الهيدروجيل BG للحصول على كثافة خلوية نهائية لا تقل عن 1000 خلية/ميكرولتر (ومن الآن فصاعدا يشار إليها بالحبر البيوي).
  4. استنشق 50 ميكرولتر من الحبر الحيوي باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر وحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى الترسب.
  5. بيبت 50 ميكرولتر من الحبر الحيوي لكل تركيب في كل بئر من صفيحة الزراعة (الفيديو التكميلي 2)؛ اترك حوالي 5 دقائق للتجلي الفيزيائي في درجة حرارة الغرفة (الشكل 4).
  6. تعرض كل بئر لأشعة فوق بنفسجية بعمق 365 نانومتر لمدة دقيقة واحدة لتحقيق الربط المتقاطع غير القابل للعكس (0.30 جول/سممربع).
  7. أضف وسط الزراعة وحضن الهياكل عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونللنقاط الزمنية المطلوبة. استخدم لوحة منفصلة لكل نقطة زمنية.

figure-protocol-4
الشكل 4: تحضير بناء زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. تتكون صفيحة البئر التي تحتوي على جيلما المحملة بالخلايا مباشرة بعد التوصيل وبعد الربط المتقاطع UV (365 نانومتر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فيديو تكميلي 2: تحضير هياكل ثلاثية الأبعاد محملة بخلايا. ترسيب خلطات خلايا الهيدروجيل في صفيحة ذات 12 بئر باستخدام تقنية توصيل بسيطة قبل الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

8. اختبار التوافق الحيوي

  1. التلوين الحي/الميت
    1. زراعة السقالات المحملة بالخلايا لفترات زمنية مرغوبة.
    2. اغسله بلطف باستخدام PBS معقم.
    3. حضن التركيبات لمدة 30 دقيقة في الظلام باستخدام محلول حي/ميت يحتوي على 0.2٪ إيثيديوم هوموديمر-1 (EthD-1) و0.05٪ كالسين AM في PBS.
    4. الصورة فورا باستخدام مجهر فلوري مع مرشحات للكالسين AM (~495/515 نانومتر) وEthD-1 (~495/635 نانومتر). مجموعات مرشحات فلوريسين إيزوثيوسيانات قياسية (FITC) ومرشحات تكساس ريد متوافقة مع كشف الكالسين AM وEthD-1 على التوالي.
    5. تحديد الخلايا الحية بواسطة التألق السيتوبلازمي الأخضر والخلايا الميتة بواسطة التألق النووي الأحمر.
      ملاحظة: يمكن معالجة الصور المستوية باستخدام ImageJ (فيجي). تم الحفاظ على العدسة الموضوعية، ووقت التعريض، والكسب، وشدة الإضاءة ثابتة لجميع العينات المقارنة، وتم تعديلها فقط لتجنب تشبع الإشارة. لتقليل سوء التفسير الناتج عن التألق الذاتي، تم الحفاظ على نفس إعدادات الاكتساب لجميع العينات داخل كل تجربة، وتم استخدام ملاحظات التحكم لهياكل الجسيمات الدقيقة في السقالات/العظم بدون خلايا للتعرف على نمط التألق الخلفي المرتبط بالمادة الحيوية. سمحت لنا هذه الضوابط بالتمييز بين الإشارة المشتقة من الجسيمات والتلوين الخلوي المستدير الحقيقي أثناء تفسير الصورة.
  2. القياس الكمية ب Alamarblue
    1. حضر محلول عمل بنسبة 5٪ من ألاماربلو في وسط كامل.
    2. احتضن السقالات في محلول alamarBlue لمدة 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO، محمية من الضوء.
    3. نقل 100 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى صفيحة ذات 96 بئر ثلاثية، بما في ذلك التحكم.
    4. قس التألق عند 360/40 نانومتر من الإثارة وانبعاث 460/40 نانومتر.
    5. تطبيع قيم الفلورة للضوابط لتحديد النشاط الأيضي النسبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل الخلايا العظمية الأولية بنجاح من رؤوس الفخذ البشرية وكان من الممكن اكتشافها في الزراعة بعد حوالي 5 أيام من الخلع. أظهرت الخلايا شكلا نجميا وشكلت شبكات مترابطة تميز شكل الخلايا العظمية، مما أكد العزلة الناجحة والارتباط والقدرة على البقاء (الشكل 5).

