يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول قابل للتكرار قائم على سيورات لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لخلايا الدم أحادية النواة CD4+ أثناء إعادة الإصابة بالملاريا

106 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70858

⸱

يوليو 31, 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا قابلا للتكرار قائم على سيورات لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من خلايا الدم أحادية النواة CD4⁺ T المحيطية لتوصيف التغاير النسخي والبرامج المناعية الوظيفية أثناء إعادة الإصابة بالملاريا. يتيح هذا البروتوكول التعرف المتسق والمقارنة والتفسير البيولوجي لحالات خلايا T الديناميكية في CD4⁺ والاستجابات المناعية عبر الحالات.

الملخص

هنا، نقدم بروتوكولا قابلا للتكرار قائم على Seurat لتحليل بيانات تسلسل RNA خلية T ذات الخلية المفردة في PBMC CD4⁺ عبر نقاط إعادة الإصابة بالملاريا. يوضح هذا البروتوكول سير عمل قابل للتكرار قائم على Seurat لتحليل بيانات الخلايا التائية في PCBMC CD4⁺ scRNA-seq عبر نقاط زمنية لإعادة الإصابة بالملاريا، باستخدام مجموعات بيانات ممثلة متاحة للجمهور لإثبات تطبيقه: GSE233703 مجموعة بيانات CD4⁺ معدلة وراثيا خاصة ببلازموديوم ومجموعة بيانات CD4⁺ متعددة النسيرات لخلايا T تقارن بين النقاط الزمنية المرتبطة بإعادة العدوى (GSE233713؛ D27₍₃₎ مقابل D30). يشمل سير العمل المعالجة المبدئية الموحدة، والتكامل، والتجميع، والتحليلات النصية اللاحقة ضمن إطار حسابي موحد. تمكن هذه الطريقة من الحساب المنهجي لدرجات الوحدات لبرامج المناعة المحددة مسبقا وخلايا CD4⁺ التائية، وتحديد جينات العلامات الخاصة بالعناقود، وتحليل التعبير التفاضلي بنقطة زمنية محددة، وإثراء مسار الأنطولوجيا الجينية وKEGG. تطبيق هذا السير يحدد الحالات الوظيفية المميزة لخلايا T في CD4⁺ ويكشف عن تغيرات نسخية ديناميكية عبر نقاط إعادة الإصابة بالملاريا. يولد البروتوكول مخرجات التصور الموحدة والنتائج المجمعة ويوفر إرشادات عملية حول اختيار المعلمات وحل المشكلة، مما يسهل التحليل المتسق والقابل للتكرار لمجموعات بيانات الخلايا التائية CD4⁺ في الملاريا والسياقات المناعية ذات الصلة. يتيح هذا البروتوكول تحليلا قابلا للتكرار والتفسير البيولوجي للاستجابات المناعية، ويمكن تطبيقه على مجموعات بيانات خلية واحدة مماثلة في الأبحاث المناعية.

المقدمة

لا تزال الملاريا عبئا صحيا عالميا كبيرا، حيث تشكل العدوى المتكررة مناعة المضيف بطرق معقدة وغير مفهومة بشكل كامل: 1. تلعب خلايا T في CD4⁺ دورا مركزيا في الاستجابات المناعية المضادة للملاريا من خلال تنسيق إنتاج الخلايا السيتوكينية الفعالة، ودعم مساعدة الخلايا البائية، وتنظيم الالتهاب2،3. خلال إعادة الإصابة بالملاريا، تخضع خلايا CD4⁺ T لإعادة برمجة نسخ ديناميكية، مما يعكس تحولات بين الحالات المؤثرة، والتنظيمية، والذاكرة، والتكاثر، والحالات المنهكة التي تؤثر على كل من التحكم في الطفيليات والمناعة المرضية 4,5. إن تحديد هذا التباين بدقة أمر ضروري لفهم الحماية المناعية، وضعف المناعة، ومدى استقرار المناعة المكتسبة طبيعيا أو الناتجة عن اللقاح ضد عدوى البلازموديوم. هنا، نقدم بروتوكولا مبنيا على سيورات قابل للتكرار لتحليل بيانات الخلايا التائية في CD4⁺ عبر نقاط إعادة الإصابة بالملاريا.

يتيح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) توصيفا عالي الدقة لتباين المناعة وقد حدد مجموعات فرعية من خلايا CD4⁺ تستجيب للطفيليات، وبرامج استنزاف، وشبكات تنظيمية في الملاريا 6,7,8,9. ومع ذلك، فإن التباين التحليلي في ضبط الجودة، والتطبيع، والتجميع، والتكامل يمكن أن يحد من قابلية التكرار ويعقد المقارنات بين الدراسات10،11. ومع ذلك، فإن هناك سير عمل موحد وموجه بيولوجيا محسن خصيصا لتحليل ديناميكيات خلايا T في CD4⁺ أثناء إعادة الإصابة بالملاريا، لا يوجد حال.

