يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس ديناميكيات ترجمة mRNA في الخلايا الحية باستخدام الوسم اللامع المنقسم في خلايا HEK293

67 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70840

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا طريقة مرنة ومتوافقة مع الإنتاجية العالية لقياس ديناميكيات ترجمة mRNA الحي في الخلايا (in cellulo) في خلايا HEK293s، وذلك باستخدام الوسم اللامع المنقسم. يميز هذا المقاييس متعدد الاستخدامات التأثيرات الهيكلية، ويدعم تحسين النسخ في المختبر (in vitro)، ويسهل تطوير العلاجات القائمة على mRNA.

الملخص

أظهر التطوير السريع للقاحات لمكافحة COVID-19 إمكانات علاجات الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) في إحداث نقلة نوعية في تطوير الأدوية. ومثل mRNA الناضج، يمتلك mRNA المنسوخ in vitro العناصر نفسها، بما في ذلك القبعة 5’، والمناطق غير المترجمة (UTRs)، والتسلسل المشفر، وذيل poly(A). وقد اعتمدت الدراسات السابقة التي بحثت في تأثيرات هذه المكونات على ترجمة mRNA بشكل أساسي على بروتينات مراسلة مهندسة للغاية تظهر كفاءة في الترجمة واستقراراً بروتينياً. ونظراً لأن العناصر الهيكلية لكل mRNA تؤثر بشكل متفاوت على ترجمتها، فمن الضروري تحديد التصميم الأمثل المرتبط بالبروتين المستهدف (POI) العلاجي. ولتمكين توصيف ترجمة البروتين المستهدف، تم استخدام نظام تكامل لوسيفيراز منقسم. حيث يرتبط وسم ببتيدي قصير (HiBiT)، والذي يمكن دمجه في أي من طرفي البروتين المستهدف، مع heterodimer المكمل له (LgBiT) لاستعادة النشاط الإنزيمي في وجود ركيزة نفاذة للخلايا. وحتى الآن، استُخدم الوسم المضيء المنقسم بشكل أساسي في دراسات معدل دوران البروتين ذات الإنتاجية العالية. وقد سبق لنا أن أثبتنا كيف يمكن توظيف الوسم المضيء المنقسم لتمكين القياس الكمي عالي الإنتاجية لترجمة mRNA زمنياً in cellulo في خلايا HEK293 التي تعبر بشكل بنيوي عن heterodimer المكمل. وهنا، نوضح بشكل أكبر تعدد استخدامات هذا المقايسة ونفصل كيف يمكن توظيفها لتحسين النسخ in vitro لخفض التكاليف. ويمكن لنظام المقايسة هذا التمييز بشكل فريد بين التغيرات في المكونات الهيكلية مع تسليط الضوء على تأثيرات تحسين التسلسل المشفر باستخدام جينات غير مهندسة. بالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن خفض تركيز القبعة 5’ بمقدار 4 أضعاف في النسخ in vitro يؤدي إلى ترجمة مكافئة in cellulo. وتوضح هذه النتائج كيف يمكن دمج الوسم المضيء المنقسم بسهولة في سير عمل علاجات mRNA، مما يسمح بمراقبة ديناميكيات التعبير البروتيني المدفوع بـ mRNA في الوقت الفعلي in cellulo، وبالتالي توفير طريقة متعددة الاستخدامات للنهوض بالعلاجات القائمة على mRNA.

المقدمة

توسعت العلاجات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) وتطبيقاته البحثية بشكل سريع في السنوات الأخيرة، مدفوعة بنجاح لقاحات mRNA1,2 والاعتراف المتزايد بتعدد استخدامات RNA كجزيء حيوي قابل للبرمجة. ويتمثل التحدي المركزي في هذا المجال في القدرة على تقييم كفاءة ترجمة mRNA كمياً وديناميكياً في سياقات متنوعة. وتوفر الطريقة الموضحة هنا -والتي تعتمد على نظام وسم لومينيسنتي منقسم- منصة مرنة وقابلة للتوسع لدراسة ترجمة mRNA الحية in cellulo3. والهدف العام من هذه الطريقة هو تمكين الباحثين من قياس كيفية تأثير ميزات التسلسل، والتعديلات الكيميائية، والعناصر الهيكلية على حركية الترجمة ومعدل دوران البروتين اللاحق، مما يوفر أداة قوية لتحسين تركيبات mRNA للتطبيقات العلاجية والعلوم الأساسية.

