بناء نماذج فعالة لكيسة الأريمة المشتقة من الخلايا الجذعية للفئران للدراسات البيئية

Summary

يصف هذا البروتوكول توليد وتحليل iGATA4-بلاستويدات، وهو نموذج قائم على الخلايا الجذعية القابل للتوسع يعيد تلخيص السمات الرئيسية لكيسة الأريمة الفأرية، بما في ذلك تنظيم السلالة والتجويف، ويمكن من تقييم قابل للتكرار وعالي الإنتاجية للاضطرابات البيئية والجزيئية التي تؤثر على التطور الجنيني المبكر.

Abstract

توفر نماذج الأجنة القائمة على الخلايا الجذعية منصة قوية للتحقيق في تطور الثدييات المبكر وحساسيتها للاضطرابات البيئية. هنا، يقدم بروتوكول قوي وسهل الوصول لتوليد بلاستويدات فأرية عالية الدقة باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)، والخلايا الجذعية الضوئية (TSCs)، والخلايا الجذعية الجنينية المعدلة للتعبير التحفيزي ل GATA4 (iGATA4-ESCs). ينتج هذا النظام iGATA4-بلاستويدات تعيد بدقة شكل الكيسة الأريمية الطبيعية E4.5، ونسب النسب، والتوقيعات النسخية، مما يوفر نموذجا موثوقا في المختبر لأقسام الأديم الداخلي البدائي (PE)، وفوق القشرة (EPI)، وتيروفيكتوديرم (TE). يوضح هذا البروتوكول أولا كيفية الحفاظ على وتحضير مجموعات الخلايا الجذعية الثلاثة المطلوبة لتكوين الخلايا الجذعية. ثم يتم توضيح التجميع خطوة بخطوة لبلاستويدات iGATA4 تحت ظروف الزراعة قبل الزرع، مع تسليط الضوء على المعايير التجريبية الحرجة. لتمكين توصيف دقيق، يتم توفير سير عمل مجرب لتثبيت البلاستويد، والتلوين، والتصوير. وأخيرا، يعرض مثال يوضح كيف يمكن استخدام iGATA4-بلاستويدات في الفحوصات عالية الإنتاجية. من خلال تعريض مجموعات كبيرة من البلاستيدات لعوامل بيئية محددة، يمكن قياس التغيرات في الشكل، وتوزيع السلالة، وتطور النمو بسرعة وبشكل متكرر. معا، يؤسس هذا البروتوكول منصة قابلة للتوسع لنمذجة تطور ما قبل الانغراس، وتحليل قرارات النسب المبكرة، وإجراء فحوصات متعددة المعايير لتقييم التأثيرات البيئية أو الجزيئية على تكوين الكيسة الأريمية.

Introduction

فهم كيفية تجميع الأجنة المبكرة من الثدييات وكيف تؤثر العوامل البيئية الشائعة سلبا على تكوينها يتطلب أنظمة نموذجية قابلة للتكرار، ومتاحة تجريبيا، وقابلة للتوسع. توفر نماذج متكاملة شبيهة بالأجنة التي تولد من دمج الخلايا الجذعية الجنينية وخارج الجينية مثل هذه المنصة ^1,2. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن تجميع الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)، والخلايا الجذعية للضباب التروفوبلاست (TSCs)، والخلايا الجذعية المصممة للتعبير التحفيزي ل GATA4 (iGATA4-ESCs) في ظروف ما قبل الزرع لإنتاج بلاستيدات ذات سلالات بطانية بدائية قوية ومتناسبة بشكل صحيح من نوع الديرم الداخلي (PE)، والخلايا الجذعية التروفوبلاستية (EPI)، وTE. أظهرت الأعمال الحديثة أن هذه الهياكل، المسماة iGATA4-بلاستويدات³، تشبه كيسة E4.5 الأريمية من حيث نسب النسب، والتوقيعات النسخية، والتعبير الوظيفي عن العلامات. عند زراعتها في المختبر، تنتقل 12.5٪ من هذه البنى إلى الشكل بعد الزرع. والأهم من ذلك، أنها قابلة للفحوصات السمومية والبيئة.

كان تطوير هذه التقنية مدفوعا بقيود في أنظمة بلاستويد موجودة مسبقا ^2,4,5. على الرغم من أن العديد من البروتوكولات 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 تولد هياكل مجوفة تشبه الكيسات الأريمية المبكرة، معظمها يفعل ذلك بكفاءة منخفضة نسبيا أو تنتج هياكل بتكوين PE غير مكتمل، أو هويات خلايا غير محددة، أو نسب سلالية غير صحيحة. تقلل هذه التناقضات من ملاءمتها للدراسات الميكانيكية وشاشات الاضطراب عالية الإنتاجية. نظرا لأن مواصفات PE في الجسم الحي تتبع تنشيط GATA6 وSOX17 وGATA4 وSOX7²²، وعيوب في PE أو مشتقها، الأديم الداخلي الحشوي (VE)، تعيق تطور الزرع المحيط^{بالزرع 23,24,25,26,27}، مما يفرض هذا البرنامج النسخي في المختبر يحسن دقة البلاستويد. تتحول الخلايا التنحية الجنينية التي تحمل جين متحول شرطي من GATA4 بشكل قوي إلى VE، وعند دمجها مع ESCs وTSCs في ظروف ما بعد الزراعة، تولد نماذج جنينية متكاملة تقوم بتحويل المعدة وبدء تكوين الأعضاء 28,29,30,31. هنا، تم تكييف هذا المبدأ لظروف ما قبل الانغراس، مما يوضح أن iGATA4-ESCs تولد PE بشكل موثوق وتنتج بلاستويدات تشبه إلى حد كبير الكيسات الأريمية الطبيعية³.

تتغلب هذه الطريقة على القيود السابقة في نمذجة الكيسة الأريمية باستخدام الخلايا الجذعية وتوفر كفاءة عالية في تكوين الأبلاستويد (80٪ من الهياكل المكونة هي بلاستويد، و75٪ منها تظهر تنظيما نسبيا صحيحا) ودرجة عالية من الشبه الجنيني. علاوة على ذلك، يوفر التجميع المعياري لبلاستويدات iGATA4، حيث يتم اشتقاق كل سلالة من مجموعة خلايا جذعية مزروعة بشكل مستقل، وصولا مباشرا تجريبيا إلى كل جزء من الجنين. تجعل هذه الخصائص النظام مناسبا بشكل خاص لتطبيقات الفحص متعدد المعايير. ونظرا لأنه ينتج مجموعات كبيرة من البنى المتسقة شكليا مع سلالات TE وEP وPE متناسبة بدقة، فإنه يتيح اضطرابات متوازية وقياس استجابات خاصة بالسلالة بقوة إحصائية لا يمكن تحقيقها باستخدام الأجنة الطبيعية.

