يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ترجمة mRNA خالية من الخلايا في المختبر في محللات ذبابة الفاكهة

374 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70844

⸱

يونيو 12, 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم تفاصيل حول كيفية تحضير التحلل وإجراء الترجمة المخبرية باستخدام أجنة ذبابة الفاكهة .

الملخص

لعبت الترجمة الحية الدقيقة للرنا الخالية من الخلايا في المختبر دورا حاسما في فهم عملية تخليق البروتين أثناء التعبير الجيني عبر حقيقيات النواة. كان تطوير الليزات من أنظمة مختلفة للترجمة في المختبر له دور أساسي في دراسة أدوار معظم مكونات آلية الترجمة وفي تحليل العديد من خطوات عملية تخليق البروتين. تمت دراسة جوانب مختلفة من الترجمة والتحكم الانتقالي باستخدام ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر الليزاتية. توفر هذه الورقة بروتوكولات مفصلة لتحضير قوالب mRNA الصناعية، وزراعة مزارع الذباب الحية واسعة النطاق، وتحضير محللات التحليل القادرة على الترجمة من أجنة ذبابة الفاكهة، وإجراء تفاعلات الترجمة المختبرية الخالية من الخلية. هذا البروتوكول مناسب لأي نوع من جنس ذبابة الفاكهة — الميلانوغاستر، الفيريليس، السودوسكورا، الجريمشاوي، الهايدي، وغيرها. نقارن هذا البروتوكول أيضا مع أنظمة الترجمة الأخرى ونناقش القيود والخطوات الحرجة وحل المشكلة. تتضمن النتائج الممثلة للمساعدة في تقييم أداء البروتوكول وقابليته للتكرار. وأخيرا، نناقش التطبيقات المحتملة في التكنولوجيا الحيوية والبحث.

المقدمة

لأكثر من قرن، أثبتت ذبابة الفاكهة أنها كائن نموذجي قوي وقابل وراثيا لدراسة العديد من الظواهر والجزيئات البيولوجية، بما في ذلك التحكم الانتقالي وآلية الترجمة 1,2,3,4. أصبحت ترجمة ذبابة الفاكهة الخالية من الخلايا في المختبر أداة فعالة لدراسة تخليق البروتين، لأنها تستطيع إعادة تلخيص العديد من الأحداث التي لوحظت في الجسم الحي. لذا، ذبابة الفاكهة هي نظام مثالي لاكتشاف وظائف وجزيئات جديدة تقوم بالترجمة والتحكم في الترجمة. أظهرت الدراسات المبكرة نظاما في المختبر، وقادرا على الترجمة في المفصليات المرتبطة بالذباب Artemia salina5 ولاحقا في ذبابة الفاكهة 6.

لاحقا، تم تطوير محللات تستجيب للرنا الريبي المغناطيسي الخارجي في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. أجريت معظم الدراسات على الترجمة المختبرية لذبابة الفاكهة في أجنة من أعمار مختلفة، رغم أن بعض الاختلافات في محلول تفاعل الترجمة استخدمت من قبل مجموعات بحثية مختلفة. للمقارنة، تم سرد الظواهر المختلفة التي تم دراستها وظروف تفاعل الانتقال في الجدول 1. بالإضافة إلى الأجنة، تم تطوير بروتوكولات للترجمة الخالية من الخلايا في المختبر باستخدام بويضات ذبابة الفاكهة 10,22,23,24,25,26 ومحللات خلايا شنايدر أو Kc المزروعة 17,27,28,29,30,31,32. وصف المكونات المطلوبة للترجمة في المختبر ومقارنة بين الليزات من أنواع مختلفة في المراجع 33,34.

على الرغم من أن عملية ترجمة mRNA محفوظة عبر حقيقيات النواة، إلا أن الاختلافات الكبيرة بين الأنواع توجد غالبا في مرحلة بدء الترجمة حيث تقوم جزيئات مختلفة بكبت أو تعزيز الترجمة طوال التطور بطريقة خاصة بالتصنيف أو النوع35,36. هذا البروتوكول مناسب جدا لدراسة ترجمة mRNA في الحشرات طوال فترة التطور، حيث لا يمكن استخدام الليزات من ميتازوين البعيد تطوريا، بما في ذلك الليزات التجارية من القمح أو الأرانب. في الواقع، يمكن لهذا البروتوكول أن يعيد تلخيص أحداث الترجمة التي تحدث أثناء تكوين الجنين، وهو أمر غير ممكن عند استخدام محللات البويضات23. حتى الآن، لم يتم إجراء أي مقارنة بين أنظمة ذبابة الفاكهة الجنينية والبويضية والخلايا المزروعة. إضافة تعديلات ما بعد الترجمة إلى البروتينات المصنعة في المختبر هو حد من قيود هذا البروتوكول في حالته الحالية. علاوة على ذلك، لا تعطي هذه الطريقة كميات تحضيرية من البروتين مقارنة بطرق إنتاج البروتينات المؤتليفة في البكتيريا.

