علم الأدوية الشبكي والتحقق التجريبي لاستكشاف قشر السينامومي ضد نخر العظم الناتج عن الستيرويدات في رأس الفخذ

ملخص

تهدف هذه الدراسة إلى استكشاف الآليات المحتملة لقشرة سينامومي في علاج نمار العظم في رأس الفخذ من خلال دمج علم الأدوية الشبكي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، والتجارب الحيوانية.

الملخص

يسبب التكروس العظمي الناتج عن الستيرويد في رأس الفخذ (SONFH) ألما شديدا ومحدودية الحركة، مما يؤثر بشكل كبير على جودة حياة المرضى. لقد ثبت أن Cinnamomi Cortex (CC) يخفف هذه الحالة بشكل فعال، ومع ذلك لا تزال آلية عمله غير واضحة. تهدف هذه الدراسة إلى تحديد المركبات الفعالة للكربونات الكيميائية واستكشاف آلياتها في SONFH. تم فحص المكونات النشطة باستخدام قواعد بيانات HERB 2.0 وPubChem وSwissADME، وتم التنبؤ بأهدافها المقابلة باستخدام قاعدة بيانات التنبؤ بالأهداف السويسرية. تم تحديد أهداف SONFH من خلال تقاطع الأهداف من قواعد بيانات GEO وDisGeNET وGeneCards وOMIM مع الأهداف المتعلقة بالمركبات المختلفة. تم بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) باستخدام قاعدة بيانات STRING، وأجريت تحليلات إثراء GO وKEGG عبر قاعدة بيانات DAVID. تم التحقق من صحة أكثر التفاعلات الواعدة بين المركبات والهدف من خلال محاكاة الالتحام الجزيئي (MD) والديناميكا الجزيئية. حدد الباحثون 563 هدفا محتملا، بما في ذلك 61 هدفا مرتبطا ب SONFH، مع وجود AKT1 وHIF-1α وSTAT3 كعقد مركزية. سلط تحليل إثراء KEGG الضوء على مسار إشارة HIF-1α كآلية رئيسية. علاوة على ذلك، أظهرت التجارب الحيوانية أن الجزء النشط من CC خفف بشكل فعال من الضرر الهيكلي لرأس الفخذ في نموذج فأر باستخدام SONFH. تشير النتائج إلى أن ال CC قد يحسن SONFH من خلال تنسيق التكيف مع نقص الأكسجين وتنظيم تكوين الأوعية الدموية وتكوين العظام.

المقدمة

التكرول العظمي الناتج عن الستيرويد في رأس الفخذ (SONFH) هو اضطراب عظمي حرج في المفاصل، ينجم عن اضطراب أو انخفاض تدفق الدم إلى رأس الفخذ من عدة^{أجزاء 1}. يؤدي موت خلايا العظم ومكونات نخاع العظم إلى تلف هيكلي داخل رأس الفخذ وضعف وظيفي في مفصل الورك². سريريا، عادة ما يظهر المرضى بألم في الورك وحركة^{محدودة 3}. بدون علاج فعال، يتطور 80٪ من مرضى SONFH إلى انهيار رأس الفخذ، مما يتطلب استبدال كامل للورك⁴. يضع ضغطا نفسيا شديدا وعبء اقتصادي ثقيلا على المرضى⁵. توصي الممارسات السريرية باستخدام مزيج من مضادات التخثر، وأدوية تحلل الفيبرينو، وموسعات الأوعية، وأدوية خفض الدهون لعلاج SONFH، والتي أظهرت بعض الإمكانات السريرية لكنها عموما محدودة الفعالية العلاجية⁶.

لقد أظهر الطب الصيني التقليدي (TCM) تأثيره الإيجابي بشكل متزايد في علاج SONFH⁷. يظهر طب الطب الصيني الصيني إمكانات في تخفيف الأعراض، والسيطرة على الأمراض، وتحسين حركة المفاصل وجودة حياة المرضى⁸. سريريا، تم استخدام الكولبوك العقدي ومكوناته بشكل واسع في تحسين SONFH، مما أظهر فعالية ملحوظة⁹. العديد من المواد الفعالة حيويا الموجودة في الكربون الكيميائي لها مجموعة متنوعة من التأثيرات البيولوجية، بما في ذلك خصائص مضادة للالتهابات، مضادة للأكسدة، تعزز تكوين الأوعية، وتحسين الدورة الدموية الدقيقة¹⁰. أثبتت أبحاث سابقة في هندسة أنسجة العظام والتمثيل الغذائي أن السينامالديهايد، وهو مكون نشط رئيسي في الكلبوكس القلبي، يمكنه تعديل مسارات الإشارات المتعلقة بإعادة تشكيل العظام^. أشارت الدراسة الأولية إلى أن حبوب يوغوي (YGPs) لديها إمكانات علاجية ل SONFH من خلال تعزيز تكوين الأوعية الدموية وتعزيز الاستجابات الالتهابية^. باعتباره الدواء السيادي في YGPs، يمكن للCC تدفئة اليانغ والاستفادة من الطاقة وتحرير خطوط الطول، مما ينتج تأثيرات علاجية مفيدة على SONFH¹³. ومع ذلك، لا تزال الآليات الدقيقة وراء فعاليته غير واضحة. توضيح الشبكة التنظيمية متعددة الأهداف التي يستخدمها CC لتحسين SONFH لن يساعد فقط في فهم طبيعته الدوائية، بل سيشجع أيضا على استخدامه السريري المعقول وخلق تحسينات ذات صلة. دمج المعلوماتية الحيوية مع علم الأدوية الشبكي يوفر نهجا فعالا لتوضيح آليات العمل¹⁴.

يمكن لعلم الأدوية الشبكي تحديد المكونات الحيوية النشطة في الأعشاب والتنبؤ بالارتباطات بين هذه المكونات الدوائية وأهداف الجينات¹⁵. يستخدم MD للتحقق من التفاعلات المرتبطة بين المركبات الفعالة المرشحة والأهداف العلاجية الرئيسية. تستخدم الديناميكا الجزيئية ميكانيكا نيوتن لتقييم استقرار ومرونة ارتباط مستقبلات الرابطة من خلال محاكاة الحركة¹⁶. قام المؤلفون بدراسة شاملة في التأثيرات المحتملة للكثب الكرسي على SONFH باستخدام محاكاة علم الأدوية الشبكي، والطب المعالج، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية. توفر النتائج مرجعا للأبحاث المتعمقة المستقبلية حول الأساس الديناميكي الدوائي للمادة والآلية في CC لتحسين SONFH. يظهر مخطط الدراسة في الشكل 1.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية في جامعة الطب الصيني في تشجيانغ (IACUC-20240708-22) وامتثلت لدليل العناية واستخدام الحيوانات المخبرية الصادر عن المعاهد الوطنية للصحة. في هذه التجربة، تم استخدام عشرين فأرا أنثى عمرها 10 أسابيع من نوع C57BL/6J تزن من 20 إلى 22 جرام. تم الحصول على هذه الفئران من مركز الحيوانات في جامعة تشجيانغ الطبية الصينية. راجع جدول المواد للحصول على قائمة بجميع المواد والمعدات والبرمجيات المستخدمة في هذا البروتوكول.

فحص المركبات النشطة وأهداف CC
تم تحديد المركبات الكيميائية للكربونات الكيميائية باستخدام عشبة 2.0¹⁷ مع الكلمة المفتاحية "CC". تم تصفية المواد الكيميائية التي لا تحتوي على معرف PubChem أو بنفس المعرف. ثم دمج وإزالة النسخ المكررة للحصول على المواقع المستهدفة المقابلة ل CC. قم بإجراء فحص أولي باستخدام قاعدة بيانات PubChem¹⁸ بناء على قاعدة ليبينسكي الخمسة (Mw ≤ 500، miLogP ≤ 5، nOHNH ≤ 5، nOH ≤ 10)¹⁹. يستخدم المؤلفون قاعدة بيانات PubChem لتحديد تمثيل SMILES لكل مركب كيميائي. باستخدام قاعدة بيانات SwissADME، يختار المؤلفون المركبات التي تقيد امتصاص الجهاز الهضمي "العالي" وقيم ≥2 "نعم" في تقييم الشبه الدوائي²⁰. استخدم قاعدة بيانات توقعات الأهداف^{السويسرية 21} لاستخراج البروتينات المستهدفة التي لديها احتمال أعلى من الصفر. ثم قم بدمج وإزالة النسخ المكررة للحصول على المواقع المستهدفة التي تتوافق مع CC.