In vitro يحاكي الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) المنسوخ مخبرياً البنية الأساسية للنواتج النسخية الناضجة، حيث يشتمل على غطاء 5′، ومناطق غير مترجمة (UTRs)، وتسلسل مشفر، وذيل poly(A)، بينما يتضمن غالباً نيوكليوتيدات معدلة لتقليل الاستمناع4,5. وقد أظهرت أعمال مكثفة أن كل عنصر من هذه العناصر -سواء بمفرده أو مجتمعاً مع غيره- يمكن هندسته للتأثير بقوة على كفاءة الترجمة وإنتاج البروتين6,7. ومع ذلك، اعتمدت معظم الدراسات السابقة على بروتينات مراسلة محسنة للغاية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)7، أو NanoLuc8، أو بروتين spike الخاص بفيروس SARS-CoV-28,9، والتي تمت هندستها لتُترجم بكفاءة عالية ولتنتج بروتينات مستقرة جداً، وبالتالي فهي لا تعكس التحديات التي تواجه السياقات العلاجية. ونظراً لأن جزيئات mRNA العلاجية تشفر بروتينات اهتمام (POIs) متنوعة، يخضع كل منها لقيود هيكلية فريدة وتنظيم خاص بنوع الخلية، فإن مبادئ التصميم التي تزيد من الترجمة لبنية معينة قد لا تعمم على بنية أخرى، كما تم الإبلاغ عنه سابقاً3. لذا، فإن تحديد التكوين الأمثل لبروتين اهتمام علاجي معين يعد أمراً ضرورياً، ويتطلب طرقاً يمكنها تقييم مدى مساهمة السمات الفردية للناتج النسخي في إنتاج البروتين بشكل حساس ومنهجي.

تُميز الطرق التي تركز على الريبوسومات، مثل تحليل تعدد الريبوسومات (polysome profiling)، أجزاء الترجمة من خلال الطرد المركزي المتدرج10، بينما يوفر تحليل الريبوسومات (Ribo-seq) دقة على مستوى النيوكليوتيدات لشغل الريبوسومات ومواقع البدء والتوقف11. وعلى غرار Ribo-seq، تعمل نهج أخرى قائمة على التسلسل مثل التسلسل عالي الإنتاجية للحمض النووي الريبوزي المعزول عن طريق الترسيب المناعي للروابط المتقاطعة (HITS-CLIP) وتنقية تقارب الريبوسومات المترجمة (TRAP) على توصيف ترجمة الحمض النووي الريبوزي المرتبط بالبروتينات الرابطة للحمض النووي الريبوزي أو المرتبطة بالريبوسومات12. ورغم قوتها، تتطلب هذه التقنيات تحضيراً معقداً ومعدات متخصصة وخبرة حاسوبية، مما يجعلها غير مناسبة لتطوير الـ mRNA العلاجي عالي الإنتاجية. ويقوم الترسيب المناعي للسلسلة الناشئة13 بقياس كفاءة الترجمة باستخدام بروتينات موسومة بـ FLAG يتم ترسيبها مناعياً من الريبوسومات وتقدير كميتها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR). ومع إمكانية تكييف هذا المقايسة مع الـ mRNAs العلاجية، إلا أنها تتطلب مجهوداً عضلياً كثيفاً، وتفتقر إلى الدقة الزمنية، وغير مناسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية. ويوفر نظام SunTag14 قياسات حية داخل الخلايا لمخرجات تخليق البروتين والتنظيم الترجمي من جزيئات mRNA مفردة، ويعمل من خلال تفاعل شظية متغيرة أحادية السلسلة (scFv) مدمجة مع GFP مع تكرارات ترادفيّة للحاتمة الببتيدية. يتيح هذا النظام قياسات ديناميكية للترجمة والتوطين بدقة جزيء mRNA واحد، وبالتالي فقد تم استغلاله لتطوير العديد من أنظمة تتبع السلاسل الناشئة15,16. ومع ذلك، فإن هذا النهج منخفض الإنتاجية ويتطلب استخدام مجاهر عالية القوة.