هنا، نصف بروتوكولات مفصلة لزراعة أقفاص ذبابة الفاكهة بشكل روتيني واسع النضج، وتحضير قوالب mRNA صناعية، وتحضير محللات قادرة على الترجمة من الأجنة، وإجراء اختبارات ترجمة مختبرية خالية من الخلية. يوضح جدول المواد المواد المطلوبة طوال البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1) بناء البلازميد القالب للنسخ في المختبر

  1. اختر البلازميدات التي تحتوي على منطقة غير مترجمة (UTR) بمقدار 5 أقلاع، وحوض صحفي، وأنبوب UTR بمقدار 3 أقدام، وذيل بولي(A) أسفل محفز بوليميرازات RNA من نوع T7 أو T3 أو SP6. تأكد من أن كل تركيب يحتوي على موقع تقييد فريد مباشرة أسفل ذيل البولي(A) لخطية البلازميدات قبل النسخ (الشكل 1).
    ملاحظة: يجب اختيار موقع إنزيم التقييد المستخدم بعناية بحيث يكون موقع التعرف خارج التسلسل المنسخ أو موقع يسمح للحمض النووي الخطي بالانتهاء ب A. علاوة على ذلك، يجب أن يترك إنزيم التقييد بروزا غير حاد أو 5 أقدام في نهاية القالب 3 أقدام من القالب. يمكن أن تؤدي البروز بحجم 3' إلى منتجات نسخ شاذة. إذا تم استخدام إنزيم بامتداد 3 أقدام، يجب تخفيف القطعة قبل الاستخدام.
  2. تحقق من جميع البنى عن طريق التسلسل قبل استخدامها كقوالب للنسخ الصناعي .
    ملاحظة: تم استخدام تراكيب مراسل فايرفلاي لوسيفيراز (FLuc) ذات ذيل بولي(A)71 لهذا السير عمل. تراكيب FLuc مشتقة من شريط pLUC-cassette12. معلومات المتجهات والمجموعات مدرجة في جدول المواد.

2 ) النسخ الصناعي لصور mRNA المغطاة ومتعددة الأدينيلات

  1. خطي كل بناء بلازميدي باستخدام موقع التقييد الفريد أسفل ذيل البولي(A) (هنا، KpnI).
  2. حل الحمض النووي الخطي بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام 1٪ من الأجاروز عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة.
  3. استخرج الحمض النووي بالهلام وتحقق من سلامته وخطيته بشكل صحيح عن طريق الرحلان الكهربائي الجيلي المماثل.
    ملاحظة: ليس من الضروري تنقية الحمض النووي الخطي بالجل—إذا تم قطع الحمض النووي بالكامل، فإن تنقية العمود أو استخراج الفينول/ترسيب/ETOH كافية.
  4. قم بنسخ الحمض النووي الخطي المنقى باستخدام مجموعة نسخ في المختبر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف نظيرا بقطر 5 أقدام في تفاعل النسخ لتثبيت الحمض النووي الريبي وتحفيز الترجمة.
    ملاحظة: نظير الغطاء الوظيفي، مثل m7G(5′)ppp(5′)G RNA، يدعم تثبيت النسخ وتحفيز الترجمة. يدعم نظير الغطاء غير الوظيفي، مثل G(5′)pp(5′)A، تثبيت النسخ لكنه لا يدعم تحفيز الترجمة. يستخدم هذا المثبط للترجمة عند ترجمة النسخ البيسيسترونية لاختبار وجود مواقع دخول داخلية للريبوسوم (IRES) التي تدفع ترجمة السيسترونالثاني 7. لاختبار اعتماد ذيل متعدد الطبقات(A)، يمكن حذف هذا من البلازميد القالب قبل إجراء النسخ.
  5. عالج جميع تفاعلات النسخ باستخدام DNase الخالي من RNase لإزالة قالب الحمض النووي بعد النسخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. توفر مجموعات النسخ المجهزة بالكامل DNase الخالي من RNase.
  6. قم بتنقية النص عن طريق ترسيب كلوريد الليثيوم أو تنظيف الحمض النووي الريبي المعتمد على الأعمدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: جميع مجموعات النسخ في المختبرات توفر مواد الليثيوم كلوريد.
  7. قم بقياس النسخة المنقاة بواسطة التحليل الطيفي وتقييم سلامة ال mRNA بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام 1٪ من الأغاروز الذي يعمل بقوة 100 فولت لمدة ساعة واحدة.
  8. قم بتركيب mRNA وخزن عند -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3) الصيانة الدورية لثقافة ذبابة الفاكهة واسعة النطاق

