سير عمل حقن ميكروي بنظام CRISPR/Cas9 لوضع وسم فلوري داخلي في خط جرثوتي Caenorhabditis elegans للحصول على خطوط التوصيل المتماثلة لتحليل مواقع البروتينات في الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الوسم الفلوري الداخلي المعتمد على CRISPR/Cas9 لجينات محددة في التهاب الكاينورهابديتس المهاجر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد تحديد موقع البروتين في خط جرثوتي Caenorhabditis elegans (C. elegans) محوريا لتفسير وظيفة الجينات أثناء تكوين الأمشاج، ومع ذلك غالبا ما تؤدي الطرق التقليدية للجينات المعدلة إلى تعبير متغير ويمكن إسكاته في الخلايا الجرثومية. هنا، يوصف سير عمل عملي ل CRISPR/Cas9 يدخل علامة فلورية في موقع داخلي النشأة، مما يمكن من توليد أليلات مستقرة تثبت توزيع البروتينات تحت التنظيم الطبيعي. يغطي البروتوكول المراحل الرئيسية من الإجراء: اختيار استراتيجية وسم مناسبة للبروتين المستهدف، وتوصيل كواشف كريسبر عن طريق الحقن الدقيق للغدد التناسلية في الخنثى الشابة، واستعادة الحيوانات المحقونة للفحص. يتم تحديد المرشحين المرتبطين من خلال التصنيف الجيني المعتمد على PCR عبر جيلين لعزل الديدان المتماثلة الزيجوت والتحقق من الأليل المعدل. وأخيرا، يستخدم المجهر الكونفوكلي للتحقق من تألق الجرثومة وتقييم التموقع تحت الخلوي في الجسم الحي. تم تصميم سير العمل ليكون قابلا للتكرار وتطبيقا واسعا على الجينات الغنية بالجرثومة، مما يوفر مسارا مباشرا لتأسيس سلالات متماثلة الزيجوت للتحليلات التطورية والبيولوجية الخلوية.
المقدمة
Caenorhabditis elegans (C. elegans) هو نموذج راسخ لدراسة التطور التناسلي وتكوين الأمشاج، وذلك بسبب دورة حياته القصيرة، وجسمه الشفاف، وقابليته الوراثية العالية1. توجد C. elegans بشكل أساسي كخنثى ذاتية التلقيح، حيث تخضع غددتها التناسلية أولا لتكون الحيوانات المنوية، ثم تتحول إلى تكوين البويضات. هذا النمط التناسلي يبسط الحفاظ على الإجهاد ويجعل من السهل الحصول على خطوط متجانسةالزيجوت 2. وقد وسعت التقنيات الحديثة في النسخ المكاني قائمة الجينات الغنية في الغدد التناسلية بشكل كبير وكشفت عن أنماط تعبير واضحة خاصة بالجنس عبر الجهاز التناسلي في C. elegans3. مؤخرا، مكن تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من إعادة بناء مسارات تطور الخلايا الجرثومية واستنتاج شبكات تنظيم الجينات التي تحكم تكوين الحيوانات المنوية4. معا، تولد هذه المجموعات قوائم مرشحين غنية، لكن التفسير الوظيفي غالبا ما يتطلب مراقبة سلوك البروتينات في الجسم الحي — وتحديدا تحديد متى وأين تتووضع البروتينات المقابلة وكيف تتغير أنماطها خلال تطور الخط الجرثوي.
غالبا ما تعتمد عملية التحول الوراثي التقليدية في C. elegans على الحقن الدقيق للغدد التناسلية للحمض النووي البلازميدي، مما يولد بسهولة مصفوفات خارج الكروموسومات متعددة النسخ5. ومع ذلك، في الخط الجرثوي، غالبا ما يتم إسكات هذه المصفوفات بشكل قوي، وهو آلية يعتقد أنها تساعد في الحفاظ على سلامة الخط الجرثوي من خلال تقييد التعبير عن الحمض النووي المتكرر، مما يحافظ على وظيفة الخط الجرثوي واستقرار المعلومات الجينية عبر الأجيال 6,7. نتيجة لذلك، يمكن أن تكون البنى التعبيرية المعدلة جينيا التي تعبر عنها بسهولة في الأنسجة الجسدية ضعيفة أو غير متسقة في الخط الجرثوي. حتى عندما يكون التعبير قابلا للكشف، يمكن لتأثيرات أرقام النسخ والعناصر التنظيمية الهندسية أن تغير جرعة البروتين وتوقيته، مما قد يربك الاستنتاجات حول تحديد الموقع والديناميكيات الأصلية. لمعالجة هذه القيود، يستخدم القصف الجسيمات الدقيقة وإدخال النسخة المفردة (MosSCI) بوساطة Mos1 على نطاق واسع لتوليد خطوط معدلة وراثيا منخفضة أو مفردة النسخة 8,9,10. يمكن لهذه الطرق تحسين التعبير في السلالة الجرثومية، لكنها تختلف في التكلفة والإنتاجية ومدى جودة إعادة إنتاج التنظيم الداخلي. يوفر تحرير الجينوم بتقنية CRISPR/Cas9 مسارا أكثر مباشرة من خلال إدخال علامة فلورية في الموقع الداخلي عبر إصلاح موجه بالتماثل، مما يولد أليلات مستقرة تنقل مواقع البروتين وديناميكياته تحت السيطرة التنظيمية الطبيعية 11,12,13,14.