توفر الأطر الحسابية الحالية لتحليل scRNA-seq، بما في ذلك Seurat وScanpy، مجموعات أدوات شاملة للمعالجة المسبقة، والتجميع، وتفسير البيانات المفردة الخلية 12,13,14. يقدم Seurat، المنفذ بلغة R، سير عمل متكامل بشكل محكم للتطبيع، ودمج البيانات، والتصور، بما في ذلك طرق تثبيت التباين مثل SCTransform التي تحسن اكتشاف الإشارات في مجموعات البيانات المناعية غير المتجانسة13. يوفر Scanpy، المطبق بلغة بايثون، حلولا قابلة للتوسع محسنة لمجموعات البيانات الكبيرة واستخدام الذاكرة بكفاءة، مما يجعله مناسبا بشكل خاص للتحليلات عالية الإنتاجية أو السحابية12,14. رغم هذه التطورات، لا تزال هناك حاجة إلى سير عمل موحد وقابل للتكرار يعالج بشكل صريح الأسئلة البيولوجية في بيئات العدوى مع الحفاظ على الشفافية والقدرة على التكيف والاتساق عبر مجموعات البيانات. يعالج البروتوكول الحالي هذه الفجوة من خلال الجمع بين متانة المعالجة المبدئية القائمة على سورا والتفسير البيولوجي المنظم المصمم لاستجابة خلايا T ليوم CD4⁺ أثناء إعادة الإصابة بالملاريا. مقارنة بسير العمل العامة الحالية، يركز هذا البروتوكول على قابلية التكرار، واختيار المعلمات البيولوجية المستنير بيولوجيا، والتحليل المتسق عبر النقاط الزمنية المصمم خصيصا لنماذج العدوى.

ميزة رئيسية لهذا البروتوكول هي تركيزه على قابلية التكرار وسهولة الاستخدام العملي. عتبات مراقبة الجودة ليست ثابتة بل يتم اشتقاقها باستخدام أساليب تكيفية البيانات تعتمد على الانحراف المطلق الوسيط، مما يسمح بتوسيع عتبات تعقيد النص، عمق التسلسل، ومحتوى الميتوكوندريا مع توزيعات خاصة بمجموعة البيانات. يجعل هذا التصميم سير العمل قابلا للتطبيق عبر مجموعات بيانات بأحجام مختلفة، عادة ما تتراوح بين عدة آلاف إلى عشرات الآلاف من الخلايا، وعبر مجموعة واسعة من أعماق التسلسل التي تصادف عادة في تجارب scRNA-seq القائمة على القطرات. تدعم الإرشادات المدمجة في سير العمل اختيار المعلمات المناسبة لتقليل الأبعاد، وحل التجميع، والتكامل، مما يضمن بقاء التحليلات ذات معنى بيولوجي وقوية تقنيا. ومع ذلك، يعتمد سير العمل على جودة البيانات وعمق التسلسل وقد يتطلب تعديلا لمجموعات البيانات ذات التنوع الشديد أو تأثيرات الدفعات الشديدة.

تم تصميم هذا البروتوكول للمستخدمين المتوسطين والمتقدمين الذين لديهم معرفة أساسية بتحليل R وتحليل الخلايا الواحدة، مع البقاء متاحا للمبتدئين المتحمسين من خلال تنفيذه المنظم والخطوات والمخرجات القابلة لإعادة الإنتاج بالكامل. ينتج سير العمل جداول وأرقام موحدة في كل مرحلة، بما في ذلك ملخصات مراقبة الجودة، ومخرجات التجميع، ونتائج التعبير التفاضلي، وتحليلات الإثراء، مما يسهل الشفافية والتحقق وإعادة الاستخدام في سياقات التعاون أو الدراسات المتعددة. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للدراسات التي تحقق في التباين المناعي عبر الفترات الزمنية أو الظروف في أبحاث العدوى والمناعة.

توفر الطريقة سير عمل من البداية إلى النهاية من البداية إلى النهاية لتحليل scRNA-seq لخلايا CD4⁺ عبر نقاط إعادة الإصابة بالملاريا. يدمج التحكم في الجودة التكيفي، وتثبيت التباين، وتقليل الأبعاد، والتجميع، والتكامل متعدد العينات عند الاقتضاء13,15. لتعزيز قابلية التفسير البيولوجي، يتضمن سير العمل تقييم وحدات الجينات المناعية ومجموعة CD4⁺ من الخلايا التائية لقياس البرامج الوظيفية بما في ذلك Th1، Tfh، Tr1، Treg، الذاكرة المركزية، ذاكرة المؤثر، التكاثر، السمية الخلوية، والإرهاق16، 17، 18. تم تضمين تحديد علامات التجمعات التكميلية، وتحليل التعبير التفريقي في النقاط الزمنية، وإثراء المسارات باستخدام قواعد بيانات Gene Ontology وKEGG لدعم التعليقات التوضيحية والمقارنة القوية لحالات الخلايا التائية19,20. على الرغم من إثبات ذلك باستخدام مجموعات بيانات Plasmodium scRNA-seq المتاحة للجمهور، إلا أن هذا البروتوكول قابل للتطبيق بشكل واسع على نماذج إعادة الإصابة بالملاريا الأخرى والاضطرابات المناعية حيث يتطلب الأمر تحليلا قابلا للتكرار والتفسير لخلايا CD4⁺ T على خلية واحدة. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول إطارا قابلا للتكرار وقابلا للتفسير البيولوجي لتحليل الخلايا المفردة لاستجابات خلايا T في CD4⁺، مما يدعم التحقيق القوي في ديناميكيات المناعة في الملاريا والأنظمة ذات الصلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاقيات:

تم الحصول على جميع البيانات المستخدمة في هذه الدراسة من مجموعات بيانات متاحة للجمهور (GSE233703 GSE233713). امتثلت الدراسات الأصلية للإرشادات المؤسسية والأخلاقية للتجارب على الحيوانات. شملت هذه الدراسة تحليلا ثانويا للمعلوماتية الحيوية لمجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المتاحة وغير المحددة للجمهور، والتي تم الحصول عليها من مستودع التعبير الجيني (GEO) (GSE233703 و GSE233713). لم يشارك أي مشاركين بشريين جدد، أو عينات سريرية، أو معلومات مرضى قابلة للتعرف عليها في هذه الدراسة. وفقا للإرشادات المؤسسية والوطنية للأبحاث المتعلقة بمجموعات بيانات مجهولة الهوية متاحة للجمهور، لم تكن هناك حاجة إلى موافقة أخلاقية إضافية وموافقة مستنيرة لهذا التحليل المعلوماتي الحيوي. أجريت الدراسات الأصلية المرتبطة بهذه البيانات وفقا للمعايير الأخلاقية المؤسسية ذات الصلة والإرشادات المعمول بها للأبحاث الطبية الحيوية.