تجميع الأهداف الجينية المرتبطة ب SONFH
تم الحصول على أهداف متعلقة ب SONFH من قواعد البيانات: قاعدة بيانات DisGeNET²²؛ قاعدة بيانات GeneCards²³؛ قاعدة بيانات OMIM²⁴، وقاعدة بيانات GEO²⁵. قام المؤلفون بتنزيل وإزالة النسخ من جينات SONFH من قواعد بيانات OMIM وDisGeNET. تم الحصول على ما مجموعه 233 هدفا مرتبطا بالأمراض من قاعدة بيانات GeneCards بعد إزالة التكرارات. جميع الأهداف المسترجعة كانت درجات الصلة تزيد عن 0 وتم تضمينها في التحليلات اللاحقة. كان الحد الأدنى لدرجة الصلة بين الجينات المسترجعة 6.48. تم الحصول على جينات معبرة تفاضليا (DEGs) مرتبطة ب SONFH من سلسلة GSE123568 على منصة GPL15207 في قاعدة بيانات GEO. تم تصحيح تأثيرات الدفعات باستخدام حزمة ليما في R، وتم تحديد الجينات المعبر عنها تفاضلا (DEGs) بمعايير |logFC| > 1 وP < 0.05²⁶. تم استخدام حزمة ggplot2 لإنشاء مخطط بركاني لتصوير توزيع DEGs، وتم إنتاج خريطة حرارية لعرض النتائج. تم إنشاء مكتبة أهداف مرض SONFH عن طريق إزالة الأهداف المكررة باستخدام حزمة Venn في R.

تأسيس شبكة PPI
استنادا إلى الأهداف المتوقعة للمكونات النشطة للأهداف المرتبطة ب CC وSONFH، تم إنشاء مخطط فين بواسطة فيني 2.1.0²⁷. بهدف الحصول على بيانات PPI، استورد المؤلفون الأهداف إلى قاعدة بيانات STRING²⁸. كان الحد الأقصى لمعيار الفحص الخاص بالكائن الحي هو "الإنسان العاقل" بمؤشر ثقة ≥0.4. استخدم المؤلفون Cytoscape 3.7.2 لتحديد الأهداف الرئيسية لشبكة PPI. تم استخدام مركزية الدرجة (DC) لفحص أهداف المفاتيح في شبكة PPI. مرشح المعاملات يكون أكثر من ضعف القيمة الوسيطة. وبهدف تحديد الأهداف الرئيسية بشكل أعمق، تم استخدام الإضافة إلى Cytoscape.

أجريت تحليلات إثرائية باستخدام قواعد بيانات أنطولوجيا جينية (GO) وقاعدة بيانات موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG)
تم تحليل الأهداف المشتركة ل CC و SONFH لتحليلات إثراء GO وKEGG من خلال قاعدة بيانات DAVID²⁹. لتصور أفضل 10 مصطلحات GO وأفضل 20 مسارا ل KEGG، تم استخدام Wei Sheng^{Xin 30} لرسم مخطط الفقاعات بنقطة الإثراء.

بناء الشبكة
تم توضيح الآليات الجزيئية للكربون الكرسي في تحسين SONFH من خلال شبكات مركب الأعشاب والهدف (H-C-T) والمركب-الهدف-المسار (C-T-P). وقد عرضت برامج Cytoscape 3.10.3 الشبكات. تم تطوير شبكة H-C-T باستخدام المركبات النشطة من CC وأهدافها المشتركة. ثم استخدم أداة تحليل الشبكة. لتعزيز فهم العلاقات بين المسارات والمركبات والأهداف، تم تنظيم أفضل 20 مسارا، إلى جانب أهدافها ومركباتها ذات الصلة، في شبكة C-T-P بواسطة Network Tools.

التحقق من MD
تم الحصول على الأهداف الأساسية: HIF-1α، STAT3، ESR1، AKT1، SRC، ERBB2، CASP3، وEGFR من تحليل PPI. تم البحث عن الهدف بواسطة قاعدة بيانات يونيبورت³¹ مع قيود البشر، وتمت مراجعتها من قبل قاعدة بيانات RCSB^{PDB رقم 32}. تم اختيار هياكل بروتينية بشرية ذات دقة عالية نسبيا. تم تحديد المكونات الفعالة من شبكة C-T-P. تم تحميل هياكلها ثلاثية الأبعاد المقابلة بصيغة mol2 من قاعدة بيانات PubChem. تم فتح كل ملف بتقنية Chem3D وتقليل الطاقة. ثم استخدم المؤلفون برنامج AutoDockTools³³ لإجراء عمليات الجفاف والهدرجة وحساب شحنات جاستايجر لبروتين المستقبل. تم الاحتفاظ بكل من الليغاندات والمستقبلات بصيغة PDBQT. استنادا إلى الموقع المكاني وقدرة الربط، يقيم المؤلفون جدوى واستقرار التنص. عبر جهاز AutoDock فينا، تم التنبؤ بصندوق شبكة الإرساء والجزيء الكبير. في هذا البحث، سمح لجميع الروابط القابلة للدوران للرابطة بالدوران بحرية، بينما تم ضبط المستقبلات على أنها صلبة. تشير درجة الالتحام إلى الترابط بين المستقبل والرابط؛ كلما كانت الدرجة أقل، زادت التقارب المرتبط. وفقا لهذا المبدأ، يختار المؤلفون التكوينات ذات الطاقة الارتباطية الأكثر ملاءمة لدراسة تفاعلات الربط بين الروابط والبروتينات. تم عرض النتائج البصرية بواسطة PyMOL.

محاكاة الديناميكا الجزيئية
تم إجراء محاكاة الديناميكا الجزيئية باستخدام GROMACS³⁴ مع حقل القوة CHARMM36. تم مركز مركب البروتين-الليغاند في صندوق محاكاة دوري مكعب بمسافة أدنى لصندوق المذاب تبلغ 1.0 نانومتر، وتم حل النظام باستخدام نموذج SPC216 المائي. تم تحييد النظام بإضافة مضادات Na⁺ و Cl⁻ المناسبة. تم إجراء تقليل الطاقة بشكل متسلسل باستخدام خوارزمية النزول الأكثر حدة تليها طريقة التدرج المزدوج لإزالة التلامسات الذرية غير المواتية. تم حساب التفاعلات الكهروستاتيكية طويلة المدى باستخدام طريقة شبكة الجسيمات إيوالد (PME) بمسافة قطع تبلغ 10 أنجلوست. تم تقييد جميع الروابط التساهمية التي تشمل ذرات الهيدروجين باستخدام خوارزمية LINCS. تم الحفاظ على درجة الحرارة عند 300 كلفن باستخدام منظم الحرارة V-rescale، وتم التحكم في الضغط عند 1 بار باستخدام باروستات بيريندسن مع اقتران متساوي الاتجاه. تم تطبيق قيود على الليجند بقوة ثابتة 1000 كيلوجولول⁻¹·^{نانومتر} ⁻2 خلال مرحلة التوازن. بعد تقليل الطاقة، تم تعديل النظام بمحاكاة 2 نانوثانية NVT و2 نانوثانية NPT، تلتها محاكاة ديناميكية جزيئية إنتاج بقيمة 100 نانوثانية مع خطوة زمنية 2-fs. تم تسجيل الإحداثيات الذرية كل 10 ثانية لتحليل المسار اللاحق.

التحقق التجريبي في نموذج فأر SONFH
الحيوانات ومؤسسة نموذج SONFH
تم الحصول على عشرين فأرا أنثى من نوع C57BL/6J، تبلغ أعمارها 10 أسابيع ويزن بين 20 إلى 22 جرام، من مركز الحيوانات في جامعة تشجيانغ الطبية الصينية. خضعت الفئران لفترة تأقلم مدتها 7 أيام في بيئة محكمة وحصلت على وصول غير مقيد إلى الطعام والماء. تم تخصيص جميع الفئران عشوائيا إلى المجموعات (عدد = 5 لكل مجموعة): مجموعة الضابطة، مجموعة SONFH، مجموعة SONFH + CC منخفضة الجرعة (CC-منخفضة، 7.5 جم/كغ/يوم)، ومجموعة SONFH + CC عالية الجرعة (CC-عالية، 15 جم/كغ/يوم). تم تأسيس نموذج SONFH كما هو موصوف سابقا. باختصار، تلقت فئران مجموعات SONFH وSONFH + CC-Low وSONFH + CC-High حقنتين وريديا من عداد الدهون (LPS؛ 20 ميكروغرام/كغ) في اليوم 0. بعد ذلك، تم إعطاء ثلاث حقن عضلية من ميثيل بريدنيزولون (MPS؛ 40 ملغ/كغ) بفواصل زمنية كل 24 ساعة، بدءا من 24 ساعة بعد حقن LPS. تم إعطاء مستخلص الأقراص الكيميائية للفئران في مجموعات العلاج يوميا عبر الفتحة الفموية لمدة 6 أسابيع، بدءا من يوم آخر حقنة MPS. تلقت فئران مجموعة الضابطة كميات مكافئة من المحلول الملحي في نقاط زمنية متوافقة.

