عزل وتخليق وتوصيف الجسيمات النانوية المغطاة بغشاء البلاعم المعدلة (حمض اللاكتيك-كو-جليكوليك) المغطاة بغشاء البلاعم المعدلة و-CD47 والإنتجرين α4/β1

Summary

يتيح هذا البروتوكول تحضير وتوصيف الجسيمات النانوية المغطاة بغشاء البلاعم (حمض اللاكتيك-كو-جليكوليك) المعدلة معا مع الميكروفون α4/β1 والإنتجرين لتطبيقات توصيل الأدوية المستهدفة.

Abstract

تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن ويساهم بشكل رئيسي في أمراض القلب والأوعية الدموية والوفيات. لا يزال توصيل العوامل المضادة للالتهابات المستهدف إلى مواقع تصلب الشرايين تحديا كبيرا. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحضير وتوصيف جسيمات البولي (حمض اللاكتيك-كو-غليكوليك) المحملة بأغشية البلاعم المغطاة بغلاف الكولكيسين (MMM/COL NPs) المعدلة بشكل مشترك من CD47 والإنتجرين α4/β1. يشمل البروتوكول تعديل البلاعم عبر نقل البلازميدات وتحفيز بطانة البطانة 1، وعزل الغشاء، وتصنيع NP، وطلاء الغشاء. يتم تقييم النوايا الناتجة من MMM/COL باستخدام التوصيف الفيزيائي-الكيميائي، وتحليل تعبير البروتين، والاختبارات في المختبر وفي الجسم الحي . يشمل التحقق الوظيفي تقييم الارتباط الخلوي بالخلايا البطانية النشطة، وامتصاص البلعميات، والتأثيرات المضادة للالتهابات في خلايا الرغوة، والتوزيع الحيوي في نموذج تصلب الشرايين في الفوار. بالإضافة إلى ذلك، يتم تسليط الضوء على معايير التجارب الرئيسية وخطوات مراقبة الجودة لضمان قابلية التكرار والاتساق عبر المختبرات. يوفر هذا البروتوكول نهجا قويا وقابلا للتوسع لتوليد مضادات حيوية للتعاطي الحيوية لتطبيقات توصيل الأدوية المستهدفة في أبحاث تصلب الشرايين.

Introduction

تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن يؤدي إلى أحداث قلبية ووعائية قاتلة وسكتة دماغية من خلال تضيق تجويف الشريان وتمزق اللويحات غير المستقر، مما يشكل عبئا صحيا عالميا كبيرا ^1,2,3. خفض تنظيم الاستجابات الالتهابية في موقع تصلب الشرايين هو هدف علاجي رئيسي ^4,5. أظهر الكولشيسين، وهو دواء قوي مضاد للالتهابات، وعدا في تقليل الأحداث القلبية الوعائية السلبية ^6,7. ومع ذلك، فإن فائدته السريرية محدودة بسبب نافذة علاجية ضيقة وآثار جانبية جهازية، مما يستلزم وجود أنظمة توصيل مستهدفة لتعزيز تراكم اللويحات في موقع اللويحات مع تقليل السمية⁸.

برزت الجسيمات النانوية المغلفة بغشاء الخلية (NPs) كمنصة قوية لتوصيل الأدوية المستهدف، مستفيدة من الوظائف البيولوجية الطبيعية لخلايا المصدر ^9,10,11. من بين أنواع الخلايا المتورطة في تصلب الشرايين، تلعب البلاعم دورا محوريا^12،13،14. الإنتجين α4/β1، المعبر عنه في البلعميات، يتوسط التجنيد إلى اللويحات التصلب الشرايين عن طريق الارتباط بجزيء الالتصاق الخلية الوعائية-1 (VCAM-1) المعبر عنه في الخلايا البطانية المنشطة (ECs). CD47، إشارة "لا تأكليني"، تتيح لنظام البلعمة أحادية النواة^15,16 تفادي البلعمة. من خلال هندسة أغشية البلاعم لزيادة التعبير عن هذه البروتينات مقارنة بأغشية البلاعم الأصلية، يمكن إنشاء NPs مع استهداف معزز عبر تفاعل الإنتجين α4/β1–VCAM-1 وتقليل البلعمة عبر الإشارات التي توسطها CD47^. تحسن استراتيجية التعديل المزدوج على الأنظمة الطبيعية المغلفة بالغشاء وأنظمة الاستهداف القائمة على الليجند من خلال تعزيز الاستهداف إلى الخلايا الخارجية المنشطة وتقليل التخلص من الخلايا البلعمية. على عكس أغشية البلعم الأصلية التي تعبر فقط عن مستويات أساسية لهذه البروتينات، يوفر غشاءنا المهندس وظائف محسنة دون إدخال روابط استهداف صناعية قد تحفز المناعة الحيوية.

يوضح هذا البروتوكول تحضير وتوصيف الأغشية البلاعمية المحملة بالكولشيسين (حمض اللاكتيك-كو-غليكوليك) NPs (COL NPs) المغطاة بأغشية بلاعمية معدلة مشتركة مع CD47 وإنتجرين α4/β1، مما يولد أغشية بلاعمية معدلة مغلفة بأغشية البلاعم (MMM/COL NPs). نسوي طرق التعديل الجيني والدوائي لبلاعم RAW 264.7، وعزل الأغشية المعدلة، وتحضير وطلاء NPs PLGA، والاختبارات الشاملة في المختبر والجسم. توفر هذه الطريقة إطارا قابلا للتكرار لإعداد وتقييم الممارسين الحيويين للمحاكاة الحيوية لتطبيقات توصيل الأدوية المستهدفة في أبحاث تصلب الشرايين.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى برج نانجينغ درام، واتبعت الإرشادات الخاصة برعاية واستخدام الحيوانات المخبرية التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة.