بينما لا يمكن تجنب وسم البروتين الناشئ، فقد تم تحديد الاستخدام المحتمل لوسم ببتيدي صغير، مشتق من لوسيفيراز NanoLuc، للإبلاغ عن ترجمة mRNA في الخلايا الحية. تم هندسة NanoLuciferase لتقسيمه إلى وحدة فرعية صغيرة مكونة من 11 حمضاً أمينياً (HiBiT) ووحدة فرعية أكبر مكونة من 158 حمضاً أمينياً (LgBiT)، واللتان يمكنهما التماثر بسرعة، وبوجود الركيزة، إعادة تكوين لوسيفيراز وظيفي17,18. هناك عدة مزايا رئيسية لنظام الوسم المضيء المقسم لدراسات ديناميكيات mRNA. أولاً، يسمح الحجم الضئيل للوحدة الفرعية الصغيرة المدمجة مع البروتين المستهدف (POI) ببقاء البنية المشفرة أقرب ما يمكن إلى البروتين الأصلي المستهدف. وبما أن طول التسلسل المشفر يمكن أن يؤثر بشكل مباشر على نسب الترجمة19، فإن تقليل طول الوسم يحسن من توقعاتنا لديناميكيات ترجمة mRNAs الاصطناعية. ومن الأهمية بمكان أن استراتيجية الوسم الضئيلة هذه تمكن من اكتشاف الاختلافات في الترجمة الناتجة عن تباين التسلسلات المشفرة المترادفة، مما يسمح باستقصاء كفاءة الترجمة بشكل مستقل عن تسلسل البروتين أو استقراره3. لهذا السبب، يعتبر استخدام الأوسمة الأكبر، مثل البروتينات الفلورية أو اللوسيفيرازات كاملة الطول، غير مثالي. ثانياً، يتيح نظام الوسم المضيء المقسم المستخدم هنا توليد إشارة فورية. حيث أن تفاعل التكملة السريع والفعال in cellulo يتمتع بتقارب عالٍ مسجل (KD = 700 pM) وقد استُخدم لقياس تعديل turnover البروتين بقراءات قصيرة تصل إلى كل 30 s18. وبينما تم قياس نظام الوسم المضيء المقسم الأصلي بشكل أساسي مقارنة بأنظمة لوسيفيراز مقسمة أخرى17,18، فإن الميزة الرئيسية في هذا السياق هي أن توليد الإشارة لا يتقيد بنضوج البروتين. وفي المقابل، تتطلب البروتينات الفلورية نضوجاً للكروموفور، والذي قد يستغرق من دقائق إلى ساعات20، مما يحد من الدقة الزمنية. أخيراً، يتجاوز نظام الوسم المضيء المقسم المعتمد والمستخدم هنا قيود أنظمة البروتين الفلوري المقسمة، والتي تتطلب عادةً تكوين الكروموفور بعد التكملة21، مما يتسبب في تأخير إضافي ويحد من ملاءمتها لالتقاط العمليات الديناميكية السريعة. وقد أثبتت الدراسات السابقة فائدة الوسم المضيء المقسم في مقايسات turnover البروتين ودراسات التحلل22,23,24. ويمثل توسيع هذه التكنولوجيا المعتمدة لتشمل حركية الترجمة تقدماً منهجياً كبيراً. على سبيل المثال، بينما يمكن أن يكشف تحديد مواقع الريبوسومات (ribosome profiling) عن كثافة الريبوسومات على طول النسخ، إلا أنه لا يمكنه بسهولة التقاط التغيرات الديناميكية في معدلات بدء أو استطالة الترجمة تحت ظروف مختلفة. وكما تم توضيحه سابقاً3، يمكن لنظام الوسم المضيء المقسم هذا اكتشاف الاختلافات عند تغيير بنية الغطاء (cap structure)، وتكوين المنطقة غير المترجمة 5′ (UTR)، وتحسين الكودونات، وتعديلات النيوكليوتيدات، وطول ذيل poly(A)، وكلها محددات حرجة لكفاءة الترجمة. وهذا النطاق من القابلية للتطبيق يجعل هذه الطريقة قوية بشكل فريد لتشريح مساهمات الميزات الفردية لـ mRNA في إنتاج البروتين الإجمالي. ومن الجدير بالذكر أنه، اعتماداً على الجهاز المستخدم، يمكن التقاط بيانات الخلية الواحدة والبيانات الخاصة بالبئر الكاملة باستخدام هذه التكنولوجيا. كما أن منصات التصوير القادرة على الحصول على صور قائمة على الإضاءة الحيوية يمكن أن تمكن من استخدام هذه التكنولوجيا لدراسة ديناميكيات ترجمة الخلية الواحدة. وهنا، نركز على تطبيق قائم على الآبار باستخدام قارئ الأطباق، نظراً لطبيعته ذات الإنتاجية المتوسطة إلى العالية ومتطلباته الدنيا لتحليل البيانات.