هنا، يوصف سير عمل عملي للوسم الفلوري الداخلي الموحد بتقنية كريسبر/كاس9 في C. elegans ، يطبق على الجينات المختارة بناء على أنماط تعبير مغنية بالخط الجرثوي المبلغ عنها. يوضح البروتوكول اختيار الهدف، وتصميم قالب المتبرع ودليل الحمض النووي الريبي، والحقن الدقيق للغدد التناسلية، والفحص التالي لعزل خطوط التوصيل المتماثلة، تليها التحقق باستخدام التصنيف الجيني. هذا النهج قابل للتطبيق بشكل واسع على الجينات المعبر عنها عبر الخط الجرثومي عبر مراحل التطور ويتيح تحليلات كمية لتحديد مواقع البروتين وديناميكياته في الجسم الحي. يوفر هذا السير استراتيجية عملية لوضع علامات على الجينات المعبر عنها في الخط الجرثومي ولتحليل توطين البروتين وديناميكياته في الجسم الحي تحت الرقابة التنظيمية الأصلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع التجارب التي شملت Caenorhabditis elegans أجريت وفقا للإرشادات المؤسسية لرعاية واستخدام الكائنات المختبرية في جامعة بكين العادية.
الشكل 1: نظرة عامة على الوسم الفلوري الداخلي البوساط بواسطة كريسبر/كاس9 في C. elegans. سير عمل تخطيطي يوضح المراحل الرئيسية لتوليد والتحقق من التأهيل الفلوري الداخلي. في مرحلة التصميم والبناء، يتم اختيار جين هدف مثري بالجرثومة وموقع إدخال، ويستخدم pDD162 كبلازميد CRISPR/Cas9 لتعبير Cas9 ودليل RNA، ويستخدم pPD95.75 كعمود فقري متبرع حيث يتم استنساخ وسم الفلورسنت (مثل GFP) وأذرع التجانس الأيسر والأيمن. في مرحلة الحقن المجهر، يتم توصيل خليط حقن كريسبر/كاس9 (بما في ذلك بلازميد gRNA/Cas9، وقالب المتبرع، وعلامات الحقن المشتركة) إلى الغدد التناسلية لدى الخنثى البالغين الشباب، يليه الاسترداد على ألواح مزروعة. في مرحلة التحقق، يتم اختيار النسل الإيجابي للعلامات لإجراء التصنيف الجيني لاحقا، بما في ذلك التعرف على أحداث الاصطدام بالتفاعل الإيجابي المكثف وتأكيده عبر تسلسل الحمض النووي، ويتم فحص خطوط الإدخال الناجحة لاحقا بواسطة المجهر الفلوري لتقييم تعبير الخط الجرثومي وتحديد الموقع تحت الخلوي للبروتين الموسوم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
1. اختيار جين هدف محظوظ بالخط الجرثومي
- تحديد الجينات المرشحة ذات التعبير السائد في الغدد التناسلية أو الخلايا الجرثومية باستخدام قواعد البيانات العامة والأدبيات المنشورة.
- اختر موقع وسم مناسب بناء على خصائص البروتين. سجل الشكل المماثل المختار ووضع إدخال العلامة لتصميم الحمض النووي الريبي التوجيهي ونموذج المتبرع (الشكل 1).