1. تعديل بلاعم RAW 264.7

1. تحضير خلايا RAW 264.7، وإكمال وسط النسر المعدل من Dulbecco مع إضافة 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين، بلازميد CD47 للتعبير الزائد، كاشف النقل Lipofectamine 3000، الإندوثلين-1 (ET-1)، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، وإمدادات زراعة الأنسجة المعقمة.
2. زراعة الخلايا RAW 264.7 في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37°C مع 5٪ CO₂ والحفاظ على الخلايا حتى تصل إلى حوالي 4–5 × 10⁵ خلايا لكل بئر في صفيحة مكونة من 6 آبار.
3. قم بتعديل CD47
   1. تحضير محلول DNA للبلازميد عن طريق خلط 2.5 ميكروغرام من حمض نووي البلازميدي مع 5 ميكرولتر من مادة P3000 في وسط خال من مصل Opti-MEM بسعة 125 ميكرولتر.
   2. تحضير محلول كاشف التحويل عن طريق تخفيف 3.75 ميكرولتر من مادة التحويل في 125 ميكرولتر من وسط خال من المصل.
   3. استخدم هذه الأحجام لصيغة صفائح ذات 6 آبار. قم بقياس جميع المكونات بشكل متناسب لصيغ أخرى مع الحفاظ على نسبة DNA:P3000 1:2 (μg:μL) ونسبة كاشف DNA:transfection تبلغ 1:1.5 (μg:μL).
      ملاحظة: على سبيل المثال، استخدم 10 ميكروغرام من الحمض النووي، و20 ميكرولتر من P3000، و15 ميكرولتر من كاشف التحويل لأطباق 10 سم.
   4. ادمج محلول الحمض النووي مع محلول التحويل واحتضن لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 25°C.
   5. أضف مركبات النقل إلى الخلايا في DMEM الخالي من المضادات الحيوية مع 10٪ FBS بمعدل تقريبا 2–2.5 × 10⁶ خلايا لكل طبق 10 سم.
   6. استبدل الوسط بوسط جديد كامل يحتوي على مضادات حيوية بعد 6 ساعات من عملية النقل.
4. قم بإجراء تعديل الإنتجرين α4/β1
   1. تحفيز الخلايا المنقولة أو غير المنقولة ب 100 نانوميل ET-1 في وسط خال من المصل لمدة 24 ساعة لزيادة تعبير الإنتجين α4/β1.
      ملاحظة: تحقق من كفاءة التعديل من خلال تفاعل بوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتحليل النقطة الغربية ل CD47، الإنتجين α4، والإنتجرين β1.

2. عزل غشاء البلاعم المعدل (MMM)

1. احصد خلايا RAW 264.7 المعدلة باستخدام كاشطة الخلايا.
2. قم بعمل الطرد المركزي على الخلايا عند 900 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. اغسل حبيبات الخلية ثلاث مرات مع 1× PBS بارد.
4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من محلول التحلل المنخفض المبرد مسبقا (10 ملليمول من تريس-HCl، رقم الهيدروجينيوم 8.0، 1 مللي مولار من KCl، 1.5 ملليمولار MgCl₂، و1 ملليمول من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل) وحضن التعليق على الجليد لمدة 15 دقيقة.
5. جمد التعليق في النيتروجين السائل لمدة دقيقتين، ثم أذيبه في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. كرر دورة التجميد والذوبان خمس مرات لتحليل الخلايا بالكامل.
   تحذير: النيتروجين السائل يمكن أن يسبب حروقا شديدة بسبب التبريد. تعامل مع استخدام قفازات معزولة مناسبة وحماية للوجه.
6. قم بالطرد المركزي بجهاز التحذير عند 850 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة النوى والخلايا غير المكسورة.
7. قم بالطرد المركزي بالمادة الفائقة المجمعة عند 15,000 × جرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. للحصول على نقاء أغشائي أعلى، يتم نقل المادة الفائقة التي تم الحصول عليها بعد 15,000 × جرام من الطرد المركزي إلى أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق والطرد المركزي عند 100,000 × جرام لمدة ساعة واحدة عند 4°C باستخدام جهاز الطرد المركزي الفائق.
   تحذير: تأكد من توازن أنابيب الطرد المركزي الفائق بشكل صحيح ومصنفة للطرد المركزي عالي السرعة لمنع اختلال أو فشل الدوار.
   ملاحظة: الطرد المركزي فوق الفائق ينتج أغشية بلازما منقاة مع تقليل تلوث العضيات داخل الخلية.
8. اجمع الحبيبات التي تحتوي على شظايا MMM وأعد تعليقها في 300 ميكرولتر من 1× PBS أو محلول تحلل للحصول على تركيز بروتين يقارب 1–2 ملغ/مل.
9. حدد تركيز بروتين الغشاء باستخدام مجموعة اختبار كمية بروتين BCA.
   ملاحظة: يمكن تخزين الأغشية المعزولة عند −80°C للاستخدام لاحقا.

3. تحضير مخازن PLGA المحمولة بالكولشيسين (COL NPs)

