سير عمل منخفض التكلفة بدون علامات يعتمد على DeepLabCut لتحليل المشي والحركة التلقائية في الفئران التي تتحرك بحرية

ملخص

نقدم سير عمل منخفض التكلفة وبدون علامات باستخدام DeepLabCut لقياس المشي والحركة التلقائية في الفئران الحرة. يدمج هذا البروتوكول التقاط الفيديو بكاميرا واحدة، وتتبع المعالم التشريحية بدون علامات، واستخراج معلمات الحركة المكانية والزمانية، مما يوفر إطارا غير جراحي وسهل الوصول لتحليل سلوك الحركة دون الحاجة إلى معدات متخصصة.

الملخص

المشي هو مؤشر حيوي وظيفي واسع الاستخدام لاكتشاف التغيرات الحركية عبر مختلف الأمراض والحالات، حيث يعكس التغيرات في التنسيق والقوة والتوازن والتكامل الحسي الحركي. ومع ذلك، غالبا ما تتطلب الطرق التقليدية لتحليل المشي في نماذج الحيوانات معدات باهظة الثمن، أو تجهيزات معقدة، أو إجراءات غازية يمكن أن تغير السلوك الطبيعي. هنا، نقدم سير عمل منخفض التكلفة وبدون علامات يعتمد على برنامج DeepLabCut، وهو برنامج مفتوح المصدر لتقدير الوضعيات، للتحليل الكمي للمشي والحركة التلقائية في الفئران الحرة. تعتمد الطريقة على الحصول على فيديو بكاميرا واحدة، وتتبع المعالم التشريحية بدون علامات، واستخراج معلمات الحركة المكانية والزمانية، دون الحاجة إلى علامات فيزيائية أو أجهزة متخصصة. لإثبات تطبيق البروتوكول، تم تطبيقه في نموذج الفأر المعدل وراثيا الثلاثي لمرض الزهايمر (3xTg-AD) كمثال تمثيلي للتطبيق. يحافظ هذا النهج على حرية الحركة ويقلل من التوتر المرتبط بالتعامل مع التعامل، مما يمكن من تقييم السلوك الحركي بشكل غير جراحي. البروتوكول متوافق مع بيئات اختبار السلوك القياسية. بشكل عام، توفر هذه الطريقة إطارا متاحا وغير جراحي للتحليل الكمي للمشي والحركة في الأبحاث ما قبل السريرية.

المقدمة

المشي هو عملية حركية معقدة تنشأ من التفاعل اللحظي بين الأنظمة الحركية والحسية والإدراكية، وتتطلب معالجة منسقة للتغذية الراجعة الحسية، والتحكم في الوضعية، والتخطيط الحركي، وتنشيط العضلات لتوليد حركة مستقرة وتكيفية¹. وبسبب هذه الطبيعة التكاملية، أصبح التعرف بشكل متزايد على تغييرات المشي كمؤشرات وظيفية لخلل الوظائف العصبية في كل من الممارسة السريرية والأبحاث التجريبية. في نماذج البشر والحيوانات، يمكن تحليل المشي من اكتشاف التغيرات في الحركة، وخطر السقوط، والهشاشة، والقدرة الوظيفية، وقد تم اقتراحه كمؤشر حيوي لتقدم المرض وفعالية التدخل عبر عدة حالات^2،3،4.

في البحث الأساسي، لا سيما في نماذج الفئران، يمثل تقييم المشي التلقائي والنشاط الحركي استراتيجية مستخدمة على نطاق واسع لتوصيف الأنماط الظاهرية الحركية وتقييم تأثير الاضطرابات الفسيولوجية والتدخلات العلاجية. يسمح القياس الموضوعي لمعايير الحركة الذهنية باكتشاف التغيرات الحركية الدقيقة التي لا يتم التقاطها بشكل موثوق من خلال الفحص البصري فقط، وهو قيد ذو صلة خاصة في الدراسات ما قبل السريرية التي تستهدف^{الأنماط} الظاهرية المبكرة أو الخفيفة. في هذا السياق، برز تحليل المشي كأداة قيمة للتحقيق في التغيرات في السلوك الحركي وتحديد التغيرات الوظيفية المرتبطة بحالات تجريبية مختلفة، مثل الأمراض العصبية والتنكسية العصبية⁶.

