يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول حسابي لقياس التحولات الترانسكريبتومية المرتبطة بالأرتيسونات في نسيج دماغ الملاريا الدماغية التجريبية باستخدام DESeq2

75 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70870

⸱

يوليو 31, 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الملاريا الدماغية التجريبية (ECM) تسبب التهابا عصبيا وخللا في الحاجز الدموي الدماغي. باستخدام GSE162535، يقارن هذا السير المتكرر القائم على R بين أدمغة التحكم (CB)، ECM (MB)، والأدمغة المعالجة بالأرتيسونات (AB)، وإجراء تحليلات QC وPCA وDESeq2. يحدد التغيرات النسخية المدفوعة ب ECM ويقيم التعديل الهوائي للمسارات الالتهابية والأوعية العصبية بواسطة التيار المفصلي.

الملخص

يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) على نطاق واسع لتعريف برامج النسخ المرتبطة بالأمراض، لكن هناك حاجة إلى سير عمل متسق من البداية إلى النهاية لضمان مقارنات قابلة للتكرار عبر مجموعات التجارب وتسهيل نتائج قابلة للتفسير بيولوجيا. هنا، يقدم بروتوكول تحليل RNA-seq كامل لتقييم التغيرات الترانسكريبتومية في الملاريا الدماغية التجريبية (ECM) والعلاج الارتزوناتي التالي باستخدام مجموعة البيانات العامة GSE162535. يحلل سير العمل ثلاث مجموعات — الدماغ الضابط (CB)، دماغ ECM (MB)، ودماغ ECM المعالج بالأرتيسونات (AB)—بدءا من مصفوفة عد HTSeq. بعد استيراد وتنسيق العد الخام، يقوم البروتوكول بإنشاء مجموعة بيانات DESeq2 باستخدام CB كمستوى مرجعي، ويقوم بتصفية الجينات منخفضة العد، ويقوم بمراقبة الجودة باستخدام التصور بحجم المكتبة، وتحليل المكونات الرئيسية، وتجميع مسافة العينة. ثم يحسب التعبير التفاضلي لثلاثة تباينات رئيسية (MB مقابل CB، AB مقابل MB، AB مقابل CB)، مع تطبيق انكماش log2 لتغيير الطي لتقدير حجم التأثير المستقر. يصدر البروتوكول جداول تعبير تفاضلي كاملة وذات دلالة، ويولد مخططات بركانية ومخططات MA، وينتج خرائط حرارة لأكثر الجينات تنوعا والجينات المعبر عنها تفاضليا الأعلى ترتيبا لكل تباين. لدعم التفسير الميكانيكي، يشمل سير العمل استخراج علامات المناعة المستهدفة (مثل السيتوكينات، الكيموكينات، علامات تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة، جينات BBB/البطانة) ويجري تحليلات جينية وتحليلات إثراء KEGG لمجموعات جينية مرتفعة ومنخفضة بشكل ملحوظ. يوفر هذا البروتوكول قالبا قابلا للتكرار لتوصيف برامج النسخ العصبية الالتهابية المرتبطة ب ECM ولقياس التعديل المرتبط بالأرتيسونات لهذه التواقيع.

المقدمة

الملاريا الدماغية (CM) هي مضاعفات عصبية مهددة للحياة لعدوى البلازموديوم فالسيباروم ، ولا تزال مساهما رئيسيا في وفيات الملاريا رغم التقدم في إدارة الحالات. يتميز CM باعتلال دماغي حاد، وخلل الأوعية الدموية الدقيقة، وتنشيط البطانة، واضطراب الحاجز الدموي-الدماغي (BBB)، مع التهاب عصبي لاحق يمكن أن يؤدي إلى غيبوبة، وبين الناجين، آثار عصبية معرفية مستمرة1. التسبب المرضي للسرطان الكيميائي متعدد العوامل ويتضمن تفاعل استجابات التهابية للعائل مع عوامل مشتقة من الطفيليات والمضيف عند الواجهة العصبية الوعائية، مما يصعب استنتاج الآليات السببية من نقاط النهاية السريرية وحدها1.

توفر نماذج الملاريا الدماغية التجريبية (ECM)، وخاصة عدوى ANKA من البلازموديوم بيرغي في فئران C57BL/6، منصة قابلة للبحث عن أمراض المناعة الخاصة بالدماغ، وإصابة BBB، والإشارات الالتهابية العصبية في بيئة محكمة 2,3. تم استخدام هذه النماذج لرسم خريطة الاستجابات الخلوية والجزيئية عبر مراحل المرض ولاختبار التدخلات المساعدة في الجسم الحي 2,3. ومع ذلك، فإن علم الأمراض المرضي للطب العصبي العصبي معقد وديناميكي للغاية، وقد تفشل الاختبارات المستهدفة في حدوث تحولات منسقة على مستوى المسار التي تحدث عبر برامج مناعية وعائية عصبية متعددة.

