جهاز تحميل الضغط العالمي لتصوير الخلايا الحية تحت ضغط ميكانيكي فسيولوجي مستمر

Summary

جهاز تحميل الضغط الموصوف هنا يتيح التصوير البصري بتقنية التايم لابس للخلايا المزروعة، وهو متوافق مع أطباق زراعة الخلايا القياسية والمجاهر المقلوبة. باستخدام هذا الجهاز، تم تأكيد أن بيئة الضغط الهيدروستاتيكي للورم تعزز نقل إشارة الكالسيوم، مما يوفر منصة عملية لدراسة نقل الإشارة الميكانيكية في البيئة الدقيقة للورم.

Abstract

يصف هذا البروتوكول جهاز تحميل الضغط الهيدروستاتيكي الذي يسهل الملاحظة المجهرية في الوقت الحقيقي للخلايا الملتصقة أثناء التحفيز المستمر للضغط الهيدروستاتيكي، وهو متوافق مع أطباق زراعة الخلايا التجارية بقطر 3.5 سم. يتكون الجهاز من غرفة زراعة محكمة الإغلاق مصنوعة من قاعدة من الألمنيوم، وغطاء شفاف بصريا من البولي (ميثيل ميثاكرولات)، ومنافذ مدخل/مخرج غاز مدمجة في الغطاء، ونافذة مراقبة محكمة الإغلاق. من خلال الاتصال بمصدر غاز منظم، يحافظ الجهاز على ضغط هيدروستاتيكي مستقر (0–200 كيلو باسكال، قابل للتعديل) مع تمكين التصوير المستمر بتباين الطور أو الفلورة. باستخدام هذا الجهاز الذي يحمل الضغط، يمكن تسجيل التأثيرات المعتمدة على الجرعة الناتجة عن الضغط على نمط الخلية وسلوكياتها مثل الشكل والتكاثر والهجرة. علاوة على ذلك، يمكن أيضا تسجيل إشارات الفلورسنت في الوقت الحقيقي. هنا، تم ملاحظة وقياس الإشارات Ca^2⁺ التي تثبت بالضغط وتباين وديناميكيات خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 وخلايا HeLa في سرطان عنق الرحم بواسطة المجهر الفلوري المقلوب باستخدام التصوير السريع السري. تدمج هذه المنصة التحميل الميكانيكي مع التصوير بالخلايا الحية لتجاوز قيود أنظمة النهاية التقليدية، مما يوفر أداة عالمية للدراسات الميكانيكية البيولوجية.

Introduction

تعاني العديد من الخلايا والأنسجة والأعضاء من قوى ضغط مستمرة أو متقطعة كجزء من فسيولوجيتها¹. على سبيل المثال، تتعرض الخلايا السنخيلة للضغط الدوري أثناء التنفس²، بينما تتحمل خلايا المثانة الظهارية أحملا ميكانيكية أثناء احتباس البول³. في السياقات المرضية مثل الأورام الصلبة، تتعرض خلايا السرطان باستمرار لقوى ضغط ناتجة عن الحبس المكاني وارتفاع ضغط السوائل الخلالية⁴. وبالمثل، في أمراض أخرى مثل تنكس الغضروف الهلالي والتليف الرئوي، تتعرض خلايا الغضروف الهلالية⁵ والخلايا الظهارية^{السنخي 6} أيضا لإجهادات ميكانيكية مستمرة بسبب الضغط الناتج عن الشد والصلابة المصفوفية.

هناك أدلة متزايدة تؤكد أن الضغط الميكانيكي يعمل كمنظم قوي لنمط وسلوك الخلية^7،8. في الخلايا غير الخبيثة، يعزز الإجهاد الضاغط تكاثر الخلايا الجذعية في دواعم السن ويحفز اندماج الخلايا العظمية من خلال نتوءات غازية⁹. وعلى العكس، في نماذج السرطان، يظهر الضغط تأثيرات جانوس: فهو يثبط تكاثر وهجرة خلايا الميلانوما بينما ينشط في الوقت نفسه إعادة برمجة النسخ التي تعزز مقاومة الكيماوي ^10,11. علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي الضغط الحجمي الناتج عن الضغط الفائق التناغمي في حدوث تكدس داخل الخلايا ويحفز إعادة توزيع تركيز البروتين والقوة الأيونية عبر فصل الطور بين السائل والسائل (LLPS)، مما يغير بشكل عميق سلوكيات الخلايا ومصيرها. يعزز هذا الاضطراب الفيزيائي توسع العضوية المعوية من خلال تنشيط إشارات Wnt/β-Catenin وزيادة التجدد الذاتي للخلايا الجذعية المعوية¹². بالإضافة إلى ذلك، في نواة الخلية، يشارك LLPS الناتج عن تغيرات الحجم في التحكم في النسخ الجيني من خلال تنسيق بدء النسخ، والإطالة، والإنهاء^13,14.