1. قم بإذابة 10 ملغ من PLGA (50:50، MW 90,000) و1 ملغ من الكولشيسين في 1 مل من ثنائي ميثيل كبريتوكسيد (DMSO).
   تحذير: يمكن لDMSO أن يخترق الجلد ويعزز امتصاص المواد الأخرى. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات نيتريل، معطف مختبر، ونظارات أمان) عند التعامل. جمع المحاليل التي تحتوي على DMSO كنفايات عضوية للمذيبات والتخلص منها من خلال خدمات التخلص المرخصة من النفايات الخطرة. الكولشيسين سام وقد يكون مثيرا للسبب. جمع جميع المواد الملوثة بالكولشيسين (المحاليل، القفازات، والأنابيب) كنفايات صيدلانية خطرة والتخلص منها من خلال خدمات التخلص المرخصة من النفايات الخطرة وفقا للأنظمة المؤسسية والمحلية.
2. حرك المحلول بسرعة 500 دورة في الدقيقة باستخدام محرك مغناطيسي مع قضيب تحريك مطلى بتفلون بحجم 10 مم عند 25°C.
3. أضف 4 مل من الماء فائق النقاء بشكل قطري بمعدل تقارب 1 مل/دقيقة باستخدام مضخة حقنة مزودة بحقنة 5 مل وإبرة 26 جرام عند 25°C.
4. استمر في تحريك الخليط لمدة 3 ساعات للسماح بتكوين ال NP.
5. انقل تعليق NP إلى حقيبة غسيل كلى (MWCO 3,500 Da).
6. قم بتحليل الداليز مقابل 2 لتر من الماء المقطر عند 4°C تحت التحريك اللطيف عند 200 دورة في الدقيقة.
7. استمر في الغسيل لمدة 24 ساعة واستبدل مخزن الغسيل بالكامل عند 6 و12 و24 ساعة لإزالة الكولشيسين الحر وDMSO.
   تحذير: اجمع جميع المذيبات والمواد العضوية والكواشف، بما في ذلك تلك الناتجة عن الغسيل الكلولي، كنفايات كيميائية عضوية. لا تتخلص منه في المصرف. اتبع بروتوكولات التخلص من النفايات الخطرة المؤسسية.
8. اجمع تعليق COL NP المحمول واحتفظ بالحرارة عند 4°C.
   ملاحظة: يمكن تخزين موطنات التكلفة المنخفضة عند 4°C للاستخدام القصير (حتى 3 أيام). لوضع العلامات الفلورية، أدرج 0.1٪ (بوزن/وزن) من صبغة 1,1′-ثنائي أوكتاديكسيل-3,3,3′,3′-رباعي ميثيليندوكربوكانين بيركلورات (DiI) في محلول PLGA خلال الخطوة 3.1.
9. تحقق من إزالة DMSO والكولشيسين المجاني
   1. اجمع الغسيل النهائي (المخزن المؤقت بعد التغيير الأخير عند 24 ساعة) وتحليله باستخدام القياس الطيفي فوق البنفسجي-المرئي (UV–vis).
   2. امسح الغسيل من 200 إلى 400 نانومتر وقارنه مع عينة تحكم (مخزن غسيل جديد للغسيل المعاكس).
   3. تأكد من عدم وجود ذروة امتصاص عند حوالي 210 نانومتر (وهي سمة مميزة ل DMSO) أو عند 345 نانومتر (سمة للكولشيسين)، مما يشير إلى نجاح إزالة المذيب المتبقي والدواء الحر.
   4. بدلا من ذلك، حدد تركيز DMSO المتبقي باستخدام مجموعة اختبار DMSO وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من أن DMSO المتبقي أقل من 0.1٪ (v/v) لتجنب السمية الخلوية في الاختبارات اللاحقة.

4. تصنيع المضادات المغلفة بالغشاء (MMM/COL NPs)

1. قم بسونيك نظام تعليق MMM المعزول (من الخطوة 2.7) لمدة 20 دقيقة باستخدام جهاز صوت حمام الماء عند 40 كيلوهرتز و110 واط. حافظ على حجم العينة عند 1 مل في أنبوب 1.5 مل ودرجة حرارة أقل من 25°م باستخدام حمام ثلج حسب الحاجة.
2. قم ببثق تعليق الغشاء الصوتي عبر فلتر غشائي بولي كربونات بحجم مسام 400 نانومتر باستخدام جهاز بثق صغير لتشكيل الحويصلات الغشائية.
3. اخلط حويصلات COL NPs (من الخطوة 3.5) مع حويصلات MMM بنسبة كتلة غشائية إلى PLGA تبلغ 1:1.
   1. استخدم تعليق غشائي يحتوي على 10 ملغ من البروتين مقابل 10 ملغ من PLGA كما يحدده اختبار قياس البروتين.
   2. اخلط بلطف ماصات COL NPs مع حويصات MMM للأعلى والأسفل 15 مرة باستخدام ماصة بحجم 1 مل.
4. قم ببثق الخليط معا عبر فلتر غشائي بولي كربونات بحجم مسام 200 نانومتر وكرر البثق لمدة 15 مرة.
5. اجمع التعليق الناتج الذي يحتوي على منشطات MMM/COL NPs وتخزينه عند 4°C للاستخدام الفوري.