جمع العينات والتحضير
في نهاية فترة العلاج التي استمرت 6 أسابيع، تم إعدام الفئران الرحيم. تم تشريح وحصاد رؤوس الفخذ الثنائية بعناية. لكل حيوان، كان رأس الفخذ الأيسر ثابتا لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية لإزالة الكالسية وتثبيت البارافين. تم تثبيت رأس الفخذ الأيمن ثم استخدامه مباشرة لفحص الميكرو-CT دون إزالة الكالسية.

التحليل النسيجي (تلوين ABH)
بعد إزالة الكالسية وتثبيت البارافين، تم صبغ أقسام رأس الفخذ باستخدام بروتوكول ألسيان بلو/هيماتوكسيلين (ABH) لتقييم تغيرات التعرج العظمي. لفترة وجيزة، تم صبغ المقاطع بلون أزرق ألسي بنسبة 1٪ (درجة حموضة 2.5) لمدة 30 دقيقة، ثم شطفها، ثم صبغت بمحلول هاريس هيماتوكسيلين. بعد الجفاف والتثبيت، تم تصوير الشرائح تحت مجهر ضوئي. تم إجراء قياس نخر العظم بواسطة مراقبين أعمى باستخدام برنامج ImageJ. تم حساب نسبة الفجوات الفارغة كأنها (عدد الفجوات الفارغة/إجمالي عدد الفجوات) × 100٪ في ثلاثة حقول عالية القدرة مختارة عشوائيا لكل عينة ضمن المنطقة تحت الغضروف الفرعية. تم تحديد نسبة النوى البيكنوتية بطريقة مماثلة.

تحليل التصوير المقطعي الدقيق المحوسب (Micro-CT)
تم تحليل البنية الدقيقة العظمية ثلاثية الأبعاد لرأس الفخذ باستخدام ماسح ميكرو-CT عالي الدقة. تم مسح العينات الثابتة بدقة 10 ميكرومتر (70 كيلو فولت، 114 ميكروأمبير). تم إعادة بناء وتحليل حجم كروي موحد (VOI) يشمل المنطقة الأساسية الحاملة للوزن باستخدام برنامج CTAn. تم قياس المعايير المورفومترية التالية: حجم العظم/الحجم الكلي (BV/TV)، سمك الترابيكولار (Tb.Th)، والفصل الترابيكوالي (Tb.Sp).

التلوين بالتوهج المناعي (IF)
لتقييم البيئة الدقيقة للعظم، تم إجراء صبغة فلورية مناعية على مقاطع البارافين. بعد سحب المستضدات وحجبها، تم حضانة الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الأرنب المضادة HIF-1α (1:200)، المضادة لALP الأرنبية (1:300)، ومضادة VEGF للأرنب (1:150). بعد الغسيل، تم حضن الأقسام بمزيج من الأجسام المضادة الثانوية المرافقة بالفلوروفور: IgG مضاد للأرانب من Alexa Fluor 488، وIgG مضاد للأرانب مع علامة Alexa Fluor 555. تم صبغ النوى بمادة DAPI. تم التقاط الصور باستخدام مجهر فلوري تحت إعدادات تعريض متسقة. تم قياس شدة التألق النسبية لكل علامة باستخدام برنامج ImageJ عبر ثلاثة حقول لكل عينة.

التحليل الإحصائي
تعرض جميع البيانات الكمية كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاه اختبار ما بعد الاختبار من توكي باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 9.0) لتحديد الدلالة الإحصائية بين المجموعات. تم اعتبار قيمة P أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تحديد المكونات النشطة والأهداف المتوقعة للتحكم المستمر وتطوير شبكة "H-C-T".
لاستكشاف آليات المكونات والأهداف الرئيسية للكبائن الكليشي في تحسين SONFH، استخدم المؤلفون قاعدة بيانات HERB 2.0 لتحديد جميع مكونات CC التي تم فحصها. تم العثور على 85 مركبا نشطا بيولوجيا محتملا من بين 209 مكونات نشطة مرشحة ل CC (الجدول التكميلي 1). باستخدام منصة التنبؤ بالأهداف السويسرية وإزالة المدخلات المكررة وغير الصالحة، تم الحصول على 563 هدفا مفترضا يتوافق مع هذه المكونات المحدودة (الجدول التكميلي 2). حدد المؤلفون المكونات النشطة والأهداف للتحكم السريع.

دراسة الآليات الجزيئية المشاركة في بداية وتطور SONFH وتحديد الأهداف المحتملة للعلامات الحيوية. حدد تحليل مجموعة البيانات GSE123568 في قاعدة بيانات GEO مستويات DEGs مرتبطة ب SONFH، بما في ذلك 207 جين مرفوع و216 جينا منخفضا. يظهر مخطط البراكين ل 425 DEG في الشكل 2A، بينما تعرض أنماط التعبير لأعلى 60 DEG مصنفة حسب مستوى التعبير كخريطة حرارية في الشكل 2B، مع انعكاس شدة اللون لقيم التعبير المحولة إلى لوغاريتم. قدمت قواعد البيانات DisGeNET وOMIM وGeneCards 711 هدفا مرتبطا ب SONFH. بدمج 425 نقطة DEG من قاعدة بيانات GEO، يتم ربط إجمالي 1136 هدفا ب SONFH. بعد القضاء على التكرارات، تم تأكيد 1115 هدفا مرتبطا ب SONFH، كما هو موضح في الشكل 2C. وقد أنشأ المؤلفون بشكل مبدئي مكتبة استهداف الأمراض ل SONFH.

لتحديد الأهداف والمكونات الأساسية، حدد تحليل تقاطع بين 563 هدفا من CC و1115 هدفا مرتبطا ب SONFH 61 هدفا شائعا (الشكل 3A والجدول التكميلي 3)، والتي تم إدخالها إلى Cytoscape 3.10.3 لبناء شبكة "H-C-T" (الشكل 3B). تكونت هذه الشبكة من 147 عقدة و413 حافة. أظهر التحليل الطوبولوجي أن (s)-4-نونونوليد (درجة:16)، إيزوهوموجينول (درجة:15)، أسيتات نيريل (درجة:14)، ميليلوتوكاربان A (درجة:14)، 3-ميثوكسي سينامالديهيد (درجة:13) أظهرت أعلى اتصال مع أهداف البروتين.

تطوير وتقييم طوبولوجي لشبكة مثبطات مضخة البروتون.
لاستكشاف أهداف CC في تحسين SONFH. تم استخدام Cytoscape 3.10.3 لعرض شبكة PPI بعد وضع 61 هدفا متطابقا في قاعدة بيانات STRING. كان هناك 463 حافة و60 عقدة في الشبكة. في الشكل 4A، تنتقل العقد في اللون والحجم من أفتح وأصغر إلى أغمق وأكبر، مما يشير إلى زيادة في الدرجة من المنخفضة إلى العالية. سهل الإضافة MCODE تجميع هذه الأهداف في وحدتين وظيفيتين (الشكل 4A)، من بينها المجموعة 1 تحتوي على 23 عقدة و216 حافة، بدرجة 19.636. لتوصيف بنية الشبكة بشكل أعمق، تم استخدام DC وBC وCC كمقاييس طوبولوجية. مع تعيين القيم الوسيطة لهذه المعلمات كنقاط قطع، حدد المؤلفون 8 أهداف نشطة (الشكل 4B). استخدم إضافة CytoHubba خوارزمية MCC لترتيب العقد، وتحديد أفضل 10 جينات. (الشكل 4C).

تحليل إثراء GO
لاستكشاف آليات CC في تحسين ONFH، تم إجراء تحليل إثراء GO على 61 هدفا محتملا، باستخدام BP وCC وMF. تم إثراء ما مجموعه 435 مدة من الشروط الحكومية، بما في ذلك 293 بدا من فئة البنات البريطانية، و41 مدة من الفئة المشتركة، و101 مدة من الفئة الأجنبية. تظهر هذه النتائج في الجداول التكميلية 4 و5 و6. يعرض الشكل 5A بصريا أفضل 10 مصطلحات غنية ب BP وCC وMF باستخدام مخطط فقاعي. أشارت النتائج إلى أن مصطلحات بلبورترال كانت مرتبطة بشكل رئيسي بنقل الإشارة، والتنظيم الإيجابي للنسخ بواسطة بوليميراز RNA II، والتنظيم السلبي لعملية الاستماتة، والتنظيم الإيجابي للنسخ المصمم على قالب DNA، والتنظيم السلبي للنسخ بواسطة بوليميراز RNA II. كشف التحليل أن مصطلحات MF كانت تتعلق بشكل رئيسي بارتباط البروتين، وارتباط الأيونات المعدنية، والارتباط بالبروتين المتطابق. أظهرت نتائج CC أن غالبية الأهداف كانت تقع بشكل رئيسي في السيتوبلازم والغشاء والغشاء البلازما.