الأرتيسونات هو العلاج الوريد الموصى به للخط الأول للملاريا الشديدة، وقد أظهر فائدة كبيرة في البقاء مقارنة بالكينين عبر قواعد الأدلة الرئيسية4. على الرغم من أن إزالة الطفيليات بسرعة أمر أساسي لفعالية الأرتيسونات، إلا أن النتائج العصبية تعكس على الأرجح تقليل الطفيليات والتعديل الثانوي للمسارات الالتهابية والأوعية العصبية 1,4. لذا، يمكن لفهم كيفية إعادة علاج الأرتيميسينين تشكيل برامج النسخ الدماغية أثناء ECM أن يوفر رؤى ميكانيكية تكمل بيانات الفعالية السريرية وقد تحدد مسارات مرشحة لاستراتيجيات الحماية العصبية المساعدة.

يتيح تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) التحليل غير المتحيز على مستوى الجينوم للاستجابات النسخية في حالات المرض والعلاج، مما يدعم تحليل التعبير التفاضلي والتفسير الوظيفي لاحقا. توفر المستودعات العامة مثل مجموعة NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) مجموعات بيانات مختارة مناسبة لإعادة التحليل القابلة لإعادة الإنتاج، بما في ذلك GSE162535، الذي يحتوي على RNA-seq من أدمغة التحكم (CB)، وأدمغة ECM (MB)، وأدمغة ECM المعالجة بالأرتيسونات (AB)5. لدعم الاكتشاف القابل للتكرار من هذه المجموعات، هناك حاجة إلى أطر إحصائية قوية للتعبير التفريقي القائم على العد، كما تحتاج أدوات إثراء لتفسير التغيرات على مستوى الجينات من حيث المسارات والعمليات البيولوجية.

تقدم هذه الدراسة سير عمل تحليل RNA-seq قابل للتكرار من البداية إلى النهاية لمجموعات أنسجة الدماغ عبر مجموعات التحكم (CB)، والملاريا الدماغية التجريبية (MB)، والمعالج بالأرتيسونات (AB). تكمن حداثة هذا المقال في خط أنابيب DESeq2 الموحد، الذي يتضمن تباينات بيولوجية محددة مسبقا (MB مقابل CB، AB مقابل MB، و AB مقابل CB)، ومخرجات مراقبة جودة صارمة (تقييم حجم المكتبة، تحليل المكونات الرئيسية، وخرائط الحرارة لمسافات العينة)، والتفسير المتكامل في مرحلة لاحقة من خلال إثراء مسار Gene Ontology (GO) وKEGG باستخدام clusterProfiler 6,7. بالإضافة إلى ذلك، ينفذ سير العمل تفسيرا منظما يعتمد على لوحات المناعة، مما يمكن من التوصيف المنهجي للاستجابات الالتهابية العصبية والمناعية والعوائية العصبية. من خلال الجمع بين الصرامة الإحصائية والشفافية والمخرجات الجاهزة للنشر، يوفر هذا البروتوكول إطارا قويا وقابلا لإعادة الاستخدام لتحليل خلل تنظيم النسخ المرتبط ب ECM وتقييم التعديل المدفوع بالعلاج في دراسات الملاريا قبل السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

استخدمت هذه الدراسة بيانات RNA-seq المتاحة للجمهور ولم تتضمن أي تجارب جديدة على البشر أو الحيوانات. لذلك، لم تكن هناك حاجة للموافقة الأخلاقية والموافقة المستنيرة (جدول المواد).

1. إعداد بيئة الحوسبة وهيكل المجلدات

  1. إعداد الأجهزة ونظام التشغيل
    1. استخدم محطة عمل أو لابتوب يحتوي على ذاكرة RAM لا تقل عن 8GB (16GB موصى به) ومساحة قرص ≥10GB للتحميل والمخرجات.
    2. استخدم ويندوز أو ماك أو أو لينكس مع إذن لتثبيت حزم R وكتابة الملفات في الدليل العامل.
  2. تثبيت البرنامج المطلوب
    1. ثبت R (الإصدار 4.2 أو أحدث). تثبيت RStudio Desktop (موصى به) لتشغيل سير العمل بشكل تفاعلي ولإدارة دليل المشروع.
  3. إنشاء دليل مشروع ومجلدات إخراج
    1. أنشئ مجلد جديد للتحليل (مثلا GSE162535_RNAseq_DESeq2). قم بتعيين هذا المجلد كدليل R العامل.
    2. أنشئ مجلدات الإخراج بالضبط كما يلي:
      1. اصنع النتائج/. أنشئ النتائج/fig/. أنشئ نتائج/جداول/.
  4. تثبيت حزم R المطلوبة
    1. قم بتثبيت حزم CRAN: tidyverse، pheatmap، و RColorBrewer. تثبيت حزم Bioconductor: DESeq2، apeglm (اختياري)، clusterProfiler، وorg. Mm.eg.db.
    2. قم بتحميل الحزم المطلوبة في بداية السكريبت: DESeq2، tidyverse، pheatmap، RColorBrewer، clusterProfiler، org. Mm.eg.db، وggplot2. قم بتعيين بذرة لإعادة الإنتاج عن طريق تشغيل set.seed(123).
  5. تطبيق سلامة البيانات وحماية الخصوصية
    1. تخزين الملفات التي تم تنزيلها في دليل المشروع فقط. تقييد الوصول إلى دليل المشروع إذا كانت البيئة تحتوي على بيانات حساسة أو محظورة. سجل إصدارات البرامج عن طريق تصدير sessionInfo() إلى النتائج/sessionInfo.txt في نهاية سير العمل.
      ملاحظة: يقوم هذا البروتوكول بتحليل داخل السيليكو لبيانات عد RNA-seq العامة ولا يتضمن التعامل مع العينات البيولوجية.