اعتمد تحليل السلوك الحركي والمشي في نماذج الفأر تقليديا على منصات تكنولوجية متخصصة مصممة لقياس المتغيرات الحركية المكانية والزمانية. تستخدم أنظمة مثل الممرات المضيئة، والمنصات المزودة بالأجهزة، وبرامج تتبع الحركة التجارية بشكل شائع؛ ومع ذلك، فإن اعتمادهم على الأجهزة المكلفة والبنية التحتية المخصصة يحد بشكل كبير من إمكانية الوصول للعديد من المختبرات 7,8,9,10. بعيدا عن الاعتبارات الاقتصادية، تقدم هذه الأساليب قيودا تجريبية إضافية. تتطلب عدة أنظمة من الحيوانات عبور ممرات ضيقة أو ممرات مضاءة بشدة، مما يفرض أنماط حركة قسرية تقلل من السلوك التلقائي، بينما تعتمد أنظمة أخرى على علامات فيزيائية، أو بقع طلاء، أو علامات لاصقة مثبتة على الأطراف. يمكن أن تسبب هذه التدخلات توترا، تغير ميكانيكا المشي، وتعيق التفسير الفسيولوجي للنتائج الحركية 11,12,13,14. تسلط هذه القيود مجتمعة الضوء على الحاجة إلى منهجيات قادرة على التقاط المشي في ظروف طبيعية حرة الحركة دون الاعتماد على إجراءات تدخلية أو بنية تحتية مكلفة.

تقييم المشي أثناء الحركة غير المقيدة يتيح ملاحظة أنماط حركية أكثر طبيعية، متجنبا القيود الخارجية التي تنظم السرعة أو المسار أو الوضعية بشكل مصطنع. يسهل هذا النهج توصيف السلوك الحركي تحت ظروف محدودة للغاية. ديب لاب كت هو إطار عمل لتقدير الوضعيات مفتوح المصدر قائم على التعلم العميق، يستخدم الشبكات العصبية الالتفافية لتتبع المعالم التشريحية التي يحددها المستخدم دون الحاجة إلى علامات مادية. من خلال تمكين تتبع النقاط التشريحية من تسجيلات الفيديو القياسية، يسمح DeepLabCut باستخراج معلمات حركية مع تقليل التكلفة والتعقيد التجريبي بشكل كبير 15,16,17,18. ومن المهم أن التتبع بدون علامات يقلل من التداخل التجريبي، مما يجعله مناسبا لدراسات السلوك التلقائي. هذا النهج الخالي من العلامة بكاميرا واحدة هو الأنسب للدراسات التي تتطلب قياسا غير جراحي وسهل الوصول للنشاط الحركي التلقائي وميزات المشي ثنائية الأبعاد تحت ظروف الحركة الحرة. ومع ذلك، فإن منصات المشي المجهزة بالأجهزة أو أنظمة التقاط الحركة ثلاثية الأبعاد مطلوبة عندما تكون هناك حاجة للمتغيرات البيوميكانيكية المباشرة، مثل قوى رد الفعل الأرضية، الضغط الأخمصي، زوايا المفاصل، أو حركيات الأطراف ثلاثية الأبعاد كاملة.

هدف هذه المقالة هو تقديم سير عمل منخفض التكلفة وبدون علامات يعتمد على DeepLabCut لقياس المشي والحركة التلقائية غير الجراحية في الفئران الحرة، مع دمج التقاط الفيديو بكاميرا واحدة، وتتبع العلامات التشريحية، واستخراج معلمات الحركة المكانية والزمانية ضمن سير عمل يمكن الوصول إليه لا يتطلب أجهزة متخصصة أو تلاعبا تدخليا. يركز هذا البروتوكول على التنفيذ المنهجي والمخرجات التمثيلية لسير العمل.

البروتوكول

تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا لدليل NIH لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوية في معهد علم الأعصاب، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك، بموجب البروتوكول رقم 117.

1. سياق الدراسة

1. استخدم الفئران في الظروف التجريبية المطلوبة للدراسة. في هذا المقال عن البروتوكول، نستخدم نموذج الفأر الثلاثي المعدل وراثيا لمرض الزهايمر (3xTg-AD)، مع احتواء الجينات المعدلة APPSwe وtauP301L على خلفية PS1M146V الفاصلة، مع الفئران غير المعدلة وراثيا كعناصر تحكم، كمثال تمثيلي لتنفيذ سير العمل.
2. حدد النمط الجيني لجميع الحيوانات قبل بدء الدراسة.
3. الحفاظ على الفئران مع الطعام والماء بقدر الحرية تحت ظروف محكمة تتكون من دورة ضوء وظلام 12:12 ساعة، ودرجة حرارة 22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 60٪ ± 5٪ تحت إشراف بيطري.
4. قم بإجراء تسجيلات خلال المرحلة الضوئية بعد فترة تعود مدتها 60 دقيقة، باستخدام جلسة مفتوحة واحدة لكل حيوان للحفاظ على السلوك الاستكشافي العفوي وتجنب تقليل النشاط المرتبط بالتعرض المتكرر للساحة.
   ملاحظة: في هذه المقالة عن البروتوكول، نقدم تسجيلات تمثيلية حصرية لتوضيح سير العمل ونوع مخرجات الحركة والمشي التي تولدها الطريقة، بدلا من دعم المقارنات البيولوجية بين المجموعات.