كدليل على المبدأ، تم قياس تأثيرات العوامل البيئية المشتركة المعروضة عند النطاقات الفسيولوجية^{32، 33، 34، 35، 36، 37، 38} على تطور البلاستويد. تم تقييم تأثير الكافيين والنيكوتين والإيثانول وتعديلات الأحماض الأمينية على معدل التجويف، والشكل، واللياقة، ونسب النسب عبر مجموعة من التركيزات وفترات العلاج الزمنية. معظم الحالات (الكافيين، الإيثانول، النيكوتين، وتلك التي تحاكي الأنظمة الغذائية منخفضة البروتين) أدت إلى تكوين بلاستيديات غير طبيعي وتدهور جودة البني. على النقيض من ذلك، فإن زيادة تركيز الأحماض الأمينية المتفرعة (المشابهة للأنظمة الغذائية عالية البروتين) حسن من كفاءة وجودة تكوين البلاستويد. تعكس هذه النتائج التأثيرات التي لوحظت في الأريى الجرعة الطبيعية³ التي تم زراعتها في المختبر، مما يثبت أن هذا النظام يلتقط الأنماط الظاهرية الدقيقة المعتمدة على الجرعة ويدعم خطوط فحص متعددة الأبعاد قابلة للتوسع غير ممكنة مع الأجنة الطبيعية.

ضمن السياق الأوسع لنمذجة الأجنة، تظهر هذه التقنية أن نفس الخلايا المستخدمة لنمذجة التطور المتكامل بعد الزرع يمكن أيضا استخدامها كنماذج ما قبل الانغراس. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص للتطبيقات التي تتطلب نمذجة قابلة للتوسع لهياكل شبيهة بالأكياس الأرومية مع تكوين دقيق ل PE وتكامل سلالات قوي. ومع ذلك، كما هو الحال مع نماذج الخلايا الجذعية الأخرى لكيس الأريمة في الفأر، تفشل iGATA4-بلاستويدات في الزرع والتطور أكثر بعد نقلها إلى فأر المضيف، وبالتالي فهي غير مناسبة لدراسات التفاعلات بين الجنين والأم. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول نهجا موثوقا وسهل الوصول لتوليد بلاستيدات عالية الدقة التي تصدر قرارات مبكرة لنوع الخلايا في جنين الثدييات.

Protocol

جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول تشمل خطوط خلايا محددة وتم تنفيذها وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا. لم يتم إجراء أي عمل على الحيوانات أو البشر الحيين.

تم اختبار عدة خطوط من ESC وTSC ووجد أنها تدعم تكوين بلاستويد iGATA4. تم استخدام²⁸ بنجاح من ESCs وiGATA4-ESCs وTSCs من دراسات سابقة لإكمال جميع الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول. يصف نفس المؤلفين توليد أجهزة iGATA4-ESC من خط ESC فأر CD1 (ICR) تم تأسيسه سابقا.

يتم تربية TSCs فوق الأرومات الليفية الجنينية للفئران (MEFs) المتوفرة تجاريا. جميع المواد الكيميائية والكواشف والمجموعات والمعدات والبرمجيات المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. زراعة الخلايا الجذعية للفئران لتكون الأبلاستويد

1. تحضير ألواح تغذية MEF
   1. غط صفيحة زراعة خلايا مكونة من 6 آبار ب 1.5 مل من الجيلاتين 0.2٪ (مع الفولت) في مياه منزوعة الأيونات (DI) لكل بئر. حضانة عند 37 درجة مئوية في نورموكسيا لمدة لا تقل عن 45 دقيقة.
   2. أثناء الحضانة، جهز أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل مع 4 مل من وسط FC (الجدول 1) مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
   3. قم بإذابة قارورة MEF في حمام مائي بحركة رقم ثمانية حتى يبقى فقط كرة صغيرة من الجليد. انقل المحتويات إلى الأنبوب المحضر، ثم استخدم الماصة للأعلى والأسفل لتخلط جيدا. الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 4 دقائق.
   4. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 1 مل من التيار المتوسط FC. قم بضبط حجم كاف لتغليف ~160,000 خلية لكل بئر في 1.5 مل لكل بئر.
   5. استنشق الجيلاتين واللوحة بمقدار 1.5 مل من ال MEFs لكل بئر. حضن في نورموكسيا طوال الليل دون إزعاج.
   6. استبدل الوسط ب 1.5 مل جديد لكل وسط FC في اليوم التالي. غير الوسيط كل 48 ساعة. استخدم MEFs بعد 2–7 أيام من الطبق. قد يبقى الصندوق المالي الميداني بصحة جيدة لفترة أطول، لكن قدرتها على دعم نمو TSC قد تتأثر بذلك.

تحذير: إجراء جميع زراعة خلايا الفئران في خزائن تدفق سطحية بمستوى السلامة البيولوجية (BSL) 1 باستخدام تقنية BSL-2.

2. إذابة ومرور الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (WT ESCs وiGATA4-ESCs)
   1. إذابة ال ESCs WT أو iGATA4-ESCs بعد الخطوات 1.1.1–1.1.3. بعد الطرد المركزي، أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط N2B27/2i/LIF (الجدول 1) وزرع ~50,000 خلية في كل بئر في صفيحة مغطاة بالجيلاتين بستة آبار مع ~1.5 مل لكل بئر. حضن عند 37 درجة مئوية في نورموكسيا وغير الوسط كل 48 ساعة.
   2. تأكد من أن المستعمرات مكتظة بإحكام ودائرية مع بروز طفيف قبل المرور. المرور كل يومين إلى ثلاثة.
      ملاحظة: لا يمكن تمييز خلايا ESC من WT وiGATA4-ESC شكليا حتى الحث بالدوكسيسيكلين (DOX).
   3. غطي صفيحة ذات 6 آبار ب 1.5 مل من الجيلاتين بنسبة 0.2٪ في مياه DI لكل بئر. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 45 دقيقة.
   4. أضف 500 ميكرولتر من مادة تفكك الخلايا لكل بئر واحتضن لمدة 3 دقائق. أضف 2 مل من الميديوم السريع مع التوصيل بلطف حول الحواف. تأكد من >90٪ انفصال تحت المجهر. إذا بقيت الخلايا متصلة، استخدم الماصة بلطف للمساعدة في إعادة التعليق.
   5. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 500 × جرام لمدة 4 دقائق.
   6. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط N2B27/2i/LIF. تحديد تركيز الخلية باستخدام 10 ميكرولتر على جهاز قياس الدم الخلوي. اضبط الحجم ليصل إلى ~50,000 خلية لكل بئر.
   7. استنشق الجيلاتين وزرع الخلايا. حضانة في نورموكسيا. غير المتوسط في اليوم التالي وكل 48 ساعة بعد ذلك.
3. إذابة ومرور الخلايا الجذعية في الخلايا الصرامية للفئران (TSCs)
   1. إذابة الميكانيكات التقنية بعد الخطوات 1.1.1–1.1.3. بعد الطرد المركزي، أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط TSF4H (الجدول 1) وزرع ~20,000 خلية لكل بئر في صفيحة مغطاة ب MEF مكونة من 6 آبار. الحضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، 5٪ أكسجين (نقص الأكسجين) وتغيير الوسط كل 24 ساعة.
   2. تأكد من أن المستعمرات كبيرة (>75 ميكرومتر) وتكون مسطحة قبل المرور. أضف 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا لكل بئر وحضن لمدة 5 دقائق. أضف 2 مل من الوسط الدائري مع التوصيل بلطف بالماصة. أكد >90٪ انفصال.
   3. انقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي وادور عند 500 × جرام لمدة 4 دقائق.
   4. أعد تعليقها في 1 مل TSF4H متوسط. حدد التركيز وضبط إلى ~20,000 خلية في كل بئر.
   5. ضع الطبق على MEFs وحضانه في حالة نقص الأكسجين. غير الوسط كل 24 ساعة والمرور كل 2-3 أيام قبل دمج المستعمرة.