2. الحصول على مصفوفة عدد RNA-seq وتعريف المجموعات التجريبية

  1. حمل ملفات مجموعة بيانات GEO ل GSE162535
    1. قم بتحميل ملف عدد HTSeq ل GSE162535 من GEO واحفظه في مجلد المشروع ك GSE162535_All.HTSeq.counts.txt.gz. تحقق من سلامة الملف بتأكيد أن الملف يفتح بدون خطأ باستخدام gzfile() و read.delim().
  2. تحميل عداد HTSeq إلى R
    1. استيراد جدول العد المضغوط باستخدام read.delim(gzfile(...), header = TRUE, check.names = FALSE, quote = "", comment.char = ""). افحص الكائن المستورد باستخدام str()، head()، و colnames() للتأكد من أن:
      1. يحتوي العمود الأول على معرفات جينية (مثل AccID). الأعمدة المتبقية تحتوي على عد على مستوى العينة.
  3. توحيد أنواع البيانات وحل معرفات الجينات المكررة
    1. عرف أعمدة العينة بأنها جميع الأعمدة باستثناء عمود معرف الجين (AccID). إجبار جميع أعمدة العينة على العد الصحيح. قم بجمع معرفات الجينات المكررة عن طريق جمع الأعداد عبر الصفوف التي تشترك في نفس AccID.
    2. حول الجدول المطوي إلى إطار بيانات قياسي. قم بتعيين أسماء الصفوف إلى معرف الجين وإزالة عمود المعرف من مصفوفة العد.
  4. تحقق من بنية مصفوفة العد
    1. تأكد من أن مصفوفة العد تحتوي على 12 عمودا عينات. تأكد من أن أسماء الأعمدة النموذجية تتبع التنسيق AB_1..AB_4، CB_1..CB_4، و MB_1.MB_4.
    2. توقف التنفيذ إذا لم يكن مصفوفة العد تحتوي على 12 عمودا.
  5. إنشاء والتحقق من بيانات وصفية نموذجية
    1. أنشئ جدول بيانات وصفية نموذجي (colData) يحتوي على الأعمدة التالية:
      1. العينة: معرفات عينة فريدة تتوافق مع أسماء أعمدة مصفوفة العد. المجموعة: حالة بيولوجية مخصصة لكل عينة.
    2. استرجع التعليقات التوضيحية النموذجية المقابلة لمجموعة البيانات GSE162535 من مجموعة التعبير الجيني (GEO).
    3. تحقق من هوية كل عينة باستخدام معلومات الوصول إلى GEO وحقول التعليقات التوضيحية التي تصف حالة التجربة. قم بربط كل معرف عينة في مصفوفة العد بتعليق GEO المثبت الخاص به.
    4. خصص كل عينة موثقة إلى واحدة من المجموعات التالية: الدماغ الضابط (CB)، دماغ الملاريا الدماغية التجريبي (MB)، أو الدماغ التجريبي المعالج بالملاريا الدماغية (AB).
    5. ترتيب جدول البيانات الوصفية بحيث يتطابق ترتيب العينة مع ترتيب الأعمدة في مصفوفة العد.
    6. قارن معرفات العينة في جدول البيانات الوصفية مع مصفوفة العد لتأكيد التوافق الفردي. ترميز متغير المجموعة كعامل مع ترتيب المستويات ك CB وMB وAB.
    7. حدد CB كمستوى مرجعي لتعريف مجموعة الدماغ الضابطة كأساس لتحليل التعبير التفاضلي في المراحل النهائية.
    8. اضبط أسماء الصفوف في جدول البيانات الوصفية مساويا لمعرفات العينة.
      ملاحظة:لم يتم تعيين تسميات المجموعات فقط من ترتيب العينات في مصفوفة العد. تم التحقق من هويات العينات بشكل مستقل باستخدام بيانات وصفية GEO ومعلومات الإدخال قبل التوافق مع مصفوفة التعبير لتحسين قابلية التكرار وتقليل خطر سوء تصنيف العينة.

