يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

يرتبط التهاب دواعم الأسنان القمي المزمن بقصر الحمل عبر مسار TLR4/MyD88/NF-κB

161 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70793

⸱

مايو 15, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقييم مسببات الأمراض الفموية المرتبطة بالتهاب دواعم الأسنان القمي المزمن (P. gingivalis, F. nucleatum) باستخدام نماذج CAP في الفئران واختبارات عدوى التروفوبلاست البشرية. لوحظ قصر الحمل إلى جانب تنشيط التهاب المشيمة المتوافق مع إشارات TLR4/MyD88/NF-κB. يمكن اكتشاف الحمض النووي البكتيري في الأنسجة المشيمية/الأوعية، مما يدعم رابطا دمويا وأهدافا محتملة للتدخل.

الملخص

لا تزال الولادة المبكرة التلقائية (sPTB؛ الولادة قبل الأسبوع 37) سببا رئيسيا لوفيات حديثي الولادة، وترتبط العدوى داخل الرحم بنسبة كبيرة من الحالات. تربط الأدلة الناشئة مسببات الأمراض الفموية مثل Porphyromonas gingivalis وFusobacterium nucleatum بنتائج الحمل السلبية؛ ومع ذلك، لا تزال المسارات الميكانيكية التي تربط التهاب دواعم الأسنان القمي المزمن (CAP) بخطر الحمل غير محددة بشكل كامل. في الفئران الحوامل C57BL/6J، تم تأسيس CAP عن طريق تلقيح قناة الجذر وتم تدعيمه بنموذج تحدي الوريد الذيلي باستخدام تعليق بكتيريا (1 × 108 CFU/mL). تم تقييم طول الحمل، وعلم النسيج المرضي للمشيمة، والعلامات الالتهابية، وإشارات الحمض النووي البكتيري بواسطة qPCR. بالتوازي، تعرضت الخلايا المغذية البشرية ل P. gingivalis أو F. nucleatum (MOI = 50، 24 ساعة) لفحص الإشارات الالتهابية المتوافقة مع تنشيط محور TLR4/MyD88/NF-κB. مقارنة بمجموعة المراقبة، أظهرت المجموعات المرتبطة ب CAP تقصرا في فترة الحمل (الوسيط 19.5 مقابل 20.5 يوما)، مصحوبا بزيادة في قراءات التهاب المشيمة (بما في ذلك ارتفاع IL-1β وTNF-α) وميزات نسيجية مرضية تتوافق مع الإصابة الالتهابية. أشار qPCR أيضا إلى وجود إشارات الحمض النووي البكتيري في الأنسجة المشيمية والأوعية الدموية. في اختبارات التروفوبلاست، أثارت F. nucleatum استجابات التهابية أقوى من P. gingivalis، بالتزامن مع زيادة فسفر NF-κB. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن مسببات الأمراض الفموية المرتبطة ب CAP قد تساهم في قصر فترة الحمل من خلال دفع التهاب المشيمة عبر إشارات TLR4/MyD88/NF-κB، مما يدعم محور الميكروبات الفموية-المشيمة كهدف محتمل للتخفيف من مخاطر الحمل المرتبطة بالعدوى.

المقدمة

يعرف الولادة المبكرة التلقائية (sPTB) بأنها الولادة التي تحدث بين الأسبوع 20–37 من الحمل دون تدخل طبي1. وباعتبارها مصدر قلق عالمي حيوي للصحة العامة، تتراوح نسبة حدوث sPTB بين حوالي 5٪–9٪ في الدول المتقدمة إلى 12٪–18٪ في المناطق ذات الموارد المحدودة 2,3. تظل الولادة المبكرة ومضاعفاتها سببا رئيسيا للوفاة بين الأطفال دون سن الخامسة، حيث تمثل حوالي مليون وفاة حديثة الولادة سنويا4. غالبا ما يعاني الناجون من مضاعفات فورية مثل متلازمة ضيق التنفس، وتبعات طويلة الأمد، بما في ذلك الشلل الدماغي وتأخر النمو5،6، مما يفرض أعباء اقتصادية كبيرة على العائلات والمجتمع7،8.

أسباب sPTB متعددة العوامل، حيث تعكس التفاعلات بين عوامل الأم والجنين والعوامل البيئية، بما في ذلك خلل انقباض الرحم، قصور عنق الرحم، اضطرابات الغدد الصماء، اضطرابات المشيمة، والعدوى داخل الرحم. تعتبر العدوى داخل الرحم مساهما رئيسيا ويقدر أنها تمثل حوالي 30٪–40٪ من حالات الولادة المبكرة10,11. قد تصل مسببات الأمراض إلى التجويف الأمنيوسي عبر طرق صاعدة (مثل المهبل العنقي) أو مسببة للدم، مما ينشط الاستجابات المناعية للمضيف ويعزز إطلاق السيتوكينات الالتهابية (مثل IL-6، TNF-α) والبروستاجلاندينات التي يمكن أن تسبب الولادة12. تساهم الخلايا التروفوبلاستية، كعناصر خلوية رئيسية في واجهة الأم والجنين، في التحمل المناعي وكذلك الدفاع المضاد للميكروبات13.