2. تكوين بلاستويدات iGATA4

1. تحضير لوحة تجميع البئر الدقيقة لتجميع الخلايا
   1. أضف 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق إلى كل بئر من صفيحة تجميع البئر الدقيقة. الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 5 دقائق مع توازن مناسب لإزالة الهواء المحبوس من الآبار الدقيقة. حضن عند 37 درجة مئوية في نورموكسيا لمدة ساعة واحدة على الأقل أو طوال الليل.
2. تحضير البلاستويد، اليوم 0 — تحضير وطلاء WT وiGATA4-ESCs
   1. وسائط N2B27/2i/LIF، FC، وFSIL قبل التسخين (FC + 10 ng/ml LIF مؤتلف للفأر (mLIF) + 2 ميكرومولار مثبط ROCK Y27632) حتى 37 درجة مئوية. حضر جيلاتين بنسبة 0.2٪ في ماء DI واجهز مادة تفكك الخلية.
   2. استنشق محلول منع الالتصاق دون لمس قاع البئر. اغسلي مرتين ب 1 مل PBS ومرة واحدة ب 1 مل من FCYL متوسط. استخدم المبصمات على طول الجدار لتجنب تلف الآبار الصغيرة.
   3. جهز صفيحة ذات 6 آبار مغطاة بالجيلاتين (≥45 دقيقة حضانة) للخلايا التي تمر.
   4. حصاد WT وiGATA4-ESCs عن طريق استنشاق وسط وإضافة 500 ميكرولتر كاشف تفكك الخلايا لكل بئر. حضانه لمدة 3 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. أضف 2 مل من التيار المتوسط والمزايدة برفق. أكد الانفصال الكامل تحت المجهر. انقله إلى أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 500 × جرام لمدة 4 دقائق.
   5. أعد تعليقها في 1 مل من FCYL متوسط. تحديد تركيز الخلية باستخدام 10 ميكرولتر على جهاز قياس الدم الخلوي. عدل إلى 500,000–700,000 خلية/مل. احسب الحجم المطلوب ل 5 وحدات ESC بوزن وزن و5 وحدات iGATA4-ESC لكل ميكروبئر (6,000 خلية لكل بئر).
      ملاحظة: قم بتحسين الاعتماد على خطوط ESC الأخرى إذا لزم الأمر. النطاق الابتدائي هو 4–7 وحدات ESC لكل ميكروبئر مع نسبة 1:1 من ESCs إلى iGATA4-ESCs.
   6. جهز 500 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر. أضف إلى لوحة تجميع Microwell باتجاه السقوط باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر. استخدم الطرد المركزي عند 100 × جرام لمدة 3 دقائق وتحقق من التوزيع المتساوي. احتضن لمدة 6 ساعات حتى تتكون التجمعات.
   7. المرور بقايا ESC كما هو موضح في القسم 1.2.
3. تحضير البلاستويد، اليوم 0 — تحضير وسط التوصيل
   1. جهز ~20 مل من الوسط الأساسي باستخدام DMEM/F12 (الجدول 2). استعد طازجا لكل تجربة.
      1. أضف 200 ميكرولتر 200 ملليمتر لم-ألانيل-إل-غلوتامين (الكمية النهائية 2 ملليمول). تخزين المخزون عند 4 درجات مئوية.
      2. أضف 200 ميكرولتر 10,000 U/mL بنسلين/ستربتوميسين (آخر 100 U/mL لكل منهما). تخزين عند −20 درجة مئوية.
      3. أضف 40 ميكرولتر 32 ملغ/مل لحمض الأسكوربيك (النتيجة 64 ميكروغرام/مل). جهز في ماء DI، وقم بتصفيق، وقم بتنقيط التعقيم، وتخزينه عند −20 درجة مئوية.
      4. أضف 20 ميكرولتر من سيلينيت الصوديوم (في النهاية 14 نانوغرام/مل). جهز وتخزين عند −20 درجة مئوية.
      5. أضف 240 ميكرولتر NaHCO₃ (النهائي 543 ميكروغرام/مل). اخلط جيدا بعد الإذابة.
      6. أضف 20 ميكرولتر هولو-ترانسفيرين (النتيجة 10.7 ميكروغرام/مل). اخلط بعد إذابة الماء.
      7. أضف ~37.5 ميكرولتر إنسولين (النهائي 19.4 ميكروغرام/مل؛ يعتمد على الدفعة). تخزين عند 4 درجات مئوية.
   2. قبل الاستخدام مباشرة، أضف Y27632 إلى تركيز نهائي 20 ميكرومولار، CHIR99021 إلى 3 ميكرومولار، IL-11 إلى 30 نانوغرام/مل، FGF4 إلى 25 نانوغرام/مل، هيبارين إلى 1 ميكروغرام/مل، mLIF إلى 10 نانوغرام/مل، TGFβ إلى 15 نانوغرام/مل، و8Br-cAMP إلى 25 ميكرومول.
4. تحضير البلاستويد، اليوم 0 — تحضير وطلاء البلاستيدز
   1. TSF4H قبل الدفء، FC (الجدول 1)، ووسائط TX (القسم 2.3). جهز أطباق مغطاة بالجيلاتين (≥45 دقيقة) لاستنزاف MEF.
   2. حصاد TSCs بإضافة 500 ميكرولتر من مادة كاشف تفكك الخلايا لكل بئر وحضانة لمدة 5 دقائق في حالة نقص الأكسجين. أضف 2 مل من التيار المتوسط والمزايدة برفق. أكد الانفصال. انقله إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 500 × جرام لمدة 4 دقائق.
      ملاحظة: قد تتطلب المضادات المزروعة لمدة >4 أيام علاجا متفاعلا مع تفكك الخلايا لمدة تصل إلى 10 دقائق.
   3. أعد تعليقها في متوسط TSF4H بسعة 1 مل واضبط الحجم المناسب للطلاء بنسبة 1:2.
   4. وضع الصفائح على آبار مغطاة بالجيلاتين لاستنزاف MEF. حضن ~45 دقيقة في حالة نقص الأكسجين. تأكد من أن MEFs تثبت التثبيت بينما تبقى TSCs في الغالب غير مرتبطة.
   5. استبدال وسط 900 ميكرولتر من آبار ألواح تجميع البئر الدقيقة بوسط TX بسعة 500 ميكرولتر. العودة إلى نقص الأكسجين.
   6. نقل المادة الفائقة التي تحتوي على TSC إلى أنبوب دون إزعاج الميتروليفات الملحقة. حدد التركيز (الهدف 500,000–700,000 خلية/مل).
   7. احسب الحجم ل 12 TSC لكل ميكروبئر (14,400 خلية لكل بئر). الطرد المركزي إذا كان هناك حاجة لمزيد من التركيز.
      ملاحظة: تحسين الخطوط الأخرى من TSC (10–15 خلية لكل ميكروبئر موصى به).
   8. أضف 500 ميكرولتر لتعليق خلية لكل بئر من ناحية الانخفاض. الطرد المركزي عند 100 × جرام لمدة 3 دقائق. أكد التوزيع وحضن في حالة نقص الأكسجة لمدة 24 ساعة.
   9. اجتياز الدورات المتبقية حسب الحاجة (القسم 1.3).
5. تحضير البلاستويد، اليوم الأول — التحفيز
   1. بعد حوالي 24 ساعة من إضافة TSC، أضف 20 ميكرولتر من 5 مللي مولار 8Br-cAMP و1 ميكرولتر من 1 ميكروغرام/مل DOX لكل بئر. حضن لمدة 48–72 ساعة في حالة نقص الأكسجين.
6. تحضير البلاستويد، اليوم الثالث — التثبيت
   1. أعد تعليق الركام باستخدام رأس ماصة مقطوع بسعة 1000 ميكرولتر. انقله إلى أنابيب بحجم 2 مل ودع الترسب لمدة 5 دقائق.
   2. أزل الفائق الفائق وأضف 250 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). أعد تعليقها بلطف.
      تحذير: تعامل مع PFA في غطاء بخاري مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
   3. حضن كل 15 دقيقة، وتحريك كل 5 دقائق.
   4. أزل PFA وأضف 300 ميكرولتر PBST (PBS + 0.1٪ Tween-20). اخلط بلطف. احتفظ بالحرارة 4 درجات مئوية لمدة <1 أسبوع قبل الصبغ.
7. التألق المناعي للألهم
   1. نقل 150 ميكرولتر لكل عينة إلى صفيحة U-bottom ذات 96 بئئر.
   2. أضف 100 ميكرولتر لمخزن نفاذية واحتضن لمدة 20 دقيقة. استبدلها بمحلول الأجسام المضادة الأولية وحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   3. اغسل 3× باستخدام PBST (5 دقائق لكل منها). أضف الأجسام المضادة الثانوية.
   4. احتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   5. اغسل 3× وانتقل إلى طبق التصوير.
   6. صورة باستخدام المجهر الكونفوكلي (≥25× الموضوعي، NA ≥0.8).