2. تصميم دليل RNA وقالب المتبرع
- تحديد تسلسل RNA موجه 20 NT (gRNA) أعلى النقوش المجاورة للبروتوسباسير (PAM؛ NGG)، التسلسل المطلوب للتعرف على Cas9، ووضعه بالقرب قدر الإمكان من موقع إدخال العلامة المقصود.
- قيم جرنا المرشحة باستخدام أداة تصميم إلكترونية (مثل أداة تصميم IDT CRISPR) مع اختيار جينوم C. elegans. اختر دليلا يتمتع بكفاءة قطع متوقعة قوية في الهدف ولا توجد مواقع متوقعة عالية المخاطر خارج الهدف.
- قم باستنساخ تسلسل gRNA في المنطقة بين محفز U6 وسقالة gRNA داخل العمود الفقري للبلاسميد لتعبير CRISPR.
ملاحظة: برايمرات تصميم تدمج تسلسل gRNA كبروز بارزات. إجراء تضخيم PCR يليه تجميع قائم على إعادة التركيب المتماثل، وهي طريقة استنساخ مستقلة عن الربط تلغي هضم إنزيمات التقييد وتمكن الاستنساخ بخطوة واحدة مباشرة إلى متجه التعبير15. - تأكد من الإدخال الصحيح بواسطة تسلسل سانجر.
- بناء البلازميد المانح باستخدام علامة فلورية محاطة بحوالي 1000 قطعة طيران من اليسار و1000 قطعة طيران أذرع التجانس اليمنى مشتقة من موقع الهدف.
ملاحظة: قم بتضخيم أذرع التجانس من الحمض النووي الجينومي N2 المحضر كمحلل دودة باستخدام هضم البروتيناز K. تمشيط التصميم التي تتداخل بين 15–20 بت بولبول مع العلامة المتجهة والفلورية الخطية. قم بتجميع أذرع التماثل والوسم في العمود الفقري عبر إعادة التركيب المتماثلة في تفاعل واحد. أدخل علامة الفلورسنت مباشرة بعد رمز بدء ATG لوضع العلامات على الطرف N أو قبل رمز التوقف لوضع العلامات على الطرف C. تضمين تسلسل رابط بين الجين المستهدف وعلامة الفلورسنت للحفاظ على طي البروتين ووظيفته بشكل صحيح. استخدم الرابط لتقليل التداخل الستيريكي بين شركاء الاندماج، وضمان إدراج كل من الرابط والعلامة في إطار تسلسل الترميز. اختر موقع الإدخال بعناية لتجنب تعطيل المجالات الوظيفية المعروفة أو المتوقعة، أو الببتيدات الإشارية، أو المناطق العابرة للأغشية (الملف التكميلي 1). - إدخال استبدالات صامتة في تسلسل قالب المتبرع المتماثل لتعطيل تسلسل PAM أو تسلسل الارتباط بالدليل دون تغيير تسلسل البروتين ومنع إعادة قطع Cas9 بعد الدمج.
ملاحظة: دمج الطفرات النقطية المرادفة في البادئات المستخدمة في تضخيم ذراع التجانس، مستهدفة الكودونات داخل منطقة PAM. - تأكد من سلامة تسلسل المانح عبر كل من ذراعي التجانس ووصلات العلامات بواسطة تسلسل سانجر.
ملاحظة: تخزين البلازميدات المؤكدة عند −20 درجة مئوية للتخزين قصير الأمد أو −80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد.
3. جهز خليط الحقن
- قم بتجميع خليط الحقن بدمج بلازميد تعبير كريسبر، وبلازميد المتبرع (المبني بناء على pPD95.75)، وعلامات الحقن المشتركة في dH₂O المعقم إلى حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر عند التركيزات المدرجة في الجدول 1.
ملاحظة: تحسين التركيزات تجريبيا لتحقيق توازن بين قابلية قراءة المؤشر، وتعافي المرشحين، والبقاء بعد الحقن. - قم بعمل طرد مركزي لخليط الحقن عند 10,000 × جرام لمدة 10–20 دقيقة لتكوين ذرات الحبيبات ومنع انسداد الشعيرات الدموية الدقيقة للحقن.
| المكون | الوظيفة | تركيز العمل (ng/μL) |
| pDD162 | بلازميد CRISPR/Cas9 (تعبير Cas9 وgRNA) | 50-100 |
| بلازميد المتبرع (العمود الفقري pPD95.75) | قالب مانح HDR يحمل علامة فلورية محاطا بأذرع تجانس ~1 كيلوبايت | 50-100 |
| pRF4 | علامة الحقن المشتركة (النمط الظاهري للبكرة) | 50-100 |
| pPD122.11 | علامة الحقن المشترك (تعبير GFP) | 5-10 |
| DDH2O المعقم | نأتقل إلى المجلد النهائي | – |
الجدول 1: تركيب خليط الحقن ووظائف البلازميد. يحتوي خليط الحقن على بلازميد تعبير كريسبر، وبلازميد المتبرع، وpRF4، وpPD122.11 عند التركيزات الموجهة، ليصبح الحجم الإجمالي 10 ميكرولتر.