الكائنات الدقيقة الفموية، بما في ذلك Porphyromonas gingivalis وFusobacterium nucleatum، متورطة في العمليات الالتهابية المرتبطة ب sPTB، ربما من خلال البكتيريا و/أو انتشار الوسطاء الالتهابيين14. هذه الأنواع هي مسببات أمراض لثة الدواعم، وقد تم الإبلاغ عن ارتباطات بين التهاب دواعم السن والتهاب اللثة في الدراسات الوبائية والسريرية 15,16,17. ومن الجدير بالذكر أن P. gingivalis و F. nucleatum غالبا ما يتم اكتشافهما في التهاب دواعم السن القمي المزمن (CAP)18,19، ومع ذلك لا تزال العلاقة بين التهاب اللثة القمي والنتائج السلبية للحمل غير مدروسة بشكل كاف، والمسارات البيولوجية ذات الصلة ليست محددة بالكامل20. أبلغ هارجونما وآخرون لأول مرة عن علاقة بين التهاب دواعم الأسنان القمي وانخفاض طول الحمل وانخفاض وزن الولادة في عام 2015:21. لم تدعم دراسة متابعة لنفس المجموعة النقل المباشر للبكتيريا إلى المشيمة، مما يشير إلى أن الالتهاب الجهازي قد يمثل رابطا معقولا بين التهاب دواعم الأسنان القمي ونتائج الحمل22. تماشيا مع هذا التفسير، تم ربط التهاب دواعم الأسنان القمي المؤكد بالأشعة بزيادة خطر الولادة المبكرة والوزن المنخفض23. وباعتباره عدوى خفية مستمرة، قد يساهم CAP في خطر الحمل من خلال الالتهاب الجهازي المزمن منخفض الدرجة و/أو التعرض الدموي لمكونات ميكروبية 24,25. لذلك هناك حاجة إلى مزيد من التوضيح لعلاقة CAP مع الحمل لتحسين فهم مسارات الالتهاب الفموية والمشيمة وتوجيه استراتيجيات الوقاية من مخاطر الحمل المرتبطة بالعدوى.

سلطت الدراسات الحديثة الضوء على أهمية محور الإشارة TLR4/MyD88/NF-κB في الولادة المبكرة المرتبطة بالالتهاب. حدد روبرتسون وآخرون TLR4 كهدف علاجي محتمل في المخاض المبكر الناتج عن الالتهاب، وأبلغوا عن تأثيرات وقائية في نماذج حيوانية26. وأظهر بينغ وآخرون أيضا أن miR-199a-3p يخفف من التهاب ظهارة عنق الرحم من خلال تثبيط مسار HMGB1/TLR4/NF-κB27. بالإضافة إلى ذلك، وصف شين وآخرون التأثيرات المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات للسيرينجين في الفئران الحوامل المصابة بالسكري، مع تضمين مسار TLR4/MyD88/NF-κB مرتبطبالتحسينات الملحوظة. معا، تدعم هذه النتائج إطارا ميكانيكيا يساهم فيه الإشارات الالتهابية المرتبطة ب TLR4/MyD88/NF-κB في مسارات مرتبطة بالعدوى تؤثر على التبول، مع الاعتراف بأن عدة مستقبلات مناعية فطرية قد تعمل بالتوازي حسب سياق الممرض.

تقيم هذه الدراسة التأثيرات الحامية المرتبطة ب CAP باستخدام اختبارات التروفوباست المكملية في المختبر ونماذج الفئران في الجسم الحي . يتيح نموذج التروفوبلاست استجوابا مسيطرا على الإشارات الالتهابية الناتجة عن الممرض، في حين يربط نموذج CAP للفئران الحامل الاستجابات الخلوية بأنماط الحمل على مستوى الكائن تحت ظروف الحمل الفسيولوجية. يتضمن نموذج تحدي الوريد الذيلي لتوفير مسار تعرض دموي مكمل ولتقييم ما إذا كانت أنماط التنشيط الالتهابي التي لوحظت في بيئة العدوى الفموية تتكرر عندما تصل المكونات البكتيرية إلى الدورة الدموية الأمومة. على وجه التحديد، يستخدم التعرض للأرومات الغبية ل P. gingivalis و F. nucleatum لتحليل استجابات السيتوكينات وتنشيط محور TLR4/MyD88/NF-κB، بينما تقيم التجارب الحيوانية طول الحمل، والتهاب المشيمة، والكشف القائم على qPCR لإشارات الحمض النووي البكتيري في انقسام السباتي وأنسجة المشيمة. نظرا لأن qPCR يشير إلى وجود حمض نووي بكتيريا بدلا من قابلية البقاء أو تحديد موقع الخلية، فإن التفسيرات المتعلقة بوجود الميكروبات عند واجهة الأم والجنين تبقى حذرة. بالإضافة إلى ذلك، قد تحد اختلافات الأنواع والتعرض التجريبي المسيطر عليه من الترجمة السريرية المباشرة، مما يؤكد الحاجة إلى التحقق لاحقا في بيئات ذات صلة بالبشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للإرشادات الأخلاقية التي وضعتها لجنة أخلاقيات أبحاث الحيوان في أول مستشفى تابع لجامعة شينجيانغ الطبية (رقم الموافقة: IACUC-20231121-13) ووفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية (طبعة 2011). علاوة على ذلك، أجريت هذه الدراسة وفقا لإرشادات ARRIVE. جميع الإمدادات (الكواشف، المواد الاستهلاكية، المعدات، والبرمجيات) ومعلومات الشركة المصنعة وأرقام الكتالوج المقابلة لها مقدمة في جدول المواد لتسهيل قابلية التكرار.