  1. استخدم السلالة البرية المرجعية ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر أوريغون-R.
  2. حضر طعام الذباب وفقا لوصفة مرجعية معتمدة.
    ملاحظة: استخدم المؤلفون وصفة مركز ذبابة الفاكهة في بلومينغتونرقم 37 كمرجع لتحضير الطعام. تفاصيل هذه الوصفة مذكورة في الجدول 237. يوضح الشكل 2 سير العمل العام من جمع الأجنة وحتى قياس نشاط اللوسيفيراز.
  3. ضع قفص أكريليك مكعب أو أسطواني بطول حوالي 1 متر وقطره 50 سم.
  4. اصنع فتحة قطرها حوالي 30 سم في الجزء العلوي من القفص وأغلقها بشبكة (الشكل 3).
  5. ضع الورق المبلل فوق الشبكة لتوفير الماء للذباب، واستبدل الورق المبلل يوميا (الشكل 3).
  6. حافظ على الجزء الأمامي من القفص مفتوحا ومغطى بالقماش للسماح بالدخول إلى داخل القفص. ضع الأكريليك على الجانب الخلفي من قفص الذباب البلاستيكي، مغلق تماما.
  7. قم بتضخيم الطعم قبل جمع الأجنة، وضع ~1,000 ذبابة صغيرة داخل القفص. حافظ على قفص الذباب عند 22–25 درجة مئوية باستمرار.
    ملاحظة: يمكن الحفاظ على عدة أقفاص للذباب بنفس الأبعاد وكثافة الذباب في نفس الوقت. تضع الذباب البيض لمدة تقارب 15 يوما وتبدأ بالموت حوالي اليوم العشرين.
  8. أطعم الذباب يوميا بأطباق عصير الأجار والفواكه مع ملعقة من خميرة الخباز المعاد ترطيبها تحتوي على 200 ميكرولتر من حمض الخليك أو الخل.
  9. لتأسيس الجيل التالي من الذباب، اجمع عدة أطباق من الأجنة عمرها 0–12 ساعة. ضع الأجنة في صناديق بلاستيكية بحجم 22 سم × 17 سم × 10 سم تحتوي على طعام الذباب بعمق 3 سم. تأكد من وجود فتحة مغلقة بشبكة للصناديق، للسماح بدوران الهواء ومنع اليرقات من الهروب (الشكل 4). أضف خميرة نشطة جافة فوق الطعام ودع الأجنة تنمو عند 25 درجة مئوية.
  10. بعد 3 أيام، ضع ورقا مطويا بارتفاع 5 سم داخل الصناديق حتى تتمكن يرقات المرحلة الثالثة من الصعود وتصبح عذراء.
  11. بعد 10 أيام، ضع الصناديق التي تحتوي على الذباب البالغ الذي فقس حديثا في القفص. دع الذباب يخرج من الصناديق ويتزاوج في القفص لمدة يومين.
  12. للحصول على أجنة من عمر معين لتحضير التحلل، افتح القفص بعناية وضع أطباق عصير الأجار داخل القفص لفترة وضع البيض المطلوبة.
  13. أزل الصحون واجمع البيض باستخدام كومة من المنخلات.
    ملاحظة: بالنسبة لحلبات الأجنة التي عمرها 0–12 ساعة، ضع طبقين من عصير الأجار في القفص الساعة 8:00 صباحا وأخرجهما الساعة 8:00 مساء لجمع الأجنة.
    1. اجمع الأجنة لتحضير الليزات بين اليومين 3 و10 بعد فقس الذباب البالغ.
    2. بالتوازي، يجمع الأجنة في الأيام 2–4 ويؤسس جيلا جديدا من الذباب في صناديق تحتوي على الطعام كما هو موضح أعلاه.