للتحقيق الكمي في هذه التأثيرات البيولوجية الناتجة عن الضغط، من الضروري وجود أنظمة تجريبية قادرة على تطبيق محفزات ضغطية محددة ومتجانسة جيدا. بالنسبة للخلايا المزروعة في المختبر، والتي تحيط بها وسط مائي، يعمل الضغط الهيدروستاتيكي كوسيلة أساسية وذات صلة فسيولوجية لتطبيق مثل هذه القوى الضاغطية، وقد تم اعتمادها على نطاق واسع لدراسة التحويل الميكانيكي الخلوي¹⁵. يمكن للضغط الهيدروستاتيكي أن يزيد من نشاط الفوسفاتاز القلوي ويسرع تكوين الخلايا الجذعية الميزانشيمية المشتقة من الدهون البشرية دون إضافة عوامل تحفيزية عظمية¹⁶. في مرض الكبد الدهني غير الكحولي، يمكن للقوى الميكانيكية مثل الضغط الهيدروستاتيجي أن تسهم في ارتفاع ضغط الدم البابي دون وجود تليف كبير، مما يبرز دوره في تنوع الأنسجة¹⁷. على الرغم من أن الضغط الهيدروستاتيكي يلعب دورا مهما في التنظيم الفيزيولوجي المرضي، إلا أن الدراسات الميكانيكية للضغط الهيدروستاتيكي تواجه قيدا حرجاما: حيث تمنع غرف الضغط التقليدية المراقبة الفورية للخلايا الحية أثناء التحفيز. تسمح معظم الأنظمة التجريبية فقط بتحليل نقطة النهاية، مما يخفي الديناميكيات المكانية والزمنية لأحداث النقل الميكانيكي، مثل تنشيط ميكانيكي بيزو1، وتباين تدفق^Ca⁺، وإعادة تنظيم الهيكل الخلوي. هذا الفجوة حدت من فهم كيفية دفع الضغط الهيدروستاتيتيكي لتنوع الأنماط الظاهرية في الأورام أو الأنسجة الأخرى.

لمعالجة هذه الفجوة التكنولوجية، تم تطوير منصة تجريبية جديدة تتيح الملاحظة الفورية للاستجابات الخلوية للضغط الهيدروستاتيجي المتحكم بدقة من خلال التصوير البصري. يدمج هذا النظام ثلاث قدرات رئيسية: (1) تطبيق ضغط هيدروستاتيكي مستدام ضمن نطاق 0–100 كيلوباسكال عبر وحدة تحكم ضغط غاز قابلة للتعديل (مقياس الضغط له نطاق من 0–200 كيلو باسكال، ويمكن اختيار الضغوط المطبقة بناء على المعايير الفسيولوجية). على سبيل المثال، استنادا إلى الإجهادات الضاغطة المبلغ عنها لأنواع خلايا مختلفة: 8-16 كيلوباسكال لخلايا نخاع العظم البشري¹⁸، 12-24 كيلوباسكال لخلايا العضلات الملساء الوعائية¹⁹، و0–15 كيلوباسكال لخلايا ظهارة الثديي البشرية²⁰.); (2) تصوير الخلايا الحية المستمر بدقة زمنية عالية أثناء تطبيق الضغط الهيدروستاتيكي؛ و(3) الحفاظ على ظروف الزراعة الفسيولوجية طوال التجارب الممتدة. يسمح هذا النهج بتصور العمليات الديناميكية بشكل مباشر، بما في ذلك تجنيد وتنشيط قناة بيزو1، وموجات إشارات الكالسيوم، وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي التي تحدث استجابة للتحفيز الميكانيكي. بالإضافة إلى ذلك، يتوافق هذا الجهاز مع معظم أطباق الزراعة التجارية والمجاهر المقلوبة، مما يجعله مريح جدا للاستخدام في المختبرات. توفر القدرة على مراقبة هذه الأحداث الكيميائية الحيوية داخل الخلايا في الوقت الحقيقي رؤى غير مسبوقة حول كيفية استشعار الخلايا وتكيفها مع الضغط الهيدروستاتيكي. من خلال التقاط التسلسل الزمني لأحداث النقل الميكانيكي، والتي تشمل الإحساس الأولي للقوة، والإشارات اللاحقة، والتغيرات الظاهرية، توفر هذه المنصة أداة قوية للتحقيق في الآليات الأساسية التي يؤثر بها الضغط الهيدروستاتيكي على سلوك الخلية في السياقات الفسيولوجية والمرضية.