3. شاشات عالية الإنتاجية باستخدام نموذج iGATA4-blastoid

1. تحضير iGATA4-بلاستويد واختبار العوامل البيئية
   1. تحضير لوحة تجميع البئر الدقيق كما هو موضح في القسم 2.1 وتوليد بلاستويدات iGATA4 وفقا للأقسام 2.2–2.4. جهز آبارا كافية، بما في ذلك الضوابط المناسبة. يتضمن تحكم فارغ (بلاستويدات معدة باستخدام البروتوكول القياسي)، وتحكم حامل، وحالة أو أكثر من الظروف التجريبية.
   2. حضانة البلاستويدات طوال الليل في حالة نقص الأكسجين. بعد حوالي 24 ساعة من التلقيح ب TSC، حضر وسط TX مع إضافة 8Br-cAMP، والدوكسيسيكلين (DOX)، والمركب المعني (أو التحكم في الحامل). تم اختبار الحالات التالية:
      1. الكافيين: 3.5 ملغ/لتر، مخفف من مخزون ماء فائق النقي.
      2. النيكوتين: 330 نانوغرام/لتر، مخفف من مخزون 100٪ إيثانول (EtOH).
      3. الإيثانول: 17 مللي مول، مخفف من EtOH المطلق.
      4. الأحماض الأمينية عالية السلسلة المتفرعة (BCAA): +5٪، +25٪، +50٪ نسبة إلى التركيزات الأساسية (0.45 ملليمولار إل-ليوسين، 0.45 ملليمولار ل-فالين، 0.42 ملليمولار إل-إيزوليوسين)، تم تحضيرها من مخزونات مركزة في مياه فائقة النقي.
      5. الميثيونين والليوسين المنخفضان: −5٪، −25٪، −50٪، −100٪ مقارنة بتركيزات الأساس (0.12 ملليمولار L-ميثيونين، 0.45 ملليمولار L-ليوسين)، تم تحضيره باستخدام DMEM/F12 خالي من Met-/Leu. يتم إضافة DMEM الخالي من Met/Leu (LM-DMEM) بمزيج مغذي من Ham مرة واحدة قبل الاستخدام.
         تحذير: جهز وتعامل مع مخزون الكافيين والنيكوتين المركز في غطاء بخار باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الحماية الشخصية؛ القفازات، معطف المختبر، واقي العين). الإيثانول قابل للاشتعال ويجب إبعاده عن مصادر الحرارة.
   3. استنشق الوسط من كل بئر وأضف 1 مل من وسط TX يحتوي على مركبات. قم بمعالجة واحدة بشكل جيد في كل مرة لتجنب الجفاف. أعد الطبق إلى حاضنة نقص الأكسجين والزراعة حتى اليوم الثالث.
   4. التقط صورا تمثيلية للمجال الساطع في اليوم الثالث باستخدام مجهر ضوء مرسل. تثبيت الهياكل وأداء الفلورة المناعية كما هو موضح في القسمين 2.6 و2.7.
      ملاحظة: قم بضبط نوافذ العلاج حسب هدف التجربة. يمكن تطبيق العلاجات خلال التجمع المبكر (اليوم الأول) أو المراحل اللاحقة (مثل توسع التسوس). تشمل النوافذ النموذجية اليوم 1–3، اليوم 1–2 (يليه استبدال الوسائط)، والأيام 2–3.
2. تحليل iGATA4-بلاستويد متعدد المعلمات
   1. استخدم صور الحقل المضيء لقياس نسبة الآبار التي تحتوي على هياكل مجوفة (أي الهياكل ذات التجويف المركزي المحدد) وقياس قطر البلاستويد.
      1. افتح الصور في برنامج تحليل الصور.
      2. استخدم أداة الخط المستقيم لرسم خط عبر كل هيكل.
      3. قس القطر باستخدام تحليل > قياس.
   2. اختر عينات ممثلة مصبوغة مناعة (20–40 هيكل لكل نسخة بيولوجية، مع ما لا يقل عن ثلاث نسخ بيولوجية لكل حالة) وصورة كما هو موضح في القسم 2.7.
   3. قم بقياس عدد الخلايا الكلي وتركيب النسب باستخدام مؤشرات التألق المناعي: TE (إيجابي CDX2)، EPI (إيجابي SOX2 وSOX17 سالب)، وPE (إيجابي SOX17).
   4. تقييم التنظيم البنيوي والشكل من خلال تحديد ما إذا كانت خلايا PE مفصولة مكانيا عن خلايا EPI داخل كتلة الخلية الداخلية (ICM) (التصنيف الثنائي: نعم/لا).
   5. صنف الشكل كجيد (بنية شفافة تشبه الكيسة الأريمية مع تجويف محدد وأقسام TE، EPI، وPE منظمة بشكل صحيح)، أو متوسطة (تشوهات بسيطة مثل الشكل غير المنتظم أو التجويف الجزئي)، أو سيئة (تشوهات كبيرة مثل غياب التجويف أو سلالات غير منظمة/غير مرتبة).
   6. قم بقياس المعلمات الإضافية، بما في ذلك حجم التجويف أو الحجم، حيثما كان ذلك مناسبا. استخدم أدوات المعلوماتية الحيوية أو أدوات أخرى للرسم والتحليل الإحصائي، وبرامج تحليل الصور ثلاثية الأبعاد لعد الخلايا و/أو تحضير الصور للعرض.