3. إنشاء مجموعة بيانات DESeq2 وإجراء ضوابط جودة أساسية

  1. تعقيم مصفوفة العد
    1. استبدل القيم المفقودة في مصفوفة العد بالصفر. أكد غياب القيم المفقودة باستخدام ملخصات is.na()) حسب عمود.
  2. إنشاء مجموعة بيانات DESeq2
    1. إنشاء مجموعة بيانات DESeqStatSet باستخدام DESeqDataSetFromMatrix() مع: countData = counts; colData = sample_info; التصميم = ~ مجموعة.
  3. تصفية الجينات منخفضة العد
    1. إزالة الجينات ذات العد الإجمالي <10 عبر جميع العينات باستخدام dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ]. سجل عدد الجينات المحتجزة عن طريق طباعة ملخص الكائن.
  4. تقييم أحجام المكتبات
    1. احسب أحجام المكتبات كمجموع أعمدة لمصفوفة العد المصفاة. أنشئ مخطط باري بحجم مكتبة واحفظه كنتائج/صورة/library_sizes.pdf.
    2. افحص مخطط حجم المكتبة وتأكد من أنه لا توجد عينة لها عمق تسلسل شديد يتعارض مع تصميم الدراسة.

4. شغل DESeq2 وتولد كائنات تحويل للتصور

  1. ملاءمة نموذج DESeq2
    1. شغل نمذجة التعبيرات التفاضلية باستخدام dds <- DESeq(dds). احتفظ بجسم DDS المناسب لجميع استخراج النتائج لاحقا.
  2. إنشاء مصفوفات تعبير محولة
    1. احسب تحويل اللوغاريتمية المنظمة باستخدام rld <- rlog(dds, blind = FALSE). احسب تحويل تثبيت التباين باستخدام vsd <-vst(dds، أعمى = خطأ). استخدم rld و vsd لتحليل PCA، والتجميع، وخرائط الحرارة.
      ملاحظة: استخدم الأعمى = FALSE للحفاظ على بنية التباين المعتمدة على المجموعة.

5. إجراء مراقبة الجودة العالمية باستخدام تحليل التحليل الوظيفي (PCA) وتجميع المسافة من عينة إلى عينة

  1. توليد تحليل المكونات الرئيسية (PCA)
    1. احسب PCA باستخدام plotPCA(rld, intgroup = "group", returnData = TRUE). شرح نسبة التباين في الاستخلاص ل PC1 و PC2. رسم PC1 مقابل PC2 باستخدام ggplot2، مع تصنيف النقاط حسب اسم العينة والتلوين حسب المجموعة.
    2. احفظ مخطط PCA كنتائج/شكل/PCA_samples.pdf. تأكد من أن النسخ البيولوجية تتجمع بين مجموعة وأنه لا توجد عينة تنفصل كحالة استثنائية.
  2. إنشاء خريطة حرارية لمسافة عينة
    1. احسب مسافات العينات الزوجية باستخدام dist(t(assay(vsd))). حول كائن المسافة إلى مصفوفة للتصور. أنشئ جدول تعليقات عمودية يحتوي على عامل المجموعة لكل عينة.
    2. رسم مصفوفة المسافة باستخدام pheatmap() واحفظها كنتائج/fig/sample_distance_heatmap.pdf. تأكد من أن العينات تتجمع بشكل أساسي حسب المجموعة.

6. حساب التعبير التفاضلي للتباينات الثلاثة الرئيسية

  1. حدد التباينات
    1. عرف تأثير المرض بأنه ECM مقابل السيطرة: MB مقابل CB. عرف تأثير العلاج داخل ECM كمعالج بالأرتيسونات مقابل ECM: AB مقابل MB. عرف العلاج مقابل الأساس كعلاج بالأرتيسونات مقابل الضابط: AB مقابل CB.
  2. استخراج نتائج DESeq2 مع انكماش التغيير الطي log2
    1. استخلاص النتائج الخام لكل تباين باستخدام النتائج (dds, contrast = c("مجموعة"، المجموعة A، المجموعة B)). تغييرات log2 القابلة للانقباض باستخدام lfcShrink(dds، التباين = c("المجموعة"، المجموعة A، المجموعة B)، res = res، النوع = "العادي").
    2. حول النتائج إلى إطار بيانات وتخزين معرف الجين كعمود باسم gene_id. ترتيب النتائج حسب القيمة الاسمية p للتقارير المستقرة.
    3. احفظ كل جدول نتائج كامل في النتائج/جداول/ كالتالي:
      1. DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv، DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv، DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv
        ملاحظة: إذا فشل الانكماش بسبب تكوين الحزمة، أعد التشغيل بنوع انكماش بديل مدعوم في التثبيت المحلي.
  3. تحديد عتبات الأهمية وتصدير مجموعات جينية مهمة
    1. حدد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) باستخدام: قيمة p المعدلة (FDR) < 0.05 وتغيير log-2 مطلق ≥ 1. قم بتصفية كل تباين لاستبعاد الجينات التي تحتوي على قيم p معدلة مفقودة.
    2. تصدير جداول DEG المهمة إلى: results/tables/DESeq2_MB_vs_CB_sig.csv, results/tables/DESeq2_AB_vs_MB_sig.csv, results/tables/DESeq2_AB_vs_CB_sig.csv
  4. لخص عد DEG لكل مقارنة
    1. احسب عدد الجينات المهمة لكل تباين. احفظ جدول الملخص كنتائج/جداول/DE_summary_counts.csv.