ينبغي للباحثين الذين يفكرون في استخدام هذه الطريقة تقييم مدى ملاءمتها في ضوء أهدافهم التجريبية المحددة. وتكتسب هذه المقايسة قيمة خاصة في السياقات التي تتطلب فحصاً عالي الإنتاجية لبنى mRNA الاصطناعية، كما هو الحال في مسارات تصميم العلاجات القائمة على mRNA. وهي مناسبة تماماً للتحليلات المقارنة لخصائص تتابعات mRNA الاصطناعية - بما في ذلك المناطق غير المترجمة، أو استخدام الكودونات، أو تعديلات النيوكليوتيدات - حيث يمكن اكتشاف الاختلافات الطفيفة في كفاءة الترجمة3. وبما أن النظام يتوافق مع منصات الترجمة الخالية من الخلايا، ومقاييس الخلايا الحية، ومقاييس التحلل الخاصة بنقاط زمنية محددة، فإنه يوفر مرونة للباحثين الذين يرغبون في تفصيل تصميمهم التجريبي سواء للدراسات الميكانيكية أو البحوث التطبيقية. وفي الوقت ذاته، من المهم إدراك حدود هذه التقنية؛ فمن الناحية النقدية، لا توفر مقايسة الوسم المضيء المنقسم دقة في تحديد إشغال الريبوسوم، وهي قدرة تظل فريدة في مناهج بصمة الريبوسوم، كما أنها لا تقيس استقرار RNA أو تحلله بشكل مباشر، وهو ما قد يتطلب تقييمه باستخدام طرق تكميلية. ومع ذلك، ونظراً لمحدودية التقنيات الحالية المرتكزة على الريبوسوم، يعتمد الباحثون على المقاييس القائمة على الوسوم مثل نظام الإضاءة المنقسم لاستقصاء تعبير البروتين المدفوع بـ mRNA والمحدد زمنياً كبديل لديناميكيات الترجمة. وبناءً على ذلك، فبينما يعد هذا النظام أداة قوية لمراقبة تعبير البروتين المدفوع بـ mRNA الاصطناعي، فإن ملاءمته تعتمد على ما إذا كان سؤال البحث يركز على مخرجات البروتين الديناميكية بدلاً من تحديد موضع الريبوسوم الدقيق أو تحلل RNA.

باختصار، يمثل نظام الوسم المضيء المنقسم طريقة قوية ومتعددة الاستخدامات لدراسة ترجمة mRNA. ويتمثل هدفه العام في تزويد الباحثين بأداة مرنة، وقابلة للتوسع، وعالية الإنتاجية، وقادرة على اكتشاف الاختلافات في إنتاج البروتين الناتجة عن mRNA اصطناعي يحتوي على عناصر هيكلية وتسلسلية متنوعة3. وتكمن الغاية من تطويره في التغلب على قيود التقنيات الحالية، مما يوفر مزايا من حيث الحساسية، وقابلية التوسع، والدقة الزمنية. وبموضعه ضمن الأدبيات الأوسع حول بيولوجيا RNA والعلاجات الجينية، يشكل هذا الأسلوب إضافة قيمة للمجموعة التجريبية، مما يتيح تحقيق رؤى أساسية وتقدمات ترجمية. ومن خلال النظر بعناية في نقاط القوة والقيود الخاصة بهذا المقايسة، يمكن للباحثين تحديد مدى ملاءمتها لتطبيقاتهم المحددة، وبذلك يتم تعظيم تأثيرها في مجال علوم RNA سريع التطور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يظهر تمثيل رسومي للبروتوكول كاملاً في الشكل 1.

1. تحضير القالب لعملية النسخ in vitro (IVT)

ملاحظة: لإعداد قالب DNA لعملية IVT، تأكد من أن DNA البلازميد يحتوي على محفز RNA polymerase (عادةً T7 أو SP6)، والمناطق غير المترجمة (UTRs) عند الطرفين '5 و '3، وإطار القراءة المفتوح للبروتين المراد دراسته POI (الشكل 1).