Results

الحفاظ على خلايا البلاستيدات وiGATA4-ESCs (نورموكسيا) وTSCs (نقص الأكسجين) تحت ظروف الزراعة المناسبة أمر ضروري لنجاح إنتاج الأبلاستويد. عند زراعتها كما هو موضح، يجب أن تكون ال ESCs وiGATA4-ESC غير مميزة إلى حد كبير، وتشكل مستعمرات متوسطة الحجم ومستديرة ومحددة جيدا بعد 3 أيام. ظهور المستعمرات المسطحة أو الحواف البارزة يشير إلى تمايز ناشئ، ولا ينبغي استخدام مثل هذه الثقافات لتكوين البلاستويد. يجب أن تشكل الدهشات الظهارية المسطحة ذات حواف مرتفعة قليلا ومراكز أكثر تسطحا. غالبا ما تؤدي مستعمرات TSC المتضخمة أو المدمجة (عادة بعد >3 أيام من الزراعة) إلى نتائج سيئة للبلاستويد (الشكل 1).

خلال تجميع iGATA4-بلاستويد، تشير عدة علامات مبكرة إلى نجاح البروتوكول (الشكل 2A، B). بعد حوالي 6 ساعات من تجميع ESC وiGATA4-ESC، يجب أن تكون تجمعات الخلايا المحكمة مرئية في قاع الآبار الدقيقة. تشير التجمعات الفضفاضة إلى التعرض المفرط لمادة تفكك الخلايا المفرطة، مما يقلل من التصاق الخلية بالخلية. التقدم إلى الخطوة التالية (إضافة TSC؛ يجب أن يحدث القسم 2.4) فقط عند ملاحظة تجمعات محكمة (الشكل 2B، نقطة زمنية D0.5). يجب أن يظهر التلطيخ المناعي في هذه المرحلة تجمعات متجانسة SOX2⁺ و GATA4⁻ (الشكل 2B، نقطة زمنية D0.5).

بعد إضافة TSC والحضانة الليلية، يجب أن يكون هناك تجمع متماسك واحد محاط بخلايا CDX2⁺ (الشكل 2B). غالبا ما يشير وجود خلايا كبيرة غير متجمعة على سطح التجمعات إلى وجود متبقيات MEF. يمكن أن يقلل تلوث MEF من كفاءة تكوين البلاستويد؛ لذلك، فإن استنزاف كاف ل MEF أمر بالغ الأهمية للحصول على شريحة سكانية ذات أغلبية من TSC قبل التجميع. قد يستخدم مصفاة خلوية بحجم 40 ميكرومتر لإزالة MEFs المتبقية، رغم أن ذلك قد يقلل من عائد TSC. يمكن تصحيح تغطية CDX2⁺ غير المكتملة أو المفرطة عن طريق تعديل عدد TSCs المضافة لكل ميكروبئر (النطاق الموصى به: 10–15).

بعد إضافة DOX و8Br-cAMP، تلاحظ عادة التسوس بحلول اليوم الثاني وقد تستمر حتى اليوم الثالث. تحت المجهر المضيء، تظهر التجاويفات كفراغات واضحة وفارغة داخل البلاستويدات (الشكل 2B، C؛ خط أبيض متقطع). تظهر خلايا GATA4⁺ بعد فترة وجيزة من تحفيز DOX وتفرز تدريجيا على سطح الحجرة الشبيهة بالICM (الشكل 2B). يتميز التكوين البلاستويد الناجح بكفاءة عالية في التجويف (عادة ~80٪ من الهياكل لكل لوحة تجمع ميكروويل؛ الشكل 2D)، وظهارة خارجية ذات طبقة واحدة شبيهة ب CDX2⁺ TE، وتجويف يشبه الأبلستوكول، وحجرة مستديرة شبيهة بالأشعة المحيطية تحتوي على خلايا شبيهة ب SOX2⁺ EPI مغطاة بخلايا شبيهة ب GATA4⁺ PE (الشكل 2C–E).

تشمل النتائج غير المثالية الشائعة هياكل غير مجوفة، وبلاستويدات غير منتظمة الشكل ذات تجاويف متعددة أو حجرات شبيهة ب ICM، والآبار التي تحتوي على عدد قليل من الهياكل أو الحطام الخلوي. بينما من المتوقع حدوث حوالي 20٪ من البنى غير الطبيعية (الشكل 2C)، قد تشير المعدلات الأعلى إلى مشاكل مثل تحضير غير صحيح لوسط TX، أو ضعف جودة الخلايا الابتدائية، أو عدم إضافة DOX أو 8Br-cAMP في اليوم الأول، أو إزاحة الهياكل أثناء تغييرات الوسط.

لتطبيقات الفحص عالية الإنتاجية، يجب أن تنتج آبار التحكم غير المعالجة وآبار التحكم في المركبات بلاستيدات مماثلة لظروف التحكم الإيجابي (الشكل 3A,B). قد تؤثر العلاجات التجريبية على عدة مقاييس جودة، بما في ذلك حجم البلاستويد (الشكل 3C)، وكفاءة التجويف، وأعداد الخلايا الكلية والخاصة بالسلالة (الشكل 3D)، وترتيب PE، والشكل العام (الشكل 3E). على سبيل المثال، أدى العلاج بالكافيين أو النيكوتين أو الإيثانول أثناء تكوين البلاستويد إلى تراكيب أصغر مع كفاءة تجويف أقل، وانخفاض عدد الخلايا الكلية أو ICM، وضعف في فرز PE، وشكل شكل أسوأ. على النقيض من ذلك، أدى تركيز متزايد من الأحماض الأمينية المتفرعة إلى إنتاج بلاستويدات أكبر وأكثر تجويف مع زيادة عدد الخلايا وتحسين الشكل (الشكل 3C–E). من المتوقع وجود تباين بيولوجي بين التجارب، مما يبرز أهمية تضمين كل من التحكم الفارغ والحامل في كل تجربة.