5. توصيف الممارسين المتقدمين

1. قياس القطر الهيدروديناميكي، ومؤشر التشتت المتعدد (PDI)، وجهد زيتا باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) تحت الشروط التالية: درجة الحرارة، 25°C؛ زاوية التبعثر الخلفي، 173°؛ وقت التوازن، دقيقتان؛ وثلاث قياسات مكررة لكل عينة.
2. تخفيف العينات 20 ضعفا في ماء منزوع الأيونات (التركيز النهائي، حوالي 0.1 ملغ/مل).
   ملاحظة: يقلل التخفيف من تأثيرات التشتت المتعددة.
3. تصور بنية النواة-الغلاف لوحدات MMM/COL NPs باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM).
   1. ضع 5 ميكرولتر من تعليق NP (حوالي 0.1 ملغ/مل) على شبكة نحاسية مطلية بالكربون ومفرودة بتوهج (300 شبكة).
   2. اترك العينة تمتص لمدة دقيقتين عند 25°C.
   3. أزل السائل الزائد عن طريق لمس حافة الشبكة بلطف بورق التصفية.
   4. ضع 5 ميكرولتر من محلول أسيتات اليورانيل بنسبة 1٪ على الشبكة وحضن لمدة دقيقة واحدة عند 25 درجة مئوية.
   5. أزل البقعة الزائدة بورق الفلتر.
   6. اترك الشبكة تجف تماما لمدة لا تقل عن 10 دقائق قبل التصوير.
      تحذير: أسيتات اليورانيل سام ومشع. التعامل مع المعدات الواقية الشخصية المناسبة (قفازات، معطف مختبر، وحماية للعين)، والتخلص من النفايات وفقا لإرشادات المواد الخطرة المؤسسية.
4. قم بتسمية الغشاء بصبغة بيركلورات 3,3′-ديأوكتاديكسيلوكساكربوكربوسيانين (DiO) خلال الخطوة 2 أو عن طريق وضع علامات على الخلايا سليمة قبل عزل الغشاء، ووضع علامة على نواة PLGA ب DiI.
5. تحليل التداخل المشترك بين إشارات DiO (الأخضر) وDiI (الحمراء) باستخدام المجهر الماسح بالليزر الكونفوكلي (CLSM).
   1. اضبط معايير الإثارة/الانبعاث كما يلي: DiO (أخضر)، الإثارة 488 نانومتر، الانبعاث 550 نانومتر؛ DiI (أحمر)، إثارة 561 نانومتر، انبعاث 620 نانومتر.
   2. استخدم عدسة غامرة بالزيت بحجم 60× (فتحة عدسة رقمية، 1.4).
   3. اضبط الثقب على وحدة إيري واحدة.
   4. قم بضبط كسب الكاشف لتجنب تشبع البكسل.
   5. احصل على صور بدقة 1024 × 1024 بكسل مع متوسط خطين ×.
   6. حافظ على قوة الليزر أقل من 5٪ لتقليل التبييض الضوئي.
6. تحليل وجود CD47، والإنتجين α4، والإنتجرين β1 على سطح NP في MMM/COL (NP) باستخدام تحليل البقعة الغربية.
7. تحديد تحميل وإطلاق المخدرات
   1. قم بتحليل حجم 100 ميكرولتر من NPs في DMSO وقياس امتصاص الكولشيسين عند 345 نانومتر لتحديد كفاءة تحميل الأدوية والتغليف.
   2. ضع 1 مل من تعليق MP/COL NP (يحتوي على حوالي 100 ميكروغرام من الكولشيسين) في كيس غسيل الكلى (MWCO، 3,500 دالتون).
   3. أغلق الكيس واغمره في 50 مل من PBS (pH 7.4) يحتوي على 20٪ FBS في كأس زجاجي بسعة 100 مل.
   4. حافظ على وسط الإطلاق عند 37°C تحت التحريك المستمر عند 100 دورة في الدقيقة باستخدام محرك مغناطيسي مع قضيب تحريك مطلى بتفلون بقطر 20 مم.
   5. حافظ على ظروف الحوض طوال فترة التجربة.
      ملاحظة: ذوبان الكولشيسين في PBS مع 20٪ FBS هي >1 ملغ/مل؛ أقصى تركيز للكولشيسين في وسط الإطلاق هو <10٪ من التشبع.
   6. عند نقاط زمنية محددة مسبقا (0، 1، 2، 4، 8، 12، 24، 36، 48، و62 ساعة)، اسحب 500 ميكرولتر من وسط الإطلاق.
   7. استبدل الحجم المسحوب بحجم مماثل من PBS الطازج المسخن مسبقا (37°C) يحتوي على 20٪ FBS.
   8. قس تركيز الكولشيسين في العينات المسحوبة باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية–البصرية عند 345 نانومتر.
   9. قم بإجراء جميع القياسات بثلاث نسخ.