Protocol

1. المواد

1. مواصفات الجهاز (انظر الشكل 1)
   1. جهز المكونات بناء على المواصفات المذكورة أدناه:
      القاعدة: ألمنيوم (Ø 56 مم، ارتفاع 15 مم)، النافذة المركزية Ø 40 مم.
      الغطاء: PMMA (Ø 56 مم) مع: 6 × M3 ثقوب ملولبة، منفذ غاز Luer-lock، حشية سيليكون (القطر الداخلي 25 مم، القطر الخارجي 32 مم، السماكة 0.8 مم)
      منظم الضغط: (نطاق 0–200 كيلو باسكال)
2. الخلايا والكواشف
   1. استخدم خلايا MDA-MB-231 وHeLa في هذه الدراسة. استخدم وسط L-15، وسط RPMI 1640، مصل العجل حديثي الولادة (NCS)، محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات بنسبة 1٪، ومسبار تصوير الكالسيوم لزراعة الخلايا ووضع علامات Ca²⁺.

2. تحضير الجهاز

1. التصنيع
   1. التصميم المخصص هو المكون المركزي لهذه الدراسة. القاعدة الدقيقة وغطاء PMMA حسب المواصفات (انظر الشكل 1 والشكل 1 والشكل الإضافي).
   2. اقطع حشية السيليكون، وعالجها إلى الحجم المطلوب.
      ملاحظة: النفاذية الضوئية لمادة PMMA كافية لتصوير الضوء المنقول القياسي. كانت جميع المكونات قابلة للتعقيم ومتوافقة حيويا في تجارب زراعة الخلايا اللاحقة. لا تفرض متطلبات خاصة على تفاوتات تصنيع هذه الغرفة (تم اعتماد تسامح ±0.1 مم في هذه الدراسة).
2. التعقيم
   1. لتعقيم القاعدة (الألمنيوم)، قم بتعقيم القاعدة عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   2. لتعقيم الغطاء (PMMA)، امسحه بنسبة 75٪ إيثانول، ثم قم بتعقيم الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
   3. قم بتعقيم حشية السيليكون عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

3. معالجة الخلايا

1. زراعة الخلايا
   1. خلايا البذور في أطباق بحجم 35 مم عند التقاء بنسبة 30٪–70٪. زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة في وسط RPMI-1640 أو L15 (مع 10٪ NCS) في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
   2. لمرور الخلايا، قم بفصل الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين وإنهاء الهضم بوسط كامل. استخدم الخلايا لإعادة الزراعة بمجرد وصولها إلى 70٪–80٪.
2. صبغة Ca²⁺
   1. أزل الوسط، ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول الملح المتوازن (HBSS) المسخن مسبقا في خزانة السلامة البيولوجية.
   2. صبغ Ca²⁺ بين الخلايا باستخدام مسبار تصوير كالسيوم بقوة 5 ميكرومولايت في وسط خال من المصل. حضن الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في بيئة محمية بالضوء.
   3. أزل الصبغة، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام HBSS، ثم قم بإزالة التعقيم لمدة 30 دقيقة في وسط خال من المصل.