تحليل KEGG
لتوضيح معلومات حول الآليات الكيميائية الحيوية المحتملة التي قد يحسن بها الكولبوك الكيميائي الكربوبي الكربوبي الخفيف الفائق السطحي، تم إجراء تحليل تخصيب مسار KEGG لتوضيح الآليات الكيميائية الحيوية التي قد يحسن من خلالها الكربون الكيميائي الكربوبي SONFH. باستخدام معيار الفحص P < 0.05 وFDR < 0.05، تم تحديد 48 إدخالا لإثراء KEGG (الجدول التكميلي 7). تم تصور أفضل 20 مسارا تم إثراؤها بشكل ملحوظ، والتي تم تحديدها بواسطة إثراء الطية والعد، باستخدام مخططات الفقاعات والشريط (الجدول 1، الشكل 5B و5C). باستخدام Cytoscape 3.10.3، تم إنشاء شبكة C-T-P تحتوي على 167 عقدة و589 حافة (الشكل 5D). ترتبط تأثيرات ال CC على SONFH بشكل رئيسي بعدوى فيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوزي، ومسار إشارة HIF-1، وتصلب الشرايين والدهون، كما تشير تحليلات GO الوظيفية وتحليل مسار KEGG.

التحقق من MD
لتقييم التفاعلات المحتملة بين المركبات الفعالة والأهداف الرئيسية، تم ربط المركبات العشرة من شبكة C-T-P، بما في ذلك أنثول، ميليلوتوكاربان A، أسيتات النيريل، حمض الكابريليك، الإيزوهوموجينول، 3-ميثوكسي سينامالديهيد، (s)-4-نونانوليد، ميريستين، بورنيول، وأسيتات السيناميل، مع الأهداف الرئيسية AKT1، HIF-1α، STAT3، ESR1، CASP3، SRC، وEGFR. تلخص النتائج الكاملة للالتحام لجميع أزواج المركب-الهدف في الجدول التكميلي 8، ويتم توفير معلومات مفصلة عن المركبات والأهداف ومعلمات الالتحام في الجدول التكميلي 9. يقدم الشكل 6 خريطة حرارية لتوزيع طاقة الربط.

بشكل عام، أظهرت عدة أزواج مركبة-مستهدفة تقاربات ارتباط مفضلة نسبيا، مع انخفاض قيم طاقة الارتباط إلى تفاعلات متوقعة أكثر استقرارا. ومن الجدير بالذكر أن نتائج الالتحام أظهرت تباينا واضحا في تقارير الارتباط بين المركبات والأهداف. أظهرت بعض المركبات، مثل ميليلوتوكاربان A، باستمرار تقارير ارتباط قوية نسبيا عبر عدة أهداف، بينما أظهرت أخرى تفاعلات أكثر اعتدالا أو أضعف، مما يشير إلى أن المركبات المختلفة قد تساهم بشكل غير متساو في التأثيرات الدوائية المتوقعة.

بالإضافة إلى ذلك، لوحظت أيضا تباين عبر الأهداف. على سبيل المثال، أظهرت بعض الأهداف مثل STAT3 وEGFR تقاربات ارتباط متوسطة أو ضعيفة نسبيا مع عدة مركبات، مع بعض القيم التي تقترب من -5.0 كيلو كالوري/مول مقارنة بأهداف مثل AKT1 أو SRC. يشير هذا النمط إلى أن ليس كل الأهداف الأساسية تعمل بالضرورة كشركاء ارتباط مباشرين عالي التقارف للمركبات المحددة وقد تلعب أدوارا تنظيمية غير مباشرة ضمن شبكة التفاعل. قد تكون هذه الاختلافات مرتبطة باختلافات في التوافق الهيكلي بين الليغاندات ومواقع ارتباط البروتين، بالإضافة إلى الخصائص الجوهرية للأهداف.

من بين الأزواج التي تم تقييمها، أظهر AKT1 أدنى طاقة ارتباط مع ميليولوكاربان A (-9.6 كيلو كالوري/مول)، مما يشير إلى تفاعل محتمل وإيجابي. يوضح الشكل 7 نمط الارتباط المتوقع لهذا المعقد. تحديدا، يشكل SER205 من AKT1 روابط هيدروجينية مع ميليولوتوكاربان A، أنثول، وميريستيسين. بالإضافة إلى ذلك، كان من المتوقع أن يشكل ميليلوتوكاربان A روابط هيدروجينية مع GLY309 من HIF-1α، وLEU438 وTHR440 من STAT3، وSER433 وARG412 من ESR1، وARG500 وGLU510 من SRC.

لتحديد المركبات المرشحة الممثلة، تم استخدام أدنى طاقة ارتباط لكل هدف، وتم تعيين عتبة طاقة ارتباط ≤-5.0 كيلو كالوري/مول للدلالة على تفاعلات مستقرة نسبيا. استنادا إلى هذه المعايير، تم تحديد ميليلوتوكاربان A، وأنثول، وميريستيسين كمركبات رئيسية محتملة. بشكل عام، أظهرت غالبية المكونات النشطة للكربون الكولومبي تفاعلات محتملة مع الأهداف العلاجية المختارة، مع بعض المركبات التي أظهرت اتجاهات ارتباط أقوى نسبيا عبر عدة أهداف. ومع ذلك، يجب ملاحظة أن MD هو نهج حسابي مبسط يوفر توقعات أولية للتفاعلات المحتملة وقد لا يأخذ في الاعتبار مرونة البروتين والبيئات البيولوجية المعقدة بشكل كامل. لذلك، يجب تفسير هذه النتائج بحذر، ولا تشكل التفاعلات المرصودة دليلا قاطعا على الارتباط المباشر.

محاكاة الديناميكا الجزيئية
لتقييم استقرار المجمعات بشكل أعمق، اختار المؤلفون مركبات AKT1-melilotocarpan A، HIF-1α-melilotocarpan A، وSTAT3-melilotocarpan A لمحاكاة الديناميكا الجزيئية. من بين الأهداف المتوقعة، تم اختيار STAT3 وHIF-1α لمحاكاة MD بناء على أدوارهما المركزية في شبكة مثبطات مضخة البروتون وأهميتهما البيولوجية لأمراض SONFH. أظهر STAT3 واحدة من أعلى درجات الاتصال في شبكة PPI، مما يشير إلى دور تنظيمي محتمل في مسارات الإشارة المتعددة. تم اختيار HIF-1α لأن تحليل إثراء KEGG حدد مسار إشارات HIF-1 كأحد أكثر المسارات ارتباطا بتكوين الأوعية الدموية وتكيف نقص الأكسجين في تحمار العظم.

في الوقت نفسه، ركز المؤلفون على AKT1 كهدف تمثيلي بسبب درجات الالتحام القوية وعلاقتها المباشرة بالخصائص المرضية ل SONFH، لا سيما تكوين الأوعية الدموية الناتج عن نقص الأكسجين وتجديد العظام. نظرا لمحدودية الموارد الحاسوبية، تم اختيار ثلاثة مجمعات تمثيلية لمحاكاة MD التفصيلية، وهي استراتيجية شائعة في دراسات المحاكاة الجزيئية القائمة على علم الأدوية الشبكي. يقيم متوسط انحراف الجذر التربيعي (RMSD) بشكل فعال الاستقرار التكويني لمركبات البروتين-الرابط، حيث تشير القيم المنخفضة إلى استقرار هيكلي أكبر. كما هو موضح في الشكل 8A، أكمل مركب AKT1-ميليوتوكاربان A الاسترخاء خلال أول 12 نانوثان ووصل لاحقا إلى هضبة مستقرة، مع ملاحظة تقلب مؤقت فقط حوالي 50-55 نانوثانية قبل العودة بسرعة إلى التوازن. كان متوسط RMSD الإجمالي طوال المحاكاة حوالي 0.369 نانومتر. يوضح الشكل 8B أن مركب HIF1A-ميليلوتوكاربان A خضع للاسترخاء خلال أول 16 نانوثانية، تلاها الحفاظ على هضبة مستقرة. حدث تقلب قصير بين 38 و42 نانوثانية، وبعدها لوحظ إعادة تثبيت سريعة. كان متوسط RMSD الإجمالي لهذا المجمع 0.25 ميل بحري. في الشكل 8C، خضع مركب STAT3-ميليوتوكاربان A للاسترخاء ضمن 0.3 نانوثانية، ثم وصل إلى هضبة مستقرة. حدث التقلب القصير بين 5 نانوثانية و80 نانوثانية. كانت المحاكاة الإجمالية حوالي 0.21 نانومتر. كما هو موضح في AKT1-melilotocarpan A وHIF-1α-melilotocarpan A وSTAT3-melilotocarpan حافظت على الاستقرار دون تغييرات ملحوظة، مما يشير إلى تركيبة مستقرة نسبيا.