6. الاختبارات الوظيفية في المختبر

1. بذور خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs). حفز الخلايا بعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) بقوة 10 نانوغرام/مل لمدة 24 ساعة لزيادة تنظيم VCAM-1.
2. الارتباط الخلوي بين متلازمات MMM/DiI مع HUVECs
   1. حضن الخلايا ب MMM/COLs NPs الموسومة بDiI (MMM/DiI NPs) بتركيز 50 ميكروغرام/مل (استنادا إلى كتلة النواة PLGA) لمدة 4 ساعات عند 37°C في غلاف جوي يحتوي على 5٪ CO₂.
   2. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المبرد مسبقا. قم بعمل الطرد المركزي على 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية بعد كل غسل.
   3. أعد تعليق الخلايا المغسولة في PBS التي تحتوي على 0.5٪ ألبومين مصل البقري (BSA). اضبط تركيز الخلايا النهائي إلى 1 × 10⁶ خلايا/مل.
   4. اضبط معلمات الجهاز لقياس التدفق الخلوي أو CLSM. اكتشف التألق DiI باستخدام الإثارة عند 549 نانومتر والانبعاث عند 565 نانومتر (قناة PE).
   5. احصل على البيانات من العينات. جمع ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة لقياس خلوية التدفق أو التقاط الحقول التمثيلية ل CLSM.
   6. اختر خمسة حقول تمثيلية لكل عينة من مناطق مختلفة، باستثناء الحواف، باستخدام عدسة غمر زيتي بقياس 60×. تأكد من أن الخلايا سليمة وغير متداخلة.
   7. قم بتعمية العينات قبل التقاط الصورة. اختر الحقول عن طريق تحريك المرحلة عشوائيا بدلا من اختيار مناطق محددة يدويا.
   8. تطبيق معايير العتبة والتحليل المتطابقة على جميع العينات تحت ظروف عمياء.
   9. استبعد حطام الخلايا باستخدام بوابة FSC-A/SSC-A. اختر الخلايا الفردية باستخدام بوابة FSC-A/FSC-H.
   10. اختر الخلايا الحية باستخدام صبغة القابلية للحياة. أضف 7-أمينوأكتينوميسين D (7-AAD) عند 1 ميكروغرام/مل، واحتضن لمدة 5 دقائق عند 4°C في الظلام، واستخدمه لمراقبة الخلايا الحية.
   11. تحليل شدة الفلورة لقياس الارتباط الخلوي. استخدم متوسط شدة الفلورة كمقاييس للكمية. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل تدفق الخلايا FlowJo (الإصدار 10.8.1).
3. امتصاص الخلايا لمتلازمات MMM/DiI بواسطة بلاعم RAW 264.7
   1. حضن NPs موسومة بDiI MMM/COL (MMM/DiI NPs) مع بلاعم خام 264.7 غير معدلة بتركيز 50 ميكروغرام/مل (استنادا إلى كتلة نواة PLGA) لمدة 4 ساعات عند 37°C في غلاف جوي يحتوي على 5٪ CO₂.
   2. جهز الخلايا للتحليل كما هو موضح في الخطوات 6.2.2–6.2.3.
   3. اضبط معلمات الجهاز لاكتشاف DiI باستخدام الإثارة عند 549 نانومتر والانبعاث عند 565 نانومتر (قناة PE).
   4. احصل على البيانات من العينات. احصل على ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة.
   5. استبعد حطام الخلايا باستخدام بوابة FSC-A/SSC-A. اختر الخلايا الفردية باستخدام بوابة FSC-A/FSC-H.
   6. اختر الخلايا الحية باستخدام صبغة القابلية للحياة. أضف 7-AAD بسرعة 1 ميكروغرام/مل، ثم احتضن لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في الظلام، واستخدم في التغطية الحية.
   7. تحليل شدة الفلورة لقياس امتصاص السيل. استخدم متوسط شدة الفلورة كمقاييس للكمية. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل التدفق الخلوي.
4. اختبار الخلايا الرغوية
   1. تميز خلايا RAW 264.7 إلى خلايا رغوة عن طريق الحضانة باستخدام بروتين دهني مؤكسد منخفض الكثافة (oxLDL) عند 50 ميكروغرام/مل لمدة 48 ساعة. تأكد من تكوين خلايا الرغوة عن طريق صبغة Oil Red O، والتي تشير إلى تراكم الدهون داخل الخلية.
   2. عالج خلايا الرغوة بالكولشيسين الحر، أو COL NPs، أو MMM/COL NPs بتركيز مكافئ للكولشيسين 1 ميكرومول. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37°C في جو رطب يحتوي على 5٪ CO₂.
      ملاحظة: اختر هذا التركيز بناء على تجارب الجرعة-الاستجابة الأولية التي تقيم بقاء الخلايا وفعاليتها المضادة للالتهابات.
   3. قياس مستويات السيتوكينات الالتهابية باستخدام اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
      1. اجمع الزائفات الزائدة لزراعة الخلايا مباشرة بعد العلاج (بعد 24 ساعة من العلاج).
      2. قم بعمل الطرد المركزي على الألواح على حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4°C لإزالة بقايا الخلايا.
      3. انقل المواد الشفافة إلى أنابيب نظيفة وخزنها عند −80°م حتى التحليل.
      4. قس مستويات TNF-α وإنترلوكين-6 باستخدام مجموعات ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      5. قم بإجراء جميع القياسات في آبار ثلاثية التكرار وكرر التجربة ثلاث مرات مستقلة.
      6. أبلغ عن تركيزات السيتوكينات كقيم مطلقة (pg/mL) دون تطبيع إضافي، حيث أن كثافة بذر الخلايا وظروف المعالجة متسقة عبر جميع المجموعات.

7. التطبيق العلاجي في الجسم الحي في نموذج تصلب الشرايين

ملاحظة: يجب أن تتم الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة العناية والاستخدام المؤسسي المعني.