1. الزراعة البكتيرية

تم التعامل مع السلالات المرجعية من Porphyromonas gingivalis وFusobacterium nucleatum (معرفات الإجهاد المقدمة في جدول المواد) تحت ظروف لا هوائية. تم إنشاء الزراعة الأولية على صفائح الأجار الدموية كولومبيا المختزلة مسبقا وحضنتها لاهوائية (85٪ N₂، 10٪ H₂، و5٪ CO₂) عند 37 °م لمدة 48 ساعة. في التحضيرات التجريبية، تم تلقيح مستعمرة واحدة معزولة جيدا في مرق تسريب القلب للدماغ بحجم 40 مل وحضنتها تحت ظروف لاهوائية متطابقة حتى نمو المرحلة اللوغاريتمية المتوسطة (OD660 = 0.6–0.8). لتقليل التعرض للأكسجين، تم إجراء خطوات التطعيم والنقل داخل محطة عمل لاهوائية باستخدام وسائط وأدوات مخفضة مسبقا. تم توحيد تركيزات البكتيريا إلى 1 ×10 8 CFU/mL للتعرض للحيوانات باستخدام القياس القائم على OD660 مع منحنى قياسي OD–CFU خاص بالسلالة تم توليدها تحت نفس ظروف الزراعة؛ تم تحديد منحنى المعايرة من خلال التخفيف التسلسلي والعد المستعمري على ألواح أجار اللاهوائية مع ثلاث معايرة مستقلة على الأقل. في دراسات عدوى التروفوبلاست، تم قياس المعلقات البكتيرية باستخدام طريقة عد موثقة وتخفيفها في وسط زراعة كاملة خال من المضادات الحيوية لتحقيق تعدد العدوى المحدد (MOI) مباشرة قبل الزراعة المشتركة.

2. إسكان الحيوانات وتجميعها

تم إيواء فئران C57BL/6J الخالية من مسببات الأمراض المحددة (عدد = 90؛ 60 أنثى، 30 ذكر) التي تتراوح أعمارها بين 6 و7 أسابيع تحت ظروف محكمة (22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية، 60٪ ± رطوبة 10٪، دورة إضاءة لمدة 12 ساعة) مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بشكل مرضي . بعد أسبوع من التكيف، تم توزيع الفئران عشوائيا إلى ست مجموعات تجريبية (n = 15/مجموعة): ضابط طبيعي (NC)، CAP مع P. gingivalis (AP)، CAP مع F . nucleatum (أينين)، حقن وريد الذيل المحلول الملحي الطبيعي (VN)، حقن وريد الذيل P. gingivalis (VP)، وحقن وريد الذيل في F. nucleatum (VF). تم تسجيل العشوائية وتخصيص الأقفاص لتقليل تحيز التخصيص وتأثيرات الأقفاص المحتملة.

3. تأسيس نموذج CAP

تم إجراء جميع الإجراءات الجراحية تحت ظروف معقمة. تم تحفيز التخدير عن طريق إعطاء الصوديوم بنتوباربيتال (1.62 ملغ/30 جرام وزن الجسم) داخل الصفاق مع كبريتات الأتروبين (12.5 ميكروغرام/30 جرام وزن الجسم)، وتم تأكيد عمق التخدير الكافي من خلال غياب رد فعل انسحاب الدواسات. وضعت الفئران على ظهر على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم، وفتح الفم بلطف لتمكين رؤية مستقرة للأضراس الأولى في الفك العلوي الجانبي. تحت التكبير، تم فتح حجرات اللب في الأضراس الأولى في الفك العلوي الثنائي باستخدام فتحة دائرية معقمة، تلاها إزالة نسيج اللب الإكليلي باستخدام أجهزة دقيقة معقمة. تم تحديد فتحات قناة الجذر باستخدام مبرد جذور صغير (بحجم 06–10)، وتم التفاوض على القنوات بلطف لتحقيق التعقيم مع تجنب القوة الزائدة لتقليل خطر الثقب. تم غسل الحجرة بمحلول ملحي معقم (أو PBS معقم) وتجفيفها بنقاط ورق معقم قبل التطعيم.

تم إجراء التطعيم البكتيري باستخدام تعليق موحد عند 1 × 108 CFU/mL. لجعل الجرعة قابلة لتكرار الجرعات، كان الحجم المسلم ثابتا تشغيليا عند 2 ميكرولتر لكل سن (حوالي 2 ×10 5 وحدة CFU لكل سن)، ويتم تسليمه باستخدام طرف ميكروبايبت معاير موضوع عند مدخل الحجرة. ثم يتم وضع نقطة ورق ماصة معقمة منقوعة مسبقا بنفس التعليق في غرفة اللب للحفاظ على التعرض الموضعي. تم تأكيد نجاح التوصيل من خلال ترطيب نقطة الورق بشكل واضح وعدم وجود تسرب إلى تجويف الفم. بعد التطعيم، تم تجفيف الغرفة بالهواء حتى لا يبقى سائل مرئي، ثم أغلقت بمادة لاصقة أسنانية متصببة بالضوء (20 ثانية)، ثم الترميم باستخدام راتنج مركب قابل للتدفق بالمعالجة الخفيفة (20 ثانية). تم تأكيد سلامة الختم من خلال الفحص البصري والفحص اللطيف؛ أما الترميمات التي أظهرت فجوات أو فقدان مبكر فقد تم إغلاقها فورا. تم توفير مسكنات الألم والمراقبة بعد الإجراء وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات المؤسسية.