2. المواد

1. نحن المواد والمعدات المدرجة في جدول المواد والمعدات لتسجيل وتحليل الحركة والمشي التلقائية. انظر الشكل 1 للتجميع العام للإعداد التجريبي.

3. التعود وتسجيل الحركة العفوية

1. تحضير الحيوانات وتعويده
   1. انقل الفأر بحذر من غرفة التخزين إلى غرفة اختبار السلوك قبل 60 دقيقة على الأقل من التجربة للسماح بالتعود البيئي.
   2. الحفاظ على غرفة الاختبار السلوكي تحت ظروف بيئية مضبوطة، بما في ذلك درجة حرارة ثابتة بين 20 °C–22 °C، وشدة إضاءة موحدة (120–150 لوكس تقاس على مستوى الساحة)، وضوضاء بيضاء مستمرة لتقليل المحفزات السمعية الخارجية.
   3. خلال فترة التعود، يجب إبقاء الحيوان في قفصه المنزلي دون إدخال محفزات إضافية أو إثراء. التعامل مع الحيوانات وفقا لإرشادات رفاهية الحيوانات المؤسسية لتقليل التباين السلوكي الناتج عن التوتر.
   4. تعامل مع الحيوان بقفازات نظيفة وحركات بطيئة ومدروسة. ارفع الحيوان برفق من قاعدة الذيل وادعم الجسم باليد الأخرى قبل وضعه في ساحة الحقل المفتوح.
      ملاحظة: الخطوة الحرجة: التعامل غير المتسق أو وقت التعود غير الكافي قد يزيد من السلوكيات المرتبطة بالقلق ويدخل تباين في معايير الحركة. تأكد من اتباع إجراءات التعود المتطابقة بين جميع الحيوانات والجلسات.
2. ساحة مفتوحة وتحضير للكاميرا
   1. قبل كل جلسة تسجيل، نظف ساحة الحقل المفتوح الأكريليك جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول لإزالة الروائح المتبقية وعلامات الروائح السابقة. اترك السطح يجف تماما قبل الاستخدام.
   2. تعامل مع 70٪ إيثانول في منطقة جيدة التهوية، وابق الساحة بعيدا عن مصادر الحرارة أو الاشتعال، ودع الساحة تجف تماما قبل الاستخدام.
   3. ضع ساحة الحقل المفتوح بإحكام على المنصة الخشبية، لضمان استقرار الهيكل وخاليا من الاهتزازات.
   4. افحص الجدران الشفافة من الأكريليك وسطح الأرضية غير اللامع للتأكد من خلوهما من الغبار أو الرطوبة أو بقايا العاكسة التي قد تعيق تتبع الفيديو.
   5. ضع مصابيح الضوء الأبيض الجانبية الخارجية على جانبي الساحة بزاوية تقريبية تتراوح بين 30–45° بالنسبة لمستوى الساحة لتوفير إضاءة موحدة عبر منطقة التسجيل وتقليل الظلال والانعكاسات أو السطوع الزائد. قم بضبط وضع المصباح قبل كل جلسة وتحقق من أن الإضاءة في مستوى الساحة تبقى ضمن النطاق المستهدف بين 120-150 لوكس.
   6. ضع الكاميرا أسفل الساحة في تكوين من الأسفل على مسافة ثابتة تقارب 80 سم من مستوى الحلبة، لضمان رؤية كاملة لمنطقة التسجيل. لاحظ أن هذه المسافة المثلى قد تحتاج إلى تعديل حسب فتحة العدسة ومجال الرؤية (FOV) للكاميرا المحددة للحفاظ على تغطية كاملة للساحة.
   7. قم بتوصيل الكاميرا بنظام الكمبيوتر وتشغيل برنامج التقاط الفيديو قبل إدخال الحيوان.
   8. اضبط تركيز الكاميرا ومجال الرؤية لضمان أن سطح الساحة بالكامل مرئي وبدقة واضحة.
   9. احصل على صورة مرجعية للمعايرة المكانية عن طريق وضع شبكة رقعة الشطرنج أو نمط المعايرة بأبعاد معروفة على مستوى الساحة.
      ملاحظة: خطوة حرجة: محاذاة الكاميرا بدقة، ومسافة ثابتة للكاميرا، والإضاءة المتسقة ضرورية لتقدير وضعية موثوقة بدون علامات. يمكن أن يقلل الانحرافات في الهندسة أو ظروف الإضاءة من دقة التتبع ويؤثر على قابلية المقارنة بين الجلسات عبر الجلسات.
      ملاحظة: يمكن استخدام مواد بديلة، بما في ذلك الفولاذ المقاوم للصدأ، لبناء هيكل الدعم الخارجي، بشرط أن يبقى الإعداد مستقرا ويتم الحفاظ على محاذاة التسجيل.
      ملاحظة: قد يستخدم أيضا ساحة معتمة أو مواد جدارية بديلة، خاصة عندما يرغب في التحكم الإضافي في المدخلات البصرية الخارجية، بشرط أن يبقى إعداد التسجيل مستقرا ويقلل التداخل البصري الخارجي.
      ملاحظة: أبعاد الساحة المستخدمة في هذا البروتوكول تتوافق مع التكوين المستخدم لتسجيل الفئران الحرة. يمكن تعديل هذه الأبعاد وفقا للقارض المستخدم وبروتوكول المجال المفتوح المعتمد، بشرط الحفاظ على رؤية كاملة للحيوانات، ومعايرة مكانية، وظروف اكتساب متسقة.
3. تسجيل سلوك الحركة التلقائية
   1. قبل وضع الفأرة في الساحة، عرض معرف الحيوان لفترة وجيزة في إطار الفيديو لضمان الارتباط البصري المباشر بين التسجيل والجلسة التجريبية المقابلة.
   2. ابدأ تسجيل الفيديو قبل وضع الفأرة في وسط ساحة الحقل المفتوح لضمان التقاط السلوك الاستكشافي الأولي منذ بداية الجلسة.
   3. ضع الفأر برفق في وسط ساحة الحقل المفتوح.
   4. سجل الحركة التلقائية بشكل متواصل لمدة 3 دقائق دون حدوث اضطرابات بصرية أو سمعية أو لمسية. في البروتوكول الحالي، تم إجراء جلسة تسجيل واحدة فقط لكل فأرة.
   5. راقب بث الفيديو المباشر على شاشة الكمبيوتر لتأكيد التسجيل المستمر والتقاط حركات الحيوان بشكل صحيح.
   6. تحقق بشكل دوري من محاذاة الكاميرا وتجانس الإضاءة بين الجلسات لضمان ظروف تسجيل متسقة بين الحيوانات.
   7. في نهاية فترة التسجيل، توقف التقاط الفيديو وأخرج الحيوان بعناية من الساحة باستخدام نفس إجراءات التعامل الموضحة أعلاه.
   8. أعد الحيوان إلى قفصه المنزلي ودعه يرتاح قبل أي إجراءات أخرى.
      ملاحظة: تجنب إعادة تموضع الحيوان أثناء التسجيل، لأن التداخل الخارجي قد يغير أنماط المشي التلقائية ويؤثر على التحليل في المراحل التالية.
4. التنظيف، تخزين البيانات، وإكمال الجلسة
   1. نظف الساحة المفتوحة مرة أخرى بنسبة 70٪ (v/v) إيثانول بعد كل جلسة واتركها تجف تماما قبل إدخال الحيوان التالي.
   2. تأكد من عدم بقاء أي إيثانول أو رائحة متبقية على سطح الساحة قبل إدخال الحيوان التالي.
   3. وثق معرف الحيوان، وتاريخ ووقت الجلسة، وحالة التجربة، واسم المشغل مباشرة بعد كل تسجيل.
   4. إذا تم اختبار حيوانات إضافية، كرر الإجراء بدءا من الخطوة 3.1.1 تحت ظروف بيئية وتجريبية متطابقة.
   5. احفظ كل ملف فيديو في مجلد مخصص باستخدام نظام تسمية موحد (مثل AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. في نهاية اليوم التجريبي، أوقف نظام الكاميرا ومعدات الإضاءة لمنع انحراف إعدادات الإضاءة عبر الجلسات.
      ملاحظة: على الرغم من استخدام 70٪ إيثانول في هذا البروتوكول لأنه مطهر شائع الاستخدام في هذا النوع من الإجراءات، إلا أنه يمكن أيضا استخدام مطهرات متوافقة مع الأكريليك لتجنب تدهور السطح التدريجي، بشرط أن تكون الساحة جافة تماما وخالية من الرائحة المتبقية قبل التسجيل التالي.
      ملاحظة: عند الإمكان، قد تكون عدة ساحات جاهزة للسماح بالتبديل الفوري بين الجلسات وتسهيل التقدم المستمر للتجربة بين الحيوانات.
      انظر الشكل 1 للمواد والتجميع في الإعداد التجريبي، بما في ذلك المنصة الخشبية (الشكل 1A)، ساحة الأكريليك (الشكل 1B)، نظام الإضاءة الجانبية (الشكل 1C)، تموضع الكاميرا في الأسفل (الشكل 1D)، والإعداد التجريبي الكامل (الشكل 1E).