4) تحضير محللات الانتقال من أجنة ذبابة الفاكهة عمرها 0–12 ساعة

ملاحظة: هذا البروتوكول لا يشمل العلاج بنوكلياز المكورات الدقيقة. تم حذف هذه الخطوة لتجنب احتمال تدهور mRNA المراسل الخارجي إذا كان تعطيل النوكلياز غير كامل. يجب مراقبة الترجمة الخلفية في كل تجربة باستخدام تحكم بدون mRNA.
ملاحظة: هذه الطريقة مشتقة من البروتوكولات 7,12,14,15,16,17,22 التي تم وصفها سابقا.

  1. جهز مخزن تحلل الجنين كما هو موضح في الجدول 2 وتخزينه عند -20 درجة مئوية في 1 مل من أليكوت.
    ملاحظة: قم بإذابة كل عدد من النقاط حتى مرتين للاستخدام الفوري.
  2. جمع الأجنة باستخدام مصفاة.
    ملاحظة: يستخدم البروتوكول القياسي أجنة عمرها 0–12 ساعة، لكن أعمار الأجنة الأخرى قد تكون مناسبة أيضا لتحضير التحذير.
  3. غسل الأجنة بماء الصنبور بشكل مكثف ثم باستخدام حاجز للأجنة يحتوي على 0.9٪ NaCl + 0.03٪ Triton X-100.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل المعالجة.
  4. إزالة الأجنة لمدة 5 دقائق في محلول 50٪ من حاجز الأجنة و50٪ مبيض المنزل (هيبوكلوريت الصوديوم [NaOCl] 4–6٪ وهيدروكسيد الصوديوم [NaOH] 0.02–0.1٪).
    تحذير: استخدم القفازات والنظارات البلاستيكية الشفافة عند التعامل مع المبيض.
  5. اغسله جيدا بماء الصنبور. جفف الأجنة بالورق وزنه.
  6. نقل الأجنة المعبأة إلى آلة طاحونة الأنسجة الزجاجية على الثلج. أضف 1 مل من محلول تحلل الجنين لكل 1 جرام من الأجنة. توحيد الأجنة على الجليد ب 20 ضربة.
  7. انقل التجانس إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 15,900 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. استرجع الطور التفاعلي في 50 ميكرولتر أليكوت على الجليد. قم بتجميد القطع في النيتروجين السائل وخزنها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: الطور التداخل هو محلول سائل عكر بين الطور العلوي والسفلي. الطور العلوي هو طبقة من الدهون البيضاء المعتمة اللزجة للغاية. الطور السفلي عبارة عن حبيبات صلبة.
    تحذير: تجنب تلويث محلول الطور التداخلي من الأطوار المجاورة.
    تحذير: استخدم القفازات والنظارات البلاستيكية الشفافة عند التعامل مع النيتروجين السائل.

5) تفاعل الترجمة في المختبر

  1. قم بإعداد تفاعلات التحويل في صفيحة بسعة 96 بئر أو أنابيب PCR فردية بسعة 0.2 مل على جهاز دورة حرارية PCR. جهز كل تفاعل ترجمة في حجم نهائي 17 ميكرولتر، بما في ذلك 5 ميكرولتر من تحلل الجنين ومكونات التفاعل المتبقية الموضحة في الجدول 2.
    ملاحظة: يمثل تحلل الجنين 30٪ من حجم التفاعل الكلي لكل حجم.
  2. إذا أضيفت بروتينات مؤتلفة إلى تفاعل الترجمة، قم بتحليل البروتين مقابل 20 ملليموتر هيبس-كوه-كو إh درجة حموضة 7.4. اختر حجم كاسيت الغسيل الكلوي وقطع الوزن الجزيئي حسب حجم العينة وحجم البروتين.
    ملاحظة: إضافة البروتينات المؤتلفة مهمة لدراسة المثبطات الانتقالية أو الاختبارات المعتمدة على الجرعة مع عوامل البدء. تجنب إضافة PBS إلى البروتينات المؤتليفة المستخدمة في تفاعل الترجمة. حافظ على الجلسرول عند أو أقل من 5٪ في عينة البروتين أو تفاعل الترجمة. إذا أمكن، تجنب إضافة الجلسرول إلى التفاعل.
  3. قم بتغيير طبيعة mRNA عن طريق التسخين إلى 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين وتبريد سريع على الجليد لمدة دقيقتين قبل تفاعل الترجمة في المختبر .
  4. قم بترجمة كل mRNA في ثلاث نسخ. اضبط التفاعل كما يلي: 2.7 ميكرولتر من كوكتيل التفاعل (الجدول 2) + 5 ميكرولتر من ليزات الجنين + mRNA (30 نانوغرام) + H2O إلى 17 ميكرولتر من الحجم النهائي. كمزيج أساسي رئيسي، اتبع كوكتيل التفاعل لتفاعل واحد في الجدول 2 وقم بقياس عدد التفاعلات التي يجب تنفيذها. حضن التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: لا تضاف ATP وGTP بشكل منفصل إلى التفاعل القياسي الموضح هنا. في أيدينا، لم يحسن إضافة إضافية ATP/GTP للتفاعل من إنتاج FLuc ويقلل من الترجمة تحت الظروف المختبرة. لذلك، يتم تنفيذ التفاعل باستخدام نظام تجديد الطاقة الموضح في الجدول 2 دون إضافة إضافية للنوكليوتيدات.
  5. برمج الثيرموسايلر بخطوة أولية 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، تليها 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية والخطوة النهائية 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. توقف التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من محلول التحليل السلبي البارد 1× البارد. ضع التفاعل على الثلج لمدة 10 دقائق إضافية.
  7. تخزين العينات عند -20 درجة مئوية أو تابع إلى قياس كمية اللوسيفيراز.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