بعد أسبوعين، تم الحصول على صور إشعاعية حول الحافة لتأكيد تأسيس CAP. تم تحديد التأسيس الناجح بوضوح شديد في الشفافية حول الحافة مع تغيرات حول العظام تتوافق مع الالتهاب المحيط بالعظام المزمن وتدمير العظام. بدأ التزاوج بعد أسبوعين من العدوى/تأسيس النماذج.

4. تأسيس نموذج حقن وريد الذيل

تم تحضير المعلقات البكتيرية بتركيز 1 × 108 CFU/mL في محلول ملحي معقم. تم تقييد الفئران، وتم تدفئة الذيل لمدة دقيقة إلى دقيقتين لتوسيع الأوردة الجانبية للذيل. تم إجراء الحقن باستخدام إبرة دقيقة (عادة 29–30 G) مدخلة بزاوية مائلة للأعلى في الوريد الجانبي للذيل بزاوية ضحلة (حوالي 10–15°). تم تأكيد الوضع الصحيح عن طريق الوريد من خلال ومضة دم في المحور وحقن سلس مع مقاومة منخفضة؛ أظهر عدم نجاح الحقن زيادة المقاومة و/أو تكوين فم تحت الجلد، وفي هذه الحالة تم إيقاف التسريب وتكراره في موقع أقرب بعد إعادة تسخين قصيرة. تلقت الفئران حقنا يوميا لمدة ثلاثة أيام متتالية (100 ميكرولتر لكل فأر في كل مرة). بعد ثلاثة أيام، تم إسكان الإناث مع الذكور، وتم فحص السدادات المهبلية في صباح اليوم التالي. بعد تأكيد وجود سدادات مهبلية (GD 0.5)، تم إعطاء الحقن كل ثلاثة أيام (100 ميكرولتر لكل فأر في كل مرة) حتى اليوم الخامس عشر من فترة الحمل.

5. تأسيس نموذج الفئران الحامل

تم إسكان الإناث والذكور معا بنسبة 2:1 (إناث إلى ذكر) طوال الليل بدءا من الساعة 20:00 يوميا. تم تصنيف وجود سدادة مهبلية أو مسحة مهبلية إيجابية للحيوانات المنوية في الساعة 08:00 صباح اليوم التالي كيوم حمل (GD) 0.5. لكل فأر، تم تسجيل وزن الجسم الأولي، ووزن ما قبل الولادة، ووزن ما بعد الولادة، وطول الحمل، ووزن الولادة الوليدية، وحجم الولادة، وعدد حالات الولادة الميتة. استنادا إلى دراسات سابقة29,30، تم تعريف الولادة قبل الحمل 18.5 عمليا بأنها ولادة مبكرة في الفئران. نظرا لأن قصر الحمل قد يحدث ضمن نطاق المدة، فقد تم تفسير نتائج الحمل مع مراعاة التمييز بين الولادة المبكرة الحقيقية وأنماط قصر الحمل.

6. جمع العينات ومعالجتها

في اليوم الخامس عشر من الحمل، تم اختيار ثلاث فئران حوامل عشوائيا لكل مجموعة لأخذ عينات من المشيمة والأوعية الدموية (NC/AP/AF وVN/VP/VF). بعد التخدير الناتج عن الحقن داخل الصفاق من الصوديوم البنتوباربيتال (1.62 ملغ لكل 30 جرام من وزن الجسم) وكبريتات الأتروبين (12.5 ميكروغرام لكل 30 جرام من وزن الجسم)، تم الحصول على عينات دم عبر النزيف الرجعي الحجاج. تم إعدام الفئران في غرفة ثاني أكسيد الكربون حتى تأكد الوفاة لغياب التنفس أو نبض القلب أو رد فعل القرنية؛ اتبع توصيل ثاني أكسيد الكربون نهجا تدريجيا للتعبئة المتوافقة مع إرشادات رفاهية الحيوانات المؤسسية. تم جمع انقسام الشريان السباتي وأنسجة المشيمة بسرعة باستخدام أدوات معقمة لتقليل التلوث عبر العينات. تم تقسيم نسيج المشيمة إلى جزأين: تم تخزين جزء عند درجة حرارة −80 درجة مئوية، والجزء الآخر مثبت في الفورمالين المحايد 10٪ لمدة 24 ساعة، تلاها عملية تجفيف الإيثانول بدرجات ودمج البارافين. تمت مراقبة الفئران المتبقية لوزن الجسم اليومي، وطول الحمل، وحجم الولادة، ووزن الولادة لحديثي الولادة.

7. زراعة الخلايا والعلاج

تم زراعة خط الخلايا التروفوبلاستية البشرية HTR-8/SVneo في وسط RPMI 1640 مع 10٪ من مصل البقر الجيني المعلل بالحرارة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. لتجارب العدوى، تم زرع خلايا HTR-8/SVneo (1 × 106 خلايا) في مرحلة النمو اللوغاريتمي في صفائح ذات 6 آبار وسمح لها بالالتصاق طوال الليل. قبل التحدي البكتيري، تم استبدال الوسط بوسط كامل خال من المضادات الحيوية لتجنب التأثيرات المضادة للبكتيريا أثناء الزراعة المشتركة. تمت إضافة معلقات بكتيرية ل P. gingivalis أو F. nucleatum عند الحد الأدنى = 50، وتم تعديل كل بئر إلى حجم نهائي قدره 2.5 مل باستخدام وسط الزراعة الكامل. تم حضن الألواح لمدة 24 ساعة. تم جمع المواد الفائقة عند 24 ساعة وتم تصفيتها بواسطة جهاز طرد مركزي قصير لإزالة الحطام قبل قياس السيتوكينات. تم غسل الخلايا اللاصقة مرتين باستخدام PBS معقمة لإزالة البكتيريا غير الالتصقة ثم معالجتها فورا لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين وفقا لسير العمل الموضح أدناه.