  1. قم بعملية خطية للحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) باستخدام إنزيم قطع يحتوي على موقع قطع واحد يقع بعد المنطقة غير المترجمة 3’ UTR، وجهز التفاعل وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد الحضانة، قم بتنقية تفاعل الهضم الإنزيمي باستخدام طقم تنقية الحمض النووي المعتمد على أعمدة الدوران (spin column). قم بقياس كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  2. لتأكيد عملية الخطية، جهز هلام أغاروز TAE بتركيز 1% يحتوي على صبغة الحمض النووي بروميد الإيثيديوم (Ethidium Bromide) بتركيز 0.1 µg/mL. امزج 150 ng من الحمض النووي المهضوم مع الماء وصبغة التحميل. قم بتحميل هلام الأغاروز بالعينة، والبلازميد غير المقطوع، وسلم الحمض النووي (DNA ladder)، ثم قم بتشغيل هلام الأغاروز عند 100 V لمدة 40 min في محلول منظم 1× Tris-acetic acid-EDTA (TAE). قم بالتصوير باستخدام جهاز تصوير الهلام.
    تنبيه: محلول بروميد الإيثيديوم مادة مطفرة قوية وتتطلب مناولة حذرة باستخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE) المناسبة.
  3. إذا كان الحمض النووي البلازميدي لا يحتوي على ذيل poly(A) مباشرة بعد المنطقة 3’ UTR، قم بإدخاله باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسلة (PCR). أكمل تفاعل PCR وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام بوليميراز عالي الدقة مع بادئات مصممة بشكل مناسب. تأكد من أن الناتج التضخيمي (amplicon) يتضمن محفز T7، وإطار القراءة المفتوح (open reading frame)، وذيل poly(A).
    ملاحظة: قد تتطلب تقنيات وضع الغطاء (Capping technologies) تسلسلات محددة عند محفز T7؛ لذا يمكن تلبية هذه المتطلبات من خلال التصميم المناسب للبادئ الأمامي. يرتبط البادئ العكسي بنهاية المنطقة 3’ UTR ويقوم بإدخال ذيل poly(A) (الطول الموصى به 80 T على الأقل). بالنسبة للمركبات التي تحتوي على نسبة عالية من GC، يوصى باستخدام PCR تدريجي (step-up PCR) و/أو 3% DMSO.
  4. لتأكيد نجاح تفاعل PCR، جهز هلام أغاروز TAE يحتوي على بروميد الإيثيديوم (راجع الخطوة 1.2). إذا كان طول المركب ≥1 kb أو <1 kb، جهز هلاماً بتركيز 1% أو 2% على التوالي. امزج 5 µL من تفاعل PCR مع الماء وصبغة التحميل. قم بتحميل هلام الأغاروز بكل من العينة وسلم الحمض النووي، وقم بتشغيله عند 100 V لمدة 40 min في محلول TAE المنظم. قم بالتصوير باستخدام جهاز تصوير الهلام.
  5. بعد تأكيد حجم ناتج PCR، قم بتنقية تفاعل PCR باستخدام طقم تنقية الحمض النووي المعتمد على أعمدة الدوران. قم باستخلاص الناتج في 15–20 µL من محلول الاستخلاص (الذي غالباً ما يتوفر مع طقم تنقية الحمض النووي) أو ماء خالٍ من النيوكلياز لتركيز قالب الحمض النووي لاستخدامه في النسخ في المختبر (IVT). قم بقياس كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

2. النسخ In vitro

  1. قبل البدء، قم برش ومسح منضدة العمل والقفازات والماصات بمحلول لإزالة تلوث RNase. ولتحسين الإنتاجية والجودة، قم بإجراء هذا الإجراء في بيئة غطاء معقمة.