الشكل 1: إعداد تجريبي لتسجيل الفيديو للحركة في ساحة الحقل المفتوح. (أ) هيكل الدعم للساحة؛ (ب) ساحة مفتوحة من الأكريليك موضوعة على المنصة؛ (ج) الإضاءة الجانبية لضمان إضاءة متجانسة؛ (د) تحديد موقع الكاميرا لتسجيل الحركة من الأسفل؛ (ه) إعداد كامل. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى اتجاه مصدر الضوء في الشكل 1C واتجاه الكاميرا في الشكل 1D. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. معالجة الفيديو والتحليل الحركي

1. تحضير الفيديو ومراقبة الجودة
   1. احصل على فيديوهات RAW في . تنسيق MOV وتحويلها إلى صيغة .avi للتوافق مع DeepLabCut مع الحفاظ على معدل إطارات ومعايير دقة ثابتة.
   2. يقوم ببتحميل جميع ملفات الفيديو الخام فور الحصول عليها في مجلد مخصص على جهاز التحليل ويطبق نظام تسمية موحد (مثل AnimalID_Session_Date).
   3. راجع كل فيديو بالكامل للتأكد من أن التسجيل مكتمل وخال من المقاطعات أو الإطارات المفقودة أو التلف. يجب استبعاد مقاطع الفيديو التي تحتوي على أخطاء اكتساب من التحليل.
   4. حول الفيديوهات إلى MP4 (H.264) أو صيغة AVI غير مضغوطة إذا لم تكن الصيغة الأصلية متوافقة مع DeepLabCut.
   5. اختياريا، يتم تقليم لقطات الفيديو لإزالة الفواصل غير التجريبية في بداية ونهاية الجلسة (مثلا أثناء إدخال أو إزالة الحيوان من ساحة التجريب).
   6. تأكد من أن الدقة ومعدل الإطارات يتطابقان مع معايير الاكتساب المستخدمة أثناء التسجيل ويبقيان متسقين عبر جميع الجلسات.
   7. تحقق من أن سطح الساحة بالكامل مرئي داخل إطار الفيديو وأنه لا توجد أجزاء من الجسم محجوبة باستمرار أثناء الحركة.
   8. Pقم بدمج جميع الفيديوهات المثبتة والمعالجة في دليل مشروع مخصص لتحليل DeepLabCut.
      ملاحظة: خطوة حرجة: معدلات إطارات غير متسقة، رؤية جزئية للساحة، أو ضبابية الحركة ستقلل مباشرة من دقة التتبع. لا ينبغي تضمين الفيديوهات التي لا تستوفي معايير الجودة في تدريب النماذج أو الاستنتاجات.
2. إنشاء المشروع وتكوينه
   1. خصص مكتبة فيديو للمشروع، باستخدام نفس الفيديوهات المخصصة للتحليل أو مجموعة تمثيلية لتدريب الشبكات.
   2. شغل بيئة بايثون واستورد حزمة DeepLabCut.
   3. أنشئ مشروع DeepLabCut جديد باستخدام الأمر:
   4. deeplabcut.create_new_project('اسم المشروع'، 'المؤلف'، 'مسار الفيديو').
   5. حدد المعالم التشريحية (أجزاء الجسم) التي تهم في ملف config.yaml، مع ضمان تعريفات واضحة ومتسقة تشريحيا.
   6. يجب تحسين تعريفات أجزاء الجسم للسؤال التجريبي والبقاء متطابقة في جميع الحيوانات والجلسات.
3. استخراج الإطار ووضع علامات على أجزاء الجسم
   1. حدد البدء، التوقف، numframes2extract، و cropping_parameters في ملف config.yaml حسب طول الفيديو والتخطيط المكاني.
   2. استخرج إطارات تمثيلية باستخدام: deeplabcut.extract_frames(config_path، 'تلقائي'، 'kmeans'/'uniform').
   3. راجع الإطارات المستخرجة لتأكيد وجود تباين في وضعية الجسم، الاتجاه، وضعية الطرف، وتغطية طور المشي عبر التسجيل. إذا كانت الوضعيات أو تكوينات الأطراف أو المراحل الحركية غير ممثلة بشكل كاف، فعليك استخراج إطارات إضافية لتمثيل هذه الحالات بشكل أفضل.
   4. عندما تكون هناك حاجة لمراحل دورة مشية محددة، يتم استخراج الإطارات يدويا باستخدام: deeplabcut.extract_frames(config_path، 'يدوي').
   5. شغل واجهة التسمية الرسومية باستخدام: deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. قم بتسمية جميع المعالم التشريحية المحددة مسبقا المعروضة في الشكل 2، بما في ذلك إطار الفيديو التمثيلي أثناء الاقتناء (الشكل 2A)، والكشف التلقائي عن نقاط الجسم المثبت على الإطار الأصلي (الشكل 2B)، والتمثيل التخطيطي للمعالم الجسدية المحددة ونقاط المرجعية المستخدمة للتحليل (الشكل 2C). اتباع معايير تشريحية متسقة (مثل الأنف: طرف الخطم الأمامي؛ قاعدة الذيل: نقطة التقاء بين العمود الفقري والذيل)