الشكل 1: أمثلة على وحدات WT ESCs ذات الجودة الجيدة والضعيفة، وiGATA4-ESCs، وTSCs. صور مجهرية من الحقول المضيئة لمناطق WT ESCs، iGATA4-ESCs، وTSCs تظهر الأشكال المتوقعة للمستعمرات بعد 2-3 أيام من الزراعة في N2B27/2i/LIF (ESCs) أو وسط TSF4H (TSCs). تظهر اللوحة المعنونة "WT ESCs – سوء الجودة" خلايا ذات شكل غير مثالي، بما في ذلك مستعمرات مسطحة ذات حواف بارزة (رؤوس سهام حمراء). لوحة "TSC مفرط النباتات" تظهر مستعمرات TSC مدمجة وموسعة بعد 4 أيام من الثقافة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر لجميع الألواح. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: الشكل التخطيطي والالمتوقع لبلاستويدات iGATA4. أعيد الطباعة من Developmental Cell، المجلد 61، Jorgensen V، Bao M، Junyent S وآخرون، نماذج فعالة لأجنة الفئران المشتقة من الخلايا الجذعية للدراسات البيئية، الصفحات 193–207.e6، حقوق النشر (2025)³، بإذن من Elsevier. (أ) التمثيل التخطيطي لتطور الكيسة الأريمية الطبيعية للفئران (الأعلى) ونمذجة الكيسة الأريمية القائمة على الخلايا الجذعية باستخدام WT ESCs، iGATA4-ESCs، وTSCs.
(ب) صور مجهرية تظهر الشكل المتوقع وتعبير العلامات في مراحل مختلفة من البروتوكول. إسقاط الشدة القصوى (MIP)؛ الخطوط المتقطعة تحدد التجويف. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. (C) صورة الحقل الساطع لبلاستويدات iGATA4 في اليوم الثالث. شريط المقياس: 100 ميكرومتر.
(د) معدلات التجويف في iGATA4-بلاستويدات الناتجة باستخدام مضادات TSC المزروعة مسبقا في نورموكسيا أو نقص الأكسجين؛ تم زراعة التجمعات تحت ظروف نقص الأكسجين. n ≥ 4; تمثل أشرطة الخطأ القياسي للمتوسط. (ه) تلطيخ المناعة لكيسات E4.5 الأريمية واليوم الثالث iGATA4-بلاستويدات لعلامات النسب (CDX2، سماوي؛ أكتوبر الرابع، الأحمر؛ GATA4، أخضر). إسقاط الشدة القصوى (MIP)؛ مستوى Z واحد يظهر حيث هو مشار إليه. شريط المقياس: 25 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3. تأثيرات العوامل البيئية على تكوين وجودة البلاستويد. (أ) صور ثلاثية الأبعاد لفلورة المناعة التمثيلية (في الأعلى) وإعادة بناء سطح IMARIS (الأسفل) لبلاستويدات iGATA4 المعالجة بعوامل بيئية (الكافيين، النيكوتين، الإيثانول، وظروف تحاكي الأنظمة الغذائية عالية ومنخفضة البروتين). أشرطة المقياس: 25 ميكرومتر لجميع الصور. (ب) مخطط سير العمل التجريبي. (ج) قطر البلاستويد تحت ظروف معالجة مختلفة. يمثل هذا النطاق النسبة المئوية من 10 إلى 90؛ تشير الصناديق إلى النطاق بين الربع؛ يشير الخط إلى الوسيط. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل النوفاع الجوي أحادي الاتجاه مع عدة مقارنات. (د) قياس أعداد الخلايا الكلية (الرمادية)، والأديرم التروفيكتودريمي (السيان)، والإيبيبلاست (الأحمر)، والخلايا البدائية (الخضراء) في الخلايا الأريمية المسيطرة والمعالجة. القضبان تمثل المتوسط؛ تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل النوفاع الجوي أحادي الاتجاه مع عدة مقارنات. (ه) قياس نسبة البلاستويدات المصنفة ك "جيدة" (فرز صحيح للسلالة مع أقل شذوذات شكلية)، أو "متوسطة" (شكل صحيح إلى حد كبير مع شذوذات طفيفة، بما في ذلك فرز غير مكتمل لEPI–PE)، أو "سيئة" (شكل غير طبيعي بشدة مع اضطراب في تنظيم النسب) تحت ظروف السيطرة والعلاج. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل النوفاين ثنائي الاتجاه مقارنة بظروف التحكم. لجميع الألواح، n ≥ 3. تشير الدلالة الإحصائية إلى *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الإعلام	المادة الكيميائية	التركيز النهائي
FC
	DMEM	ن.أ.
	نظام FBS غير منشط بالحرارة (iFBS)	15%
	غلوتا ماكس	2 مللي مول
	2-ميركابتوإيثانول (2-ME)	0.1 مللي مولار
	الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)	1x
	نا بيروفاتي	1x
	البنسلين-ستريبتوميسين	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	نيوروبازالا	50%
	مكمل فيتامين B27	1x
	ملحق N2	0.5x
	2-ME	100 ميكرومولار
	البنسلين-ستريبتوميسين	1%
	غلوتا ماكس	2 مللي مول
	PD0325901	1 ميكرومولار
	CHIR99021	3 ميكرومولار
	LIF المؤتلف في الفأرة	10 نانوغرام/مل
TSF4H
	ميغاسيل RPMI-1640 ميديوم	ن.أ.
	iFBS	20%
	غلوتا ماكس	2 مللي مول
	نا بيروفاتي	1x
	البنسلين-ستريبتوميسين	1x
	FGF4	25 نانوغرام/مل
	هيبارين	1 ميكروغرام/مل

الجدول 1: وصفات الوسائط ل FC وN2B27/2i/LIF وTSF4H. وصفات لتحضير وسط FC، ووسائط N2B27/2i/LIF، ووسائط TSF4H، مع تركيزات نهائية.