4. تحميل وتحضير إبرة الحقن
- اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية إلى إبر حقن دقيقة باستخدام أداة سحب الإبر مصممة لإنتاج تدرج طويل ذو طرف حاد مناسب لحقن الغدد التناسلية.
ملاحظة: قم بتحسين معلمات السحب تجريبيا. أمثلة على معلمات البداية: الحرارة = 540، السحب = 20، السرعة = 100.
تحذير: تعامل مع الإبر المسحوبة بعناية لتجنب إصابات الثقب. استخدم الملقط عند التعامل مع الإبر وتخلص منها في حاوية للأحذية الحادة. - سخن ماصة شعيرات دقيقة وقم بتقطيعها إلى قطعتين لإنشاء أداة تحميل.
ملاحظة: يمكن استخدام رؤوس التحميل التجارية كبديل. - قم بتثبيت لمبة شفط مطاطية على الطرف العريض من الماصة الدقيقة القصيرة الشعرية.
- يتم استنشاق حوالي 1 ميكرولتر من خليط الحقن الشفاف إلى المحمل.
ملاحظة: الحجم الدقيق ليس أمرا حاسما. تأكد من أن المحلول يملأ طرف الإبرة. - أدخل الجرافة في الجزء الخلفي من إبرة الحقن وقم بتفريغ خليط الحقن بلطف.
- ضع الإبرة المحملة أفقيا لمدة 10 دقائق للسماح للمحلول بالاستقرار نحو الطرف وتأكيد وجود عمود مستمر.
- ثبت الإبرة على مجهر الحقن واجعل الطرف في التركيز باستخدام عدسات الحقل المضيء.
- افتح طرف الإبرة بلمسه بلطف بحافة غطاء الغطاء بزيت هالوكربون واختبر التدفق.
ملاحظة: اضبط ضغط الحقن (30–80 رطل لكل بوصة مربعة) لتوليد فقاعة تكاد تساوي قطر الغدد التناسلية ضمن 1 ثانيةو16.
5. تحضير الديدان للحقن
ملاحظة: جهز صفائح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) ومخزن M9 كما هو موضح سابقافي 17. الحفاظ على الديدان على الصفائح المزروعة بالإشريكية القولونية OP50 (وفيما بعد OP50) وإجراء الحقن في خلفية N2.
- اختر خنثى L4 من صفيحة صحية واحتضنها عند 20 درجة مئوية لمدة 10 ساعات للحصول على شباب بالغين لديهم خطوط جرثوفية متطورة.
- انقل الديدان إلى صفيحة غير مزروعة لتقليل انتقال البكتيريا.
- حضر وسادة جافة بحجم 2٪ أغاروز على شريحة زجاجية ووضع قطرة من زيت الهالوكربون.
- انقل دودة إلى وسادة الأغاروز باستخدام أداة التقاط الرموش.
- ثبت حركة الدودة ووجه الغدد التناسلية للحقن.
تحذير: أكمل الحقن خلال 20–30 دقيقة لمنع الجفاف.
6. إجراء حقن دقيق في الغدد التناسلية
الشكل 2: تحديد موقع الغابة البعيدة للحقن الدقيق لدى خنثى C. elegansالصغيرة. (A) صورة منخفضة التكبير لخنثى شاب بالغ مركب على شكل خنثى. كلا ذراعي الغدد العظمية مرئية؛ يتم تحديد موقع الحقن لذراع واحدة (السهم) كمثال تمثيلي. المنطقة المغلفة تحدد المنطقة المعروضة بتكبير أعلى في اللوحة B. (B) عرض DIC بتكبير أعلى للغدد البعيدة المقابلة للمنطقة المعبأة في اللوحة A. يشير السهم إلى موقع الحقن داخل المخلية البعيدة في الغدد التناسلية، حيث يتم توصيل خليط الحقن. أشرطة السلالم: 100 ميكرومتر (A) و20 ميكرومتر (B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
- حدد موقع دودة ثابتة وحدد الغدد التناسلية باستخدام هدف تكبير منخفض.