تم تقييم مرونة بقايا الأحماض الأمينية في البروتينات باستخدام تقلب متوسط الجذر التربيعي (RMSF). في الشكل 9A، كان متوسط تقلب البقايا العالمية حوالي 0.17 نانومتر، مما يشير إلى أن الاستقرار كان يحافظ عليه بشكل رئيسي بواسطة النواة الهيكلية وجيب الربط. كانت المرونة الأعلى محصورة إلى حد كبير في المناطق المتنقلة جوهريا مثل المقاطع الطرفية ومناطق الحلقة بدلا من النواة الجيبية. من المعروف جيدا أن هذه المناطق مرنة بطبيعتها. يظهر الشكل 9B أن حوالي 94٪ من البقايا أظهرت قيم RMSF أقل من 0.20 نانومتر، وحوالي 6٪ فقط تجاوزت 0.30 نانومتر، مما يشير إلى أن العمود الفقري للبروتين الكلي وبقايا الداخلية تذبذب ضمن نطاق مستقر. يظهر الشكل 9C أن متوسط البقايا العالمية كان حوالي 0.17 نانومتر. لم يتم تحديد أي تقلبات تتجاوز 0.15 نانومتر في البيانات، مما يشير إلى أن جيب الربط حافظ على شكل مستقر طوال فترة المحاكاة. لقد ثبت أن كل من مركبات AKT1-ميليوتوكاربان A و HIF-1α-ميليوتوكاربان A تتفاعلان بقوة واستقرار.

تعد الروابط الهيدروجينية حيوية لتعزيز تفاعلات البروتين والليجاند. يظهر الشكل 10A أن مركبات AKT1-ميليوتوكاربان A كانت عادة تشكل رابطة هيدروجينية واحدة، مع تفاوت عدد الروابط الهيدروجينية بين 0 و2. بين ميليلوتوكاربان A و HIF-1α يفصل بينهما أقل من 0.35 نانومتر. غالبا ما يتفاعل AKT1 بالقرب من ميليلوتوكاربان A. تشكل مركبات HIF-1α-ميليلوتوكاربان A من 0 إلى 2 رابطة هيدروجينية، معظمها رابطة هيدروجينية واحدة، كما هو موضح في الشكل 10B. في الشكل 10 C، عدد روابط الهيدروجين في مركب STAT3-melilotocarpan A هو من صفر إلى أربعة. في معظم الأحيان، تكون ذرات A بين ميليوتوكاربان A و HIF-1α مفصولة بأقل من 0.35 نانومتر. تؤسس مركبات HIF-1α-ميليوتوكاربان A من 1-3 أزواج من التلامس القريب وأحيانا حتى 7-9 أزواج. يشير ذلك إلى تفاعلات فعالة في الروابط الهيدروجينية بين الجزيء الصغير والبروتينات المستهدفة. باختصار، يظهر كل من مركبات AKT1-melilotocarpan A و HIF-1α-melilotocarpan A الاستقرار والقوة.

يثبط الحمض النووي التفاعل الالتهابي واستماتة الخلايا المبرمجة لدى فئران SONFH
كشف التحليل النسيجي باستخدام تلوين ABH عن تغيرات واضحة في النخر العظمي في مجموعة SONFH، تميزت بزيادة الفجوات الفارغة، ونوى العقدة، وتعطل في بنية الترابيكو، في حين تم تخفيف هذه السمات المرضية بشكل ملحوظ بعد معالجة ال CC (الشكل 11A). أكد التحليل الكمي أن نسب الفجوات الفارغة ونوى البيكنوتين انخفضت بشكل ملحوظ في المجموعات المعالجة ب CC مقارنة بمجموعة SONFH (الشكل 11B–C). أظهر تحليل الميكرو-CT فقدانا شديدا للعظم الترابيكي في مجموعة SONFH، والذي تم عكسه جزئيا بإعطاء ال CC (الشكل 11D). بشكل مستمر، زاد علاج الجلود القلبي من زيادة ملحوظة في التهاب المهبل المهديدي/التلفاز السل. مع تقليل Tb.Sp بالنسبة لمجموعة SONFH (الشكل 11E–G). أظهر التلوين المناعي الفلوري ارتفاعا في تعبير HIF-1α وانخفاض مستويات ALP في مجموعة SONFH، مصحوبا بتغير في تعبير VEGF. عدل علاج الكربون العقدي تعبير HIF-1α وVEGF وحسن إشارات ALP، مما يشير إلى تحسين البيئة الدقيقة العظمية والنشاط المسبب للعظام (الشكل 11H).

توفر البيانات:
مجموعات البيانات المستخدمة أو التي تم تحليلها خلال الدراسة الحالية متاحة على الرابط: https://zenodo.org/records/19730455.