1. سير عمل تحليل scRNA-seq المبني على CD4⁺ T المعتمد على Seurat القابل للتكرار ل GSE233703 و GSE233713

ملاحظة: يتم توفير هذا سير العمل كملف تكميلي S1. كما يمكنك الرجوع إلى مخطط يقدم نظرة عامة على سير العمل بالكامل (الشكل 1).

  1. حدد النطاق والمستخدمين المستهدفين قبل بدء البروتوكول
  2. تعريف المستخدمين المستهدفين
    1. استخدم هذا البروتوكول إذا كان المستخدم لديه معرفة متوسطة إلى متقدمة بتحليل تسلسل RNA الخلية والخلية المفردة (scRNA-seq).
    2. طبق هذا سير العمل على مجموعات بيانات الخلايا التائية CD4⁺ في طحال الفأر المولدة بصيغة مصفوفة بنمط 10x. استخدم الهيكل التدريجي والمخرجات المتوقعة للتحقق من كل مرحلة قبل المضي قدما.
      ملاحظة: تأكد من ممارسات التعامل المناسبة مع البيانات والتخزين الآمن عند العمل مع مجموعات بيانات تسلسل كبيرة.
  3. تعريف scRNA-seq
    1. تعامل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) كطريقة نسخية²¹ تقيس تعبير الجينات في الخلايا الفردية.
    2. استخدم scRNA-seq لتحديد الحالات الخلوية المنفصلة، والتجمعات الانتقالية، وبرامج المناعة غير المتجانسة داخل الأنسجة المعقدة.
  4. إعداد متطلبات البرمجيات والحزم
  5. تثبيت البرامج الأساسية
    1. قم بتثبيت R 4.2 أو أحدث.
    2. افتح واجهة RStudio. قم بتعيين الدليل العامل باستخدام setwd().
    3. نفذ السكريبتات بشكل متسلسل باستخدام دالة المصدر(). سجل النسخ الدقيقة ل R وRStudio ونظام التشغيل في ملاحظات المشروع.
  6. تثبيت حزم R
    1. قم بتثبيت حزم CRAN المطلوبة: Seurat، Matrix، tidyverse، patchwork، pheatmap، RColorBrewer، cluster، glmGamPoi، و ggplot2.
    2. قم بتثبيت حزم Bioconductor المطلوبة: clusterProfiler, org. Mm.eg.db، enrichplot، و DESeq2.
    3. قم بتثبيت الحزم الاختيارية فقط إذا لزم الأمر: DoubletFinder لإزالة الدوبلت ومونوكلي3 لتحليل المسار. قم بتحميل جميع الحزم المطلوبة في بداية جلسة التحليل.
  7. نسخ التسجيل
    1. احفظ معلومات الحزمة والجلسة في نهاية سير العمل باستخدام sessionInfo() أو دالة مكافئة.
    2. أبلغ عن مكونات التحليل الرئيسية بشكل صريح في المخطوطة، بما في ذلك نسخة R، نسخة Seurat، نسخة DESeq2، ونسخة clusterProfiler.
  8. تشغيل أوامر التثبيت المذكورة في الملف التكميلي 2
  9. تأكيد متطلبات الأجهزة والتخزين
  10. تأكيد الحد الأدنى من الموارد
    1. استخدم محطة عمل تحتوي على ذاكرة لا تقل عن 16 جيجابايت، و4 أنوية معالج، ومساحة قرص حرة 20 جيجابايت لتحليل المجموعات الروتينية لمجموعات البيانات التي تحتوي على عدة آلاف إلى عشرات الآلاف من الخلايا.
  11. تأكيد المصادر الموصى بها
    1. استخدم ذاكرة RAM بسعة 32 جيجابايت أو أكثر للتحليلات المتكاملة، أو الرسم المتكرر، أو الكشف الاختياري باستخدام الدوبلت.
    2. قم بزيادة future.globals.maxSize إذا كانت الكائنات الكبيرة أو مجموعات البيانات المدمجة تنتج أخطاء متعلقة بالذاكرة.
    3. تطبيق إعداد الذاكرة النموذجي
  12. شغل الأوامر التالية لتعيين خيارات الذاكرة المذكورة في الملف التكميلي 2

2. إنشاء هيكل المشروع

  1. إنشاء دليل المشروع الجذري
    1. أنشئ دليل مشروع للتحليل.
    2. أنشئ أدلة فرعية باسم data/، scripts/، و results_spleen_cd4/.
  2. استخدم هيكل الإخراج الموحد
    1. تأكد من أن سير العمل يكتب المخرجات إلى الأدلة التالية:
      results_spleen_cd4/GSE233703/fig/
      results_spleen_cd4/GSE233703/جداول/
      results_spleen_cd4/GSE233703/rds/
      results_spleen_cd4/GSE233713/fig/
      results_spleen_cd4/GSE233713/جداول/
      results_spleen_cd4/GSE233713/rds/
      results_spleen_cd4/post_markers/
  3. استخدم تسمية الملفات المتسقة
    1. أعد تسمية ملفات إدخال GEO لتطابق المسارات المتوقعة من قبل السكريبت.
    2. استخدم أسماء الملفات الدقيقة التالية:
      البيانات/GSE233703_matrix.mtx.gz
      البيانات/GSE233703_genes.tsv.gz
      البيانات/GSE233703_barcodes.tsv.gz
      البيانات/GSE233713_d27_3_matrix.mtx.gz
      البيانات/GSE233713_d27_3_features.tsv.gz
      البيانات/GSE233713_d27_3_barcodes.tsv.gz
      البيانات/GSE233713_d30_matrix.mtx.gz
      البيانات/GSE233713_d30_features.tsv.gz
      البيانات/GSE233713_d30_barcodes.tsv.gz
    3. قم بتسمية ملفات البيانات الوصفية الاختيارية كما يلي:
      البيانات/GSE233703_cell_metadata.csv
      البيانات/GSE233713_cell_metadata.csv
  4. تأكيد متطلبات البيانات الوصفية
    1. تأكد من أن كل ملف بيانات وصفية يحتوي على عمود باركود. أضف أعمدة اختيارية مثل العينة، النقطة الزمنية، وقم بتكرارها عندما توفر.
    2. استخدم مطابقات الباركود الدقيقة بين مصفوفات البيانات الوصفية والعداد.
      تحذير: تأكد من وجود ثلاثيات المصفوفة وملفات البيانات الوصفية عند المسارات المتوقعة قبل بدء الاستيراد.