4. تجميع الجهاز (الشكل 2)

1. انقل طبق الزراعة إلى النافذة المركزية لغرفة الضغط، ثم أزل وسط الزراعة.
2. ضع الحشوة المعقمة في طبق الزرعة.
3. محاذاة الغطاء فوق كومة حشية الطبق.
4. شد البراغي بشكل مائل عن طريق شدها يدويا حتى تشعر بالمقاومة، ثم أضف 1.5 لفة إضافية باستخدام محرك يتحكم فيه بعزم الدوران.
5. وصل أنبوب الغاز السيليكون إلى منفذ Luer-lock وحقن الغاز المختلط في الجهاز لفحص التسربات.
6. افصل أنبوب الغاز السيليكون واحقن وسط جديد في طبق زراعة الخلايا عبر منفذ Luer-lock باستخدام حقنة معقمة بسعة 5 مل.

5. تحميل الضغط والتصوير

1. قم بتوصيل أنبوب الغاز السيليكوني (قطر داخلي 4 مم) من منفذ Luer-Lock على حشية السيليكون إلى مقياس الضغط الرقمي وخزان الوقود.
2. قم بتركيب الجهاز المجمع على مرحلة المجهر.
3. قم بمعايرة الضغط.
   1. التحقق من استقرار نطاق 0–200 كيلوباسكال باستخدام المقياس.
      ملاحظة: يستخدم غاز مختلط يحتوي على 75٪ نيتروجين، 20٪ أكسجين، و5٪ ثاني أكسيد الكربون في زراعة خلايا HeLa. يستخدم غاز مختلط يحتوي على 80٪ نيتروجين و20٪ أكسجين في زراعة الخلايا MDA-MB-231. يمكن استبدال نوع الغاز المستخدم في تجربة تحميل الضغط حسب نوع الخلية، نوع الوسط، أو متطلبات التجارب المحددة. لا توجد مكونات خاصة بالنموذج، ويمكن اختيار أبعاد وحدة كشف الضغط وأنابيب السحب الخاصة بها حسب الحاجة.
4. اضبط الضغط المستهدف (مثلا 100 كيلو باسكال) عبر منظم الضغط الرقمي.
5. ابدأ التصوير بمجرد الوصول إلى الضغط المستهدف.
6. التصوير
   1. عدل المرحلة، وأكد منطقة التصوير، وتأكد من أن الخلايا في بؤرة التركيز.
   2. التقاط صور فلورية للخلايا الملونة باستخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بهدف 20× مع المعايير التالية: وقت تعريض 400 مللي ثانية، فواصل زمنية 5 ثوان، ومدة تصوير إجمالية تبلغ 10 دقائق (فلتر FITC: Ex/Em = 490/525 نانومتر، القطع = 515 نانومتر).
   3. الصورة تحت ظروف غير مضغوطة لمدة 10 دقائق لضمان التشغيل السليم للنظام والحصول على بيانات الإشارة الأساسية.
   4. بعد فتح صمام الغاز لضغط الحمل، أعد ضبط ارتفاع المرحلة لضمان تركيز الخلايا، ثم ابدأ بتصوير إشارات الكالسيوم الديناميكية.
   5. اختر العدسة الموضوعية بناء على سماكة الطبق السفلي للطبق ومسافة العمل الخاصة بالهدف. اختر وقت التعريض المستخدم لتمكين مراقبة اهتزازات إشارة الكالسيوم مع تجنب التبييض الضوئي المفرط والأضرار الضوئية.
   6. قم بضبط المعاملات وفقا لنوع المسبار ومتطلبات التجربة عند ملاحظة إشارات ديناميكية أخرى.

6. استكشاف الأخطاء

1. راجع الجدول 1 للحصول على نصائح حول استكشاف المشكلة.

7. التحليل الإحصائي

1. قدم جميع البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم استخدام برنامج GraphPad Prism (الولايات المتحدة الأمريكية) لمقارنة النتائج بين مجموعتين باستخدام اختبار t الطالب غير المقترن. اعتبر الفروقات ذات دلالة إحصائية عندما يكون **p < 0.01، أو ***p < 0.001، أو ****p < 0.0001.