الشكل 1: مخطط تدفق استراتيجية دراسة الدواء الشبكي لتحسين الأقراص الكيميائية لعلاج SONFH. تظهر الشكل 1 أن الدراسة تحدد الأهداف المحتملة للمكونات الفعالة من ال CC من قاعدة البيانات، مع SONFH كمرض أساسي. بعد تقاطع هذه مع الأهداف المرتبطة بالأمراض، تم إنشاء شبكة "المكون–الهدف–المسار" ومصطلحات GO، KEGG. ثم يتم استخدام الالتحام الجزيئي ومحاكاة الديناميكا الجزيئية لتقييم الترابط بين المكونات الرئيسية والأهداف الأساسية، مع إجراء التأكيد النهائي من خلال التحقق التجريبي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: فحص الأهداف المتقاطعة المرتبطة ب SONFH. (أ) مخطط بركاني يوضح توزيع الجينات المعبر عنها بشكل مختلف في عينات الأمراض. تشير النقاط الحمراء إلى جينات مرتفعة، والنقاط الزرقاء إلى جينات منخفضة التنظيم، والنقاط الرمادية تمثل جينات تفتقر إلى تعبير تفاضلي كبير. (ب) خريطة حرارية تعرض أنماط التعبير ل 60 جين معبرة تفاضلا، مع أعمدة تمثل عينات وصفوف تمثل الجينات. (ج) مخطط فين الذي يعرض تداخل الأهداف المتعلقة بالأمراض التي تم الحصول عليها من قواعد بيانات مختلفة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: فحص الأهداف المتقاطعة بين CC وSONFH. (A) مخطط فين يوضح توزيع 61 هدفا مشتركا مشتركا بين الأهداف المتوقعة للمركبات الفعالة في CC (الأصفر) وأهداف الأمراض المرتبطة ب SONFH (باللون البنفسجي). (ب) توضح شبكة مركب الأعشاب والهدف (H-C-T) التفاعلات بين المركبات وأهدافها المقابلة. تمثل العقدة الزرقاء المربعة المرض، والعقد الخضراء المربعة ترمز إلى المركبات النشطة، والعقد المربعة البرتقالية إلى أهداف مشتركة. تشير الحواف إلى التفاعلات بين المركبات وأهدافها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تحديد الهدف المرشح من خلال تحليل PPI. (A) شبكة PPI مجمعة مع إضافة MCODE. (ب) سير العمل التخطيطي للفحص الطوبولوجي داخل شبكة PPI. (ج) الجينات الرئيسية المستخرجة من شبكة مثبطات مضخة البروتون بواسطة إضافة CytoHubba. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: نتائج تحليل إثراء GO وتحليل مسار KEGG للهدف الشائع ال 61. (أ) مخطط فقاعي يعرض أفضل 10 مصطلحات تحليل إثراء GO لبي بي، CC، وMF. (ب) حبكة فقاعة تصور أفضل 20 مسارا أغنى بشكل كبير في KEGG. (ج) توزيع أفضل 20 مسارا غنية بناء على تصنيف الوظائف KEGG. (د) شبكة C-T-P توضيحية توضح الآليات المحتملة التي قد تحسن بها CC نخر عظم الفخذ. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: خريطة حرارة طاقة الارتباط للتفاعلات بين المركبات النشطة في CC والأهداف الرئيسية (kcal/mol). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: أنماط ربط الأهداف الرئيسية مع مركبات نشطة محددة. AKT1-ميليلوتوكاربان A (A1)، HIF-1α-ميليولوتوكاربان A (B1)، STAT3-ميليولوتوكاربان A (C1)، ESR1-ميليولوتوكاربان A (D1)، CASP3-ميليولوتوكاربان A (E1)، SRC-ميليلوتوكاربان A (F1)، EGFR-ميليولوكاربان A (G1)، AKT1-أنيثول (H1)، AKT1-ميريستيسين (I1). توضح أنماط الربط ثنائية الأبعاد على التوالي (A2)، (B2)، (C2)، (D2)، (E2)، (F2)، (G2) و(H2). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: RMSD ل MD. (A) قيم RMSD لمجمعات AKT1-Melilotocarpan A. (ب) قيم RMSD لمركبات HIF-1α-ميليلوتوكاربان A. (ج) قيم RMSD لمجمعات STAT3-Melilotocarpan A. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 9: RMSF ل MD. (A) قيم RMSF لمركبات AKT1-Melilotocarpan A. (ب) قيم RMSF لمجمعات HIF-1α-ميليلوتوكاربان A. (ج) قيم RMSF لمركبات STAT3-Melilotocarpan A. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 10: روابط H ل MD. (A) قيم روابط H لمجمعات AKT1-Melilotocarpan A. (ب) قيم روابط H لمركبات HIF1A-ميليلوتوكاربان A. (ج) قيم الروابط الهيدروجينية لمجمعات AKT1-ميليلوتوكاربان A. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 11: يثبط ال CC الاستجابة الالتهابية واستماتة المبرمج في رأس الفخذ، مما يحسن SONFH. (أ) أقسام رأس الفخذ الممثلة الملطخة ب ABH. تشير الفراغات إلى الفراغات برؤوس سهام سوداء، وتشير إلى النوى البيكنوتية بالسهام. (B–C) التحليل الكمي لنسبة الفجوات الفارغة (B) وعدد النوى البيكنوتية (C). n = 5. (د) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد ميكرو-CT تمثيلية لرؤوس الفخذ. (E–G) قياس معايير الميكرو-CT، بما في ذلك نسبة حجم العظم (BV/TV)، والفصل الترابيكي (Tb.Sp)، وسماكة الترابيكولار (Tb.Th). (ح) تلوين فلوري مناعي تمثيلي لهيفيدر-1α وVEGF وALP في أقسام رأس الفخذ؛ تم صبغ النوى بمادة DAPI. تعرض البيانات كمتوسط ± SD (n = 5). *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المصطلح		إثراء الطية	P-Value	الكونت	معرفات المستخدمين
سرطان المثانة		28.44	1.23E-07	7	CREBBP,CXCL8,NOS2,MMP2,STAT3,F2,PTGS2, HIF1A، ESR1، MMP9، EGFR، MTOR، VEGFA، CASP3، ERBB2,EP300,PPARG,NFE2L2,BCL2L1
مسار إشارات HIF-1		16.66	6.56E-10	11	SRC,MMP2,STAT3,HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR, MTOR,VEGFA,CASP3,ERBB2,KDR,PDCD4,PTPN6
مقاومة مثبط كيناز التيروزين EGFR		16.66	3.84E-07	8	CCR1، CREBBP، CXCL8، SRC، CASP3، STAT3 ,EP300,TYK2,PTGS2,HIF1A,MTOR,VEGFA
تقاطع أديرينز		12.54	1.64E-05	7	CREBBP,ABCB1,CASP3,ERBB2,STAT3,PDCD4, EP300، PTGS2، MMP9، EGFR، MTOR، VEGFA
مقاومة الغدد الصماء		11.78	2.35E-05	7	كريبب، رقم 2، رقم 3، إرب2، ستات3، SERPINE1,EP300,HIF1A,EGFR,MTOR,VEGFA
مسار إشارات الغضب العمري في مضاعفات السكري		11.55	2.63E-05	7	CCR1، CXCL8، SRC، CASP3، STAT3، CXCR2، PTGS2، EGFR، MTOR، VEGFA
البروتيوغليكانات في السرطان		11.43	1.19E-10	14	CXCL8، SRC، NOS3، CASP3، STAT3، PPARG، MMP9، BCL2L1، NFE2L2
مسار إشارات ريلايكسين		10.25	1.02E-05	8	OXTR,NOS2,NOS3,ERBB2,PTAFR,KDR,NOS1,EGFR,VEGFA
عدوى فيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوزي		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
مسار إشارات هرمون الغدة الدرقية		9.56	7.64E-05	7	NOS2، SRC، NOS3، MMP2، NOS1، MMP9، EGFR، VEGFA
إجهاد القص السائل وتصلب الشرايين		8.21	0.000177	7	CREBBP، CXCL8، SRC، CASP3، STAT3، EP300، TYK2، MMP9
التهاب الكبد الوبائي B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP,STAT3,EP300,PTPN6,TYK2,EGFR,MTOR,BCL2L1
مسار إشارات JAK-STAT		7.93	5.35E-05	8	SRC,VDR,STAT3,CYP3A4,ESR1,EGFR,MTOR,VEGFA
عدوى فيروس المضخم الخلوي البشري		7.34	6.2E-06	10	كريبب، كاسب3، EP300، TYK2، PTGS2، EGFR، MTOR، VEGFA
الدهون وتصلب الشرايين		6.94	0.000035	9	CXCL8,SRC,MMP2,ERBB2,MMP9,EGFR,VEGFA
الميكروRNA في السرطان		6.25	2.06E-06	12	CREBBP، SRC، ERBB2، EP300، PTPN6، PTPRF، EGFR
السرطان الكيميائي - تنشيط المستقبلات		6.14	0.000265	8	SRC,MMP2,ERBB2,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR
المسارات في السرطان		5.94	6.64E-10	19	CXCL8,NOS3,CASP3,MMP2,STAT3,SERPINE1,VEGFA
مسار إشارات الكالسيوم		5.90	0.00011	9	KAT2B، CREBBP، SRC، EP300، HIF1A، ESR1، MTOR
عدوى فيروس الورم الحليمي البشري		4.00	0.00324	8	SRC، NOS3، MMP2، KDR، MMP9، NFE2L2، VEGFA

الجدول 1: نتائج إثراء KEGG لأفضل 20 مسارا مثريا.

الجدول الإضافي 1: معلومات أساسية عن المركبات الفعالة في CC.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: أهداف 85 مكنا نشطا في CC.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: معلومات عن 61 هدفا مشتركا لنظام CC-SONFH.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 4: نتائج مصطلحات فئة العمليات البيولوجية من تحليل إثراء GO.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 5: نتائج مصطلحات تصنيف المكونات الخلوية من تحليل إثراء GO.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 6: نتائج مصطلحات فئة الوظائف الجزيئية من تحليل إثراء GO.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 7: نتائج المسارات من تحليل إثراء KEGG.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 8: طاقات ربط الالتحام الجزيئي (kcal/mol) لأزواج المركبات-المستهدفين.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 9: تفاصيل الأهداف والمكونات للالتحام الجزيئي.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

في هذه الدراسة، حصل المؤلفون على 85 مركبا حيويا نشطا من CC عبر عدة قواعد بيانات وأجروا فحصا، من بينها المكونات الكيميائية الرئيسية أنثول، ميليولوتوكاربان A، والميريستيسين. لتحديد الأهداف، تقاطع المؤلفون بين 563 هدفا من CC الدوائي و1116 هدفا مرتبطا ب SONFH، وحصلوا في النهاية على 61 هدفا. استورد المؤلفون 61 هدفا شائعا إلى قواعد بيانات STRING وDAVID لبناء شبكة مثبطات مضخة البروتون ودراسة المسارات الدوائية المحتملة. كشفت النتائج عن 10 أهداف رئيسية في شبكة PPI، بما في ذلك HIF-1α وSTAT3. نقص التروية ونقص الأكسجين هما من الخصائص الممرضة الرئيسية ل SONFH، وفقا للأبحاث السابقة³⁵. قد يمارس ال CC تأثيرات إيجابية في SONFH من خلال عمليات بيولوجية متعددة، بما في ذلك تكوين الأوعية الدموية وتنظيم النسخ. يمكن تحقيق ذلك من خلال مسار الإشارة HIF-1α، وإجهاد القص السائل وتصلب الشرايين، والدهون وتصلب الشرايين، ومسار إشارات AGE-RAGE في مضاعفات السكري، ومسارات إشارات أخرى، وفقا لتحليل KEGG للإثراء. وهذا يشير إلى أن CC قد تتصرف بناء على SONFH من خلال هذه الأهداف الرئيسية والمسارات المرتبطة بها. لتوضيح ما إذا كانت مكونات CC مرتبطة ارتباطا وثيقا بالأهداف، استنادا إلى نتائج أبحاث علم الأدوية الشبكي أعلاه، وهي نتائج فحص المكونات الفعالة للوصفة المركبة ونتائج فحص الأهداف في شبكة مثبطات مضخة البروتون، أجرى المؤلفون محاكاة ديناميكية جزيئية للميليولوكاربان A-AKT1، ميليلوتوكاربان A-HIF-1α. ومركبات STAT3-ميليلوتوكاربان. هذا يظهر أن ميليلوتوكاربان A يرتبط ب AKT1 وHIF-1α وSTAT3 بشكل مستمر، لذا قد يمارس CC بالفعل تأثيرات إيجابية من خلال التأثير على هذه الأهداف الرئيسية. بشكل عام، من خلال آلية متعددة المكونات والأهداف والمسارات المتعددة، قد يمارس ال CC تأثيرات وقائية على جودة حياة مرضى SONFH.