8. التحليل النسيجي لمشيمة الفأر

تم تثبيت أنسجة المشيمة في فورمالين مخزن محايد بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة، مدمجة بالبارافين، وتم تقسيمها بسماكة 4.5 ميكرومتر. تم إجراء تلوين روتيني بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) لفحص شكل المشيمة. بالنسبة للتلوين المناعي الكيميائي الهيستي، تم تصور تحديد مستضدات باستخدام ركيزة بيروكسيداز كروموجينية تنتج ترسبات بنية في المواقع الإيجابية، تليها التلوين المضاد بالهيماتوكسيلين. تم إجراء ضوابط سلبية عن طريق استبدال الأجسام المضادة الأولية بمصل غير مناعي.

لتعزيز قابلية التكرار والشفافية، استخدم التقييم المناعي الكيميائي النسجي نهج تقييم شبه كمي محدد مسبقا. تم تقييم شدة التلوين ك 0 (لا شيء)، 1 (ضعيف)، 2 (متوسط)، أو 3 (قوي)، وتم تسجيل نسبة الخلايا الإيجابية ك 0 (<5٪)، 1 (5–25٪)، 2 (26–50٪)، 3 (51–75٪)، أو 4 (>75٪). تم حساب درجة النشاط المناعي بضرب درجات الشدة والنسبة المئوية لكل حقل. لكل مشيمة، تم تسجيل ما لا يقل عن خمسة مجالات عالية القدرة غير متداخلة من مناطق تشريحية مماثلة. تم إجراء التقييم بشكل مستقل بواسطة مراقبين اثنين غير مدركين لتوزيع المجموعات، وتم حل الخلافات من خلال مراجعة مشتركة.

9. الكشف الكمي عن PCR لإشارات الحمض النووي البكتيري في انقسام السباط السباتي والمشيمة في الفأر

تم استخراج الحمض النووي للأنسجة باستخدام سير عمل لاستخراج الحمض النووي النسجي المعتمد على عمود السيليكا. تم تصريف محللات الأنسجة عن طريق الطرد المركزي بحرارة 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 20–25 درجة مئوية، وتم تطبيق المواد الفائقة على أعمدة السيليكا لربط الحمض النووي بالطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 20–25 درجة مئوية. تم تنفيذ خطوات الغسيل حسب سير العمل، حيث يتبع كل غسيل الطرد المركزي بحرارة 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 20–25 درجة مئوية. تم إجراء دوران جاف نهائي عند 12,000 × جرام لمدة دقيقتين عند 20–25 درجة مئوية لإزالة بقايا الإيثانول. تم استخراج الحمض النووي في مخزن إزهار بسعة 50 ميكرولتر بعد حضانة لمدة دقيقتين عند 20–25 درجة مئوية، وجمعه بالطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 20–25 درجة مئوية. تم استخراج الحمض النووي الجيني البكتيري باستخدام سير عمل لاستخراج الحمض النووي البكتيري قائم على عمود السيليكا باستخدام نفس معايير الطرد المركزي في الربط/الغسيل/الجفاف/الدوران/الترشيح ما لم يكن هناك حاجة أخرى لسير العمل.

تم قياس تركيز الحمض النووي ونقاء الحمض النووي باستخدام مقياس حمض نووي ميكروحجمي، وتم تقييم السلامة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام الأجاروزي. تم تخزين عينات الحمض النووي المؤهلة عند –20 درجة مئوية للتحليل اللاحق. تم تضخيم واستنساخ جينات البكتيريا المستهدفة باستخدام البادئات المدرجة في الجدول التكميلي 1، مع تفاصيل حالات PCR في الجدول التكميلي 2 والجدول التكميلي 3. تم تنقية نطاقات الأهداف المضخمة، واستنساخها وفقا لمواصفات الجدول التكميلي 4، وتحويلها إلى خلايا إشريشيا قولونية DH5α كفؤة. تم التحقق من السلالات المحتوية على البلازميدات المؤتلفة لضمان تسلسلات الإدخال الصحيحة، وتم استخراج حمض البلازميد النووي للتحضير القياسي. تم توليد منحنيات قياسية من خلال إجراء qPCR على معايير بلازميد مخففة تسلسليا تحتوي على شظايا جينية بكتيرية مستهدفة. تم اكتشاف إشارات الحمض النووي البكتيري P. gingivalis 16S و F. nucleatum 16S في تشعب السباتين السباتي وعينات المشيمة بشكل كمي بواسطة PCR في الوقت الحقيقي، مع حساب أرقام نسخ الحمض النووي من قيم Ct باستخدام المنحنى القياسي. يتم تفصيل أنظمة وبرامج التفاعل في الجدول التكميلي 5 والجدول التكميلي 6 على التوالي. نظرا لأن qPCR يشير إلى إشارات الحمض النووي البكتيري بدلا من قابلية البقاء أو تحديد الموقع الخلوي، فإن التفسيرات المتعلقة بوجود الميكروبات عند واجهة الأم والجنين تبقى حذرة.

