Method Article

عزل وتخليق وتوصيف الجسيمات النانوية المغطاة بغشاء البلاعم المعدلة (حمض اللاكتيك-كو-جليكوليك) المغطاة بغشاء البلاعم المعدلة و-CD47 والإنتجرين α4/β1

DOI:

10.3791/70791

May 29th, 2026

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح هذا البروتوكول تحضير وتوصيف الجسيمات النانوية المغطاة بغشاء البلاعم (حمض اللاكتيك-كو-جليكوليك) المعدلة معا مع الميكروفون α4/β1 والإنتجرين لتطبيقات توصيل الأدوية المستهدفة.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن ويساهم بشكل رئيسي في أمراض القلب والأوعية الدموية والوفيات. لا يزال توصيل العوامل المضادة للالتهابات المستهدف إلى مواقع تصلب الشرايين تحديا كبيرا. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحضير وتوصيف جسيمات البولي (حمض اللاكتيك-كو-غليكوليك) المحملة بأغشية البلاعم المغطاة بغلاف الكولكيسين (MMM/COL NPs) المعدلة بشكل مشترك من CD47 والإنتجرين α4/β1. يشمل البروتوكول تعديل البلاعم عبر نقل البلازميدات وتحفيز بطانة البطانة 1، وعزل الغشاء، وتصنيع NP، وطلاء الغشاء. يتم تقييم النوايا الناتجة من MMM/COL باستخدام التوصيف الفيزيائي-الكيميائي، وتحليل تعبير البروتين، والاختبارات في المختبر وفي الجسم الحي . يشمل التحقق الوظيفي تقييم الارتباط الخلوي بالخلايا البطانية النشطة، وامتصاص البلعميات، والتأثيرات المضادة للالتهابات في خلايا الرغوة، والتوزيع الحيوي في نموذج تصلب الشرايين في الفوار. بالإضافة إلى ذلك، يتم تسليط الضوء على معايير التجارب الرئيسية وخطوات مراقبة الجودة لضمان قابلية التكرار والاتساق عبر المختبرات. يوفر هذا البروتوكول نهجا قويا وقابلا للتوسع لتوليد مضادات حيوية للتعاطي الحيوية لتطبيقات توصيل الأدوية المستهدفة في أبحاث تصلب الشرايين.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن يؤدي إلى أحداث قلبية ووعائية قاتلة وسكتة دماغية من خلال تضيق تجويف الشريان وتمزق اللويحات غير المستقر، مما يشكل عبئا صحيا عالميا كبيرا 1,2,3. خفض تنظيم الاستجابات الالتهابية في موقع تصلب الشرايين هو هدف علاجي رئيسي 4,5. أظهر الكولشيسين، وهو دواء قوي مضاد للالتهابات، وعدا في تقليل الأحداث القلبية الوعائية السلبية 6,7. ومع ذلك، فإن فائدته السريرية محدودة بسبب نافذة علاجية ضيقة وآثار جانبية جهازي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى برج نانجينغ درام، واتبعت الإرشادات الخاصة برعاية واستخدام الحيوانات المخبرية التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة.