ركزت المجموعة البحثية على توضيح الآليات التي يمارس بها YGPs تأثيرات علاجية في الأمراض المرتبطة بالعظام. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن YGPs تعزز تكوين العظام وتحسن البنية الدقيقة للترانبيكولار في رأس الفخذ من خلال تنشيط β-كاتينين لتثبيط تكوين العظم وتعزيز تكوين العظم خلال SONFH³⁶ للأرنب. علاوة على ذلك، وجد الباحثون أن YGPs تمارس تأثيرات علاجية على SONFH بشكل أساسي من خلال تخفيف الالتهاب وتعزيز تكوين الأوعية^{الدموية 12}. يمكن لأخصائيي YGP ليس فقط تحسين SONFH بل أيضا تحسين هشاشة العظام. من خلال تثبيط مسار الإشارات IL-17/NF-κB وتقليل الاستجابات المناعية ل Th17، نجح YGPs في^{إيقاف فقدان العظم} الناتج عن استئصال العنين. من خلال تجارب على الحيوانات، أكد الباحثون أن كورنوس أوفيسيناليس، أحد مكونات YGPs، يؤثر على SONFH من خلال تثبيط إفراز الوسطاء الالتهابيين واستماتة خلايا العظم³⁸. ال CC، الذي يمكنه تدفئة اليانغ وفائدة الطاقة وتحرير خطوط الميريديان، هو العشب الرئيسي في YGPs، ويلعب دورا حيويا في تحسين SONFH وتخفيف معاناة المرضى. باختصار، تعكس هذه الدراسات التركيز الطويل الأمد على توضيح آليات التعقيم الصبغي في التعرج العظمي وتحديد النسيج القتالي كأحد الأبحاث الميكانيكية الرئيسية في SONFH.

من بين المكونات الفعالة المتوقعة، أظهرت أنثول، ميريستيكين، ومكونات أخرى نشاطا بيولوجيا ضد الأمراض المرتبطة بالعظام. لقد ثبت أن أنثول يثبط ارتفاع علامات امتصاص العظام. تقلل أنثول في النهاية من تمايز العظم ووظيفة الامتصاص من خلال تثبيط المسارات اللاحقة والعوامل التنظيمية الرئيسية³⁹. تشير الأبحاث إلى أن أنثول يظهر خصائص مضادة للالتهابات ويثبط التمايز الناتج عن الأدنوجين في الخلايا الجذعية المتوسطة لنخاع العظم ^{البشري (}hBMSCs). يثبط الميريستيسين الالتهاب ويحمي خلايا العضلات الملساء الوعائية عن طريق تثبيط مسارات PI3K/Akt و NF-κB⁴¹. الفيروبتوزيس هو أحد الآليات الرئيسية وراء مسببات مرض SONFH. الفيروبتوزيس هو نوع من موت الخلايا المبرمج يسببه التكسيد الدهني المعتمد على الحديد. يمنع ميريستيسين الفيروبتوسيس، وبالتالي حماية توازن الأكسدة في أغشية خلايا الخلايا العظمية⁴². تم التأكد من أن المكون الآخر للبورنيول يمنع تكوين حلقات الأكتين، وهي سمة في الروسيوكلاست الممتصة التي تعكس استقطاب الخلايا، خلال 30 دقيقة^و43 دقيقة. تشير هذه النتائج إلى أن هذه المكونات قد تكون مهمة جدا لتأثير الحماية للكربون المحوري في SONFH، وهي تستحق المزيد من الاستكشاف. من بين كل هذه المكونات، تم اختيار ميليلوتوكاربان A كرابطة ممثلة لأنه أظهر أكثر الروابط استقرارا مع عدة أهداف أساسية في تحليل MD. من بين المركبات الأعلى تصنيفا، أظهر ميليلوتوكاربان A تفاعلات ارتباط قوية باستمرار مع عدة بروتينات رئيسية في شبكة مثبطات مضخة البروتون، مما يشير إلى أنه قد يمثل مكونا حيويا رئيسيا في الحمض الكيميائي.

بالإضافة إلى ذلك، كشفت نتائج شبكة PPI أنه، خاصة HIF-1α وSTAT3، قد يكونان الأهداف الأساسية. يعد HIF-1α الوسيط المركزي للاستجابة الخلوية لنقص الأكسجة. في تجارب SONFH، يعزز تنشيط HIF-1α تكوين الأوعية الدموية وإصلاح العظام، مما يخفف من نخر رأس الفخذ⁴⁴. بالإضافة إلى ذلك، وجدت الأبحاث أن HIF-1α يمكن أن يمارس تأثيرا وقائيا على أنسجة الغضروف في حالات نقص الأكسجين⁴⁵. يقوم تنظيم HIF-1α بكبح الفيروبتوزية وينشط STAT3 لتسريع تمايز الخلايا الأحادية لنخاع العظم إلى عظميات⁴⁶. STAT3 هو منشط لنقل الإشارة ونسخها. تعزز HBMSCs تحويل STAT3 إلى p-STAT3، مما يعزز تكاثر الخلايا الغضروفية وهجرتها وتأثيراتها المضادة للاستماتة تحت ظروف نقص الأكسجين⁴⁷. يعزز STAT3 التمايز العظمي والتأثيرات المضادة للاستماتة لمركبات hBMSC مع زيادة إفراز عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) لتعزيز تجدد الأوعية الدموية الدقيقة^{للعظام 48}. AKT1 هو كيناز بروتين يعمل كوسيط رئيسي لإشارات تكوين الأوعية. يشارك AKT1 في الاقتران بين تكون الأوعية العظمية وتكوين العظم الترابيكولاري^. بشكل عام، تتقاطع هذه الأهداف حول تكوين الأوعية، والتكيف مع نقص الأكسجين، والالتهاب، وإعادة تشكيل العظام، مما يشير إلى أن ال CC قد يمارس تأثيرات وقائية ضد SONFH من خلال تعديل هذه الأهداف ومسارات الإشارة المرتبطة بها.

لاستكشاف آلية ال CC في تحسين SONFH، أجرى الباحثون تحليل GO وتحليل تخصيب KEGG. تظهر نتائج GO أن الجينات المستهدفة غنية بشكل رئيسي بالوظائف البيولوجية مثل الاستجابة لنقص الأكسجين، والاستجابة الخلوية لدهون متعدد السكريات، والتنظيم الإيجابي لتكون الأوعية. أشارت تحليلات إثراء KEGG إلى أن التأثيرات الدوائية للكلب المعقدي في SONFH مرتبطة بشكل رئيسي بمسار إشارات AGE-RAGE في مضاعفات السكري، ومسار إشارة HIF-1α، وتصلب الشرايين والدهون، ومسارات إشارات أخرى. يحدث SONFH عندما ينقطع تدفق الدم إلى رأس الفخذ، مما يؤدي إلى نقص الدعم الغذائي لرأس الفخذ وتحفيز الاستماتة الخلوية⁵⁰. يتكون HIF-1 من HIF-1α و HIF-1β، حيث يلعب HIF-1α دورا رئيسيا في الاستجابة النسخية للبيئات منخفضة الأكسجين والإقفاري⁴⁷. أظهرت الدراسات السابقة أنه، من خلال سلسلة إشارات VEGF/AKT/mTOR، ينسق HIF-1α تكوين العظم وتكوين الأوعية، مما يعزز بشكل حاسم التمايز العظامي للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. بعد حدوث نقص التروية، يتطور نقص الأكسجين في الأنسجة، مما يؤدي إلى ارتفاع ملحوظ في HIF-1α داخل الخلايا. مما يعزز مستويات تعبير VEGF وبالتالي يعزز إصلاح الأوعية الدموية^{وتجددها}. نقص الأكسجين يعطل إنتاج الطاقة الميتوكوندرية ويزيد من تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تعزز هذه التغيرات تكوين الخلايا العظمية، وتثبط نشاط الأروى العظمية، وفي النهاية تحفز موت الخلايا العظمية. يؤدي التعبير العالي ل HIF-1α إلى تحويل أيض الطاقة الخلوية من الفسفرة التأكسدية إلى التحلل السكري، ويقلل من إنتاج ROS، وبالتالي يخفف من الاستماتة المبرمجة في الخلايا العظمية والخلايا العظمية^52,53. يدعم العظم القبعي وظيفة تهيئة الدم لنخاع العظم ويخزن معادن مثل الكالسيوم. يمكن أن يؤدي زيادة نشاط HIF-1α إلى^{زيادة تكوين} العظام اللغوية بشكل مباشر. بالإضافة إلى ذلك، يحافظ HIF-1α على بقاء الخلايا الغضروفية وتوازن التوازن تحت ظروف نقص الأكسجين⁴⁵. وبالتالي، أصبح مسار إشارة HIF-1α هدفا علاجيا ل ONFH، مع تطبيق علاجي محتمل ل ONFH.