6) قياس كمية اللوسيفيراز المصطنح

  1. ارفع التفاعلات إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة قبل قياس نشاط FLuc.
  2. أحضر 10 ميكرولتر من كل تفاعل ترجمة و50 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيراز (لمدة لا تقل عن ساعتين قبل الاستخدام) إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف ركيزة اللوسيفيراز إلى تفاعل الترجمة. سجل وحدات الضوء النسبية باستخدام جهاز قياس ضوء أوتوماتيكي أو يدوي. برمج مقياس الضوء ليأخذ 10 قراءات بفارق ثانية واحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قمنا بإجراء تفاعلات ترجمة لتحليل تباين الكفاءة بين ستة تحضيرات ليزات مستقلة (أي التكرارات البيولوجية) باستخدام أجنة عمرها 0–12 ساعة. يمثل كل شريط ثلاثية تقنية (الشكل 5). لوحظت كفاءة ترجمة مماثلة، رغم وجود بعض التباين. كما قارنا كفاءة الترجمة بين الأجنة في أعمار مختلفة. لذا، قمنا باختبار الليزاتات من أجنة عمرها 0-2 سنة، 0 إلى 12 ساعة، و0 إلى 18 ساعة، مع إجراء تكرارات بيولوجية، أي باستخدام تحللات مستقلة (الشكل 6). لاحظنا أن الليزا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن أن تعطي ذبابة الفاكهة للتحليل الصناعي نتائج قابلة للتكرار. تم استخدام الأجنة في أعمار مختلفة وتغيرات في تركيب المخزن لدراسة مجموعة واسعة من الظواهر الأساسية في تخليق البروتينات وآلياتها (الجدول 1). هنا، وصفنا طريقة قياسية مناسبة للأجنة من أي عمر لإجراء الدراسات بدقة وكمية (الجدول 1). قد يكون هذا البروتوكول مفيدا لدراسة وظيفة بروتين أو نمط جيني معين في الذباب الطافر كلما تم إنشاء زراعة واسعة النطاق لذلك الطفرة. علاوة على ذل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