1. تعديل بلاعم RAW 264.7

  1. تحضير خلايا RAW 264.7، وإكمال وسط النسر المعدل من Dulbecco مع إضافة 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين، بلازميد CD47 للتعبير الزائد، كاشف النقل Lipofectamine 3000، الإندوثلين-1 (ET-1)، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، وإمدادات زراعة الأنسجة المعقمة.
  2. زراعة الخلايا RAW 264.7 في حاضنة رطبة عند درجة ح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء قياسات DLS باستخدام نظام Zetasizer Nano ZS عند 25°C مع زاوية ارتداد 173°C. تم تخفيف العينات 20 ضعفا في ماء منزوع الأيونات (تركيز نهائي حوالي 0.1 ملغ/مل) وتم توازنها لمدة دقيقتين قبل القياس. تم قياس كل عينة على ثلاث نسخ، وتعرض النتائج كمتوسط ± SD. تكشف DLS وTEM عن زيادة في حجم NP بعد طلاء الغشاء وتؤكدان تكوين بنية النواة-القشرة (الشكل 1). تظهر نقاط الطاقة الذاتية ذات المستوى المنخفض قطر هيدروديناميكي 180.8 ± 5.2 نانومتر، ومؤشر PDI يبلغ 0.12 ± 0.03، و.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة شاملة لبناء وتطبيق المعالجات العصبية المعدلة معا مع CD47 وα4/β1 المعدلة معا في الغشاء البلعمي لعلاج تصلب الشرايين المستهدف. تشمل المزايا الرئيسية لهذا النظام الاستهداف النشط عبر تفاعل الإنتجين α4/β1–VCAM-1 وتقليل امتصاص البلعم المرتبطة بالإشارات التي تعبر عن CD47، كما تدعمها اختبارات الامتصاص في المختبر (الشكل 3) ونتائج التوزيع الحيوي في الجسم الحي (الشكل 4). استخدام الأغشية المعدلة، بدلا من ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتور جينشوان تشاو والدكتورة جياتشي يو على نصائحهم العلمية، وفريق PROMAB على دعمهم الفني.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7-أمينوأكتينوميسين D (7-AAD)ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)A1310صبغة قابلية الاستخدام لقياس تدفق الخلايا الحية أو الميتة
أليكسا فلور 488-مخرج مضاد للأرانب IgGثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)A-11008الجسم المضاد الثانوي لتلوين الفلورية المناعية CD68
الجسم المضاد المضاد للفأر CD47أبكام (الولايات المتحدة الأمريكية)AB214453يستخدم في تحليل البقعة الغربية للتحقق من تعبير CD47
مضاد الفأرة للتكامل، وalpha؛ أربعة أجسام مضادة (B-2)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (الولايات المتحدة الأمريكية)SC-376334يستخدم في تحليل البقعة الغربية للتحقق من الإنترجين والألفا؛ تعبير 4
إنترجين مضاد الفأرة وتبيتا؛ جسم مضاد واحد (A-4)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (الولايات المتحدة الأمريكية)SC-374429يستخدم في تحليل النقطة الغربية للتحقق من الإنتغرين وبيتا؛ تعبير واحد
ApoE-/-مختبر جاكسون (الولايات المتحدة الأمريكية)لا يوجديستخدم في نموذج تصلب الشرايين داخل الجسم الحي
مجموعة اختبار BCAثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)23225يستخدم لتحديد تركيز البروتين
صفيحة سيليكون سوداءلا يوجدلا يوجداستخدم لتركيب الشريان الأبهر للتصوير خارج الجسم الحي
بلازميد CD47 (pcDNA3.1(+))جينراي بيوتيك (الصين)G0177361-1يحتوي على جين Cd47 للفأر للتعبير الزائد
الكولشيسينسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)C9754الحمولة العلاجية في الجسيمات النانوية
مجهر الليزر الكونفوكال الماسحلايكا مايكروسيستمزTCS SP8يستخدم في تصوير الفلورة وتحليل التموضع المشترك
عازل السيترات (pH 6.0)ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)لا يوجديستخدم لاسترجاع المستضدات في التلوين المناعي الفلوري
أنابيب الغسيل الكلوي (MWCO 3,500 دالتون)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)PURD35030يستخدم لتنقية الجسيمات النانوية
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)D2447مذيب لتحضير الجسيمات النانوية
DiI (1,1′-ديأوكتاديسيل-3,3,3&برايم;,3&برايم;-رباعي ميثيلين دوكربوكروسيانين بيركلورات)بيوتايم (الصين)C1036وسم الفلورية لنواة الجسيمات النانوية
DiO (3,3′-ديأوكتاديكسيلوكساكاربوكربوكانين بيركلورات)بيوتايم (الصين)C1038وسم الفلورية لغشاء البلاعم
مديربيوتايم (الصين)Y239280يستخدم في التصوير الفلوري داخل الجسم الحي
DAPIثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)D3571التلوين النووي المضاد للتصوير الفلوري
دولبيكو' النسر المتوسط المعدل (DMEM)ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)11965092وسط زراعة الخلايا