- ضع الإبرة في موقع باستخدام أدوات التحكم الدقيقة (micromanipulator).
- وجه الدودة بزاوية 20–40° بالنسبة للإبرة.
- ركز على الخط الجرثومي البعيد باستخدام تكبير أعلى.
- حرك الدودة نحو الإبرة ووضع الطرف داخل الغدد التناسلية (الشكل 2).
- حقن المحلول وتأكد من الولادة من خلال تورم ظاهري للغدد التناسلية.
ملاحظة: قم بتحسين ضغط الحقن (30–80 رطل لكل بوصة مربعة)، وضغط التعويض (0.1–0.5 رطل لكل بوصة مربعة)، ومدة الحقن (0.1–0.3 ثانية).
تحذير: الضغط أو الحجم الزائد يمكن أن يسبب تمزق الدودة. - اسحب الإبرة وأعيد وضعه للحقن لاحقا.
ملاحظة: قم بحقن أحادي الجانب لتعظيم البقاء، أو حقنة ثنائية لزيادة كفاءة التحرير. - أضف مخزن M9 لإطلاق الديدان ونقل كل دودة إلى صفيحة استرداد فردية.
- تكرار الحقن ل 20–25 دودة.
ملاحظة: استبدل الإبرة إذا انسدت أو تعرضت للتلف. - حضن الديدان المحقونة عند 20 درجة مئوية لمدة 2–3 أيام للسماح بالتعافي.
7. فحص مرشحي الفورمولا 1 لتحديد خطوط الضربة الإيجابية
- افحص نسل F1 لعلامات الحقن المشتركة واختيار الحيوانات الموجبة للعلامات.
ملاحظة: أمثلة على علامات الحقن الفلورية البديلة ذات خصائص الأنسجة المختلفة والخصائص الطيفية في الجدول التكميلي 1.
ملاحظة: اختر حيوانات تعبر عن كلا العلامتين لزيادة الموثوقية. أعط الأولوية للحضانات ذات التكرار العالي للعلامات ("الحضانات الكبرى"). - انقل كل دودة F1 إلى طبق منفصل واترك البيض يضع لمدة يوم إلى يومين.
- قم بتحليل كل دودة F1 في مخزن K البروتيناز لتحضير قوالب PCR.
ملاحظة: قم بتخزين الليزاتات عند −80 درجة مئوية إذا لم تتم معالجتها فورا. - قم بإجراء PCR الوصلة باستخدام تمهيد جينومي واحد خارج ذراع التجانس ومبرايمر وسم داخلي واحد.
ملاحظة: احتفظ بالصفائح المقابلة من الحيوانات الموجبة ل PCR F1.
8. فحص النسل F2 لعزل خطوط الضرب المتماثلة وتأكيد التكامل
- عزل نسل F2 من خطوط F1 الموجبة PCR على الصفائح الفردية.
- السماح لديدان F2 بإنتاج ذرية وتحليل البالغين للتحليل الجيني.
ملاحظة: قم بتخزين الليزاتات عند −20 درجة مئوية إذا لزم الأمر. - قم بإجراء PCR باستخدام بادئات جانبية لأذرع التجانس لتمييز الأليلات البرية والأليلات القابلة للدخول حسب حجم المنتج.
- تأكد من التكامل الصحيح من خلال تسلسل سانجر عبر كلا وصلتي الإدخال.
- تحقق من تعبير وتحديد موقع فلورة الخط الجرثوي باستخدام مجهر التألق.
- قم بتوسيع خطوط متجانسة الزيجوت المؤكدة والحفاظ على الأسهم.
ملاحظة: تم التحقق من صحة خطوط CRYOPRESERVE للتخزين طويل الأمد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وفقا للبروتوكول، تم حقن الخنثى الصغار في الغدد التناسلية ببلازميد CRISPR/Cas9 (pDD162)، ومتبرع بلازميدي يشفر علامة دخول GFP محاطة بأذرع تجانس بحوالي 1 كيلوبايت (pPD95.75)، وعلامات حقن مشتركة (pRF4 و pPD122.11). تم استخدام جين هدف غني بالخط الجرثيمي كمثال تمثيلي لتوليد أليل متصل مستقر ومتماثل الزيجوت يبلغ عن توطين البروتين تحت الرقابة التنظيمية الطبيعية.