  2. قم بإذابة وتجميع مكونات مجموعة نسخ RNA في المختبر (IVT) المعتمدة على T7 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يوصي بعض المصنعين باستخدام dithiothreitol (DTT, 0.1 M) للحد من أكسدة التفاعل وتحسين الكفاءة. يوصى بهذه الخطوة عندما تكون متوافقة مع المجموعة المستخدمة. في حالة استخدام dNTPs معدلة، استبدل النوكليوتيد غير المعدل المكافئ بنفس الكمية من النوكليوتيد المعدل. قم بتقييم الإنتاجية من نصف تفاعل، حيث لم يُلاحظ أي تحسن كبير في الإنتاجية من تفاعل كامل. عند تخليق أكثر من جزيء mRNA واحد، يوصى بإنشاء مزيج رئيسي (master mix) لتقليل أخطاء الماصات والتباين.
  3. استخدم الماصة للتحميل ثم امزج العينة جيداً ولفترة وجيزة، ثم حضنها عند 37 °C لمدة 5 h مع غطاء مسخن لتجنب التكثيف. يمكن تمديد فترة التحضين لليلة كاملة إذا لزم الأمر، حيث أن لهذا تأثير ضئيل على إنتاجية mRNA أو سلامته.
  4. أضف 1 µL من DNase I وامزج جيداً بالماصة. حضن العينة عند 37 °C لمدة 30 min.
  5. تنقية RNA المنسوخ في المختبر (in vitro)
    1. قم بتنقية تفاعل IVT باستخدام مجموعة تنظيف RNA تعتمد على الأعمدة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة (قد تؤدي المجموعات المختلفة إلى مستويات استرداد مختلفة وسعات ارتباط متفاوتة). ولعملية الاستخلاص، أضف 60 µL من ماء خالٍ من النوكلياز وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min قبل إجراء الطرد المركزي.
    2. بدلاً من ذلك، استخدم الترسيب باستخدام كلوريد الليثيوم كمنهج أقل تكلفة وأكثر مرونة.
      1. أضف حجماً مساوياً من كلوريد الليثيوم بتركيز 7.5 M إلى التفاعل، ثم امزجه وحضنه عند -20 °C لليلة كاملة.
      2. قم بإجراء الطرد المركزي عند 18,300 × g لمدة 20 min عند 4 °C، ثم قم بإزالة السائل الطافي بعناية دون تعريض كتلة RNA للاختلال.
      3. اغسل باستخدام 950 µL من الإيثانول بتركيز 70% وقم بإجراء الطرد المركزي عند 18,300 × g لمدة 5 min عند 4 °C. أزل السائل الطافي، واترك الكتلة تجف لمدة 5 min تقريباً في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليقها في ماء خالٍ من النوكلياز (60 µL هو الحجم القياسي؛ قم بتقليل الحجم حسب حجم الكتلة لزيادة التركيز).
        تنبيه: قد يسبب كلوريد الليثيوم تهيجاً للجلد أو العين في حال عدم استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. ارتدِ القفازات وواقي العين عند التعامل معه. كما أن الإيثانول سائل شديد الاشتعال ويمكن أن يسبب تهيجاً للعين. ابقِه بعيداً عن اللهب المكشوف، وارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك واقي العين.
  6. قم بقياس كمية mRNA باستخدام جهاز قياس الطيف الضوئي. تأكد من أن نسبة A260/A280 لـ mRNA تبلغ حوالي 2.0، وتأكد من أن نسبة A260/A230 تقع بين 1.8 و 2.2.
  7. لتأكيد نجاح عملية IVT، قم بتحضير هلام أغاروز بنسبة 1% في منظم TAE (غير مفكك) يحتوي على بروميد الإيثيديوم. امزج 500 ng من mRNA مع الماء وصبغة التحميل، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحضير سلم RNA وتعليمات التفكيك. قم بتحميل هلام الأغاروز وشغله عند 80 V لمدة 40 min في منظم TAE. قم بالتصوير باستخدام جهاز تصوير الهلام.
  8. لمزيد من التأكيد على الحجم الصحيح لـ mRNA، قم بتشغيل العينات على جهاز Bioanalyser.
  9. لتجنب تكرار التجميد والإذابة، قم بتقسيم mRNA إلى حصص بالحجم المطلوب للتجربة. على سبيل المثال، استخدم 1.2 pmol من mRNA لكل بئر في طبق يحتوي على 96 بئراً. بناءً على ذلك، قم بتقسيم الحجم المناسب لـ 1.2 pmol × n من المكررات، ثم خزنها عند -80 °C.