Results

للتحقق من وظيفة التصوير في الوقت الحقيقي لهذا الجهاز الهيدروستاتيكي التحميل بالضغط، تم رصد ديناميكيات إشارات الكالسيوم في خلايا الورم بعد تطبيق الضغط الهيدروستاتيكي. تم زرع خلايا MDA-MB-231 وHeLa وA549 المتلاطمة في أطباق زراعة بحجم 35 مم للاستخدام لاحقا. بعد صبغها بمسبار تصوير الكالسيوم، تعرضت الخلايا المزروعة الخالية من المصل لضغط هيدروستاتيكي قدره 40 كيلو باسكال. بعد 10 دقائق من التحميل الهيدروستاتيكي، ارتفع مستوى الكالسيوم الكلي في خلايا السرطان (الأشكال 3A,B،...

Discussion

أظهر هذا البروتوكول جهاز تحميل ضغط قابل للتكيف عالميا يتيح الملاحظة الفورية لديناميكيات النقل الآلي تحت ضغط هيدروستاتيكي قابل للضبط. من خلال دمج غطاء PMMA شفاف بصريا مع قاعدة من الألمنيوم المصنوع بدقة، يتغلب النظام على القيود الحرجة للغرف التقليدية، التي يمكنها فقط إجراء تحليل نقاط النهاية. هذا الجهاز الذي يعمل بالضغط مع مجهر معكوس قياسي، يمكنه توفير معلومات ديناميكية من خلال التصوير المؤقت (time-lapse). تساهم توافق الأجهزة مع أطباق الزراعة القياسية بقياس 35 مم وعملية التجميع البسيطة في ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100x)	ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية	15140122	تركيز 1٪ في الوسط الكامل
الأوتوكلاف	باناسونيك، اليابان	MLS-3751-PC	لتعقيم قاعدة الألمنيوم وحشية السيليكون
خزانة السلامة البيولوجية	ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية	سلسلة 1300 A2 فئة II، خزائن السلامة البيولوجية من النوع A2	يوفر بيئة معقمة للتعامل مع الخلايا
Cal-520 AM، مؤشر الكالسيوم الخلوي	AAT Bioquest، الولايات المتحدة الأمريكية	21131	للكشف الديناميكي عن تركيز أيونات الكالسيوم في الخلايا الحية
طبق زراعة الخلايا (35 مم)	بيوفيل، الصين	TCD010035	طبق قياسي بقطر 35 مم يستخدم لزرع الخلايا
قاعدة الحجرة (الألمنيوم)	كواني، الصين	/	تصميم مخصص وأوسلاش؛ 56 مم، H 15 مم، نافذة مركزية وأوسلاش؛ 40 مم
غلاف الحجرة (PMMA)	كواني،   الصين	/	تصميم مخصص وأوسلاش؛ 56 مم، مع 6&00 أضواء؛ ثقوب M3 الملولبة، منفذ الغاز لوير لوك
حاضنة CO2	ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية	HERAcell 3111	يحافظ على ظروف الزراعة عند 37 درجة؛ C مع أو بدون 5٪ CO< تحت >2< أو أقل من اللازم>
HBSS (محلول الملح المتوازن لهانكس)	بيوتايم، الصين	C0219	لغسل الخلايا قبل وبعد التلوين
خط الخلايا HeLa	مركز موارد الخلايا، معهد العلوم الطبية الأساسية، CAMS/PUMC، الصين	CRM-CCL-2	خلايا سرطان عنق الرحم البشرية
المجهر الفلوري المقلوب	نيكون، اليابان	إكليبس Ti2	للتصوير الفلوري
طائرة ليبوفيتز L-15 المتوسطة	ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية	41300039	لزراعة الخلايا MDA-MB-231
خط الخلايا MDA-MB-231	مركز موارد الخلايا، معهد العلوم الطبية الأساسية، CAMS/PUMC، الصين	CRM-HTB-26	خلايا سرطان الثدي البشرية
مصل العجل حديثي الولادة (NCS)	ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية	16010142	تركيز 10٪ في وسط كامل
منظم الضغط	هونغرون، الصين	DP20	النطاق: 0-200 كيلو باسكال
RPMI 1640 متوسط	ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية	31800022	لزراعة الخلايا MDA-MB-231
حقنة معقمة (5 مل)	KDL، الصين	1101010198	لحقن وسط أو كواشف عبر منفذ Luer-lock
تريبسين (0.25٪)	ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكية	2520056	لتفكك الخلايا الملتصقة أثناء المرور