   7. ضع علامة على الأطراف الأربعة بشكل متسق بوضع كل علامة في مركز الكف فوق الوسائد الأخمصية عند ملامسة الأرض.
   8. احفظ وفحص الملصقات باستخدام: deeplabcut.check_labels(config_path)، وصحح التعليقات غير الدقيقة إذا لزم الأمر.
   9. عندما يكون ذلك ممكنا، اطلب من مقيم مدرب ثان أن يضع علامة على مجموعة فرعية من الإطارات لتقييم الاتساق بين المقيمين.
      ملاحظة: خطوة حرجة: التسمية غير المتسقة أو غير الدقيقة تشريحيا هي مصدر رئيسي لأخطاء التتبع في مرحلة لاحقة. تأكد من الالتزام الصارم بتعريفات المعالم عبر جميع الإطارات.
4. تدريب الشبكات العصبية
   1. تدريب نموذج تقدير الوضعية لمدة 200 فترة والحصول على متوسط خطأ تدريب نهائي (RMSE) يبلغ 3.27 بكسل ومتوسط خطأ اختبار 3.59 بكسل، مما يتوافق مع أداء تتبع مستقر تحت ظروف الاكتساب الموصوفة.
   2. أنشئ مجموعات بيانات التدريب والتقييم باستخدام: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. قم بضبط معامل كسر التدريب في config.yaml لتحديد نسبة الصور المستخدمة في التدريب.
   4. تحقق من توفر بطاقة الرسوميات عن طريق تشغيل: nvidia-smi.
   5. ابدأ تدريب الشبكة باستخدام: deeplabcut.train_network(config_path، save_epochs=5، فترات زمنية = 200).
   6. راقب فقدان التدريب وأوقف التدريب بمجرد استقرار قيم الخسارة دون ملاحظة أي تحسن إضافي.
   7. إذا تم مقاطعة التدريب، استأنف من آخر نقطة حفظ محفوظة.
   8. قيم النموذج المدرب باستخدام: deeplabcut.evaluate_network(config_path) وسجل متوسط خطأ البكسل.
   9. إذا تجاوز الخطأ الحد المقبول لإعداد التجربة، أضف إطارات معنونة إضافية أو قم بتحسين التعليقات وتكرار التدريب.
      ملاحظة: قد تختلف عتبات خطأ البكسل المقبولة حسب دقة الكاميرا وحجم الساحة، لكنها يجب أن تبقى ثابتة عبر التجارب.
5. تحليل الفيديو وقياس كمية المشي
   1. اعتبر النقاط ذات القيمة الاحتمالية أقل من 0.3 على أنها مفقودة.
   2. الاستيفاء الخطي للنقاط المفقودة فقط عندما تكون الفجوات ≤3 إطارات متتالية؛ استبعد الفجوات الأطول من التحليل.
   3. حدد ضربات الحركة باستخدام عتبة سرعة مركز الجسم تبلغ 10 سم/ث.
   4. استبعد الحركات تحت هذه العتبة والأحداث العابرة التي تقل عن 3 إطارات.
   5. شغل الاستنتاج على فيديوهات تجريبية باستخدام: deeplabcut.analyze_videos(config_path، [video_path]، save_as_csv=صحيح).
   6. قم بإنشاء فيديوهات معنونة باستخدام: deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) لتأكيد جودة التتبع بصريا (الشكل 2).
   7. قم بتعيين معامل pcutoff في config.yaml إلى 0.6 لتطبيق عتبة ثقة أثناء تتبع التصور والتقييم.
   8. استيراد ملفات CSV المخرجة إلى بيئة الحوسبة الإحصائية المدرجة في جدول المواد، مع حزمة التحليل المقابلة والسكريبتات المخصصة المقدمة في المادة التكميلية 1 لقياس السلوك.
   9. حول مؤشرات الإطارات إلى زمن باستخدام معدل أخذ عينات الفيديو الأصلي.
   10. قم بمعايرة الأبعاد المكانية عن طريق تحويل إحداثيات البكسل إلى وحدات مادية باستخدام أبعاد الساحة المعروفة والمعالم المعروفة في زوايا الساحة.
   11. قم بإجراء مراقبة جودة على الإحداثيات المتتبعة قبل استخراج المتريات.
   12. اعتبر نقاطا ذات قيمة احتمالية أقل من 0.3 مفقودة واستبدلها بالاستيفاء الخطي عند المناسبة.
   13. حدد المسارات الشاذة أثناء الفحص البصري وصححها أو استبعادها عند الضرورة.
   14. حدد مقاطع المشي باستخدام معايير حركية متزامنة بناء على إزاحة مركز الجسم وحركة الطرف الخلفي.
   15. استبعد السلوكيات غير الحركية مثل الرفع، والدوران، والتجميل.