1. تأسيس نموذج الحيوان
   1. إنشاء نموذج لويحة تصلب شرايين ضعيفة لدى ذكر عمره 8 أسابيع من الفئران المصابة ببروتينات E (ApoE⁻/⁻) (خلفية C57BL/6).
   2. أطعم الفئران نظاما غذائيا عالي الدهون يحتوي على 15٪ من الدهون و0.25٪ من الكوليسترول حسب الصلاحية لمدة أسبوع قبل الجراحة واستمر لمدة 4 أسابيع بعد الجراحة.
   3. قم بتخدير الفئران بالإيزوفلوران (2٪–3٪ للتحفيز و1.5٪–2٪ للصيانة) وإعطاء البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ، تحت الجلد) لتخفيف الألم أثناء جراحة تضيق الشريان السباتي.
   4. ضيق الشريان السباتي الأيسر باستخدام إبرة قطرها 0.3 مم موضوعة بجانب الشريان. اربط رباط حريري 6-0 حول الشريان والإبرة، ثم أزل الإبرة لإحداث انقباض جزئي.
   5. تأكيد تكون اللويحات الضعيفة بعد 4 أسابيع من الجراحة من خلال تقييم نسيج.
   6. قم بإجراء الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E)، وزيت أحمر O، وتلوين ماسون ثلاثي الألوان لتقييم شكل البلاك، وترسيب الدهون، ومحتوى الكولاجين.
   7. حدد اللويحات العرضة حسب مساحة اللويحات > 40٪ من مساحة المقطع العرضي للأوعية، وسمك غطاء الليفية < 120 ميكرومتر، ومساحة نواة الدهون > 40٪ من إجمالي مساحة البلاك، وتسرب كبير للبلاعم الإيجابية ل CD68.
2. حقن 100 ميكرولتر من النوربيكولات النارية الموسومة ب DiI من MMM/COL عبر الوريد عبر الوريد بجرعة 2 ملغ/كجم (استنادا إلى كتلة نواة PLGA).
   1. صور الفئران بعد يوم واحد من الحقن باستخدام نظام تصوير داخل الجسم لتقييم التوزيع الحيوي للجسم بالكامل.
      1. تخدير الفئران بالإيزوفلوران (3٪ للتحفيز و1.5٪–2٪ للصيانة، مع معدلات تدفق أكسجين 1 و0.5 لتر/دقيقة على التوالي). راقب عمق التخدير حسب معدل التنفس وردة فعل قرص القدم.
      2. ضع الفئران مستلقية على مرحلة ساخنة بزاوية 37°C للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء التصوير.
      3. احصل على صور فلورية باستخدام إعدادات DiI (الإثارة 549 نانومتر والانبعاث 565 نانومتر) باستخدام مجموعة مرشح CY3 أو TRITC. استخدم وضع التعريض التلقائي (عادة 50–200 مللي ثانية) واكتساب التألق فوق الفلوري.
      4. التقاط صور الحقول الساطعة المقابلة في نفس الوقت للمرجعية التشريحية بدقة 1024 × 1024 بكسل.
   2. احصد الأعضاء الرئيسية والشرايين السباتية لتصوير فلوري خارج الجسم.
      1. تخدير الفئران بالإيزوفلوران (3٪ للتحفيز و2.5٪–3٪ للصيانة).
      2. حقن فئران تحتوي على 20 مل من PBS البارد جدا (pH 7.4) عبر ثقب البطين الأيسر بمعدل تدفق 5 مل/دقيقة لإزالة الدم المتبقي وNPs غير المربوطة.
      3. احصد الأعضاء (القلب، الشريان الأبهري، الكبد، الطحال، الكلى، والرئة) فور انتهاء التروية بعد 24 ساعة من الحقن.
      4. شطف الأعضاء المحصودة في PBS البارد جدا لإزالة الدم السطحي.
      5. افتح الشريان الأبهر طوليا وثبته بشكل مسطح (الجانب البطاني للأعلى) على صفيحة سيليكون أسود باستخدام دبابيس من الفولاذ المقاوم للصدأ.
      6. احتفظ بالأنسجة في PBS باردة جدا وقم بإجراء تصوير فلوري خارج الجسم خلال 30 دقيقة من الحصاد. قم بإزالة فائض PBS من سطح النسيج مباشرة قبل التصوير.
3. إجراء الجرعات والعلاج
   1. تحديد جرعة الكولشيسين من دراسة الجرعة والاستجابة الأولية (0.01–0.45 ملغ/كغ، n = 7 لكل مجموعة). اختر 0.05 ملغ/كجم من الكولشيسين كجرعة علاجية.
   2. أعط 100 ميكرولتر عن طريق حقن وريد الذيل، وهو ما يعادل جرعة NP تبلغ 2 ملغ/كغ (كتلة نواة PLGA) وجرعة كولشيسين 0.05 ملغ/كغ. حقنه مرة واحدة يوميا لمدة 14 يوما متتالية.
   3. قم بتقسيم الفئران عشوائيا إلى مجموعات علاجية (PBS، الكولشيسين الحر، وMMM/COL NPs) باستخدام مولد أرقام عشوائية. قم بإجراء جميع القياسات بواسطة مراقبين اثنين معميين عن مجموعات العلاج.
   4. طبق النقاط الإنسانية مثل فقدان وزن الجسم بنسبة >20٪، ضعف الحركة، أو علامات الضيق.
4. إجراء تحليل نقاط النهاية