3. عملية ترانسفكشن عكسية لخلايا HEK293

ملاحظة: لإجراء قياسات زمنية، يلزم استخدام خط خلوي يعبر باستمرار عن جزء اللوسيفرير (luciferase) المكمل. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إنشاء خط خلوي مستقر من خلال ترنسفكشن (transfection) بلازميد يعبر عن جزء اللوسيفرير المطلوب، يليه اختيار نسيلة (clonal selection). وهذا يتيح للمستخدم قياس ديناميكيات ترجمة mRNA بدقة زمنية في أي خلفية خلوية مختارة. وبدلاً من ذلك، يمكن شراء خطوط خلوية تعبر عن جزء اللوسيفرير المطلوب. وقد أجريت هذه التجارب باستخدام خلايا HEK293 التي تعبر باستمرار عن heterodimer المكمل.

  1. قبل البدء، قم بإذابة mRNA على الثلج لتجنب التحلل.
  2. قم بتحضير معقدات عفن الخلايا (transfection complexes). بالنسبة لصفيحة ذات 96 بئراً، يلزم وجود 1.2 pmol من mRNA لكل بئر. في حال التشغيل بنسخ مكررة، قم بتحضير كمية تكفي لـ 2.5 نسخة مكررة للسماح بهامش خطأ في عملية السحب بالممصات. وبناءً عليه، امزج 3 pmol من mRNA مع وسط Opti-MEM Reduced Serum Medium ليصل الحجم النهائي إلى 50 µL (بواقع 20 µL/بئر).
  3. أضف 0.5 µL من كاشف عفن الخلايا القائم على الليبيد الموجب (cationic lipid-based transfection reagent) (بواقع 0.2 µL/بئر)، وامزج عن طريق السحب والضخ بالمصّة، ثم حضنه في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين لمدة 5 min، امزج عن طريق السحب والضخ بالمصّة، ثم أضف 20 µL لكل بئر في صفيحة ميكروية بيضاء ذات قاع مسطح و96 بئراً. ويُقترح وضع آبار عفن الخلايا في مركز الصفيحة، مع ترك الآبار الطرفية فارغة.
  4. قم بتحضير خلايا HEK293 عن طريق إزالة الوسط وغسلها بـ 2 mL من محلول الفوسفات المنظم للملحي (PBS) الخالي من Ca2+ و Mg2+. أزل سائل الغسيل وأضف 500 µL من Trypsin-EDTA، ثم حضنه عند 37 °C لمدة 3 min.
  5. أثناء تفكيك الخلايا، املأ الآبار الطرفية للصفيحة ذات 96 بئراً بـ PBS لتقليل تبخر الوسط أثناء زراعة الخلايا. وإذا كانت جميع الآبار مطلوبة، يمكن غمر الصفيحة بـ PBS بين الآبار.
  6. أضف 4.5 mL من وسط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) المكمل بـ 1× L-glutamine و 10% من مصل الجنين البقري (FBS) لجمع الخلايا. قم بإجراء عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) أو عداد خلايا أوتوماتيكي.
  7. انقل الكمية المطلوبة من الخلايا (ما يكفي لزرع 1 x 105 خلية لكل بئر) بالإضافة إلى 3 آبار إضافية (لهامش خطأ السحب بالمصّة) إلى أنبوب جديد وقم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 2 min.
  8. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في الحجم المطلوب من وسط Leibovitz’s L-15 (الخالي من الفينول) المكمل بـ 10% FBS وركيزة Endurazine Live Cell Substrate (بنسبة 1:200) لضمان تركيز نهائي قدره 1 × 106 cells/mL. امزج باستخدام مصّة سيرولوجية لضمان المزج التام لـ Endurazine. اسحب 100 µL (بواقع 1 × 105 cells) من الخلايا المعلقة لكل بئر.
    ملاحظة: في حال إجراء تجارب السلسلة الزمنية التي تستمر لمدة 72 h، قم بزيادة الحجم إلى 200 µL لتجنب التبخر.
  9. مباشرة بعد عفن الخلايا، ضع الخلايا في قارئ الصفائح (luminometer) مضبوط على 37 °C. قم بأخذ القراءات على فترات منتظمة بزمن تكامل قدره 1 s. ونظراً للتكامل الفعال للنظام، تكون الإشارة قابلة للكشف في غضون دقائق. ولذلك، وللحصول على قراءة أساسية دقيقة، يجب تنفيذ هذه الخطوة فوراً. تعتمد هذه الفترات على التجربة والجهاز؛ ومع ذلك، في هذه التجارب، وجد أن القياس كل 12 min في تجارب السلسلة الزمنية لمدة 18 h، وكل 48 min فقط في تجارب 72 h، هو الأمر الأمثل. لا يتطلب قياس التألق الحيوي (Luminescence) مرشحاً؛ وقد لوحظت نسبة إشارة إلى ضجيج أفضل عند استخدام مرشح 530–540 nm.
    ملاحظة: يتم إنتاج إشارة نقل طاقة الرنين للتألق الحيوي (BRET) من eGFP الموّسم بـ split-luciferase، وبالتالي فإن المرشح عند 530–540 nm سيلتقط كلاً من الإشارة التألقية والفلورية. لتجنب التقاط BRET، استخدم مرشحاً عند 460–480 nm أو بدلاً من ذلك، استخدم بروتيناً غير فلوري مثل MYL3 كمرجع.