في مسار إشارات AGE-RAGE، تنتج المنتجات النهائية للجلكايشن المتقدم (AGEs) نتيجة الترابط التساهمي غير الإنزيمي للكربوهيدرات مع البروتينات أو الدهون أو الجزيئات الحيوية الكبيرة الأخرى⁵⁵. يمكن أن تتلف الخلايا والأنسجة عن طريق الضرر الالتهابي والمؤكسد. من خلال أربعة مسارات، يتم تحويل الإشارات عبر تفاعل AGE-RAGE. هي 1) JAK-2-STAT1، (2) PI3K-AKT، (3) MAPK-ERK، و(4) NADPH أوكسيداز-ROS⁵⁶. في النهاية، يدخل NF-κB المفسفر إلى النواة لينسخ تعبير السيتوكينات المضادة للالتهابات، وعوامل النمو، والسيتوكينات التليفية، والإجهاد التأكسدي. أظهرت الدراسة أن AGE-RAGE يعزز استماتة الخلايا العظمية عبر مسار إشارات MAPK وتنشيط الإجهاد التأكسدي، ويثبط التمايز العظامي من خلال كبح مستويات حساسات الإجهاد الشبكية الإندوبلازمية، وكذلك من خلال مثيلة الحمض النووي/مسار Wnt⁵⁷. بالإضافة إلى ذلك، أشارت الدراسات إلى أن AGEs وRAGEs تشارك في تكلس الأوعية^{الدموية 58}.

في مسار إشارات الدهون وتصلب الشرايين، تنشط الدهون المؤكسدة PPARγ. وهو منظم رئيسي لتكوين الدهون يثبط التمايز العظمي⁵⁹. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت عدة دراسات أن الدهون تؤثر على تمايز ونضج الخلايا العظمية والخلايا العظمية، مما يؤدي إلى تعطيل توازن العظم⁶⁰. أظهرت العديد من الدراسات التأسيسية دورا كبيرا للموت المبرمج في الآليات الفسيولوجية والمرضية ل SONFH. أكدت التجارب اللاحقة على الحيوانات في الجسم أن الجزء النشط من الحمض المبرمج يثبط بشكل فعال الموت المبرمج والالتهاب في SONFH، مما يخفف من تقدم المرض.

تماشيا مع هذه النتائج، تشير الدواء الشبكي والتحليلات التجريبية إلى أن الحمض المعقدي قد يحسن SONFH من خلال تنسيق التكيف مع نقص الأكسجين، وتنظيم تكوين الأوعية، وتنظيم العمليات الأيضية. كشف التحليل الكمي للأشعة المقطعية أن تدخل الأشعة القلبية القلبية أعاد بشكل كبير نسبة حجم العظم (BV/TV)، وقلل من الانفصال الحاق (Tb.Sp, Tb.Th)، وعزز استعادة البنية الدقيقة العظمية. سلط تحليل إثراء KEGG الضوء بشكل أكبر على مسار إشارة HIF-1α كآلية رئيسية وراء هذه التأثيرات. تشير هذه التجارب الحيوانية مجتمعة إلى أن ال CC قد يخفف من SONFH من خلال تنظيم العمليات البيولوجية المرتبطة بنقص الأكسجين والالتهابات، وتعزيز تكوين الأوعية الدموية وإعادة تشكيل العظام، وربما من خلال مسارات رئيسية مثل مسار إشارة HIF-1α.

على الرغم من الحصول على بعض النتائج الأولية المهمة، إلا أن هذه الدراسة لا تزال تعاني من بعض القيود. اعتمد المؤلفون فقط على طرق المعلوماتية الحيوية الحديثة، بما في ذلك علم الأدوية الشبكي وMD، بالإضافة إلى بعض التجارب الحيوانية، لاستكشاف دور الكلبولوجيا الكيميائية في SONFH. لذلك، يجب التحقق من موثوقية ودقة التنبؤات بشكل أكبر في التجارب الحية والمختبرية . توفر هذه الدراسة أدلة أولية حول الآليات التي يحسن بها CC SONFH، والتي تتطلب المزيد من التحقق التجريبي. من خلال دمج علم الأدوية الشبكي مع MD، قام المؤلفون برسم خرائط منهجية للمكونات النشطة الحيوية المرشحة، والأهداف الرئيسية، والمسارات المثرية للكرسي كلوي في SONFH. في الختام، بحثت هذه الدراسة في التأثيرات الوقائية المحتملة للكلب الرومي في SONFH من خلال علم الأدوية الشبكي التكاملي والتحقق الحي . تشير النتائج إلى أن الآليات كانت مرتبطة بشكل أساسي بتعديل مسار إشارات HIF-1 وتعزيز التجدد العظمي. كما هو موضح في الشكل المقابل، فقد عدل تحسن الكولبوكس المعقدي بشكل كبير تعبير البروتينات الرئيسية، بما في ذلك HIF-1α وVEGF وALP، بطريقة تعتمد على الجرعة، مما يدعم دوره في تنسيق التكيف مع نقص الأكسجين، وتكوين الأوعية، والنشاط المسبب للعظم. وقد أكدت هذه النتائج تحليل الميكرو-CT، الذي أظهر أن تدخل CC أعاد بشكل فعال نسبة حجم العظم وحسن البنية المجهرية للحاق الطرفي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
4٪ PFA	بايوشارب	BL539A
الإيثينوول المطلق	مجموعة سينوفارم Co.Ltd	10009218
مجموعة البقع الزرقاء الألكية	سولاربيولوجيا	G1563
حزب العمال	أريغو	ARG57422
أوتودوك فينا	أبحاث سكريبس		الإصدار 1.2.7
أوتودوكتوز	أبحاث سكريبس		الإصدار 1.5.7
منصة المعلوماتية الحيوية عبر الإنترنت			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 مجال القوة			يستخدم في معالجة معلمات MD
CTD			https://ctdbase.org
سيتوسكيب	اتحاد سايتوسكيب		الإصدار 3.10.3؛ الإضافات: CytoHubba، CytoNCA
حل تلوين DAPI	شركة بيوتايم بيوتيك	C1006-50 مل
ديفيد	NCI		https://david.ncifcrf.gov
ديسكفري ستوديو فيوجيولايزر	بيوفيا		استوديو اكتشاف BIOVIA 2020؛ تصور الالتحام
DisGeNET			https://disgenet.com
إزالة الكالسية EDTA	شركة بيوتايم بيوتيك	C0167-3L
محلول حجب بيروكسيداز الداخلي	شركة بيوتايم بيوتيك	P0100A
بطاقات الجين			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
ماعز مضاد للأرنب IgG(H+L)(أليكسا فلور 488)	CST	4409
مصل الماعز	شركة بيوتايم بيوتيك	C0265
منشور جراف باد	GraphPad (الدوتاماتكس)		الإصدار 10؛ التحليل الإحصائي والرسوم البيانية
جروماكس	جروماكس		الإصدار 2022؛ CHARMM36 مجال القوة
عشبة 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1α	هانغتشو هوان	HA721997
معدات ميكرو-CT عالية الدقة	بروكر	سكاي سكان
مرشح قواعد ليبينسكي			Mw & le; 500; miLogP & le; 5; HBD & le; 5; HBA & le; 10
دهنية السكاريد	سيغما-ألدرتش	L4516
ميثيل بريدنيزولون	مجموعة سينوفارم Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
البلسم المحايد	بايوشارب	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
البارافين	مجموعة سينوفارم Co.Ltd	C416770020
شبكة الجسيمات (PME)			الكهروستاتيك بعيد المدى
بوبكيمياء	المعاهد الوطنية للصحة		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
باي مول	شرö دينجر		تصور البروتين وتحضيره
R	كران		الإصدار 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
الوتر			https://string-db.org
SwissADME	المعهد السويسري		http://www.swissadme.ch
توقعات الأهداف السويسرية	المعهد السويسري		http://www.swisstargetprediction.ch
نموذج المياه TIP3P			يستخدم للحل
يوني بروت			https://www.uniprot.org
VEGF	هانغتشو هوان	ET1604-28
ويشينغشين			https://www.bioinformatics.com.cn
ويندوز 11	مايكروسوفت		يستخدم لمعالجة البيانات، والالتحام الجزيئي، ومحاكاة MD
زيلين	مجموعة سينوفارم Co.Ltd	10023418