3. استيراد مصفوفات العد والتحقق من سلامة الإدخال




    
	
  1. اقرأ مصفوفات بنمط 10x
      
		
    1. اقرأ كل ملف matrix.mtx.gz كمصفوفة متفرقة.
      2. 
		
    2. اقرأ ملف الميزات (أو الجينات) المقابلة وملف الباركود كجداول محددة بعلامات تبويب.
      3. 
		
    3. تعيين رموز الجينات لصفوف المصفوفة باستخدام العمود الثاني من ملف الميزات عند توفرها. فرض رموز جينية فريدة باستخدام make.unique().
      4. 
		
    4. تعيين معرفات الباركود لأعمدة المصفوفة.'
      5. 
	
    
	
    2. 
	
  2. تشغيل دالة استيراد مثال
      
		
    1. نفذ الكود المذكور في الملف التكميلي 2، لاستيراد المصفوفة وتعيين المعرفات.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. التحقق من سلامة المصفوفة
      
		
    1. تحقق من أن عدد صفوف المصفوفة يساوي عدد الميزات. تحقق من أن عدد أعمدة المصفوفة يساوي عدد الباركود.
      2. 
		
    2. أوقف سير العمل إذا تم اكتشاف أي عدم تطابق.
      ملاحظة: إذا تم اكتشاف عدم تطابقات، تحقق من سلامة الملف وتأكد من محاذاة الملفات الصحيحة بين ميزات وملفات الباركود قبل إعادة تشغيل الخطوة.
      نقطة التحقق: تابع فقط إذا تطابق عدد الصفوف الميزات وعدد الأعمدة يتطابق مع الباركود.
      3. 
	
    
	
    4. 





4. تعريف لوحات العلامات والوحدات




    
	
  1. تعريف لوحات خلايا T ذات الصلة بالملاريا CD4⁺
      
		
    1. حدد لوحات جينية مسماة ل: Th1، Tfh، Tr1، Treg، Tcm، Tem، الإرهاق، الانتشار، السموم الخلوي، Activation_early، Interferon_response، Immune_regulation
      2. 
		
    2. احتفظ بهذه اللوحات في قائمة R مسماة لتقييم الوحدات لاحقا.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. شغل رمز R المذكور في الملف التكميلي 2 لتعريف لوحات الجينات.
    3. 
	
  3. تعريف جينات التحقق من العلامات
      
		
    1. حدد لوحة تحقق منفصلة تحتوي على جينات علامات قانونية مثل Foxp3، Bcl6، Cxcr5، Il21، Ifng، Ctla4، Pdcd1، Lag3، Tbx21، Tcf7، و Lef1.
      2. 
	
    
	
    4. 



5. إنشاء كائنات Seurat وحساب مقاييس مراقبة الجودة




    
	
  1. تهيئة كائنات سورا
      
		
    1. أنشئ كائن Seurat لكل مجموعة بيانات باستخدام min.cells = 3 و min.features = 0. لا تفرض حواشا تعسفية على الميزات عند الاستيراد.
      2. 
		
    2. أضف بيانات بيانات بيانات، عينات، وبيانات النقطة الزمنية. دمج البيانات الوصفية الاختيارية باستخدام مطابقة الباركود.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. تشغيل مثال لتهيئة كائن Seurat
      
		
    1. نفذ رمز R المذكور في الملف الإضافي 2 لإنشاء كائن Seurat وتعيين بيانات وصفية.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. حساب مقاييس مراقبة الجودة
      
		
    1. احسب نسبة النسخ الميتوكوندرية باستخدام بادئة الفأر ^mt-.
      2. 
		
    2. قم بقياس المقاييس التالية
      nFeature_RNA
      nCount_RNA
      percent.mt
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. شغل الكود المثال المذكور في الملف الإضافي 2.
    5. 
	
  5. تصور مراقبة جودة ما قبل التصفية
      
		
    1. أنشئ مخططات الكمان ل nFeature_RNA و nCount_RNA و percent.mt. أنشئ مخططات تشتت الميزات ل nCount_RNA مقابل nFeature_RNA و nCount_RNA مقابل percent.mt.
      2. 
		
    2. احفظ أرقام التصفية المسبقة باستخدام أسماء موحدة مثل QC_pre_filter_AllCells_vln.png و QC_pre_filter_AllCells_scatter.png.
      تحذير: توقع توزيعات واسعة للمرشح المسبق مع ذيول منخفضة الجودة وربما وجود نقاط شاذة ذات عدد مرتفع.
      3. 
	
    
	
    6. 