4. تحليل البيانات

  1. احسب التغيرات في طيات وحدات التألق النسبية (RLUs)، وذلك عن طريق تسوية إشارة كل حالة إلى نقطتها الزمنية الأولى (t0، التي تمت تسويتها وفقاً لمتوسط المكررات التقنية)، بما أن الإشارة في بداية المقايسة تمثل مستوى الخلفية.
  2. قلل التباين بين المكررات البيولوجية عن طريق التسوية وفقاً لحالة ضابطة.
  3. اختر التحليل الإحصائي للمقايسة، إما لنقطة زمنية واحدة أو للمساحة تحت المنحنى (AUC) — وذلك اعتماداً على السؤال المطروح.
    1. بالنسبة لنقطة زمنية واحدة، استخدم النقاط الزمنية التي يحدث عندها ذروة التعبير (والتي تعتمد على POI) جنباً إلى جنب مع نقطة النهاية الزمنية. قم بتمثيل RLU المحسوبة في الخطوة 4.1 عند النقطة الزمنية المحددة (على سبيل المثال 240 min) وحللها باستخدام اختبار إحصائي مناسب.
    2. قس ديناميكيات ترجمة البروتين وتحلله عن طريق حساب AUC إما لإطار زمني محدد (أي من t0 إلى 240 min) أو لطول المقايسة (أي من t0 إلى نقطة النهاية). قم بتسوية قيمة AUC لكل مكرر بيولوجي إلى متوسط mRNA المرجعي، وبذلك يتم الحصول على مقياس للتغير في طيات AUC والذي يمكن تحليله باستخدام اختبارات إحصائية مناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هناك عدة طرق يمكن من خلالها تحسين الفعالية من حيث التكلفة لهذا البروتوكول. على سبيل المثال، تم تصغير حجم تفاعل IVT إلى نصف الحجم الموصى به من قبل الشركة المصنعة، ووُجد أن الإنتاجية الناتجة لبت الكمية المطلوبة لتجارب in cellulo. وتجدر الإشارة إلى أن طول التسلسل وتعقيده يؤثران على إنتاجية IVT، لذا يجب أن يؤدي التحسين الناجح للبروتوكول إلى إنتاج 50 µg على الأقل من mRNA لكل تفاعل IVT. ومثل أطقم تفاعل IVT، غالباً ما تكون كواشف القبعات (capping reagents) باهظة الثمن. وبما أن جزيء قبعة واحد فقط مطلوب لكل جزيء mRNA، فإن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توسع مجال العلاجات القائمة على mRNA بشكل سريع في السنوات الأخيرة، مما أكد على أهمية تصميم التسلسل وتحسينه كمرحلة حاسمة في مسار التطوير. وقد ركزت جهود كبيرة على بناء أدوات حوسبية للتنبؤ ببنى وتكوينات RNA الأكثر فعالية، مع إيلاء اهتمام خاص لتحسين التسلسل8,9. ورغم قوة هذه الأدوات، لا يزال التحقق التجريبي من هذه التصاميم جزءاً أساسياً من مسار العمل. ومع ذلك، اعتمد هذا التحقق إلى حد كبير على البروتينات المراسلة، بما في ذلك GFP7 وNanoLuc

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يتوجه المؤلفون بالشكر لـ Laura Itzhaki لتوفير خط خلايا HEK293 LgBiT. وقد حظي هذا العمل بدعم من منحة مشروع وجائزة ترجمية من مؤسسة القلب البريطانية (British Heart Foundation) (G114642 و G919651 لـ CHW) ومنحة أبحاث GenScript Life Science (CAPB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الأسيتيكSigma-AldrichA6283مكون من محلول TAE المنظم
أجاروزSigma-AldrichA9539الترحيل الكهربائي للهلام
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939Bجهاز تحليل حيوي يستخدم لمراقبة جودة mRNA
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-Fقارئ أطباق/مقياس لومينومتر يستخدم لقياس التلألؤ الحيوي
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113غطاء 5' يستخدم في النسخ المختبري IVT
DMEM، جلوكوز عالٍ، بيروفاتThermo Fisher Scientific41966029وسط مستنبت يستخدم لزراعة خلايا HEK293-LgBiT
DNase INew England BiolabsM0303يعمل على تفكيك قالب DNA بعد تفاعل IVT
محلول دالبكو الفسفاتي المنظم (PBS)Sigma-AldrichD8537لغسل الخلايا وللإضافة إلى الطبق لمنع التبخر
EDTA، pH 8.0، خالٍ من RNaseThermo Fisher ScientificAM9260مكون من محلول TAE المنظم
بروميد الإيثيديومSigma-AldrichE1510صبغة للترحيل الكهربائي للهلام
مصل جنين البقر (FBS)Sigma-AldrichF7524مكمل يضاف إلى DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040طقم النسخ المختبري (IVT)
وسط Leibovitz's L-15، بدون فينول ريدThermo Fisher Scientific21083027وسط مستنبت لزراعة HEK293-LgBiT أثناء قياسات التلألؤ الحيوي
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-024مكمل يضاف إلى DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150كاشف عفن Lipid-based للتحول الجيني
محلول تريبس كلوريد الليثيوم للترسيبThermo Fisher ScientificAM9480نهج بديل لتنقية mRNA بعد IVT
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130طقم تنقية بعد خطيّة البلازميد
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-Wمقياس طيف ضوئي يستخدم لتقدير تركيز DNA و mRNA
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570ركيزة مطلوبة للتلألؤ الحيوي تضاف إلى وسط L-15 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612ينقي mRNA بعد تفاعل IVT
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Fisher Scientific136101طبق يستخدم لزراعة HEK293-LgBiT والقياسات اللاحقة
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062وسط مستنبت يستخدم لتفاعل التحول الجيني
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553طقم PCR
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993سلم RNA للترحيل الكهربائي للهلام
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020بخاخ لتطهير RNase
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066مكون من محلول TAE المنظم
محلول Trypsin-EDTASigma-AldrichT4174كاشف لتفكيك الخلايا
UltraPure DNase/RNase free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977035يستخدم لتحضير القوالب ولـ IVT

المراجع

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

mRNA 5 mRNA
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.