المكون	التركيز النهائي	تركيز المخزون	المذيب والتخزين	الحجم إلى ~20 مل
8BR-cAMP	25 ميكرومولار	5 مللي مولار	PBS، تخزين عند -20 درجة مئوية	100 ميكرولتر
CHIR99021	3 ميكرومولار	10 مللي مولار	DMSO، تخزين عند -20 درجة مئوية	6 ميكرولتر
DMEM/F12	لا يوجد	لا يوجد	التخزين عند 4 درجات مئوية	20 مل
FGF4	25 نانوغرام/مل	100 ميكروغرام/مل	0.1٪ BSA في PBS، وتخزين عند -20 درجة مئوية	5 ميكرولتر
مكمل إل-ألانيل-إل-جلوتامين	2 مللي مول	200 مللي موتر	التخزين عند 4 درجات مئوية	200 ميكرولتر
هيبارين	1 ميكروغرام/مل	1 ملغ/مل	PBS، تخزين عند -20 درجة مئوية	20 ميكرولتر
الهولو-ترانسفيرين	10.7 ميكروغرام/مل	10.7 ملغ/مل	مياه DI، تخزن عند -20 درجة مئوية	20 ميكرولتر
TGF-β1 البشري	15 نانوغرام/مل	20 ميكروغرام/مل	4 ملليموتر HCl + 0.1٪ BSA، يخزن عند -20 درجة مئوية	15 ميكرولتر
IL-11	30 نانوغرام/مل	25 ميكروغرام/مل	0.1٪ BSA في PBS، وتخزين عند -20 درجة مئوية	24 ميكرولتر
الأنسولين	19.4 ميكروغرام/مل	9.5 - 11.5 ملغ/مل	يعتمد التركيز على الدفعة، وتخزينه عند 4 درجات مئوية	33.7–40.8 ميكرولتر، مع تعديل الحجم حسب تركيز المخزون.
حمض الأسكوربك-2-فوسفات المغنيسيوم	64 ميكروغرام/مل	32 ملغ/مل	مياه DI، تخزن عند -20 درجة مئوية	40 ميكرولتر
LIF المؤتلف في الفأرة	10 نانوغرام/مل	10 ميكروغرام/مل	PBS + 0.1٪ BSA، تخزين عند -20 درجة مئوية	20 ميكرولتر
NaHCO3	543 ميكروغرام/مل	45.25 ملغ/مل	مياه DI، تخزن عند -20 درجة مئوية	240 ميكرولتر
البنسلين/الستربتوميسين	1x	100x	التخزين عند -20 درجة مئوية	200 ميكرولتر
سيلينيت الصوديوم	14 نانوغرام/مل	14 ميكروغرام/مل	مياه DI، تخزن عند -20 درجة مئوية	20 ميكرولتر
Y27632	20 ميكرومولار	20 مللي مولار	DMSO، تخزين عند -20 درجة مئوية	20 ميكرولتر

الجدول 2: وصفة إعلامية لتكساس. وصفة لتحضير وسائط التوصيل، مع تفاصيل حول كيفية تحضير وتخزين الجزيئات الصغيرة والكواشف الأخرى، والتركيزات النهائية.

Discussion

توفر iGATA4-بلاستويدات نموذجا عالي الكفاءة، يشبه الجنينة ويعتمد على الخلايا الجذعية لكيسة الفئران من خلال تنظيم ثلاثة أنواع من الخلايا المختبرية ذاتيا: ESCs، وGATA4-ESCs القابلة للإدخال (iGATA4-ESCs)، وTSCs المزروعة بنقص الأكسجين. تعيد هذه البنى ملخص السمات الرئيسية لكيس الأريمة E4.5، بما في ذلك النسب النسبية المناسبة والهوية النسخية، ويمكن استخدامها في الفحص البيئي متعدد المعلمات، مما يعكس بشكل موثوق عيوب تطور مرحلة الكيسات الأريمية³. تظهر دراسة حديثة أيضا أن تجميع الخلايا الكيميائية (ESCs)، وiGATA4-ESCs، وTSCs في الأوساط القاعدية ينتج أيضا تكوين بلاستويد عالي الكفاءة، مما يبرز متانة وقابلية التكيف لهذا النهج عبر المختبرات وظروف الزراعة³⁹. لقد ثبت سابقا أن iGATA4-ESCs تعيد تمثيل وظائف خلايا التسرب الافتراضي في نماذج الأجنة القائمة على الخلايا الجذعية بعد الزرع 28,29,30,31. توضح هذه النتائج معا كيف يمكن ل iGATA4-ESCs أن تكون بديلا مرنا وموثوقا لخلايا PE/VE في نمذجة الأجنة القائمة على الخلايا الجذعية عبر مراحل التطور.

تعد عدة خطوات في البروتوكول ضرورية لتحقيق بلاستويدات عالية الجودة. تشمل هذه جودة تجمعات الخلايا الأولى، وخاصة الخلايا العصبية المزروعة بنقص الأكسجين (الشكل 1)؛ تحضير الوسيط التكسي، الذي يجب أن يكون طازجا في اليوم 0 (الجدول 2؛ القسم 2.3); والتعامل الدقيق مع الألواح بعد التجميع. تشمل القراءات الرئيسية لنجاح البروتوكول كفاءة التجويف (عادة ~80٪)، والشكل المناسب (هياكل قطرها ~100 ميكرومتر مع تجويف يشبه الأبلستوكول، وطبقة خارجية شبيهة ب CDX2⁺ TE، وكتلة خلية داخلية مرتبة SOX2⁺ وGATA4⁺ بنسبة PE تقارب 3 TE:1 EPI:1)، ووجود طبقة شبيهة ب GATA4⁺ PE مرتبة بشكل صحيح. هذه مقاييس تستخدم عادة في المجال 1,2,4,5. بين الأبلاستويدات المجوفة، يظهر حوالي 75٪ من الهياكل كل هذه الخصائص. يمكن استخدام هذه المقاييس كمؤشرات أولية لحل المشكلة. عادة ما تنعكس جودة الخلية غير المثالية في شكل المستعمرات غير الطبيعي، مما يؤدي إلى تراكمات ضعيفة أو غير مجوفة في الهياكل. قد يؤدي التحضير غير السليم للوسط إلى تجمع غير مكتمل أو عيوب في النسب، بينما قد يؤدي التعامل الخشن إلى عدة تجمعات في كل بئر صغير أو آبار فارغة.

قد تشمل التحسين الإضافي تعديل عدد الخلايا المزروعة (النطاقات الابتدائية الموصى بها: 4–7 خلايا ESC وiGATA4-ESCs، و10–15 TSC لكل ميكروبئر)، وتحسين طرق استنزاف MEF (مثل الترشيح عبر مصفاة خلية بحجم 40 ميكرومتر)، وتعديل تركيبة وسط TX. على سبيل المثال، إزالة FGF4 والهيبارين يمكن أن تدعم التكوين الفعال للبلاستويد، مع تعزيز هوية تشبه TE الجدارية. يمكن الحفاظ على بلاستويدات iGATA4 في الزراعة لمدة تصل إلى 6 أيام؛ ومع ذلك، غالبا ما تزداد الهياكل من الأيام الرابعة إلى السادسة مع الاحتفاظ بنسب شبيهة بالأكياس الأريمية من السلالة. يعطي البروتوكول نتائج متسقة عبر النسخ البيولوجية، لكن يجب تضمين ضوابط مناسبة في كل تجربة.

مقارنة بأنظمة البلاستويد الأخرى للفئران، التي تختلف في أعداد الخلايا الأولية وظروف الزراعة 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ، تحقق iGATA4-بلاستويدات كفاءة عالية في التكوين وتمثيل دقيق للسلالة. بينما تولد العديد من البروتوكولات الحالية هياكل مجوفة وتعتبر ذات قيمة لتطبيقات بيولوجية محددة، إلا أنها غالبا ما تظهر تكوين PE غير مكتمل، أو هويات خلوية غير متجانسة أو غير محددة، أو نسب سلالية غير صحيحة. من خلال دمج ثلاث مجموعات من الخلايا الجذعية الموجهة بالنسب بشكل تدريجي، تتغلب iGATA4-بلاستويدات على هذه القيود وتوفر نظاما قابلا للتكرار، معياريا، وسهل الوصول إليه تجريبيا.