   16. معايرة وتحسين عتبات التعريف يدويا وفقا للظروف التجريبية والنموذج الحيواني للحفاظ فقط على فترات الحركة المتحركة القوية والمستمرة للتحليل.
   17. احسب مقاييس المشي المستمدة من العلاقات الهندسية والزمنية بين المعالم المتتبعة باستخدام مقاطع الحركة المستمرة المفلترة (الجدول 1). شملت هذه التعديلات طول الخطوة، طول الخطوة، عرض الخطوة، الإيقاع، مدة الخطوة، مدة الخطوة، وقت الوقفة، وقت التأرجح، السعة المماثلة للجانب، ومقاييس الإزاحة الخاصة بالطرف.
   18. استخراج مقاييس الحقل المفتوح من التسجيل الكامل باستخدام نفس بيانات التتبع (الجدول 1). شملت هذه المسافة الكلية المقطوعة، متوسط السرعة، الوقت المضغوط في الحركة، نسبة الوقت الذي يقضيه في الحركة، عدد ومدة جولات المشي، والمسافة التراكمية التي تم قطعها في مناطق الوسط والطرف والمنعطف.
   19. تجميع جميع المخرجات في ملف رئيسي منظم للتحليل الإحصائي في مرحلة لاحقة.
   20. توليد تمثيلات بصرية (مثل المسارات، خرائط الحرارة، الإزاحة القائمة على الزمن، أنماط المشي، ومخططات التنسيق بين الأطراف) باستخدام البيئات الحسابية المدرجة في جدول المواد ونصوص الرسم الموضح أعلاه.
   21. يتم توفير تصورات متزامنة تمثيلية لثقة النقطة، واكتشاف ضربات المشي، وتصنيف المناطق الاستكشافية، والتنسيق بين الأطراف في الفيديو التكميلي 1 والفيديو التكميلي 2 لتسهيل تفسير سير العمل التحليلي.
6. مراقبة الجودة ونسخ البيانات
   1. افحص بصريا مجموعة عشوائية من الفيديوهات الموسومة للتأكد من الاتساق التشريحي عبر الإطارات والجلسات.
   2. قارن مواقع المعالم المتوقعة مع التسميات المشروحة للتحقق من استقرار النموذج وتعميمه.
   3. احفظ نسخة كاملة من المشروع، بما في ذلك config.yaml، والتسميات الأصلية، وأوزان الشبكة المدربة، وملفات الإخراج.
   4. وثق نسخ البرمجيات المستخدمة في سير العمل، بما في ذلك DeepLabCut وPython وPyTorch وCUDA وبيئة الحوسبة الإحصائية، مع مواصفات وحدة معالجة الرسومات وتاريخ التحليل.
   5. أنشئ تقريرا ملخصا عن متوسط الأخطاء وأوقات المعالجة من evaluation-results.csv.
   6. قم بعمل نسخة احتياطية للمشروع بالكامل إلى أرشيف محلي وإلى خادم مؤسسي أو تخزين سحابي آمن.
7. البيئة الحاسوبية وموارد قابلية التكرار
   1. التقاط تسجيلات الفيديو الأصلية في . تنسيق MOV بدقة 1080 × 1920 بكسل وحوالي 60 إطارا في الثانية.
   2. قم بمعالجة وتحويل الفيديوهات إلى .avi صيغتها.
   3. خلال هذه الخطوة التحويلية، قم بقص المنطقة المعنية، وإعادة تكبيرها إلى دقة مربعة تبلغ 720 × 720 بكسل، وتوحيد معدل الإطارات إلى ثابت 60 إطار في الثانية لضمان القياس الزمني الدقيق أثناء التحليل الحركي اللاحق.
   4. تنفيذ سير عمل التتبع بدون علامات باستخدام DeepLabCut الإصدار 3.0.0rc13 في بيئة بايثون مهيأة باستخدام بايثون 3.12.12 وPyTorch 2.5.1 وCUDA 11.8.
   5. تدريب نموذج تقدير الوضعية لمدة 200 عصر والحصول على متوسط خطأ تدريب نهائي (RMSE) يبلغ 3.27 بكسل ومتوسط خطأ اختبار 3.59 بكسل.
   6. إجراء تحليل ما بعد التتبع باستخدام بيئة الحوسبة الإحصائية والسكريبتات المخصصة المقدمة في المادة التكميلية 1 لقياس المشي والميدان المفتوح.
   7. استخدم عتبة سرعة مركز الجسم تبلغ 10 سم/ثانية لتحديد نوبات المشي. املأ الفجوات التي تصل إلى 3 إطارات بين فترات الحركة واستبعد الحركات العابرة التي تقل عن 3 إطارات للحفاظ على مقاطع المشي المستمرة للتحليل.
   8. قدم إعدادات config.yaml ذات الصلة، ونصوص تحليل تمثيلية، وأمثلة على ملفات الفيديو والتتبع، وأوزان النماذج في المادة التكميلية 1.
   9. قدم تفاصيل تنفيذ إضافية، ومقاييس تقييم النماذج، ومواصفات العتاد، ومعلمات التحليل الخاصة بالحالة في المادة التكميلية 1، حيثما كان ذلك مناسبا.
      ملاحظة: قم بضبط هذه المعايير وفقا لشروط الاستحواذ المستخدمة في كل تجربة.