figure-results-1
الشكل 5: النشاط الأيضي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم البروتوكول المعروض طريقة سهلة الوصول وترجمية لتوليد تراكيب ثلاثية الأبعاد شبيهة بالعظام، مع معالجة القيود الرئيسية للأساليب الحالية مثل الاعتماد على الطابعات الحيوية المكلفة أو المصفوفات الخاصة13. من خلال دمج GelMA مع المصفوفة العظميةالخارجية 8 المنقطعة من خلايا الإنسان، يمكن تصنيع تراكيب ذات صلة فسيولوجية باستخدام معدات مختبرية قياسية فقط. تمكن هذه البساطة من التبني في بيئات محدودة الموارد مع الحفاظ على الإشارات الأساسية لدراسة آليات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتورة كارولينا ديلغادو من وحدة التشريح المرضي في جامعة كونسيبسيون على دعمها وتوفير الوصول إلى موارد المجهر.

يرغب المؤلفون في الشكر على الدعم المالي من المؤسسة الوطنية للتحقيقات وقوانين ANID VIU24P0041 و SUC260026.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959)Sigma-Aldrich410896-10Gبادئ ضوء لبلمرة الهيدروجيل
AlamarBlue لتحديد حيوية الخلايا InvitrogenDAL1100لتحديد حيوية الخلايا الكمية
Antibiotic-Antymycotic (100´) Gibco15240-062مكون وسط الثقافة
قارورة زراعة الخلايا (T75)SPL Life Sciences70075لزراعة الخلايا العظمية
كولاجيناز من النوع 1Gibco17100-017للتحليل الانزيمي لعينات العظام
أنبوب مخروطي، 15 ملSPL Life Sciences50015لتحضير الهيدروجيل
DarkDawn D15-365 nmDarkDawn-للربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية للهيدروجيل
DPBS، مسحوق، بدون كالسيوم، بدون مغنيسيومgibco21600069مذيب الهيدروجيل، مذيب مجموعة LIVE/DEAD
EDTA Disodium Salt 2-HIDWinklerED-0760للتحليل الانزيمي لعينات العظام
Eppendorf centrifuge 5702Eppendorf5702000010لتحضير الجزيئات الدقيقة للعظام
Ethanol absolute للتحليلSupelco1,00,98,32,511لإزالة الخلايا من العظام (مخفف إلى 70٪)، مذيب بادئ الضوء
مصل بقر مجمدGibcoA52567-01مكون وسط الثقافة
الجيلاتين من جلد الخنزيرSigma-AldrichG1890-500Gمكون الهيدروجيل
HBSS (10´)Gibco14185-052لغسل عينات نخاع العظام
L-Ascorbic acid 2-phosphateSigma-AldrichA8960-5Gمكون وسط الثقافة
مجموعة LIVE/DEAD لتحديد حيوية الخلايا/السمية الخلويةInvitrogenL3224لتحديد حيوية الخلايا/السمية الخلوية النوعية
MEM Alpha (1´)Gibco12571-063مكون وسط الثقافة
أنهيدريد الميثاكريليكSigma-Aldrich276685-500Gمكون الهيدروجيل
أنبوب ميكرو سنتريفوجCitotest4610-1844لتحضير أصباغ alamarBlue و LIVE/DEAD
NuncIon delta surface Thermoscientific150628لوحة 12 بئراً لزراعة العينات
OLYMPUS BX43 مصدر ضوء فلورسنت Olympus U- LH100HGEvidentU- LH100HGمصدر ضوء لتحليل الفلورسنت
RC-6 Plus centrifugeThermo Scientific Sorvall46910لإزالة الخلايا من العظام وتحضير الجزيئات الدقيقة للعظام
Synergy HTX multi mode readerBioTek Instruments-مقياس امتصاص
محقنة مع إبرةNIPROSY3-WN-R-03لمرشح الهيدروجيل
لوحة زراعة الأنسجة 96 بئراًJet BiofilTCP00109696 بئراً لتحليل حيوية الخلايا alamarBlue.
منظف بالموجات فوق الصوتيةVWE97043-958لإجراء صوتية لعينات العظام

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

3D Bone CultureHuman OsteocytesDecellularized Extracellular MatrixMusculoskeletal Disease ModelingGelMA HydrogelsBone RemodelingIn Vitro BoneImmunofluorescence ImagingBone Construct FabricationRegenerative Medicine
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة