علم الأدوية الشبكي المتكامل، علم الماتابولوميكس، والتحقق الحي : ليانغشوي ديهوانغ ديهوانغ في فئران التهاب القولون التقرحي الناتجة عن DSS

ملخص

يصف هذا البروتوكول سير عمل قابل للتكرار يدمج علم الأدوية الشبكي، والاستقلاب غير المستهدف، والتحقق في الجسم الحي لتوضيح آليات الدمج متعدد المكونات لديكوشن ليانغشوي ديهوانغ في نموذج فأر ناتج عن كبريتات الصوديوم الدكستران لالتهاب القولون التقرحي.

الملخص

التهاب القولون التقرحي (UC) هو مرض التهاب مزمن في الأمعاء يتميز بالتهاب مستمر في الأمعاء واختلال في تنظيم الأيض. تستخدم صيغ الطب الصيني التقليدي (TCM) على نطاق واسع في الممارسة السريرية للاضطرابات الالتهابية؛ ومع ذلك، لا تزال الأساليب التجريبية المنهجية لتوضيح آلياتها متعددة المكونات والأهداف محدودة. تقدم هذه المقالة بروتوكولا تجريبيا قابلا للتكرار يدمج علم الأدوية الشبكي، والتمثيل الغذائي غير المستهدف، والتحقق في الجسم الحي لدراسة التأثيرات المضادة للالتهابات لديهوانغ ديكستشن (LXDHD) في نموذج فأر من كبريتات الدكستران الصوديوم (DSS) لالتهاب التقرح. يشمل سير العمل تحضير المحلول العشبي، ونمذجة التهاب القولون الناجم عن DSS، وتقييم نشاط المرض، والتقييم النسيجي والهيماتولوجي، وقياس سيتوكينات المصل، والتحليل الأيضي المعتمد على LC–MS، وتحليل الشبكات الحاسوبية. باستخدام هذا النهج المتكامل، تم إثبات التهاب القولون الناتج عن DSS بنجاح، وأسفر علاج LXDHD عن تحسينات ملموسة في مؤشر نشاط المرض، وطول القولون، والضرر النسيجي، ومستويات السيتوكين الالتهابية، والملفات الأيضية. أظهرت تحليلات علم الأدوية الشبكي وعلم الأيض بشكل أكبر أن هذا البروتوكول يتيح تحديد الأهداف الرئيسية والمسارات والمستقلبات المرتبطة بالتدخل العلاجي. يوفر هذا السير العملي المرئي والموحى إطارا منهجية عمليا لدراسة الآليات الدوائية لصيغ الطب الصيني الصيني متعددة المكونات في أمراض الأمعاء الالتهابية، ويمكن تكييفه مع وصفات عشبية ونماذج مرضية أخرى.

المقدمة

التهاب القولون التقرحي (UC) هو مرض التهابي مزمن في الأمعاء يتميز بالتهاب مخاطي مستمر في^{القولون 1}، مما يؤدي إلى أعراض مثل ألم البطن، والإسهال، والنزيف الشرجي، وفقدان الوزن². تزايد معدل الإصابة بالالتهاب التقرفي التقرفي حول العالم، مما يفرض عبئا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية ويضعف بشكل كبير جودة حياة المرضى³. على الرغم من أن أسباب الالتهاب القولون التقرحي لا تزال غير مفهومة بشكل كامل، إلا أن الأدلة المتراكمة تشير إلى أن الاستجابات المناعية غير المنظمة، والإنتاج المفرط للسيتوكينات الالتهابية، والإجهاد التأكسدي، والاضطرابات الأيضية تلعب أدوارا مركزية في مسببات المرض ^4,5.

تشمل الاستراتيجيات العلاجية الحالية لالتهاب القولون التقرحي بشكل رئيسي الأمينوساليسيلات، والكورتيكوستيرويدات، والعوامل المثبطة للمناعة، والأدوية البيولوجية التي تستهدف السيتوكينات الالتهابية⁶. بينما يمكن لهذه العلاجات تخفيف الأعراض وتحفيز الشفاء، فإن استخدامها طويل الأمد غالبا ما يرتبط بآثار جانبية، وتكاليف مرتفعة، واستجابات علاجية متغيرة ^7,8,9. علاوة على ذلك، يفشل عدد كبير من المرضى في تحقيق هدوء مستدام، مما يبرز الحاجة إلى طرق علاجية بديلة أو تكميلية مع تحسين السلامة وفعالية متعددة الأهداف.

يستخدم الطب الصيني التقليدي (TCM) على نطاق واسع لعلاج اضطرابات الجهاز الهضمي لقرون، ويحظى بمعرفة متزايدة لفوائده المحتملة في الأمراض الالتهابية المعقدة مثل الالتهاب العقدي¹⁰. على عكس العلاجات ذات الهدف الواحد، عادة ما تمارس صيغ الطب الصيني الصيني تأثيرات علاجية من خلال عدة مكونات تؤثر على أهداف ومسارات متعددة، مما قد يعالج بشكل أفضل الطبيعة متعددة العوامل ل UC¹¹. أشارت الدراسات السريرية والتجريبية إلى أن بعض وصفات طب الطب الصيني الصيني يمكنها تعديل الاستجابات المناعية، وقمع الالتهاب، وحماية سلامة الحاجز المعوي، وتنظيم التوازن الأيضي 12,13,14,15.

ليانغشوي ديهوانغ ديكوشن (LXDHD) هو تركيبة كلاسيكية لطب الطب الصيني التقليدي تستخدم تقليديا ل "تبريد الدم وتصفية الحرارة" وقد تم تطبيقها سريريا على اضطرابات الالتهاب والنزيف¹⁶. يتكون الوصفة الطبية من عدة أعشاب، منها Scutellaria baicalensis، Phellodendron chinense، Rehmannia glutinosa، Paeonia suffruticosa، Paeonia lactiflora، Sanguisorba officinalis، Platycladus orientalis، Saposhnikovia divaricata، Citrus aurantium، Angelica sinensis، وGlycyrrhiza uralensis. أظهرت الدراسات الدوائية الحديثة أن العديد من الأعشاب المكونة ومركباتها الفعالة تمتلك^{خصائص مضادة} للالتهاب، مضادات الأكسدة، وتعديل المناعة^. ومع ذلك، لم يتم بعد توضيح التأثيرات العلاجية العامة والآليات الأساسية ل LXDHD في الالتهاب التقرحي التقرحي بشكل منهجي.

برز علم الأدوية الشبكي كنهج فعال لاستكشاف التفاعلات المعقدة بين الصيغ العشبية متعددة المكونات والأهداف الجزيئية المرتبطة بالأمراض²⁰. من خلال دمج المعلومات من قواعد بيانات متعددة، يمكن لعلم الأدوية الشبكي التنبؤ بالمركبات الفعالة المحتملة، والأهداف العلاجية، ومسارات الإشارة، مما يوفر فهما على مستوى الأنظمة لآليات الطب الصيني التقليدي²¹. ومع ذلك، تعتمد علم الأدوية الشبكي بشكل أساسي على توقعات قواعد البيانات ولا تعكس بشكل مباشر التغيرات الأيضية في الجسم الحي .

ميتابولوميكس، كأداة قوية لتحليل التغيرات الأيضية العالمية، يقدم رؤى مكملة في فيزيولوجيا الأمراض والاستجابات العلاجية²². في جامعة كاليفورنيا، كشفت التحليلات الأيضية عن اضطرابات كبيرة في استقلاب الدهون والأحماض الأمينية، بالإضافة إلى مسارات مرتبطة بالإجهاد التأكسدي^{23، 24، 25}. يمكن أن يساعد دمج الأيض مع علم الأدوية الشبكي في سد الفجوة بين الأهداف الجزيئية المتوقعة والأنماط الأيضية الفعلية، مما يحسن من موثوقية التفسيرات الميكانيكية.

في هذه الدراسة، تم استخدام استراتيجية متكاملة تجمع بين علم الأدوية الشبكي، والاستقلاب غير المستهدف، والتحقق التجريبي لدراسة التأثيرات المضادة للالتهابات والآليات المحتملة ل LXDHD في نموذج الفأر المستحث بواسطة كبريتات الدكستران الصوديوم (DSS) للكبريتات الحامية (الشكل 1A). هذا التصميم المنهجي العام، الذي يتكامل مع التنبؤات في السيليكو مع التحقق من الأيض الحي ، يتوافق مع أطر بحثية صارمة راسخة²⁶. تم استخدام تحليل علم الأدوية الشبكي لتحديد المركبات النشطة، والأهداف العلاجية المحتملة، ومسارات الإشارة التي تم إثراؤها بعلاج LXDHD. تم إجراء عمليات أيض غير مستهدفة لتوصيف التغيرات الأيضية الناتجة عن الالتهاب التقرحي وتعدلها بواسطة LXDHD. علاوة على ذلك، تم التحقق من صحة النتائج الرئيسية من خلال تجارب في الجسم الحي ، بما في ذلك تقييمات نشاط المرض، والتغيرات النسيجية، والمعايير الدموية، ومستويات السيتوكين الالتهابية.

من خلال دمج التنبؤات الحاسوبية، والتحليل الأيضي، والتحقق البيولوجي، تهدف هذه الدراسة إلى تقديم فهم شامل للآليات متعددة المكونات والأهداف والمسارات المتعددة التي تقوم عليها التأثيرات العلاجية ل LXDHD في التكوين التقرفي. هذا العمل لا يقدم فقط أدلة تجريبية تدعم استخدام LXDHD كعلاج تكميلي محتمل للالتهاب التقرحي، بل يوفر أيضا إطارا منهجيا للتحقيق في آليات صيغ الطب الصيني التقليدي المعقدة الأخرى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات وفقا لإرشادات العناية واستخدام الحيوانات المختبرية، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في المستشفى التابع لجامعة نانجينغ للطب الصيني (رقم الموافقة #2025DW-034-01؛ تاريخ الموافقة: 24 مارس 2025). تم تحضير ليانغشوي ديهوانغ ديهوانغ للغسيل وفقا للإجراءات الموضحة في الدواء الصيني^{رقم 27}. المواد الكيميائية والمواد الكيميائية والبرمجيات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير ليانغشوي ديهوانغ ديكوشن (LXDHD)

1. حضر المواد العشبية المجففة وفقا للتركيبة القياسية ل LXDHD. التركيب العشبي الدقيق والأسماء النباتية والجرعات الموصوفة للأعشاب الأحد عشر المكونة محددة في الجدول 1.
   ملاحظة: قم بتوثيق جميع المواد العشبية من قبل مختص مختص بالصيدلة قبل الاستخدام لضمان الهوية النباتية وثبات الجودة. احتفظ بسجلات المصادقة لإمكانية تكرار النسخ.
2. تحضير المسحوق
   1. جفف جميع المواد العشبية في الهواء في درجة حرارة الغرفة في بيئة نظيفة وجيدة التهوية.
   2. قم بسحق كل عشبة بشكل منفصل باستخدام مطحنة ميكانيكية حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم.
   3. ادمج المسطحات حسب النسب المحددة.
   4. مرر المسحوق المختلط عبر منخل مكون من 80 شبكة (قطر داخلي 180 ميكرومتر ± 7.6 ميكرومتر) لضمان حجم الجزيئات المتجانس.
   5. قم بتجانس المسحوق المنخل تماما.
      ملاحظة: حجم الجسيمات الموحد ضروري لكفاءة الاستخراج المتسقة. قد يؤدي الطحن غير الكامل أو الخلط غير المتساو إلى تباين في التركيب الكيميائي.
3. تحضير مستخلص LXDHD المائي
   1. قم بوزن مسحوق الأعشاب المختلط بدقة وأضف الماء المقطر بنسبة 1:10 (w/v).
   2. سخن الخليط حتى يغلي ثم اتركه مطهورا لمدة 20 دقيقة.
   3. فلتر المستخرج واجمع الفلترة.
   4. أضف ماء مقطر طازج إلى البقايا وكرر عملية النقع لمدة 20 دقيقة إضافية.
   5. ادمج المرشحين للحصول على مستخلص LXDHD المائي النهائي.
      ملاحظة: يعد المحلول المزدوج ضروريا لضمان استخراج فعال لكل من المكونات القابلة للذوبان في الماء ومتوسطة الذوبان.
4. التركيز والتخزين
   1. ركز المحلول المركب تحت ضغط منخفض أو تسخين لطيف حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب.
   2. دع المستخلص يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
   3. خزن مستخلص LXDHD المحضر عند 4 درجات مئوية واستخدم خلال 48 ساعة.
      ملاحظة: تجنب تكرار دورات التجميد-الذوبان، لأنها قد تتلف المركبات النشطة الحيوية وتقلل من قابلية التكرار التجريبي.
5. الإدارة
   1. ارفع المستخلص إلى درجة حرارة الغرفة قبل الوضع.
   2. أعط القطري المائي المركز ل LXDHD للفئران عن طريق التنقيب الفموي بالجرعات المحددة وفقا للتجريب.

2. تصميم تجارب الحيوانات

1. الحيوانات وظروف السكن
   1. احصل على فئران ذكور C57BL/6 (بعمر 6–8 أسابيع، 20–25 جرام) من مورد معتمد للحيوانات المختبرية.
   2. فئران المنزل تحت ظروف مختبرية قياسية مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة، ودرجة حرارة محكمة (22–25 درجة مئوية)، ورطوبة نسبية (50٪–60٪).
   3. توفير وصول مجاني للفئران إلى الطعام والماء القياسي طوال فترة التجربة.
   4. دع الفئران تتكيف مع الحياة لمدة لا تقل عن 7 أيام قبل بدء التجربة.
      ملاحظة: ادرج فقط فئران سليمة ذات نشاط طبيعي ووزن جسم طبيعي في التجارب اللاحقة.
2. التجميع وحساب الجرعات
   1. حساب جرعة LXDHD للفأر وفقا لمبدأ تحويل الجرعة بين الإنسان والحيوان الموضح في منهجية التجارب الدوائية، بناء على وزن جسم بالغ قياسي يبلغ 70 كجم وجرعة سريرية يومية 8.4 جم²⁸.
   2. قسم الفئران عشوائيا إلى المجموعات التالية (n = 6 لكل مجموعة): مجموعة الضابط الطبيعية، مجموعة نموذج الالتهاب التقرحي الناجم عن DSS، مجموعة LXDHD منخفضة الجرعة (1.09 ج/كغ)، مجموعة LXDHD ذات الجرعة العالية (2.18 ج/كغ)، ومجموعة 5ASA الإيجابية للضابطين (100 ملغ/كغ)²⁹.
      ملاحظة: قم بالعشوائية باستخدام جدول أرقام عشوائية لتقليل تحيز الاختيار.
   3. إدخال الالتهاب التقرفي العصبي وإدارة الأدوية
      1. حضر محلول DSS بنسبة 2.5٪ (مع الزجاجة) في ماء الشرب.
      2. أعط حل DSS بالإرادة للفئران في النموذج، المعالج ب LXDHD، و5ASA لمدة 7 أيام متتالية لمدة³⁰ يوم.
      3. وفر ماء شرب منقى للفئران في مجموعة الضابط الطبيعية.
      4. أعط LXDHD و5ASA لمجموعات العلاج مرة واحدة يوميا عن طريق التجويز الفموي بالجرعات المقابلة طوال فترة التجارب.
      5. قم بإعطاء حجم متساو من محلول المركبات لمجموعات نماذج التحكم العادية ونماذج DSS.
         ملاحظة: جهز حل DSS جديدا واستبدلته كل يومين. قد تختلف دفعات DSS في قوة الالتهاب القولوني؛ قم بإجراء اختبارات تجريبية عند استخدام دفعة جديدة. يتميز تأسيس نموذج القولون التقرحي الناتج عن DSS بفقدان تدريجي لوزن الجسم، وإسهال دموي، وارتفاع درجات DAI، وقصر ملحوظ في القولون. تتوافق هذه المعايير والتصميم المنهجي لتجارب الفئران مع المعايير المرجعية^{المعتمدة رقم 31}.
3. تحضير مصل فارغ ويحتوي على الأدوية لعلاج الأيض الخارجي
   1. استخدم مجموعة منفصلة من فئران الذكور الأصحاء C57BL/6.
   2. قسم الفئران عشوائيا إلى مجموعتين: المجموعة الفارغة ومجموعة LXDHD.
   3. أعط LXDHD لمجموعة LXDHD عن طريق الشاقة الفموية بجرعة 2.18 جرام/كغ مرة يوميا لمدة 7 أيام متتالية.
   4. أعط كمية متساوية من الماء المقطر للمجموعة الفارغة.
   5. اجمع عينات دم بعد ساعة من الإعطاء النهائي.
   6. قم بمعالجة عينات الدم للحصول على المصل كما هو موضح سابقا في القسم 3.5.

3. تقييم نشاط المرض

1. راقب وزن الجسم، وقوام البراز، ونزيف البراز يوميا أثناء التجربة.
2. احسب مؤشر نشاط المرض (DAI) بناء على فقدان الوزن، وثبات البراز، ونزيف البراز. إطار التسجيل المحدد مفصل في الجدول 3. احسب
   الدرجة النهائية ل DAI كمتوسط (أو مجموع) هذه المعايير^{الثلاثة 32}.
3. في نهاية اليوم الثامن، قم بتخدير فئران من كل مجموعة تحتوي على 1٪ من الصوديوم بنتوباربيتال (30 ملغ/كغ). اجمع حوالي 400 ميكرولتر من الدم من الضفيرة الوريدية الرجعية لكل فأر. بعد ذلك، يتم القتل الرحيم للحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم لضمان الموت، وفقا بدقة لإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA) الخاصة بالقتل الرحيم للحيوانات (الشكل 1B).
   ملاحظة: تأكيد التخدير المناسب بقرص خفيف على أصابع الأصابع وسطح الأخمص في الكفوف الخلفية؛ غياب استجابة للانسحاب يشير إلى عمق التخدير الكافي.
4. اجمع أنسجة القولون وقياس طول القولون كمؤشر على شدة المرض.
   ملاحظة: يعتبر قصر طول القولون علامة مميزة لشدة التهاب القولون الناتج عن DSS³³.
5. الحصول على مصل الدم
   1. اترك جزءا من عينات الدم المجمعة يجلط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
   2. أخذ عينات من الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على المصل.
   3. قم بقياس مستويات الإنترلوكين (IL)-1β وIL-6 وIL-17 وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) وIL-10 في المصل.
   4. جمع عينات من أنسجة القولون للتحليل النسيجي المرضي.
   5. استخدم عينات الدم المتبقية لتحليل الدم المحيطي.
   6. احتفظ بعينات مصل إضافية لتحليل الأيض.

4. تلوين الهيماتوكسيلين-إيوزين (H&E)

1. ثبت أنسجة القولون في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
2. جفف الأنسجة عبر سلسلة إيثانول متدرجة.
3. نسيج شفاف يحتوي على الزيلين ودمج في البارافين.
4. قطع أجزاء الأنسجة (بسماكة 3–5 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم.
5. إزالة القطع من البارافين بالزيلين.
6. أعد ترطيب الأقسام عبر الإيثانول المتدرج.
7. صبغ مقاطع بالهيماتوكسيلين للتصوير النووي.
8. قطع الصبغة المضادة باستخدام الإيوزين لصبغ السيتوبلازم.
9. راقب التغيرات النسيجية المرضية تحت المجهر الضوئي والتقط صورا ممثلة باستخدام برنامج التصوير المرتبط بها.
10. قيم درجات الأنسجة (HCS) بناء على شدة الالتهاب، عمق الإصابة، وتلف القبو.
11. راجع الجدول 4 لمعايير التقييم الأنسجة التفصيلية.
    ملاحظة: التقط صورا تمثيلية لدمج الأنسجة، وتقسيمها، والتلوين لتعزيز تصور البروتوكول.

5. تحليل الدم المحيطي

1. جمع عينات دم محيطية في أنابيب مضادات التخثر EDTA-K2 (1.5 ملغ EDTA لكل مل من الدم).
2. قم بقلب الأنابيب بلطف 8–10 مرات لضمان الخلط السليم.
3. تحليل عد خلايا الدم باستخدام محلل أمراض الدم البيطري المكون من ثلاثة أجزاء (Mindray BC-2600vet) مع معايرة خاصة بالأنواع.
4. نقل العينات عند 4 درجات مئوية.
5. تحليل العينات خلال 4 ساعات من الجمع.
   ملاحظة: استبعد العينات التي تظهر تحلل الدم أو التخثر من التحليل.

6. اختبار التوربينت المناعي المرتبط بالإنزيمات (ELISA)

ملاحظة: تعد IL-6 وIL-17 وIL-1β وTNF-α سيتوكينات رئيسية مضادة للالتهابات، بينما IL-10 هو سيتوكين مضاد للالتهابات رئيسي. تعكس هذه السيتوكينات وجود وشدة الاستجابات الالتهابية³⁴.
يعد قياس هذه السيتوكينات أمرا بالغ الأهمية لفهم العمليات الالتهابية وتقييم فعالية العلاجات المضادة للالتهابات.

1. اجمع عينات دم من الضفيرة الوريدية الرجعية.
2. اترك العينات لتجلط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
3. أخذ عينات من الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على المصل.
4. قياس مستويات مصل IL-1β وIL-6 وIL-17 وTNF-α وIL-10 باستخدام مجموعات ELISA التجارية.
5. قياس الامتصاص باستخدام قارئ ميكروبليت مزود ببرنامج جمع البيانات القياسي.
6. احسب تركيزات السيتوكين بناء على المنحنيات القياسية.
   ملاحظة: قم بفحص جميع العينات والمعايير بشكل مكرر لتقليل التباين التقني.

7. تحليل LC–MS لمحلول ليانغشوي ديهوانغ

1. تحضير العينة
   1. وزن بدقة 10 جرام من مسحوق الأعشاب الخام المخلوط LXDHD.
   2. قم بإذابة المسحوق في 30 مل من الماء الساخن.
   3. قم باستخراج بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة.
   4. اخلط 100 ميكرولتر من المستخلص مع 400 ميكرولتر من الميثانول.
   5. دوامة لمدة 10 دقائق.
   6. الطرد المركزي عند 14,000 × جرام لمدة 10 دقائق.
   7. اجمع السوبرناتانت كحل اختباري.
2. شروط LC–MS
   1. إجراء فصل كروماتوغرافي باستخدام نظام LC مقترن بمطياف كتلة Q.
   2. استخدم عمود C18 (150 × 2.1 مم، 1.8 ميكرومتر).
   3. اضبط الطور المتحرك كما يلي: مذيب A، حمض الفورميك 0.1٪ في الماء؛ مذيب B، الميثانول.
   4. اضبط معدل التدفق إلى 0.30 مل/دقيقة.
   5. اضبط درجة حرارة العمود على 35 درجة مئوية.
   6. اضبط حجم الحقن على 5 ميكرولتر.
   7. طبق برنامج التدرج التالي:
      0–2 دقيقة، 5٪ B;
      2–15 دقيقة، 5–95٪ B;
      15–18 دقيقة، 95٪ B;
      18–18.1 دقيقة، 95–5٪ B;
      18.1–22 دقيقة، 5٪ B.
   8. اضبط معاملات مطيافية الكتلة كما يلي: معدل تدفق غاز الغمد، 35 أرب؛ معدل تدفق الغاز المساعد، 10 أرب؛ جهد الرش، 3.5 كيلوفولت (موجب) و2.8 كيلوفولت (سالب)؛ درجة حرارة الشعيرات الدموية 320 درجة مئوية؛ درجة حرارة سخان الغاز المساعد، 350 درجة مئوية.
   9. الحصول على بيانات MS في أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة مع نطاق مسح MS كامل بين m/z 100–1500 (الدقة: 70,000).
   10. قم بإجراء مسح MS2 (dd-MS2) المعتمدة على البيانات بدقة 17,500.
   11. معالجة البيانات الخام وتحديد المركبات باستخدام قاعدة بيانات mzCloud.

8. تحليل الأيض غير المستهدف في المصل

1. تحضير عينات المصل ومراقبة الجودة (QC)
   1. إذابة عينات المصل على الثلج.
   2. انقل 50 ميكرولتر من المصل إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل.
   3. أضف 200 ميكرولتر من الميثانول/الأسيتونيتريل البارد (1:1، v/v).
   4. الدوامة لمدة دقيقة واحدة لترسيب البروتينات.
   5. حضن الزراعة على الثلج لمدة 15 دقيقة.
   6. الطرد المركزي عند 14,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   7. انقل الفائق إلى أنبوب جديد.
   8. جفف المستخلص باستخدام جهاز تركيز مفرغ الهواء.
   9. يعاد التكوين في 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل / الماء (1:1، v/v).
   10. فورتكس تماما.
   11. الطرد المركزي مرة أخرى عند 14,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   12. اجمع المادة الفائقة لتحليل LC-MS.
   13. تحضير عينات مراقبة الجودة عن طريق تجميع 10 ميكرولتر أليكوتات من كل عينة.
   14. حقن عينة QC واحدة لكل 8–10 عينات تجريبية لمراقبة استقرار الجهاز وتكراره.
2. إعدادات الاستحواذ على LC-MS
   1. إجراء فصل كروماتوغرافي باستخدام نظام LC مع عمود C18 (150 × 2.1 مم، 1.8 ميكرومتر).
   2. اضبط درجة حرارة العمود على 35 درجة مئوية.
   3. اضبط معدل التدفق إلى 0.30 مل/دقيقة.
   4. اضبط حجم الحقن إلى 2 ميكرولتر (الوضع الموجب) أو 5 ميكرولتر (الوضع السالب).
   5. استخدم مذيب A (حمض الفورميك 0.1٪ في الماء) ومذيب B (أسيتونيتريل يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك).
   6. طبق برنامج استواء التدرج الخطي.
   7. تشغيل مطياف الكتلة في أوضاع HESI موجبة وسالبة.
   8. اضبط نطاق مسح الكتلة على m/z 100–1500.
   9. اضبط جهد الرش على 3.5 كيلوفولت (موجب) و2.8 كيلوفولت (سالب).
   10. اضبط درجة حرارة الشعيرات الدموية على 320 درجة مئوية.
3. معالجة البيانات وتحديد المستقبات التفاضلية
   1. استيراد بيانات LC-MS الخام (.raw الملفات) إلى البرنامج.
   2. قم بتنفيذ محاذاة القمة، واختيار القمة، وتصحيح الخط الأساسي.
   3. تطبيع ميزات مساحة الذروة المستخرجة إلى شدة الأيونات الكلية.
   4. تحديد المستقلبات من خلال مطابقة الكتلة الدقيقة (تحمل الكتلة < 5 جزء في المليون) وأنماط تجزئة MS/MS مع قواعد بيانات mzCloud وChemSpider.
   5. إجراء تحليل إحصائي متعدد المتغيرات (PCA و OPLS-DA/PLS-DA).
   6. حدد المستقلبات التفاضلية بناء على العتبات التالية: VIP > 1.0 و p < 0.05 (اختبار t للطالب).

9. تحليل علم الأدوية الشبكي

ملاحظة: تم استخدام علم الأدوية الشبكي للتنبؤ بالمكونات النشطة والأهداف الرئيسية ل LXDHD في UC^35,36. تشمل المنهجية التنقيب عن قواعد البيانات، معالجة المعلومات الكيميائية، جمع بيانات النشاط الحيوي، استرجاع أهداف البروتين، تحليل تعبير الجينات، بناء شبكة التفاعل، وتحليل إثراء المسارات^37,38.

1. الفحص النشط بالمركبات
   1. استرجاع المركبات الفعالة من قاعدة بيانات وتحليل أنظمة الأدوية التقليدية للطب الصيني (TCMSP) (تم الوصول إليه في 10 ديسمبر 2025) باستخدام ≥ OB بنسبة 30٪ وDL ≥ 0.18.
   2. مكمل المركبات من خلال البحث في الأدبيات في PubMed وWeb of Science (10–15 ديسمبر 2025).
   3. توحيد الأهداف باستخدام قاعدة بيانات UniProt (تم الوصول إليه في 15 ديسمبر 2025).
2. تحديد أهداف المرض
   1. اجمع الأهداف المتعلقة ب UC من قواعد بيانات GeneCards وOMIM وTTD وDrugBank (تم الوصول إليه في 15 ديسمبر 2025).
3. بناء الشبكة وتحليلها
   1. تحديد الأهداف المتقاطعة باستخدام حزمة VennDiagram في برنامج R.
   2. بناء الشبكة باستخدام برنامج Cytoscape.
   3. حلل الطوبولوجيا باستخدام إضافة NetworkAnalyzer وإضافة CytoNCA.
4. شبكة PPI وتحديد الأهداف الأساسية
   1. استيراد الأهداف المتقاطعة إلى قاعدة بيانات STRING.
   2. تقييد الأنواع على الإنسان العاقل.
   3. إزالة العقد المعزولة.
   4. ضع حد أدنى لدرجة PPI > 0.9.
   5. تصدير البيانات وتحليلها في البرنامج.
   6. احسب DC، BC، EC، CC، NC، وLAC.
   7. إجراء تصفية قائمة على الوسيط لإنشاء شبكات فرعية وتحديد الأهداف الأساسية³⁹.
5. تحليل إثراء GO وKEGG
   1. تنفيذ إثراء GO وKEGG باستخدام R وحزم الموصل الحيوي.
   2. استخدم حزم R بما في ذلك org. Hs.eg.db، clusterProfiler، DOSE، enrichplot، stringi، و ggplot2.
   3. اضبط عتبات الدلالة عند p = 0.05 و q = 0.05.
   4. قم بإجراء تحليل GO لفئات MF وBP وCC.
   5. قم بإجراء إثراء وتصنيف مسار KEGG⁴⁰.
6. الالتحام الجزيئي
   1. قم بتحميل الهياكل المركبة من TCMSP بصيغة SDF.
   2. حمل هياكل البروتين من AlphaFold بصيغة PDB.
   3. قم بتنفيذ الالتحام باستخدام خادم الويب CB-DOCK2 (مختبر CAD، جامعة سيتشوان، تشنغدو، الصين).
   4. حدد ملفات المستقبلات والليغاند وفقا لذلك.
   5. سجل وضعية الربط المثلى وطاقة الربط.
      ملاحظة: تم إجراء الالتحام باستخدام خوارزمية جينية⁴¹. تم تصنيف النتائج حسب طاقة الربط.

10. التحليل الإحصائي

1. قم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism.
2. عبر عن البيانات الكمية كمتوسط ± انحراف معياري (SD).
3. اختبار الطبيعية باستخدام اختبار شابيرو-ويلك.
4. اختبر تجانس التباين باستخدام اختبار براون–فورسايث.
5. قم بإجراء تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه مع اختبار توكي بعد التحليل للبيانات الموزعة بشكل طبيعي.
6. نفذ اختبار كروسكال–واليس باستخدام اختبار دن للبيانات غير المعلمية.
7. اعتبر p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
   ملاحظة: تشير قيمة p الأصغر إلى فرق إحصائي أكبر بين المجموعات.

النتائج

تحليل الأدوية الشبكي لتحليل LXDHD في جامعة كاليفورنيا

تم تطبيق علم الأدوية الشبكي للتنبؤ بالأهداف العلاجية المحتملة والآليات الجزيئية ل LXDHD في الكولورثية التقرعية. تم فحص ما مجموعه 211 مركبا ذات خصائص دوائية مواتية من قاعدة بيانات TCMSP، بما في ذلك 36 من Scutellaria baicalensis، و37 من Phelodendron chinense، و10 من Rehmannia glutinosa، و11 من Paeonia suffruticosa، و29 من Paeonia veitchii، و5 من