7. توليد مخططات بركانية لكل تباين.

  1. أنشئ دالة رسم بركاني.
    1. احسب -log10 (قيمة p المعدلة) لكل جين. صنف كل جين كأعلى، منخفض، أو غير ذي دلالة باستخدام العتبات: FDR < 0.05 و |log2FC| ≥ 1.
    2. رسم log2FC (محور x) مقابل -log10(FDR) (محور y) باستخدام ggplot2. أضف خطوط العتبة المتقطعة عند log2FC = ±1 و -log10(0.05).
  2. قطع بركانية تصدير
    1. احفظ كل مخطط كملف PDF في النتائج/الشكل/: volcano_MB_vs_CB.pdf، volcano_AB_vs_MB.pdf، volcano_AB_vs_CB.pdf.
      ملاحظة: استخدم حدود محاور متسقة عبر التباينات لدعم المقارنة البصرية عبر الأشكال.

8. توليد مخططات MA لكل تباين

  1. تصدير مخططات MA إلى ملف PDF واحد.
    1. افتح جهاز PDF باسم results/fig/MA_plots.pdf. رسم رسم MA لكل كائن خام في نتيجة DESeq2 باستخدام plotMA(). ضع علامة على كل قطعة باسم التباين. أغلق جهاز PDF.

9. توليد خرائط حرارة للتعبير لجينات التغير العالمي والتباين.

  1. رسم الجينات العليا عبر جميع العينات.
    1. احسب التباين صفيا عبر العينات من مصفوفة اختبار vsd. اختر أفضل 100 جين متغير. قم بمركز كل جين عبر العينات.
    2. إنشاء خريطة حرارية باستخدام pheatmap() مع تعليقات مجموعات العينة. احفظ الشكل كنتائج/شكل/heatmap_top100_variable_genes.pdf.
  2. ارسم أعلى الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي لكل تباين.
    1. اختر أفضل 50 جينا حسب قيمة p المعدلة لكل تباين. استخرج مصفوفة تعبير VSD ومركز المتوسط بواسطة الجين. أنشئ خريطة حرارية لكل تباين واحفظها كالتالي:
    2. النتائج/الشكل/heatmap_top50_MB_vs_CB.pdf، النتائج/الشكل/heatmap_top50_AB_vs_MB.pdf، النتائج/الصور/heatmap_top50_AB_vs_CB.pdf
      ملاحظة: زد عرض وارتفاع PDF إذا تم تفعيل تسميات الصفوف.

10. إجراء تحليل مستهدف لمؤشرات المناعة.

  1. لخص الجينات المناعية المختارة عبر التباينات.
    1. حدد مجموعة علامات مناعة: Il6، Il1b، Il10، Tnf، Ifng، Il21، و Icam1. استخرج log2FC، وقيمة p، وقيمة p المعدلة لهذه الجينات من كل جدول نتائج تباين.
    2. ادمج ملخصات التباين الثلاثة حسب معرف الجينات. احفظ الجدول المدمج كنتائج/جداول/immune_genes_summary.csv.
  2. أنشئ خريطة حرارية لمؤشر المناعة (rlog).
    1. تحديد الجينات المناعية الموجودة في مصفوفة الاختبار المحول. استخلاص مصفوفة تعبير rlog للجينات المناعية الحالية.
    2. التعبير في منتصف المركز حسب الجين. قم بإنشاء وحفظ خريطة الحرارة على النتائج/fig/heatmap_immune_genes.pdf.