6. اشتقاق عتبات QC التكيفية وتصفية الخلايا منخفضة الجودة


    
	
  1. اشتقاق عتبات خاصة بمجموعة البيانات
      
		
    1. تحويل لوغاريتيم nFeature_RNA + 1 و nCount_RNA + 1. احسب الانحراف المطلق الوسيط والوسيط (MAD) لكلا المتغيرين المحولين.
      2. 
		
    2. حدد العتبات التالية:
      min_features = 10^(الوسيط - 3 × MAD) - 1
      max_features = 10^(الوسيط + 3 × MAD) - 1
      min_counts = 10^(الوسيط - 3 × MAD) - 1
      max_counts = 10^(الوسيط + 3 × MAD) – 1
      3. 
		
    3. عرف عتبة الميتوكوندريا بأنها النسبة المئوية 95 من percent.mt زائد 3 × MAD، مقيدة بين 5٪ و20٪.
      4. 
		
    4. تأكد من تحديد dataset_id و sample_id و out_dir بشكل صحيح قبل تشغيل الدالة.
      qc_thr <- derive_qc_thresholds(seu, dataset_id = "GSE233703"، sample_id = "AllCells"، out_dir = "results_spleen_cd4/GSE233703")
      5. 
	
    
	
    2. 
	
  2. تطبيق الترشيح
      
		
    1. الاحتفاظ بالخلايا التي تستوفي جميع المعايير التكيفية:
      nFeature_RNA >= min_features
      nFeature_RNA <= max_features
      nCount_RNA >= min_counts
      nCount_RNA <= max_counts
      percent.mt <= max_percent_mt
      2. 
		
    2. شغل الكود المثال المذكور في الملف الإضافي 2.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. حفظ مخرجات التصفية
      
		
    1. حفظ QC_thresholds_*.csv و cell_counts_summary_*.csv.
      نقطة التوقف: حفظ المخرجات الوسيطة واستأنف التحليل من هذه الخطوة إذا لزم الأمر.
      2. 
		
    2. قم بإنشاء وحفظ مخططات الكمان والكمان بعد التصفية.
      نقطة التفتيش: توقع توزيعات أكثر إحكاما بعد التصفية، وإزالة الخلايا منخفضة التعقيد، وتقليل المؤشرات الشذوذة المتطرفة.
      3. 
	
    
	
    4. 



7. تطبيع البيانات وأداء تحليل PCA


    
	
  1. التطبيع والاستقرار التبايني
      
		
    1. تطبيع اختبار الحمض النووي الريبي قبل تسجيل النقاط على مدار دورة الخلية. قم بتشغيل التسجيل بدورة الخلايا إذا كان ذلك مفعلا. استخدم SCTransform() لتثبيت التباين.
      2. 
		
    2. تراجع محتوى الميتوكوندريا فقط إذا كان مبررا بيولوجيا وممهما بشكل صريح.
      3. 
		
    3. يتم تراجع درجات دورة الخلية فقط إذا كان ذلك مطلوبا لتصميم الدراسة.
      4. 
	
    
	
    2. 
	
  2. قم بتشغيل مثال التطبيع كما هو مذكور في الملف التكميلي 2.
    3. 
	
  3. تعريف قيم المعاملات
      
		
    1. استخدم n_variable_features = 3000.
      2. 
		
    2. استخدم dims_max_for_pca = 50.
      3. 
		
    3. اذكر هذه القيم صراحة في المخطوطة.
      4. 
	
    
	
    4. 
	
  4. شغل PCA واختيار المكونات الرئيسية
      
		
    1. شغل PCA على الفحص الطبيعي. تأكد من تنفيذ PCA بنجاح من خلال فحص التباين المفسر وتحميل المكونات الرئيسية.
      2. 
		
    2. تباين الحساب مفسر بواسطة كل مكون رئيسي.
      3. 
	
    
	
    5. 
	
  5. اختر الشخصيات باستخدام جميع المعايير الثلاثة:
      
		
    1. احتفظ بأجهزة الكمبيوتر التي تشرح تباين بنسبة لا تقل عن 1٪ على الأقل،
      2. 
		
    2. تأكد من أن التباين التراكمي يصل إلى حوالي 80٪،
      3. 
		
    3. قيد الاختيار النهائي بين 10 و40 شخصيا.
      4. 
		
    4. أحفظ PCA_variance_table_*.csv، PCA_selection_rationale_*.csv، و PCA_Elbow_*.png.
      5. 
	
    
	
    6. 
	
  6. تشغيل مثال PCA
      
		
    1. مثال كما ذكر في الملف التكميلي 2.
      نقطة التفتيش: توقع رسم الكوع مع انخفاض واضح في زيادة التباين الهامشي بعد الحد المحدد.
      2. 
	
    
	
    7. 

















8. بناء الجوار، اختيار الدقة، وجمع الخلايا العنكبوتية


    
	
  1. بناء هيكل الرسم البياني
      
		
    1. قم بإنشاء رسم بياني مشترك لأقرب جار باستخدام أجهزة الكمبيوتر المختارة.
      2. 
		
    2. قم بتشغيل تجميع أولي منخفض الدقة إذا كان اكتشاف المزدوج يتطلب تسميات العنقود.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. إزالة السترات المزدوجة اختياريا
      
		
    1. شغل DoubletFinder فقط إذا كان مثبتا ومتوافقا.
      ملاحظة: قم باكتشاف الدوبلت فقط لمجموعات البيانات ذات عدد الخلايا العالي حيث يتوقع حدوث تشوهات متعددة العدد.
      2. 
		
    2. أعد حساب التطبيع وتحليل PCA بعد إزالة الدوبلت.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. اختر دقة التجميع
      
		
    1. قيم القرارات 0.2، 0.4، 0.6، 0.8، 1.0، و1.2.8.3.2
      2. 
		