حصل N.B-Á وG.H. على دعم برنامج التمويل الداخلي للمعهد الوطني للسرطان (Instituto Nacional de Cancerología, INCan) في المكسيك؛ د.إ.في. هو زميل دكتوراه في برنامج السكرتارية للعلوم الإنسانية والتكنولوجيا والابتكارات (SECIHTI) "Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022". نشكر فانيس ميسيرليس وبيتي أوسوريو (CINVESTAV، المكسيك) على الذباب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Aluminum foil sheetReynoldsN/AStandard household aluminum foil; any equivalent commercial brand acceptable.
Amino acids mixturePromegaL4461N/A
Apple cider vinegarHeinzN/ACommercial apple cider vinegar (5% acidity); any equivalent brand acceptable.
Apple or grape fruit juiceJumexN/ACommercial grape juice; or any equivalent commercial brand.
Bacteriological agar Merck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Boric acid (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, Molecular Biology grade, ≥99.5%, powder; used for preparation of TBE buffer.
Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structureBioLabsS1411SN/A
Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analogNew England BiolabsS1404SN/A
Cap: Non-functional cap analogue G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
Centrifuge Tube (15 mL)Corning 430053N/A
Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11836170001N/A
Creatine phosphokinase from rabbit muscleMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Creatine phosphoric acid, disodium saltMerck1120A47950N/A
Dehydrated baker´s yeastFleischmann'sN/ACommercial active dry yeast; any equivalent brand acceptable.
Diethyl pyrocarbonate Merck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutant strains of Drosophila melanogaster, as well as wild-type reference strains of other Drosophila species, such as virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. are also provided by this Stock Center.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS reagent, 99.4-100.6%, powder; used for preparation of TBE buffer.
HEPESSigmaSLBH4583V99.5%(titration)
Hydrogen peroxide (H2O2)EquateN/ACommercial (~2.5-3.5% hydrogen peroxide solution; any equivalent brand acceptable.
In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 KitThermo Fisher ScientificAM1344 and AM1348N/A
KOAc, also termed KCH3COOMerck/Sigma-AldrichSeveralN/A
Lb broth (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg 
Luciferase assay systemPromega E1501N/A
MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription KitInvitrogenAM1316 and AM1312N/A
Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2Merck/Sigma-AldrichSeveralN/A
NaCl (sodium chloride)J.T Baker B17W53ACS Reagent
OligonucleotidesAny companyN/ASequence-specific.
Pasive lysis 5X bufferPromegaE1941N/A
Pipet TipsAxygenT-200-Y200 microliters yellow tips.
Pipet TipsAxygenT-1000-B1ml blue tips.
Pipet Tips AxygenT-3000.5-10 microliters clear tips.
Propionic AcidMerck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS reagent grade, ≥99.5%, liquid.
PYREX® 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder  PYREX®  7724-5N/A
QIAprep spin plasmid miniprep kitQiagen27106N/A
QIAquick gel extraction kitQiagen28704N/A
Rabbit reticulocyte lysate (RRL)Promega L4960N/A
Renilla luciferase (RLuc) assay systemPromega E2820N/A
RNasin ribonuclease inhibitorPromegaN2111AN/A
RNeasy minielute RNA clean up kitQiagen74204N/A
Slide-A-Lyzer Dialysis CassettesThermo Scientific87735 (However, it depends on the molecular size cutoff).N/A
Sodium hypochlorite (bleach)CloroxN/ACommercial bleach (~5-6% NaOCl); any equivalent commercial brand with similar concentration acceptable.
SpermidineMerck85558N/A
Stainless steel sieveN/AN/AAny commercial supplier.
Taq plus precision DNA polymeraseStratagene600211-51N/A
Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XIMerck/Sigma-Aldrich9014-25-9 or R4752N/A
Tris (Tris base)IBI ScientificIB70145Molecular biology grade powder; used for preparation of TBE buffer.
Triton X-100SigmaSLBX9437Laboratory Grade
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500N/A
Unflavored gelatin powderKnoxN/ACommercial unflavored gelatin powder; any equivalent brand acceptable.
Unrefined cane sugar (piloncillo)N/AN/ACommercial Mexican unrefined whole cane sugar; any equivalent brand acceptable.
Vector: pBluescript SK or KS (+/-)Stratagene200301N/A
Vector: pGEM-T or pGEM-T Easy. Promega

المراجع

  1. Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.
  2. Hernández G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.
  3. Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.
  4. Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.
  5. Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5′-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.
  6. Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.
  7. Hernández G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.
  8. Zapata JM, Martínez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.
  9. Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.
  10. Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.
  11. Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.
  12. Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5′ and 3′ UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.
  13. Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.
  14. Vázquez-Pianzola P, Hernández G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.
  15. Hernández G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.
  16. Hernández G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.
  17. Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.
  18. Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.
  19. Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.
  20. Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.
  21. Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.
  22. Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.
  23. Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.
  24. Hernández G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.
  25. Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.
  26. Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.
  27. Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.
  28. Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.
  29. Krüger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.
  30. Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.
  31. Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.
  32. Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.
  33. Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.
  34. Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.
  35. Hernández G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.
  36. Hernández G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.
  37. Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الترجمة الخالية من الخلاياالترجمة في المختبرتخليق البروتينآلية الترجمةقوالب mRNA الاصطناعيةالتحكم الترجميأجنة ذبابة الفاكهة (Drosophila)بروتوكول الترجمة
ترجمة mRNA خالية من الخلايا في المختبر في محللات ذبابة الفاكهة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.