المناقشة

تقدم هذه الطريقة سير عمل تجريبي مرئي وقابل للتكرار يدمج علم الأدوية الشبكي، والاستقلاب غير المستهدفة، والتحقق في الجسم لدراسة التأثيرات المضادة للالتهابات لصيغ الطب الصيني التقليدي في نموذج فأر مستحث بواسطة DSS لالتهاب القولون التقرحي. على عكس الدراسات الدوائية التقليدية التي تركز بشكل أساسي على الاستنتاجات الميكانيكية المعزولة، يؤكد هذا البروتوكول على متانة الإطار المنهجي نفسه مع كشف رؤى بيولوجية حاسمة. من المزايا الرئيسية لهذا السير المتكامل قدرته على تجاوز القيود الكامنة في ط...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حمض الأمينوساليسيليك 5-ASA	سيغما-ألدرتش	A3537	دواء مضاد إيجابي لالتهاب القولون التقرحي؛ تعطى بجرعة 100 ملغ/كغ عن طريق التمقم الفموي.
الأسيتونيتريل (درجة LC-MS)	ميرك	100030	يستخدم في تحضير عينات الأيض ومرحلة الانتقال في LC-MS.
قاعدة بيانات بنية البروتين ألفا فولد	EMBL– المعهد الأوروبي للمعلوماتية الحيوية	https://alphafold.ebi.ac.uk/	قاعدة بيانات تستخدم للحصول على البنى ثلاثية الأبعاد المتوقعة للبروتينات المستهدفة.
أنجيليكا سينينسيس (دانغ جوي)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 1.6 جم).
CB-Dock2	مختبر CADD	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	منصة ويب تستخدم للالتحام الجزيئي والتنبؤ بالليغاند– أنماط ارتباط البروتين.
الحمضيات الأورانتيوم (تشي كي)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.5 جم).
برنامج مكتشف المركبات	ثيرمو فيشر العلمي	الإصدار 3.3	يستخدم لمعالجة بيانات LC–MS وتحديد المركبات الهوائية.
CTAn Software	بروكر	الإصدار 1.17	يستخدم لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد بالميكرو-CT وتحليل تآكل العظام.
سيتوسكيب	اتحاد سايتوسكيب	الإصدار 3.8.0	البرمجيات المستخدمة في بناء الشبكات وتصورها.
كبريتات الدكستران الصوديوم (DSS)	MP Biomedicals	160110	الوزن الجزيئي 36,000– 50,000 دال؛ يستخدم لتحفيز التهاب القولون التقرحي في الفئران.
أنابيب مضادات التخثر EDTA-K2	شركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	لا يوجد	يستخدم لجمع الدم المحيطي.
محلول تلوين الإيوسين	بايوشارب	لا يوجد	يستخدم للتلوين المضاد بالسيتوبلازم في H&. تلطيخ E.
الإيثانول	شركة تشنغدو كولونيا للكيماويات المحدودة	64-17-5	يستخدم لتجفيف الأنسجة.
حمض الفورميك (درجة LC-MS)	ميرك	5.33002	يستخدم في تحضير الطور المتنقل LC-MS.
الجليسيريزا يورانسيس (غان كاو)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.5 جم).
منشور جراف باد	برنامج جراف باد	الإصدار 9.0	يستخدم للتحليل الإحصائي والعرض الرسومي.
محلل أمراض الدم	شعاع الذهن	BC-2600vet	محلل أمراض الدم البيطري المكون من ثلاثة أجزاء لتحليل روتين الدم.
محلول تلوين الهيماتوكسيلين	بايوشارب	BL700B	استخدم في H&. تلوين E لأقسام نسيج القولون.
جهاز الطرد المركزي عالي السرعة	هيتاشي	CT15E/CT15RE	يستخدم في تحضير المصل والعينات.
طقم إليسا IL-10 (فأر)	ميميان	MM-0176M2	يستخدم لتقييم مستويات IL-10 في المصل.
مجموعة IL-17 إليسا (فأرة)	أبكلونال	RK00039	يستخدم لقياس مستويات IL-17 في المصل.
IL-1 & بيتا؛ إليسا كيت (فأرة)	أبكلونال	RK00006	يستخدم للكشف عن مصل IL-1 وبيتا؛ المستويات.
مجموعة إليسا IL-6 (فأر)	أبكلونال	RK00008	يستخدم لقياس مستويات IL-6 في المصل.
برنامج ImageJ (فيجي)	المعاهد الوطنية للصحة (NIH)	الإصدار 1.53c	برمجيات مفتوحة المصدر تستخدم لمعالجة الصور وقياسها.
لايكا Application Suite X (LAS X)	لايكا مايكروسيستمز	الإصدار 3.7	برنامج تصوير يستخدم لالتقاط شرائح التحليل النسيجي.
الميثانول (درجة LC-MS)	ميرك	106035	يستخدم في تحضير عينات الأيض ومرحلة الانتقال في LC-MS.
فئران (ذكر C57BL/6)	شركة أنوكانغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.	لا يوجد	الحيوانات التجريبية (عمرها 6 سنوات؛ 8 أسابيع، 20 و20 أسبوعا؛ 25 ج) المستخدمة في نموذج الوحدة التوهرية المزمنة المستحثة بواسطة DSS.
قاعدة بيانات mzCloud	ثيرمو فيشر العلمي	https://www.mzcloud.org/	قاعدة بيانات تستخدم لمطابقة الطيف بين MS/MS.
المجهر البصري	لايكا	DM500	يستخدم للملاحظة النسيجية المرضية.
Paeonia lactiflora (تشي شاو)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.6 جم).
القشرة الشعرية (مو دان بي)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.5 جم).
بارافورمالديهايد (4٪)	شركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة	لا يوجد	يستخدم لتثبيت أنسجة القولون.
الميكروتوم المرضي	لايكا	RM2016	يستخدم لتحضير أقسام أنسجة البارافين.
فيلوديندرون تشينسي (هوانغ بو)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.5 جم).
بلاتيكلادوس أورينتاليس (سي باي يي تان)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.7 جم).
مطياف الكتلة عالي الدقة Q	ثيرمو فيشر العلمي	س: إكسكتيف	مطياف الكتلة المعتمد على أوربيراب لتحليل LC–MS.
آر سوفتوير	مؤسسة R للحوسبة الإحصائية	الإصدار 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	البرمجيات المستخدمة لتحليلات إثراء GO وKEGG.
ريهمانيا غلوتينوزا (شينغ دي هوانغ)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 2.1 جم).
سانغويزوربا أوفيسيناليس (دي يو تان)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.6 جم).
سابوشنيكوفيا ديفاريكاتا (فانغ فنغ)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.3 جم).
سكوتيلاريا بايكالينسيس (هوانغ تشين)	مستشفى مقاطعة جيانغسو للطب الصيني	دفعة: 2409001	العشب المكون ل LXDHD (الجرعة: 0.5 جم).
الصوديوم بنتوباربيتال (1٪)	سيغما-ألدرتش	P3761	يستخدم لتخدير الحيوانات قبل جمع العينات.
برنامج سوفت ماكس برو	الأجهزة الجزيئية	الإصدار 7.1	برنامج جمع البيانات وتحليلها المستخدم مع قارئ الميكروبليت في ELISA.
قاعدة بيانات السلاسل النصية	اتحاد STRING	https://string-db.org/	قاعدة البيانات المستخدمة للبروتين – تحليل تفاعل البروتين.
قاعدة بيانات TCMSP	منصة TCMSP	https://tcmsp-e.com/	قاعدة بيانات تستخدم لفحص المركبات الفعالة والتنبؤ بأهداف الأدوية.
TNF-&; إليسا كيت (فأرة)	أبكلونال	RK00027	يستخدم لتحديد TNF وalpha في المصل؛ تركيزات.
نظام LC ألتيميت 3000 RS	ثيرمو فيشر العلمي	ألتيميت 3000 RS	نظام UHPLC مقترن بمطيافية الكتلة.
منظف الموجات فوق الصوتية	شركة كونشان للأدوات فوق الصوتية المحدودة	KQ3200E	يستخدم في الاستخراج بالموجات فوق الصوتية لمادة LXDHD.
قاعدة بيانات UniProt	اتحاد يوني بروت	https://www.uniprot.org/	قاعدة بيانات تستخدم لتوحيد أسماء الجينات والبروتينات.
خلط الدوامة	شركة بكين باورستار للتكنولوجيا المحدودة	LC-Vortex-P1	يستخدم لخلط العينات.
عمود ويلش AQ-C18 (150 &مرة؛ 2.1 مم، 1.8 & مو؛ m)	مواد ويلش	AQ-18-15021	عمود يستخدم لفصل المستقلبات والمكونات العشبية.
زيلين	شركة تشنغدو كولونيا للكيماويات المحدودة	1330-20-7	يستخدم لتنظيف الأنسجة أثناء المعالجة النسيجة.