10. كشف العوامل الالتهابية بواسطة ELISA في عينات مصل الفئران ومكونات زراعة الخلايا

تم تعديل جميع المواد والكواشف والعينات إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاختبار. تم قياس مستويات المصل ل TNF-α وIL-1β باستخدام سير عمل ELISA للفئران، وتم تحديد مستويات TNF-α وIL-1β في الكائنات الزائدة في مزرعة الخلايا باستخدام سير عمل ELISA البشري، وفقا لإجراءات المجموعة. تم قياس المعايير والعينات في آبار مكررة، وتم توليد منحنيات قياسية لكل لوحة. تم حساب التكرارات التقنية لتحصل على قيمة واحدة لكل نسخة بيولوجية.

11. تحليلات أخرى في علم الأحياء الجزيئي

بالنسبة ل qRT-PCR، تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا المزروعة باستخدام سير عمل استخراج RNA قائم على الفينول-كلوروفورم. بعد فصل الطور، تم توضيح الطور المائي بالطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم ترسيب وغسل وإعادة تعليق الحمض النووي الريبي وفقا لسير العمل. تم قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام محلل الأحماض النووية، وتم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام الأجاروزي. تم إجراء نسخ عكسي لتوليد cDNA، واستخدم PCR الكمي في الوقت الحقيقي لقياس مستويات TNF-α وIL-1β mRNA. تدريجت تسلسلات البادئات في الجدول التكميلي 7، وخلطات التفاعل في الجدول التكميلي 8، وبرامج التفاعل في الجدول التكميلي 9.

في الطلاء الغربي، تم تنقية محللات البروتين من أنسجة المشيمة في الفئران أو خلايا التروفوبلاست عن طريق الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، وقياسها، وتخضوعها ل SDS-PAGE تلاها نقل الغشاء والكشف القائم على الأجسام المضادة باستخدام سير عمل تصوير فلوري. تم ضبط حمل البروتين المتساوي عند 30 ميكروغرام لكل مسار. تم الاحتفاظ بصور الغشاء الأصلية غير المقصوصة، بما في ذلك مؤشرات الوزن الجزيئي، لجميع البقع المعروضة في الأشكال وهي متاحة DOI: 10.57760/sciencedb.28254. ما لم يذكر خلاف ذلك، يشير "n" إلى النسخ البيولوجية (حيوانات فردية أو مزارع خلوية مستقلة)، بينما تستخدم التكرارات التقنية لمراقبة الجودة ولا تحل محل التكرار البيولوجي.

12. التحليل الإحصائي

أجريت تحليلات إحصائية باستخدام برامج التحليل الإحصائي، وتم توليد الأشكال باستخدام برامج الرسوم البيانية (المدرجة في جدول المواد). تم عرض البيانات المستمرة الموزعة عادة كمتوسط ± انحراف معياري وتم تحليلها بواسطة تحليل ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبارات لاحقة مناسبة، بينما تم التعبير عن البيانات غير الموزعة بشكل طبيعي كمتوسط (نطاق رباعي) وتحليلها باستخدام اختبار كروسكال-واليس مع مقارنات زوجية مناسبة. تم تحديد عتبات الدلالة الإحصائية عند P < 0.05، وP < 0.01، وP < 0.001. ما لم يذكر خلاف ذلك، فإن "n" تشير إلى النسخ البيولوجية، وتم متوسط التكرار الفني (مثل آبار ELISA المكررة) لإعطاء قيمة واحدة لكل نسخة بيولوجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يرتبط العدوى ب P. gingivalis أو F. nucleatum بتقصير فترة الحمل وارتفاع السيتوكينات المضادة للالتهاب في المصل لدى الفئران
تلخص الإحصائيات الأساسية لتغيرات وزن الأم، ونتائج حديثي الولادة، وطول الحمل في الجدول 1 والشكل 1. لم تختلف مسارات وزن الأم وحالات حديثي الولادة بشكل ملحوظ بين المجموعات (تحليل الذكريات الصبغية الأحادية الاتجاه، P > 0.05؛ الشكل 1A–F). كان ط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في السنوات الأخيرة، أشارت الأدلة المتراكمة إلى وجود روابط وثيقة بين صحة الفم ونتائج الحمل، مما دفع إلى زيادة الاهتمام بالارتباطات المحتملة بين التهاب دواعم الأسنان القمي المزمن (CAP) والنتائج السلبية للحمل، بما في ذلك الأنماط الظاهرية المرتبطة بالولادة المبكرة31 . تشير مراجعة منهجية إلى أن قاعدة الأدلة السريرية الحالية لا تزال محدودة ومتنوعة، لكنها تدعم بشكل عام وجود علاقة إيجابية بين التهاب دواعم الأسنان القمي للأم والنتائج السلبية للحمل، مع التأكيد على الحاجة إل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين مصالح متنافسة ليعلنوا عنها.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل من قبل مؤسسة تطوير الأمراض المرتبطة بالنساء والأطفال - مختبر رئيسي في مقاطعة سيتشوان (منحة رقم: FYYFEJB2025002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Chromogenic Peroxidase SubstrateAgilent DakoK3468Chromogenic peroxidase substrate for IHC