الشكل 2: سير عمل تمثيلي لتتبع نقاط الجسم بدون علامات وتحليل المشي من تسجيلات الفيديو. (أ) إطار فيديو تمثيلي لفأر يتحرك بحرية داخل ساحة الحقل المفتوح أثناء الاقتناء. (ب) مثال على اكتشاف نقاط الجسم الآلي الذي تم وضعه على إطار الفيديو الأصلي بعد تقدير الوضعية، يوضح المعالم التشريحية المستخدمة في التحليل. (ج) التمثيل التخطيطي للمعالم الجسدية المحددة ونقاط المرجعية في الساحة المستخدمة في إعادة بناء المشي، المعايرة المكانية، والتحليل الكمي للحركة. نقاط المرجعية والمعالم الرئيسية: الخطم، الحلق، مركز الجسم، وسط الجسم الأيسر (bcl)، الجسم وسط الأيمن (bcr)، الورك الأيسر (الورك)، الورك الأيمن (الورك)، الذيل قاعدة، الذيل في الوسط، طرف الذيل، الكف الأمامية اليسرى (LFP)، الكف الخلفي الأيسر (LHP)، الكف الأمامي الأيمن (RFP)، الكف الخلفي الأيمن (اليمنى)، الأيسر العلوي الأيسر (TL)، أعلى يمين (tr)، أسفل يسار (bl)، وأسفل يمين (br). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