11. إجراء تحليل لوحة مناعة موسعة حسب الفئة الوظيفية

  1. عرف لوحات المناعة.
    1. حدد لوحات العلامات المناعية حسب الفئة، بما في ذلك: السيتوكينات الالتهابية وجينات استجابة الإنترفيرون، الجينات المضادة للالتهابات والتنظيمية، الكيموكينات، مؤشرات تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة، علامات الخلايا النجمية، علامات تنشيط BBB وبطانة الجسم، علامات الخلايا التائية وعلامات الإجهاد، مؤشرات وعلامات الخلية الأحادية/البلعمية، جينات مسار المكملات، وجينات الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا.
  2. استخرج نتائج DE في لوحة المناعة لكل تباين.
    1. أنشئ جدول تعيين من رموز الجينات إلى فئات المناعة. قم بتصفية كل جدول نتائج تباين لجينات لوحة المناعة. قم بربط تعيين الفئات بكل جدول نتائج مفلتر.
    2. قم بدمج الجداول المناعية الثلاثة الخاصة بالتباين في جدول واحد. احفظ الجدول المدمج كنتائج/جداول/immune_panels_DE_all_contrasts.csv. أنشئ خريطة حرارية مصنفة لتعبير لوحة المناعة.
    3. تحديد جينات اللوحة المناعية الموجودة في مصفوفة اختبار RLD. قم بإضافة تسميات الفئات إلى أسماء الصفوف للحفاظ على تصنيف اللوحات في الشكل. رسم خريطة الحرارة الخاصة ب rlog مع تعليقات مجموعات عينات.
  3. احفظ المخرجات.
    1. احفظ باسم: results/fig/heatmap_immune_panels_all.pdf، results/fig/heatmap_immune_panels_all.png

12. توليد مخططات براكين مناعية تراكب

  1. أنشئ مخططات براكين متراكبة على المناعة.
    1. وسم الجينات كمحصنة أو غير منيعة عن طريق ربط لوحة الجهاز المناعي بكل جدول نتائج تباين. رسم جميع الجينات غير المناعة كنقاط خلفية رمادية. رسم جينات المناعة الملونة حسب فئة المناعة في المقدمة. أضف خطوط العتبة عند log2FC = ±1 و -log10(0.05).
  2. تصدير قطع براكين محصنة مع تراكب مناعي.
    1. حفظ مخططات البركان التي تعتمد على تراكب المناعة في MB مقابل CB كما يلي:
      1. النتائج/الشكل/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.pdf
      2. النتائج/الشكل/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.png
    2. حفظ مخططات البركان AB مقابل MB لتراكب المناعة كالتالي:
      1. النتائج/الشكل/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.pdf
      2. النتائج/الشكل/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.png
        ملاحظة: تم تحديد لجان جينات المناعة المختارة مسبقا وتجميعها إلى فئات وظيفية؛ القائمة الكاملة لرموز الجينات مع التعليقات موفرة في الجدول التكميلي S1. يضمن هذا الجدول الشفافية وقابلية التكرار، مما يسمح بإعادة الاستخدام المباشر والتحقق من صحة التحليلات القائمة على اللوحات عبر الدراسات.

13. إجراء تحليل الإثراء الوظيفي (GO و KEGG)

  1. تعريف مجموعات الجينات للإثراء
    1. لكل تباين (MB مقابل CB و AB مقابل MB)، استخرج جينات معبرة بشكل مختلف بشكل ملحوظ (DEGs) باستخدام عتبة p معدلة بقيمة < 0.05 وعتبة تغير طي log₂ مطلقة ≥ 1.
    2. قسم DEGs إلى جينات مرتفعة التنظيم (log₂FC > 0) وجينات منخفضة التنظيم (log₂FC < 0).
  2. تعريف مجموعة الجينات الخلفية (الكون)
    1. استخدم جميع الجينات التي تم الاحتفاظ بها بعد التصفية العدية في مجموعة بيانات DESeq2 ككون خلفي. استخرج رموز الجينات من كائن DESeq2 المصفى. حول رموز الجينات الخلفية إلى معرفات Entrez باستخدام دالة bitr() مع org. Mm.eg.db.
      ملاحظة: استخدام مجموعة جينات خلفية متسقة يضمن نتائج إثراء غير متحيزة.
  3. خريطة معرفات الجينات للإثراء
    1. حول رموز الجينات لكل مجموعة DEG إلى معرفات Entrez باستخدام bitr(). احتفظ فقط بالجينات التي تم رسمها بنجاح لإثراء KEGG. تخطي تحليل الإثراء لمجموعة جينية إذا لم يتم تعيين أي جينات بنجاح.
      ملاحظة: يستخدم إثراء الأنطولوجيا الجينية (GO) رموز جينية، بينما يتطلب إثراء KEGG معرفات Entrez.
  4. إجراء إثراء أنطولوجيا جينية (GO) (العملية البيولوجية)
    1. شغل إثراء GO باستخدام enrichGO() مع OrgDb = org. Mm.eg.db. Set keyType = "رمز" وOntology (ont) = "BP". حدد الكون كجميع رموز الجينات المصفاة من مجموعة بيانات DESeq2.
    2. استخدم pAdjustMethod = "BH" لتصحيح الاختبارات المتعددة. تطبيق عتبات الدلالة ل pvalueCutoff = 0.05 و qvalueCutoff = 0.05. قيد أحجام مجموعات الجينات باستخدام minGSSsize = 10 وmaxGSSsize = 500.
    3. تصدير نتائج إثراء GO إلى دليل results/tables/. قم بإنشاء مخططات شريطية لمصطلحات GO المغنية وحفظها في النتائج/fig/.
  5. تنفيذ إثراء مسار KEGG
    1. شغل إثراء KEGG باستخدام enrichKEGG() مع الكائن الحي = "mmu". وفر معرفات Entrez لمجموعات DEG كجينات إدخال. استخدم خلفية Entrez المخصصة ككون.
    2. تطبيق pAdjustMethod = "BH". استخدم عتبات الدلالة pvalueCutoff = 0.05 و qvalueCutoff = 0.05. قيد أحجام مجموعات الجينات باستخدام minGSSsize = 10 وmaxGSSsize = 500.
    3. تصدير جداول إثراء KEGG إلى النتائج/جداول/. قم بإنشاء مخططات شريطية لمسارات KEGG المطورة وحفظها إلى النتائج/fig/.
      ملاحظة: قد لا يعيد إثراء KEGG نتائج إذا كان رسم الجينات غير كاف؛ يتم التعامل مع مثل هذه الحالات دون مقاطعة سير العمل.