    2. احسب متوسط عرض الظل لكل دقة مختبرة. اختر الدقة التي حصلت على أعلى درجة ظلال بين الحلول التي تحتوي على مجموعتين على الأقل.
      3. 
		
    3. أحفظ resolution_sweep_*.csv، resolution_selection_rationale_*.csv، و resolution_sweep_*.png.
      4. 
	
    
	
    4. 
	
  4. قم بتشغيل اختيار الحل النموذجي عن طريق تنفيذ الكود المذكور في الملف التكميلي 2
    5. 
	
  5. شغل UMAP والتجميع النهائي.
      
		
    1. شغل UMAP باستخدام أجهزة الكمبيوتر المختارة.
      2. 
		
    2. أعد بناء رسم بياني أقرب جار. تجميع الخلايا باستخدام الدقة المختارة.
      3. 
		
    3. حفظ مخططات UMAP الموسومة بالعنقود ومجمعة حسب العينة أو النقطة الزمنية. نفذ الكود التالي المذكور في الملف التكميلي 2.
      تحذير: توقع انفصالا مستقرا للعناقيد وبنية UMAP قابلة للتفسير تتوافق مع الحالات المناعية الرئيسية.
      4. 
	
    
	
    6. 



9. تنفيذ التكامل القائم على SCT ل GSE233713


    
	
  1. تحضير أشياء منفصلة
      
		
    1. أنشئ كائنات Seurat منفصلة ل D27_3 و D30.
      2. 
		
    2. تطبيق مراقبة الجودة والتصفية بشكل مستقل على كل عينة. تطبيع كل عينة بشكل منفصل باستخدام SCTransform().
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Justify integration
      
		
    1. استخدم التكامل القائم على SCT لتقليل الفروق التقنية بين النقاط الزمنية مع الحفاظ على البنية البيولوجية المشتركة.
      2. 
		
    2. لا تفترض أن الدمج مفيد تلقائيا. أكد ذلك بشكل صريح.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. دمج العينات
      
		
    1. اختر ميزات التكامل باستخدام SelectIntegrationFeatures(). جهز الكائنات باستخدام PrepSCTIntegration().
      2. 
		
    2. ابحث عن المراسي باستخدام FindIntegrationAnchors (normalization.method = "SCT"). دمج مجموعات البيانات مع IntegrateData(normalization.method = "SCT").
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. قم بتشغيل التكامل النموذجي المذكور في الملف التكميلي 2
    5. 
	
  5. التحقق من صحة التكامل
      
		
    1. إنشاء مخططات UMAP قبل وبعد التكامل مجمعة حسب النقطة الزمنية. تفسير تحسين اختلاط الخلايا عبر النقاط الزمنية كدليل على نجاح التكامل.
      2. 
		
    2. احسب مزج الجيران قبل وبعد التكامل. احسب تركيب المجموعات حسب النقطة الزمنية وأنشئ مخططات التركيب المكدسة.
      3. 
		
    3. احفظ المخرجات التالية:
      UMAP_preintegration_*
      UMAP_postintegration_*
      integration_diagnostics_*
      cluster_timepoint_composition_*
      تحذير: توقع انفصالا في نقاط الزمن أقل بعد التكامل، وزيادة اختلاط الجيران، ومساهمة متعددة النقاط الزمنية لمعظم التجمعات دون فقدان كامل للبنية البيولوجية ذات المعنى البيولوجي.
      4. 
	
    
	
    6. 



10. توضيح المجموعات والتحقق من بنية العلامات




    
	
  1. تقييم الوحدات ذات الصلة بالملاريا
      
		
    1. شغل AddModuleScore() للوحات خلايا T المحددة مسبقا للملاريا CD4⁺.
      2. 
		
    2. حفظ وسائل الوحدات على مستوى العنقود وتصنيفات الوحدات.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. شغل مثال على تقييم الوحدات المذكور في الملف التكميلي 2
    3. 
	
  3. تعيين تسميات التجمعات المتوقعة
      
		
    1. تعيين الوحدة الأعلى ترتيبا لكل عنقود كعلامة متوقعة.
      2. 
		
    2. حفظ:
      cluster_module_score_means_*
      cluster_module_score_rankings_*
      cluster_predicted_labels_*
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. التحقق من صحة المجموعات باستخدام العلامات القانونية
      
		
    1. قم بتشغيل التحقق من العلامات باستخدام لوحة العلامات الرسمية.
      2. 
		
    2. حفظ:
      DotPlot_marker_validation_*
      FeaturePlot_marker_validation_*
      تحذير: توقع تعبيرا متوافقا لعدة جينات قانونية في حالة وظيفية، وليس إشارات جينية معزولة.
      3. 
	
    
	
    5. 



11. تحديد العلامات وأداء التعبيرات التفاضلية.




    
	
  1. ابحث عن علامات التجمع
      
		
    1. شغل FindAllMarkers() باستخدام العلامات الإيجابية فقط.
      2. 
		
    2. أحفظ markers_all_clusters_*.csv.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. نفذ الكود المذكور في الملف التكميلي لتشغيل تحديد العلامة النموذجية
    3. 
	
  3. استخدم التعبير التفاضلي الواعي بالتكرار عندما يكون متاحا
      
		
    1. تحقق مما إذا كانت البيانات الوصفية المكررة الصحيحة متاحة. إذا كانت النسخ مكررة متاحة، قم بإجراء عدد مجمعي لكل نسخة وحالة وتشغيل DE شبه حجمي مع DESeq2.
      2. 
		
    2. أحفظ DE_pseudobulk_*.
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. استخدم التعبير التفاضلي الاستكشافي على مستوى الخلية عندما تكون النسخ غير موجودة
      
		
    1. إذا كانت البيانات الوصفية المكررة غائبة أو غير كافية، قم بتشغيل DE خلية واحدة كتحليل استكشافي.
      2. 
		