   1. قتل الفئران بعد 24 ساعة من الحقن النهائي. احصد الشرايين السباتي والأبهر. قم بتقييم عبء البلاك عن طريق الوجه أو صبغة الزيت الأحمر في الشريان الأبهري.
   2. قم بقياس مساحة اللويحات
      1. قم بقياس مساحة اللويحة كنسبة المساحة الموجبة للزيت الأحمر O-موجبة من إجمالي مساحة تجويف الشريان الأبهر بالمقطع العرضي (خمسة مقاطع لكل فأرة) باستخدام برنامج تحليل الصور.
      2. افتح الصورة في برنامج تحليل الصور ImageJ.
      3. انقر على الصورة → اكتب → 8-بت لتحويل الصورة إلى التدرج الرمادي.
      4. انقر على الصورة → تعديل → العتبة. اختر طريقة أوتسو وطبق العتبة لتحديد مناطق O-موجبة الحمراء الزيتية.
      5. تطبيق نفس معلمات العتبة على جميع الصور العينة وسجل إعدادات العتبة للتحقق.
      6. انقر على تحليل → حدد القياسات واختر المنطقة.
      7. انقر على تحليل → قياس لقياس المناطق المختارة.
      8. تصدير البيانات الكمية.
   3. تقييم استقرار البلاك
      1. تقييم استقرار اللويحات من خلال التلوين النسيجي لمقطع السبايا باستخدام H&E، Oil Red O، وتلوين ماسون الثلاثي الألوان. قم بقياس الكولاجين كنسبة منطقة البلاك الثلاثية الموجبة لماسون.
      2. تحضير مقاطع مدمجة بالبارافين بسماكة 5 ميكرومتر وقطع مجمدة مدمجة بدرجة حرارة قطع مثلى بسماكة 8 ميكرومتر.
      3. قم بصبغ H&E عن طريق إزالة البارافين وإعادة ترطيب الأجزاء، تليها صبغة الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق وصبغ الإيوزين لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT؛ 23°C ± 2°C).
      4. قم بصبغ زيت أحمر على الأقسام المجمدة عن طريق الحضانة بمحلول Oil Red O لمدة 15 دقيقة عند RT. تميز الأقسام بمحلول إيزوبروبانول 60٪ لمدة 2 ثانية ثم اشطفه بالماء المقطر.
      5. قم بصبغ ماسون الثلاثي اللون وفقا لتعليمات المجموعة عن طريق حضن مقاطع بهيماتوكسيلين الحديد من ويغرت لمدة 10 دقائق، وفوسين بوسو الحمضي لمدة 5 دقائق، وحمض الفوسفوموليبديك لمدة 5 دقائق، والأنيلين الأزرق لمدة 5 دقائق عند المعالجة.
      6. الصور النسيجية المفتوحة في برنامج تحليل الصور.
      7. تطبيق عتبة اللون لتحديد المناطق الموجبة للكولاجين. قم بإجراء التحديد التلقائي وتطبيق نفس المعلمات على جميع الصور العينة.
      8. سجل إعدادات العتبة للتحقق.
      9. عرف مساحة البلاك الكلية بأنها مجموع جميع مناطق البلاك داخل النسيج الوعائي الداخلي.
      10. قس مساحة البلاك عن طريق تتبع حدود البلاك يدويا أو باستخدام تقسيم العتبة تلقائيا لتحديد جميع مناطق البلاك.
      11. قس مساحة الكولاجين الإيجابية.
      12. احسب محتوى الكولاجين كمساحة إيجابية للكولاجين مقسومة على إجمالي مساحة البلاك × 100٪.
   4. تقييم محتوى البلاعم
      1. قم بإجراء صبغة الفلورة المناعية CD68 لتقييم محتوى البلعمية. قم بقياس محتوى البلاعم كنسبة المساحة الموجبة ل CD68 من منطقة اللويح.
      2. جهز مقاطع الأنسجة (سمك 5 ميكرومتر للأقسام المدمجة بالبارافين). قم بسحب المستضد باستخدام محلول السيترات (pH 6.0) تحت ضغط عالي لمدة دقيقتين.
      3. أقسام البلوك مع 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة في RT.
      4. حضن مقاطع بالجسم المضاد الأولي وحيد النسيلة CD68 المضاد للفأر للأرنب (نسخة D4B9C، تخفيف 1:200 في 1٪ BSA) خلال الليل عند 4°C.
      5. حضن مقاطع باستخدام الجسم المضاد الثانوي IgG مضاد للأرانب أليكسا فلور 488 (تخفيف 1:500) لمدة ساعة واحدة في RT.
      6. أنوية الصبغة المضادة باستخدام 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) لمدة 5 دقائق.
      7. صور فلورية مفتوحة في برنامج تحليل الصور.
      8. حدد المناطق الموجبة ل CD68 باستخدام العتبة. قم بإجراء التحديد التلقائي وتطبيق نفس المعلمات على جميع الصور العينة.
      9. سجل إعدادات العتبة للتحقق.
      10. قس المنطقة الإيجابية CD68.
      11. احسب محتوى البلاعم كمساحة إيجابية ل CD68 مقسومة على إجمالي مساحة البلاك × 100٪.