14. إجراء تحليل إثراء المناعة فقط (وحدة اختيارية)

  1. بناء مجموعات جينية خاصة بالمناعة
    1. تعريف جينات اللوحة المناعية بناء على الفئات الوظيفية المختارة. تقاطع قوائم DEG مع جينات اللوحة المناعية. قسم مستويات DEG الخاصة بالمناعة إلى مجموعات مرتفعة ومنخفضة لكل تباين.
  2. إجراء إثراء على مجموعات جينية خاصة بالمناعة.
    1. تطبيق نفس إجراءات إثراء GO وKEGG الموضحة في القسم 13. استخدم إعدادات خلفية ومعايير متطابقة. حفظ المخرجات باستخدام أسماء الملفات التي تحتوي على تسمية "محصن" لتمييزها عن نتائج الإثراء العالمية.

15. توليد مخططات نقاط الإثراء (وحدة اختيارية)

  1. نتائج إثراء التحميل.
    1. استيراد جداول إثراء GO أو KEGG من مجلد results/tables/.
  2. تحويل مقاييس الإثراء.
    1. حول قيم GeneRatio من التنسيق الجزئي (x/y) إلى النسب الرقمية. احسب −log₁₀ (قيم p المعدلة) للتصور.
  3. توليد مخططات نقطية.
    1. رسم نسبة الجينات على المحور x ووصف مصطلحات غنية على المحور y. قم بقياس حجم النقاط حسب عدد الجينات واللون حسب −log₁₀ (قيمة p المعدلة).
    2. اختر أعلى مصطلحات غنية بناء على ترتيب قيمة p المعدل. احفظ مخططات النقاط كملفات PDF وPNG في دليل results/fig/.

16. حفظ معلومات الجلسة وإنهاء الجولة

  1. تصدير معلومات الجلسة.
    1. حفظ مخرجات sessionInfo() إلى النتائج/sessionInfo.txt لتوثيق نسخة R وإصدارات الحزمة.
  2. تأكيد الإكمال الناجح
    1. تأكد من أن سير العمل الذي تم إنشاؤه: الأشكال في النتائج/الشكل/، الجداول في النتائج/الجداول/.
    2. تأكد من وجود مخرجات التباين الثلاثة الأساسية وغير فارغة: DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv، DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv، DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تقييم جودة البيانات والبنية النصية العالمية

تمت معالجة بيانات RNA-seq من 12 عينة دماغية (CB, MB, AB; n = 4 لكل مجموعة) باستخدام سير العمل الموحد. بعد تصفية الجينات ذات العد المنخفض (≥10 إجمالا)، تم الاحتفاظ بمجموعة البيانات للتحليلات اللاحقة. أظهر تحليل المكونات الرئيسية (PCA) للعد المحولة إلى rlog فصل العينات حسب المجموعة التجريبية، مع تجمع النسخ المتسقة داخل المجموعات (الشكل 1A–B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تقدم هذه الدراسة سير عمل قابل للتكرار قائم على DESeq2 لتحليل بيانات RNA-seq الجماعية عبر التباينات البيولوجية المحددة مسبقا. يدمج البروتوكول المعالجة المبدئية الموحدة، وتعيين البيانات الوصفية الموثقة، والتطبيع، واختبار التعبير التفاضلي، والمخرجات اللاحقة المنظمة، مما يتيح تولدا متسقا وشفافا لنتائج النسخ النصية. من خلال تحديد خطوات ومعايير تحليلية بشكل صريح، تم تصميم سير العمل لتحسين قابلية التكرار والمقارنة عبر الدراسات 6,7,11

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا توجد مصالح متنافسة بين المؤلفين.