خلال جلستين حقن، تم حقن 30 خنثى P0، وتم تصنيف 20 حيوانا من نوع F1، مما أدى إلى تحديد خطين إيجابيين للاتصال P...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تصميم هذا السير لتوليد خطوط استقرية متجانسة الزيجوت حيث يتم إدخال علامة فلورية في الموقع الداخلي للإبلاغ عن توطين البروتين تحت الرقابة التنظيمية الأصلية 5,6,7,8,9,10. في الواقع، يحكم على النجاح بشكل أفضل من خلال سلسلة تحقق متسلسلة بدلا من أي قراءة واحدة: تحديد المرشحين المحتملين من خلال فح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل بمنح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2023YFA1801100 إلى L.M.)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (32400698 إلى P.W.، 32270774 إلى L.M.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | مكون لتحضير ألواح NGM الأجار |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | تحضير وسادات أجار الأغاروز 2٪ |
| Caenorhabditis elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | سلسلالة أساسية للحقن | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425 | تنقيح خليط الحقن |
| Cholesterol | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | مكون لتحضير ألواح NGM الأجار |
| Co-injection marker plasmid rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | علامة دوارة لإثراء المرشحين | |
| Confocal microscope | ZEISS | LSM880 + Airyscan | التحقق من التعبير عن GFP/التوطين |
| Di-Potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | مكون لتحضير ألواح NGM الأجار |
| Di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | مكون لتحضير مخزن M9 |
| DNA ladder | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | مرجع الحجم لأجار الأغاروز |
| Donor plasmid backbone (pPD95.75) | Addgene | 1494 | قاعدة لبناء مانح HDR |
| Electrophoresis System | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | فصل منتجات PCR على أجار الأغاروز لفحص التقاطع وتحديد النمط النووي |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | مصدر غذائي للدود | |
| Fluorescent co-injection marker plasmid (pPD122.11) | Fire Lab | علامة GFP مشتركة لإثراء المرشحين | |
| Fluorescent stereomicroscope | SOPTOP | SZX12-HT | فحص الديدان الحية لعلامات الحقن المشتركة المتوهجة |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | تصور نطاقات الحمض النووي |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | استخدم مع سحب الإبرة لصنع إبر الحقن |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | منع الجفاف أثناء الحقن |
| Incubator | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | الحفاظ على الديدان في درجة الحرارة القياسية |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | مكون لتحضير ألواح NGM الأجار ومخزن M9 |
| Microcapillary pipettes | KIMBLE | 71900-50 | ساخنة ومقشرة لإنشاء أداة التحميل |
| Microinjector unit | Eppendorf | FemtoJet 4i | توصيل نبضات الضغط المتحكم فيها من خليط الحقن إلى غدة البطن البعيدة عبر إبرة حقن دقيقة (مشغلة بالقدم) |
| Microscope cover glasses | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | تحضير وسادات أجار الأغاروز 2٪ لتركيب الديدان وتجميدها أثناء الحقن المجهري؛ فتح أطراف إبر الحقن ضد حافة الزجاج |
| Microscope for microinjection | ZEISS | Axio Observer.A1 | مجهر للحقن |
| Needle puller | Sutter Instrument Company | Model P97 | سحب أنابيب الزجاج إلى إبر الحقن |
| PCR thermocycler | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | تضخيم PCR |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + Empty sgRNA) | Addgene | 47549 | تعبير Cas9 + sgRNA |
| Peptone | Gibco | 308723 | مكون لتحضير ألواح NGM الأجار |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | مكون لتحضير ألواح NGM الأجار ومخزن M9 |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | مكون لتحضير ألواح NGM الأجار ومخزن M9 |
| Stereomicroscope | Motic | K400L | التقاط الديدان وتركيبها على وسادات الأغاروز وتنفيذ خطوات التعافي بعد الحقن |
المراجع
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).
- Ebbing, A., et al. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).
- Li, L., et al. Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells. Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Fire, A. Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).
- Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences. Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).
- Merritt, C., Seydoux, G. Transgenic solutions for the germline. WormBook. , 1-21 (2010).
- Frøkjær-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
- Vallin, E., et al. A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community. PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
- Wang, P., et al. Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).
- Khan, A. A., et al. A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants. Plant Methods. 13, 86 (2017).
- Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).
- Rieckher, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans microinjection. Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).
- Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833 (2008).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Sci Rep. 6, 20889 (2016).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121-122, 86-93 (2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