رغم هذه المزايا، لا تزال هناك عدة قيود. الزراعة الممتدة في المختبر في وسط تكساس لأكثر من 4-6 أيام تؤدي إلى نمو زائد، حتى لو بقيت نسب النسب شبيهة بالأكياس الأريمية. حوالي 12.5٪ من بلاستيدات iGATA4 تنتقل إلى أشكال شبيهة ب الغرس في المختبر، تتميز بوجود إبيبلاست شبه طبقي على شكل كوب يحيط بتجويف ما قبل السلى الجنيني، وحجرة خارج الأديم الخارجية الموسعة بجانب الفوق الأورم القريب، وطبقة خارجية شبيهة بالجلد الداخلي الحشوي. ومع ذلك، تفشل iGATA4-blastoids في الزرع وتتطور أكثر بعد نقلها إلى فأر مضيف. لذلك، فإن بلاستويدات iGATA4، والأبلاستويدات بشكل أوسع، غير مناسبة لدراسة الغرس أو التفاعلات بين الجنين والأم.

لا يزال الأساس الجزيئي لفشل الأبلاستويدات في الزرع غير واضح، رغم أن الأدلة الحالية تشير إلى أن نمذجة الأديم التفوضية غير الكاملة قد تكون عاملا مساهما. تظهر خلايا شبيهة ب TE في iGATA4-بلاستويدات هوية جزيئية قطبية مفرطة. الجهود المستقبلية لهندسة الخلايا الصلبة الصلبة التي تشبه أكثر خلايا TE الجدارية، أو لإدخال خطوط خلايا بديلة تعيد بشكل أفضل تعكس الكفاءة في الانغراس، تمثل اتجاهات واعدة لتجاوز هذه القيود. الطبيعة المعيارية لبلاستويدات iGATA4، حيث يمكن تنفيذ تعديلات خاصة ب TE بشكل مستقل عن تكوين EPI وPE، تجعل هذا النظام مناسبا بشكل خاص لمثل هذه التطورات.

عند جمع بروتوكول iGATA4-بلاستويد منصة قوية وقابلة للتوسع لدراسة مواصفات النسب والعمليات التطورية المبكرة في الأجنة الثديية. قابليته للتكرار وقابليته للتكيف تجعله مناسبا جدا لتطبيقات الفحص البيئي والدوائي والجيني عالية الإنتاجية. وبالتالي، تمثل بلاستويدات iGATA4 نظاما قويا للتحقيق في آليات التطور المبكرة وتقييم كيفية تأثير الاضطرابات المتنوعة على تطور ما قبل الانغراس.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	يُستخدم لتحضير الوسائط العامة
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	يُستخدم لتحضير وسط TX وتجويف البلاستويد
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	صفيحة تجميع دقيقة ؛ يُستخدم لتحضير البلاستويد
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	يُستخدم لتحضير البلاستويد
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	ماصّات ذات فتحة عريضة لنقل البلاستويد أثناء التلطيخ المناعي.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	يُستخدم لتحضير الوسائط
Caffeine	Sigma	58-08-2	يُستخدم كعامل بيئي للاختبار في البلاستويدات iGATA4
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	للتلطيخ المناعي ، يُستخدم بمعدل 1:200
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	قد تعمل العلامات التجارية / الموديلات الأخرى أيضًا.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	يُستخدم لتحضير الوسائط
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	يُستخدم لأغراض زراعة الأنسجة العامة
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	يُستخدم للتلطيخ المناعي ، ويُستخدم بمعدل 1: 500-1: 1000
DMEM	Gibco	11995040	يُستخدم لتحضير وسط FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	يُستخدم لتحضير وسط N2B27 و TX
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	قم بتكميل DMEM-LM بمسحوق Ham's F-12 Nutrient Mix بتركيز نهائي 1x للحصول على DMEM / F12 خالٍ من Met و Leu
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	يُستخدم للتلطيخ المناعي ، ويُستخدم بمعدل 1: 500-1: 1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	يُستخدم للتلطيخ المناعي ، ويُستخدم بمعدل 1: 500-1: 1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	يُستخدم للتلطيخ المناعي ، ويُستخدم بمعدل 1: 500-1: 1000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	يُستخدم للتلطيخ المناعي ، ويُستخدم بمعدل 1: 500-1: 1000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	يُستخدم للتلطيخ المناعي. قم بإذابتها في 4 درجات مئوية ، وقم بتخزينها في قوارير في -20 درجة مئوية.
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	لإنتاج iGATA4 أثناء تحضير البلاستويد
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	يُستخدم في مختبرنا ، وقد يعمل الآخرون. يتطلب محول الأنبوب واللوحة.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	يُستخدم للتلطيخ المناعي
FGF4	R&D Systems	5846-F4	يُستخدم لتحضير الوسائط
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	يُستخدم لتحليل الصور
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	يُستخدم للتلطيخ المناعي ، ويُستخدم بمعدل 1: 500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	يُستخدم لأغراض زراعة الأنسجة العامة
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	للتلطيخ المناعي والتصوير
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	مكمل L-alanyl-L-glutamine ؛ يُستخدم لتحضير الوسائط
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	يُستخدم كمكمل لـ DMEM-LM ، لظروف النظام الغذائي منخفض البروتين.
Heparin	Sigma	H3149	يُستخدم لتحضير الوسائط
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	قد تعمل العلامات التجارية / الموديلات الأخرى أيضًا.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	يُستخدم لتحضير وسط TX.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	يُستخدم لتحضير وسط TX.
IL-11	PeproTech	200-11	يُستخدم لتحضير وسط TX.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	يُستخدم لتحليل الصور وتحضير الصور.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	يُستخدم لتحضير الوسائط
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	الخط الخلوي متاح من مختبر Zernicka-Goetz بناءً على الطلب
Insulin	Sigma	I9278	يُستخدم لتحضير وسط TX.
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	يُستخدم كطبقة مغذي للثقافة TSC. قم بإذابتها كما هو موضح في البروتوكول واستخدمها في غضون أسبوع.
L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium	Sigma	A8960	يُستخدم لتحضير وسط TX.
L-isoleucine	Thermo Fisher Scientific	73-32-5	يُستخدم لتكملة وسط TX.
L-leucine	Thermo Fisher Scientific	61-90-5	يُستخدم لتكملة وسط TX.
L-valine	Thermo Fisher Scientific	72-18-4	يُستخدم لتكملة وسط TX.
Megacell RPMI-1640 Medium	Sigma	M3817	يُستخدم لتحضير الوسائط
Miscellaneous pipette tips	Multiple providers	NA	للتعامل العام مع السوائل