شكر وتقدير

المؤلفون لا يحصلون على أي اعترافات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
clusterProfiler (R package)BioconductorRRID:SCR_016884تحليل الإثراء الوظيفي (GO ومسارات KEGG)
DESeq2 (R package)BioconductorRRID:SCR_015687تحليل التعبير التفاضلي لبيانات RNA-seq المستندة إلى العدد
ggplot2 (R package)CRANRRID:SCR_014601تصور مخططات PCA والمخططات البركانية والرسوم البيانية الملخصة
GitHub (اختياري)GitHub Inc.RRID:SCR_002630التحكم في الإصدار ومشاركة البرامج النصية القابلة للتكرار
HTSeq-count مجموعة بيانات RNA-seq (GSE162535)NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)RRID:SCR_005012مصفوفة عداد RNA-seq الضخمة المستخدمة كمدخل للتحليل
matrixStats (R package)CRANRRID:SCR_016361حساب فعال لإحصاءات الصف/العمود (مثل التباين)
openxlsx (R package)CRANRRID:SCR_019215تصدير جداول النتائج إلى تنسيق Excel
نظام التشغيلMicrosoft / Apple / LinuxN/Aدعم Windows 10+، macOS، أو Linux
org.Mm.eg.db (R package)BioconductorRRID:SCR_002815قاعدة بيانات تعليق الجينات للفأر لتعيين معرف الجينات
عارض PDFأيN/Aعرض مخرجات الرسوم البيانية (PCA، الخرائط الحرارية، المخططات البركانية)
الكمبيوتر الشخصي أو محطة العملأيN/Aتوصية بحد أدنى 16 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي لتحليل RNA-seq
pheatmap (R package)CRANRRID:SCR_016418تصور الخريطة الحرارية للتعبير الجيني والتجميع
R Statistical Software (الإصدار &ge؛ 4.2)R Foundation for Statistical ComputingRRID:SCR_001905بيئة الحوسبة الأساسية لجميع تحليلات RNA-seq
RColorBrewer (R package)CRANRRID:SCR_015742لوحات الألوان للخرائط الحرارية والرسوم البيانية
RStudio DesktopPosit SoftwareRRID:SCR_000432بيئة تطوير متكاملة (IDE) للبرمجة والتكرار
ملف البيانات الوصفية للعينة (صيغة CSV)المولد / تعليقات GEON/Aتعليق عينة منسق يربط العينات بمجموعات CB وMB وAB
stringr (R package)CRANRRID:SCR_019195معالجة السلسلة لتصور الإثراء والتنسيق
tibble (R package)CRANRRID:SCR_019186معالجة الإطارات البيانية وهياكل البيانات المرتبة
tidyverse (مجموعة حزم R)CRANRRID:SCR_019186معالجة البيانات، التحويل، والتصور

المراجع

  1. Storm J, Craig AG. Pathogenesis of cerebral malaria—inflammation and cytoadherence. Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:100.
  2. Hinduja S, Kunieda M. Modelling of ECM and EDM processes. CIRP Annals. 2013 Jan 1;62(2):775–97.
  3. Soares SMA, Gualberto ACM, da Costa AC, Gonçalves DA, Gameiro J. A high-fat diet protects C57BL/6 mice from Plasmodium berghei ANKA infection in an experimental malaria study. Front Trop Dis. 2023;4:1188902.
  4. Manzoni G, Try R, Guintran JO, Christiansen-Jucht C, Jacoby E, Sovannaroth S, Zhang Z, Banouvong V, Shortus MS, Reyburn R, Chanthavisouk C. Progress towards malaria elimination in the Greater Mekong Subregion: perspectives from the World Health Organization. Malaria Journal. 2024 Mar 1;23(1):64.
  5. Wang Q, Tang Y, Pan Z, Yuan Y, Zou Y, Zhang H, et al. RNA-seq-based transcriptome analysis of the anti-inflammatory effect of artesunate in early treatment of a mouse cerebral malaria model. Mol Omics. 2022;18(8):716–30.
  6. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15(12):550.
  7. Anders S, Huber W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 2010;11(10):R106.
  8. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40.
  9. McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(10):4288–97.
  10. Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 2016;17:13.
  11. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284–7.
  12. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013 Jan 16;14(1):7.
  13. Shen-Orr SS, Gaujoux R. Computational deconvolution: extracting cell type–specific information from heterogeneous samples. Curr Opin Immunol. 2013;25(5):571–8.
  14. Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545–50.
  15. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years. Nat Rev Genet. 2019;20(11):631–56.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

علم المناعة والعدوىالعدد 233العدد 233قيمة فارغةعددتسلسل الحمض النووي الريبوزي بكميات كبيرةالتحليل الترانسكريبتوميالالتهاب العصبيالعلاج بالأرتيزوناتالتعبير الجيني التفاضليتوصيف المسارات المناعية

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.