    2. احفظ DE_WARNING_* لتوثيق الحالة الاستكشافية. احفظ النتائج الاستكشافية ك DE_exploratory_celllevel_*.
      3. 
	
    
	
    5. 
	
  5. توليد مخرجات تعبيرات تفاضلية عالمية
      
		
    1. أنشئ مخططات بركانية لنتائج DE واحفظ Volcano_*.
      2. 
		
    2. حفظ نتائج معادلة مهمة كجداول مفلترة.
      3. 
	
    
	
    6. 
	
  6. توليد مخرجات إثراء الوظائف
      
		
    1. شغل عملية إثراء العمليات البيولوجية GO واحفظ GO_BP_*. شغل إثراء KEGG واحفظ KEGG_*.
      2. 
		
    2. شغل GSEA باستخدام تغييرات السجل المصنف 2 واحفظ GSEA_GO_*. احفظ المخطط الشريطي والنقاط المقابلة.
      3. 
	
    
	
    7. 
	
  7. توليد مخرجات تعبيرات تفاضلية خاصة بالعناقيد
      
		
    1. شغل DE داخل كل مجموعة بين النقاط الزمنية.
      2. 
		
    2. أفرغ DE_cluster_* و DE_cluster_specific_combined_*.
      3. 
	
    
	
    8. 
	
  8. توليد مخرجات تعبير تفاضلي تركز على المناعة
      
		
    1. استخلاص نتائج DE لجينات مناعية مختارة مثل Ifng، Cxcl10، Ctla4، Il10، Foxp3، Bcl6، Cxcr5، Pdcd1، Lag3، Havcr2، Il21، وTbx21.
      2. 
		
    2. أحفظ DE_immune_focus_*.
      3. 
		
    3. قم بتوليد وحفظ المخرجات التالية:
      DotPlot_selected_genes_by_timepoint_*
      Heatmap_immune_focus_*
      تحذير: توقع تناسقا بين التحليل المعادل العالمي، ومخرجات الإثراء، والمصادر الدقيقة الخاصة بالعناصر، والتواقيع التي تركز على المناعة.
      4. 
	
    
	
    9. 









12. حفظ المخرجات النهائية وأرشفة الجلسة


    
	
  1. حفظ أشياء سورا
      
		
    1. احفظ كائنات Seurat النهائية بصيغة .rds لكل مجموعة بيانات.
      2. 
	
    
	
    2. 
	
  2. حفظ معلومات الجلسة
      
		
    1. اكتب sessionInfo() إلى ملف نصي في مجلد الإخراج.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. نفذ الكود المذكور في الملف التكميلي 2 لتشغيل تصدير الجلسة النموذجية
    4. 
	
  4. تحقق من اكتمال الإخراج
      
		
    1. تأكد من أن الأدلة المتوقعة تحتوي على الملفات المقابلة.
      2. 
		
    2. أرشفت السكريبتات ومعلومات الجلسة والمخرجات معا.
      تحذير: لا تتابع كتابة التقارير حتى تكون ملخصات مراقبة الجودة، ومخرجات PCA، ومخرجات اختيار الدقة، وتشخيصات التكامل، وملفات التعليقات التوضيحية للوحدات، ومخرجات DE، وملفات الإثراء كلها موجودة ومتسقة داخليا.
      3. 
	
    
	
    5. 











الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
جودة التسلسل ومراقبة جودة على مستوى الخلايا (خلايا CD4⁺ T التحويلية للمستضدات الخاصة بالمستضدات (تفاعلية مع PcAS) وTCR متحول وراثيا CD4⁺ (GSE233703))


أظهرت توزيعات QC قبل التصفية (الشكل 2A) تعقيد نسخ غير متجانس، حيث أظهرت معظم الخلايا عددا معتدلا من الجينات والوحدة العضلية المربعة، بينما أظهرت مجموعة أصغر ملفات تعريف شذوذ عالية تتوافق مع التعدديات المحتملة. أظهرت مخططات التشتت (الشكل 2B
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه الدراسة سير عمل موحد وقابل للتكرار قائم على سيورات لتحليل ديناميكيات نسخ خلايا T في CD4⁺ أثناء إعادة الإصابة بالملاريا. يدمج البروتوكول التحكم في الجودة التكيفي، والتطبيع، وتقليل الأبعاد، والتجميع، وتكامل مجموعات البيانات، والتحقق من صحة العلامات، وتقييم الوحدات، وتحليل التعبيرات التفاضلية ضمن إطار حسابي موحد. معا، مكنت هذه الخطوات التحليلية من التعرف والتفسير القابل للتكرار لحالات خلايا T ذات المعنى البيولوجي في CD4⁺ عبر مجموعات بيانات خاصة ومتعددة النسيرات 13,14,15.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Name of Material / EquipmentCompany / SourceCatalog NumberComments / Description
10x Genomics–formatted count matricesNCBI GEON/AMatrix Market files (matrix.mtx, features.tsv, barcodes.tsv)
clusterProfiler (R package)BioconductorN/ARRID:SCR_016884; Functional enrichment analysis (GO, KEGG)
enrichplot (R package)BioconductorN/ARRID:SCR_017030; Visualization of enrichment analysis results
GEO Dataset GSE233703NCBI Gene Expression OmnibusGSE233703PcAS-specific TCR-transgenic CD4+ T-cell scRNA-seq dataset
GEO Dataset GSE233713NCBI Gene Expression OmnibusGSE233713Polyclonal CD4+ T-cell scRNA-seq dataset (D273 vs D30)
GitHub (optional)GitHub Inc.N/ARRID:SCR_002630; Version control and reproducibility (optional)
glmGamPoi (R package)BioconductorN/ARRID:SCR_021001; Accelerated SCTransform model fitting
Matrix (R package)CRANN/ARRID:SCR_008389; Sparse matrix handling for scRNA-seq data
Operating systemMicrosoft / Apple / LinuxN/AWindows 10+, macOS, or Linux supported
org.Mm.eg.db (R package)BioconductorN/ARRID:SCR_002643; Mouse gene annotation database
patchwork (R package)CRANN/ARRID:SCR_018787; Multi-panel figure assembly
PDF viewerAnyN/AViewing QC plots, UMAPs, and heatmaps
Personal computer or workstationAnyN/AMinimum 16–32 GB RAM recommended for integration
pheatmap (R package)CRANN/ARRID:SCR_016418; Heatmap visualization of gene expression
R Statistical Software (version ≥ 4.2)R Foundation for Statistical ComputingN/ARRID:SCR_001905; Core computational environment
RStudio DesktopPosit SoftwareN/ARRID:SCR_000432; Integrated development environment for R
Seurat (R package, v4 or later)Satija LabN/ARRID:SCR_016341; Single-cell RNA-seq analysis
tidyverse (R package suite)CRANN/ARRID:SCR_019186; Data manipulation and visualization
المراجع
    