Defibrinated sheep blood, sterileThermo Fisher (Remel)R54012Additive for blood agar (5%)
Dental X-ray unit / radiography systemPlanmecaIntra (model)Periapical radiographs for CAP confirmation
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504Silica-column DNA extraction from tissues/bacteria
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057Transformation for plasmid standard construction
Eosin Y solution, alcoholicSigma-Aldrich (Merck)HT110132H&E stain
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, AustraliaGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141Supplement to complete medium 
Flowable resin composite3MFiltek Supreme Flowable 6010Restoration after sealing; light-cure
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum reference strainATCC25586Anaerobic culture; CAP and tail-vein exposure
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (version)Statistical analysis and figure generation
Hematoxylin solutionSigma-Aldrich (Merck)HHS32H&E counterstain
HTR-8/SVneo human trophoblast cell lineATCCCRL-3271In vitro infection assays 
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50Cell supernatant IL-1β measurement
Human TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00DCell supernatant TNF-α measurement
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µmMillipore (Merck)IPFL00010Fluorescent Western blot transfer
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR925-68071Fluorescent secondary antibody
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR926-32211Fluorescent secondary antibody
IκBα (44D4) Rabbit mAbCell Signaling Technology4812Primary antibody (WB)
K-File (endodontic file)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015Canal instrumentation (example size 15)
LED dental curing light3MElipar DeepCure-S (model)20 s curing (per protocol)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00CSerum IL-1β measurement
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00BSerum TNF-α measurement
MyD88 (D80F5) Rabbit mAbCell Signaling Technology4283Primary antibody (WB)
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WDNA/RNA quantification
Near-infrared imaging systemLI-COROdyssey CLx (model)Fluorescent Western blot imaging
NF-κB p65 (D14E12) Rabbit mAbCell Signaling Technology8242Primary antibody (WB)
PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023Cell washing and reagent preparation
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Antibiotics 
Pentobarbital sodium saltSigma-Aldrich (Merck)P3761Anesthesia induction (per protocol dosing)
Peroxidase blocking solutionAgilent DakoS2023Block endogenous peroxidase for IHC
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAbCell Signaling Technology3033Primary antibody (WB)
Porphyromonas gingivalis reference strainATCC33277Anaerobic culture; CAP and tail-vein exposure
PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037AcDNA synthesis
Real-time PCR systemApplied BiosystemsQuantStudio 5 (model)qPCR quantification of 16S targets
Round bur (sterile)Dentsply SironaH1-010Access opening for maxillary first molar pulp chamber
RPMI 1640 MediumGibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093HTR-8/SVneo culture medium base
SYBR-safe DNA gel stainInvitrogenS33102DNA visualization
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9760Plasmid miniprep for standards
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix (dye-based)
TLR4 (D8L5W) Rabbit mAbCell Signaling Technology14358Primary antibody (WB)
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026Phenol–chloroform RNA extraction
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco (Thermo Fisher Scientific)25200-056Cell detachment
T-Vector pMD19 (Simple)TaKaRa3271PCR product cloning for standard curves
Universal dental adhesive3MScotchbond Universal Adhesive 26200Seal pulp chamber after inoculation