بعد تطبيق سير عمل التتبع والتحليل، أعادت المعالجة الآلية بناء حركة المجال المفتوح التلقائي باستخدام معلم مركز الجسم المحدد وولدت مخرجات كمية مناسبة للتحليل اللاحق. توضح مخططات المسار التمثيلية كيف يلتقط البروتوكول الإزاحة المكانية عبر الساحة، والاحتلال الزمني، وديناميكيات السرعة أثناء الاستكشاف الحر. تم حساب متغيرات المجال المفتوح المعروضة في هذا القسم من التسجيل الكامل، وتم تضمين تسجيلات تمثيلية لتوضيح سير العمل وأنواع مخرجات الحركة والمشي التي يولدها البروتوكول.

في تسجيل تمثيلي غير Tg، يظهر ...

المناقشة

تقدم هذه الدراسة نهجا منخفض التكلفة وبدون علامات لتحليل الحركة والمشي التلقائي في الفئران الحرة باستخدام التقاط الفيديو التقليدي وتقدير الوضعية المعتمد على DeepLabCut ضمن سير عمل يسهل الوصول إليه. يسمح سير العمل باستخراج المتغيرات المتعلقة بالحركة والمشي من تسجيلات الفيديو مع الحفاظ على السلوك الطبيعي للحركة وتقليل التداخل التجريبي. وبهذا المعنى، يقدم البروتوكول بديلا عمليا ومتاحا للدراسات ما قبل السريرية للسلوك الحركي.

تم إثبات البروتوكول في نموذج فأر معدل ور...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
70% ethanol	Generic	N/A	تنظيف الساحة بين الجلسات
مصابيح ضوء أبيض قابلة للتعديل	Generic	N/A	الحفاظ على الإضاءة المستمرة (100–150 lx)
ستائر سوداء/التحكم في الوهج	Generic	N/A	تقليل الضوء الخارجي/الانعكاسات
قالب شبكة مربعة	Generic	N/A	صورة مرجعية للمعايرة المكانية
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	مفتوح المصدر	N/A	برنامج تقدير الوضع
كاميرا فيديو رقمية (HD، 16:9؛ ≥60 إطارًا في الثانية)	Generic	N/A	إعدادات ثابتة عبر الجلسات
محطة عمل GPU من Nvidia	مخصص	N/A	الأجهزة اللازمة لتدريب النموذج/استنتاج
مقياس اللمعة	Generic	N/A	التحقق من الإضاءة على مستوى الساحة
PyTorch	Pytorch Foundation	N/A	إطار عمل مطلوب من DeepLabCut
ساحة مفتوحة من الأكريليك الشفاف (42 × 42 × 42 سم)	مصنوع حسب الطلب / داخلي	N/A	ساحة مفتوحة
حامل كاميرا تحت الساحة (عرض 90 درجة)	مصنوع حسب الطلب / داخلي	N/A	حامل مستقر للتسجيل السفلي
CUDA	Nvidia Corporation	N/A	المعالجة الموازية المتسارعة بـ GPU
لغة برمجة R	R Foundation	N/A	لغة برمجة لتحليل البيانات