	
  1. World Health Organization. WHO malaria policy advisory group (MPAG) meeting report, 18–20 April 2023. Geneva: World Health Organization; 2023.
    2. 
	
  2. Stevenson MM, Riley EM. Innate immunity to malaria. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):169-80.
    3. 
	
  3. Langhorne J, Ndungu FM, Sponaas AM, Marsh K. Immunity to malaria: more questions than answers. Nat Immunol. 2008;9(7):725-32.
    4. 
	
  4. Perez-Mazliah D, Langhorne J. CD4 T-cell subsets in malaria: TH1/TH2 revisited. Front Immunol. 2015;5:671.
    5. 
	
  5. Illingworth J, et al. Chronic exposure to Plasmodium falciparum is associated with phenotypic evidence of B and T cell exhaustion. J Immunol. 2013;190(3):1038-47.
    6. 
	
  6. Tang F, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009;6(5):377-82.
    7. 
	
  7. Lönnberg T, et al. Single-cell RNA-seq and computational analysis using temporal mixture modeling resolves TH1/TFH fate bifurcation in malaria. Sci Immunol. 2017;2(9):eaal2192.
    8. 
	
  8. Butler NS, et al. Therapeutic blockade of PD-L1 and LAG-3 rapidly clears established blood-stage Plasmodium infection. Nat Immunol. 2012;13(2):188-95.
    9. 
	
  9. Soon MS, Haque A. Recent insights into CD4+ Th cell differentiation in malaria. J Immunol. 2018;200(6):1965-75.
    10. 
	
  10. Slovin S, et al. Single-cell RNA sequencing analysis: a step-by-step overview. RNA Bioinformatics. 2021:343-65.
    11. 
	
  11. Vieth B, Parekh S, Ziegenhain C, Enard W, Hellmann I. A systematic evaluation of single cell RNA-seq analysis pipelines. Nat Commun. 2019;10(1):4667.
    12. 
	
  12. Wolf FA, Angerer P, Theis FJ. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 2018;19(1):15.
    13. 
	
  13. Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019;20(1):296.
    14. 
	
  14. Stuart T, et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 2019;177(7):1888-902.
    15. 
	
  15. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol. 2015;33(5):495-502.
    16. 
	
  16. Crotty S. T follicular helper cell differentiation, function, and roles in disease. Immunity. 2014;41(4):529-42.
    17. 
	
  17. Wherry EJ, Kurachi M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 2015;15(8):486-99.
    18. 
	
  18. Belkaid Y, Rouse BT. Natural regulatory T cells in infectious disease. Nat Immunol. 2005;6(4):353-60.
    19. 
	
  19. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
    20. 
	
  20. Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
    21. 
	
  21. Gulati GS, et al. Profiling cell identity and tissue architecture with single-cell and spatial transcriptomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26(1):11-31.
    22. 
	
  22. Schofield L, Grau GE. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 2005;5(9):722-35.
    23. 
	
  23. Plebanski M, Hill AV. The immunology of malaria infection. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):437-41.
    24. 
	
  24. Crotty S. T follicular helper cell biology: a decade of discovery and diseases. Immunity. 2019;50(5):1132-48.
    25. 
	
  25. Vinuesa CG, Linterman MA, Yu D, MacLennan IC. Follicular helper T cells. Annu Rev Immunol. 2016;34:335-68.
    26. 
	
  26. Wherry EJ. T cell exhaustion. Nat Immunol. 2011;12(6):492-9.
    27. 
	
  27. Maizels RM, Smith KA. Regulatory T cells in infection. Adv Immunol. 2011;112:73-136.
    28. 
	
  28. Choudhary S, Satija R. Comparison and evaluation of statistical error models for scRNA-seq. Genome Biol. 2022;23(1):27.
    29. 
	
  29. Li M, et al. Rediscovering publicly available single-cell data with the DISCO platform. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D932-8.
    30. 
	
  30. Islam MT, Xing L. Cartography of genomic interactions enables deep analysis of single-cell expression data. Nat Commun. 2023;14(1):679.
    31. 
	
  31. Luecken MD, Theis FJ. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 2019;15(6):e8746.
    32. 

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
علم المناعة والعدوىالعدد 233العدد 233قيمة فارغةعددتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخليةالخلايا الوحيدة النواة في الدم المحيطيالتكامل الترانسكريبتوميتسجيل درجة الوحدة المناعية
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة
الخصوصية
شروط الاستخدام
السياسات
حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.