محلل تشتت الضوء الديناميكي (Zetasizer Nano ZS)مالفرن بانالياليكال (المملكة المتحدة)لا يوجديستخدم لقياسات تشتت الضوء الديناميكي (DLS) لحجم الجسيمات النانوية، ومؤشر التبليل، وجهد زيتا
مجموعة ELISAR& دي سيستمز (الولايات المتحدة الأمريكية)يعتمد ذلك على السيتوكين المستهدفيستخدم لقياس السيتوكينات الالتهابية
إندوثيلين-1 (ET-1)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)E7764يستخدم لتحفيز الإنتجرين والألفا؛ 4/β تعبير واحد
مصل البقر الجنيني (FBS)جيبكو (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية)10091148مكمل لوسط زراعة الخلايا
مقياس التدفق الخلويكلية العلوم الحيوية لكلية الأعمال (الولايات المتحدة الأمريكية)FACSCaliburيستخدم لاكتساب إشارة الفلورة
برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (FlowJo v10.8.1)كلية العلوم الحيوية لكلية الأعمال (الولايات المتحدة الأمريكية)لا يوجديستخدم لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs)شركة فوهينغ للتقنيات الحيوية (الصين)FH1122يستخدم في اختبارات الاستهداف في المختبر
برنامج تحليل الصور (ImageJ)المعاهد الوطنية للصحة (الولايات المتحدة الأمريكية)لا يوجديستخدم في تحليل الصور الكمي
نظام التصوير في الجسم الحيبيركين إلمر (الولايات المتحدة الأمريكية)IVIS لومينا IIIيستخدم في تصوير الفلورة للجسم بالكامل
إيزوبروبانول (60٪)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)34863يستخدم للتمايز أثناء صبغ Oil Red O
ليبوفكتامين 3000ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)L3000001كاشف النقل
التحريك المغناطيسي وقضيب التحريكلا يوجدلا يوجديستخدم في تحضير الجسيمات النانوية
ماسون مجموعة صبغة ثلاثية اللونأبكام (الولايات المتحدة الأمريكية)ab150686يستخدم لصبغ الكولاجين
البثق الصغيرأفانتي بولار ليبيدز (الولايات المتحدة الأمريكية)610000يستخدم في بثق الغشاء
خط خلايا مورين RAW 264.7شركة فوهينغ للتقنيات الحيوية (الصين)FH0328مصدر البلاعم
خط خلايا العضلات الملساء في الفئرانشركة فوهينغ للتقنيات الحيوية (الصين)FH-Y063يستخدم لتقييم السلامة
أويل ريد أوسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)O0625يستخدم لصبغ الدهون
أوبتي-ممثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)31985062وسط مصل مختزل للنقل
البروتين الدهني المؤكسد منخفض الكثافة (Ox-LDL)شركة يييوان للتقنيات الحيوية (الصين)YB-002يستخدم لتحفيز تكوين خلايا الرغوة
البنسلين – ستريبتوميسينثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)15140122مكمل مضاد حيوي لزراعة الخلايا
فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)78830مثبط البروتيز
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)10010023مخزن الغسيل والتخفيف
البولي (حمض اللاكتيك-كو-غليكوليك) (PLGA، 50:50؛ ميغاوات 90,000)داليان ميلون للتكنولوجيا الحيوية (الصين)MB5649-1البوليمر لتصنيع الجسيمات النانوية
مرشحات غشاء البولي كربونات (200 نانومتر، 400 نانومتر)واتمان (المملكة المتحدة)800282يستخدم في البثق
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)P9333مكون مخزن التحليل
كاشف P3000ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)L3000001معزز النقل
الميكروتوم الدوارلايكا بيوسيستمز (ألمانيا)RM2235يستخدم في تقسيمة البارافين
مضخة الحقنةجهاز هارفارد (الولايات المتحدة الأمريكية)70-3007يستخدم في تكوين الجسيمات النانوية المتحكم بها
المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)ثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)تالوس F200Sيستخدم في تصوير الجسيمات النانوية
تريس-HClسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)T2663مكون المخزن المؤقت
عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)R& دي سيستمز (الولايات المتحدة الأمريكية)410-MTيستخدم لتنشيط خلايا البطانة
الماء فائق النقاءميلي-كيو (ميرك، الولايات المتحدة الأمريكية)ZMQSV0T01يستخدم في تحضير الجسيمات النانوية وغسيل الكلى

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Macrophage MembranePoly Lactic Glycolic AcidNanoparticle SynthesisMembrane CoatingCD47 ModificationIntegrin Alpha4 Beta1Plasmid TransfectionProtein Expression AnalysisTargeted Drug DeliveryAtherosclerosis Model

Related Articles