المراجع

  1. American College of Obstetricians and Gynecologists’ Committee on Practice Bulletins—Obstetrics. Practice bulletin no. 171: Management of preterm labor. Obstet Gynecol. 128, e155-e164 (2016).
  2. Vogel, J. P., Chawanpaiboon, S., Moller, A. B., Watananirun, K., Bonet, M., et al. The global epidemiology of preterm birth. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 52, 3-12 (2018).
  3. Svenvik, M., et al. Early prediction of spontaneous preterm birth before 34 gestational weeks based on a combination of inflammation-associated plasma proteins. Front Immunol. 15, 1415016-1415028 (2024).
  4. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388, 3027-3035 (2016).
  5. Saigal, S., Doyle, L. W. An overview of mortality and sequelae of preterm birth from infancy to adulthood. Lancet. 371, 261-269 (2008).
  6. Liang, S., et al. Development of a spontaneous preterm birth predictive model using a panel of serum protein biomarkers for early pregnant women: A nested case-control study. Int J Gynaecol Obstet. 168, 701-708 (2025).
  7. Bradley, E., et al. Born too soon: Global epidemiology of preterm birth and drivers for change. Reprod Health. 22, 105-119 (2025).
  8. Hodek, J. M., von der Schulenburg, J. M., Mittendorf, T. Measuring economic consequences of preterm birth: Methodological recommendations for the evaluation of personal burden on children and their caregivers. Health Econ Rev. 1 (1), 6 (2011).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: One syndrome, many causes. Science. 345, 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., et al. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
  11. Combs, C. A., et al. Amniotic fluid infection, inflammation, and colonization in preterm labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol. 210, 125.e1-125.e15 (2014).
  12. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58-64 (2013).
  13. Semmes, E. C., Coyne, C. B. Innate immune defenses at the maternal-fetal interface. Curr Opin Immunol. 74, 60-67 (2022).
  14. Han, Y. W., Wang, X. Mobile microbiome: Oral bacteria in extra-oral infections and inflammation. J Dent Res. 92, 485-491 (2013).
  15. Ide, M., Papapanou, P. N. Epidemiology of association between maternal periodontal disease and adverse pregnancy outcomes—systematic review. J Periodontol. 84, S181-S194 (2013).
  16. Offenbacher, S., et al. Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. J Periodontol. 67, 1103-1113 (1996).
  17. Jeffcoat, M. K., et al. Periodontal infection and preterm birth: Results of a prospective study. J Am Dent Assoc. 132, 875-880 (2001).
  18. Siqueira, J. F., Rôcas, I. N. Microbiology and treatment of acute apical abscesses. Clin Microbiol Rev. 26, 255-273 (2013).
  19. Marchesan, J., et al. TLR4, NOD1 and NOD2 mediate immune recognition of putative newly identified periodontal pathogens. Mol Oral Microbiol. 31, 243-258 (2016).
  20. Georgiou, A. C., Crielaard, W., Armenis, I., de Vries, R., van der Waal, S. V. Apical periodontitis is associated with elevated concentrations of inflammatory mediators in peripheral blood: A systematic review and meta-analysis. J Endod. 45 (11), 1279-1295.e3 (2019).
  21. Harjunmaa, U., et al. Association between maternal dental periapical infections and pregnancy outcomes: Results from a cross-sectional study in Malawi. Trop Med Int Health. 20, 1549-1558 (2015).
  22. Harjunmaa, U., et al. Periapical infection may affect birth outcomes via systemic inflammation. Oral Dis. 24, 847-855 (2018).
  23. Leal, A. S., et al. Association between chronic apical periodontitis and low-birth-weight preterm births. J Endod. 41, 353-357 (2015).
  24. León, R., et al. Detection of Porphyromonas gingivalis in the amniotic fluid in pregnant women with a diagnosis of threatened premature labor. J Periodontol. 78, 1249-1255 (2007).
  25. Sanz, M., et al. Periodontitis and cardiovascular diseases: Consensus report. J Clin Periodontol. 47, 268-288 (2020).
  26. Robertson, S. A., et al. Targeting Toll-like receptor-4 to tackle preterm birth and fetal inflammatory injury. Clin Transl Immunol. 9, e1121-e1139 (2020).
  27. Peng, J., et al. miR-199a-3p suppresses cervical epithelial cell inflammation by inhibiting the HMGB1/TLR4/NF-κB pathway in preterm birth. Mol Med Rep. 22, 926-938 (2020).
  28. Shen, Z., et al. Protective effects of syringin against oxidative stress and inflammation in diabetic pregnant rats via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 131, 110681-110690 (2020).
  29. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: Suggested assessment and reporting guidelines. Biol Reprod. 99, 922-937 (2018).
  30. Ao, M., et al. Dental infection of Porphyromonas gingivalis induces preterm birth in mice. PLoS One. 10 (8), e0137249-e0137265 (2015).
  31. Jakovljevic, A., et al. The association between apical periodontitis and adverse pregnancy outcomes: A systematic review. Int Endod J. 54 (9), 1527-1537 (2021).
  32. Khalighinejad, N., Aminoshariae, A., Kulild, J. C., Mickel, A. Apical periodontitis, a predictor variable for preeclampsia: A case-control study. J Endod. 43 (10), 1611-1614 (2017).
  33. Venugopal, B., Narasimman, H., Mahalingam, A., Naren Kishore, R., Jayavel, K., et al. Systemic health associations of apical periodontitis: A systematic review of observational studies. Cureus. 17 (10), e95273 (2025).
  34. Liang, S., et al. Periodontal infection with Porphyromonas gingivalis induces preterm birth and lower birth weight in rats. Mol Oral Microbiol. 33 (4), 312-321 (2018).
  35. Lin, D., et al. Porphyromonas gingivalis infection in pregnant mice is associated with placental dissemination, an increase in the placental Th1/Th2 cytokine ratio, and fetal growth restriction. Infect Immun. 71 (9), 5163-5168 (2003).
  36. Han, Y. W., et al. Fusobacterium nucleatum induces premature and term stillbirths in pregnant mice: Implication of oral bacteria in preterm birth. Infect Immun. 72 (4), 2272-2279 (2004).
  37. Liu, H., et al. Fusobacterium nucleatum induces fetal death in mice via stimulation of TLR4-mediated placental inflammatory response. J Immunol. 179 (4), 2501-2508 (2007).
  38. Chan, E., et al. Identification of Fusobacterium nucleatum in formalin-fixed, paraffin-embedded placental tissues by 16S rRNA sequencing in a case of extremely preterm birth secondary to amniotic fluid infection. Pathology. 51 (3), 320-322 (2019).
  39. Habelrih, T., Augustin, T. L., Mauffette-Whyte, F., Ferri, B., Sawaya, K., et al. Inflammatory mechanisms of preterm labor and emerging anti-inflammatory interventions. Cytokine Growth Factor Rev. 78, 50-63 (2024).
  40. Gomez-Lopez, N., Romero, R., Plazyo, O., Panaitescu, B., Furcron, A. E., et al. Intra-amniotic administration of HMGB1 induces spontaneous preterm labor and birth. Am J Reprod Immunol. 75 (1), 3-7 (2016).
  41. Wang, S., Ma, L., Ji, J., Huo, R., Dong, S., et al. Protective effect of soy isolate protein against streptozotocin induced gestational diabetes mellitus via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 168, 115688 (2023).
  42. Reyes, L., et al. Porphyromonas gingivalis and adverse pregnancy outcome. J Oral Microbiol. 10 (1), 1374153 (2017).
  43. Aagaard, K., et al. The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med. 6 (237), 237ra65 (2014).
  44. Kuperman, A. A., et al. Deep microbial analysis of multiple placentas shows no evidence for a placental microbiome. BJOG. 127 (2), 159-169 (2020).
  45. Einenkel, R., et al. Less is more! Low amount of Fusobacterium nucleatum supports macrophage-mediated trophoblast functions in vitro. Front Immunol. 15, 1447190 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Porphyromonas Gingivalis Fusobacterium Nucleatum TLR4 MyD88 NF KappaB
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.