Results

تم إجراء قياسات DLS باستخدام نظام Zetasizer Nano ZS عند 25°C مع زاوية ارتداد 173°C. تم تخفيف العينات 20 ضعفا في ماء منزوع الأيونات (تركيز نهائي حوالي 0.1 ملغ/مل) وتم توازنها لمدة دقيقتين قبل القياس. تم قياس كل عينة على ثلاث نسخ، وتعرض النتائج كمتوسط ± SD. تكشف DLS وTEM عن زيادة في حجم NP بعد طلاء الغشاء وتؤكدان تكوين بنية النواة-القشرة (الشكل 1). تظهر نقاط الطاقة الذاتية ذات المستوى المنخفض قطر هيدروديناميكي 180.8 ± 5.2 نانومتر، ومؤشر PDI يبلغ 0.12 ± 0.03، و...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة شاملة لبناء وتطبيق المعالجات العصبية المعدلة معا مع CD47 وα4/β1 المعدلة معا في الغشاء البلعمي لعلاج تصلب الشرايين المستهدف. تشمل المزايا الرئيسية لهذا النظام الاستهداف النشط عبر تفاعل الإنتجين α4/β1–VCAM-1 وتقليل امتصاص البلعم المرتبطة بالإشارات التي تعبر عن CD47، كما تدعمها اختبارات الامتصاص في المختبر (الشكل 3) ونتائج التوزيع الحيوي في الجسم الحي (الشكل 4). استخدام الأغشية المعدلة، بدلا من ال...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-أمينوأكتينوميسين D (7-AAD)	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	A1310	صبغة قابلية الاستخدام لقياس تدفق الخلايا الحية أو الميتة
أليكسا فلور 488-مخرج مضاد للأرانب IgG	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	A-11008	الجسم المضاد الثانوي لتلوين الفلورية المناعية CD68
الجسم المضاد المضاد للفأر CD47	أبكام (الولايات المتحدة الأمريكية)	AB214453	يستخدم في تحليل البقعة الغربية للتحقق من تعبير CD47
مضاد الفأرة للتكامل، وalpha؛ أربعة أجسام مضادة (B-2)	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (الولايات المتحدة الأمريكية)	SC-376334	يستخدم في تحليل البقعة الغربية للتحقق من الإنترجين والألفا؛ تعبير 4
إنترجين مضاد الفأرة وتبيتا؛ جسم مضاد واحد (A-4)	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (الولايات المتحدة الأمريكية)	SC-374429	يستخدم في تحليل النقطة الغربية للتحقق من الإنتغرين وبيتا؛ تعبير واحد
ApoE-/-	مختبر جاكسون (الولايات المتحدة الأمريكية)	لا يوجد	يستخدم في نموذج تصلب الشرايين داخل الجسم الحي
مجموعة اختبار BCA	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	23225	يستخدم لتحديد تركيز البروتين
صفيحة سيليكون سوداء	لا يوجد	لا يوجد	استخدم لتركيب الشريان الأبهر للتصوير خارج الجسم الحي
بلازميد CD47 (pcDNA3.1(+))	جينراي بيوتيك (الصين)	G0177361-1	يحتوي على جين Cd47 للفأر للتعبير الزائد
الكولشيسين	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	C9754	الحمولة العلاجية في الجسيمات النانوية
مجهر الليزر الكونفوكال الماسح	لايكا مايكروسيستمز	TCS SP8	يستخدم في تصوير الفلورة وتحليل التموضع المشترك
عازل السيترات (pH 6.0)	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	لا يوجد	يستخدم لاسترجاع المستضدات في التلوين المناعي الفلوري
أنابيب الغسيل الكلوي (MWCO 3,500 دالتون)	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	PURD35030	يستخدم لتنقية الجسيمات النانوية
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	D2447	مذيب لتحضير الجسيمات النانوية
DiI (1,1′-ديأوكتاديسيل-3,3,3&برايم;,3&برايم;-رباعي ميثيلين دوكربوكروسيانين بيركلورات)	بيوتايم (الصين)	C1036	وسم الفلورية لنواة الجسيمات النانوية
DiO (3,3′-ديأوكتاديكسيلوكساكاربوكربوكانين بيركلورات)	بيوتايم (الصين)	C1038	وسم الفلورية لغشاء البلاعم
مدير	بيوتايم (الصين)	Y239280	يستخدم في التصوير الفلوري داخل الجسم الحي
DAPI	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	D3571	التلوين النووي المضاد للتصوير الفلوري
دولبيكو' النسر المتوسط المعدل (DMEM)	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	11965092	وسط زراعة الخلايا
محلل تشتت الضوء الديناميكي (Zetasizer Nano ZS)	مالفرن بانالياليكال (المملكة المتحدة)	لا يوجد	يستخدم لقياسات تشتت الضوء الديناميكي (DLS) لحجم الجسيمات النانوية، ومؤشر التبليل، وجهد زيتا
مجموعة ELISA	R& دي سيستمز (الولايات المتحدة الأمريكية)	يعتمد ذلك على السيتوكين المستهدف	يستخدم لقياس السيتوكينات الالتهابية
إندوثيلين-1 (ET-1)	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	E7764	يستخدم لتحفيز الإنتجرين والألفا؛ 4/β تعبير واحد
مصل البقر الجنيني (FBS)	جيبكو (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية)	10091148	مكمل لوسط زراعة الخلايا
مقياس التدفق الخلوي	كلية العلوم الحيوية لكلية الأعمال (الولايات المتحدة الأمريكية)	FACSCalibur	يستخدم لاكتساب إشارة الفلورة
برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (FlowJo v10.8.1)	كلية العلوم الحيوية لكلية الأعمال (الولايات المتحدة الأمريكية)	لا يوجد	يستخدم لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs)	شركة فوهينغ للتقنيات الحيوية (الصين)	FH1122	يستخدم في اختبارات الاستهداف في المختبر
برنامج تحليل الصور (ImageJ)	المعاهد الوطنية للصحة (الولايات المتحدة الأمريكية)	لا يوجد	يستخدم في تحليل الصور الكمي
نظام التصوير في الجسم الحي	بيركين إلمر (الولايات المتحدة الأمريكية)	IVIS لومينا III	يستخدم في تصوير الفلورة للجسم بالكامل
إيزوبروبانول (60٪)	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	34863	يستخدم للتمايز أثناء صبغ Oil Red O
ليبوفكتامين 3000	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	L3000001	كاشف النقل
التحريك المغناطيسي وقضيب التحريك	لا يوجد	لا يوجد	يستخدم في تحضير الجسيمات النانوية
ماسون مجموعة صبغة ثلاثية اللون	أبكام (الولايات المتحدة الأمريكية)	ab150686	يستخدم لصبغ الكولاجين
البثق الصغير	أفانتي بولار ليبيدز (الولايات المتحدة الأمريكية)	610000	يستخدم في بثق الغشاء
خط خلايا مورين RAW 264.7	شركة فوهينغ للتقنيات الحيوية (الصين)	FH0328	مصدر البلاعم
خط خلايا العضلات الملساء في الفئران	شركة فوهينغ للتقنيات الحيوية (الصين)	FH-Y063	يستخدم لتقييم السلامة
أويل ريد أو	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	O0625	يستخدم لصبغ الدهون
أوبتي-مم	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	31985062	وسط مصل مختزل للنقل
البروتين الدهني المؤكسد منخفض الكثافة (Ox-LDL)	شركة يييوان للتقنيات الحيوية (الصين)	YB-002	يستخدم لتحفيز تكوين خلايا الرغوة
البنسلين – ستريبتوميسين	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	15140122	مكمل مضاد حيوي لزراعة الخلايا
فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	78830	مثبط البروتيز
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	10010023	مخزن الغسيل والتخفيف
البولي (حمض اللاكتيك-كو-غليكوليك) (PLGA، 50:50؛ ميغاوات 90,000)	داليان ميلون للتكنولوجيا الحيوية (الصين)	MB5649-1	البوليمر لتصنيع الجسيمات النانوية
مرشحات غشاء البولي كربونات (200 نانومتر، 400 نانومتر)	واتمان (المملكة المتحدة)	800282	يستخدم في البثق
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	P9333	مكون مخزن التحليل
كاشف P3000	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	L3000001	معزز النقل
الميكروتوم الدوار	لايكا بيوسيستمز (ألمانيا)	RM2235	يستخدم في تقسيمة البارافين
مضخة الحقنة	جهاز هارفارد (الولايات المتحدة الأمريكية)	70-3007	يستخدم في تكوين الجسيمات النانوية المتحكم بها
المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)	ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)	تالوس F200S	يستخدم في تصوير الجسيمات النانوية
تريس-HCl	سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)	T2663	مكون المخزن المؤقت
عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)	R& دي سيستمز (الولايات المتحدة الأمريكية)	410-MT	يستخدم لتنشيط خلايا البطانة
الماء فائق النقاء	ميلي-كيو (ميرك، الولايات المتحدة الأمريكية)	ZMQSV0T01	يستخدم في تحضير الجسيمات النانوية وغسيل الكلى