يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تأثيرات تنظيم تعبير SPRY2 و miR-590-5p على الالتهام الذاتي في الخلايا الغضروفية النموذجية لالتهاب المفاصل العظمي البشري

108 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70883

⸱

يوليو 31, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

زاد الإجهاد الالتهابي في نموذج غضروفية C28/I2 المستحث بواسطة IL-1β من miR-590-5p وقلل من تعبير SPRY2. تعديل هذا المحور غير تعبير بيكلين-1 وLC3-II وBcl-2، مما يشير إلى مسار تنظيمي محتمل ل miR-590-5p/SPRY2 قد يؤثر على الاستجابات المرتبطة بالال الذاتي وبقاء الخلايا الغضروفية في التهاب المفاصل العظمي.

الملخص

التهاب المفاصل العظمي (OA) هو مرض تنكسي شائع في المفاصل يتميز بتدمير تدريجي للغضروف وفقدان توازن الخلايا الغضروفية. على الرغم من أن الالتهام الذاتي غير المنظم يساهم في تكوين أمراض التهاب الغضروف الصبغية، إلا أن الآليات الجزيئية التي تحكم الاستجابات المرتبطة بالالتهام الذاتي في الخلايا الغضروفية لا تزال غير مفهومة بشكل كامل. بحثت هذه الدراسة في دور محور التنظيم miR-590-5p/SPRY2 في بيئة دقيقة التهابية لنسيج التراكمي الدهري باستخدام الخلايا الغضروفية البشرية المستحثة بواسطة IL-1β من C28/I2. تم إنشاء نموذج OA في المختبر من خلال معالجة خلايا C28/I2 ب IL-1β. تم تقييم تعبير miR-590-5p وSPRY2 باستخدام PCR الكمي وتحليل Western Blotting. تم استخدام أساليب اكتساب وفقدان الوظيفة لتقييم تأثيرات SPRY2 وmiR-590-5p على العلامات المرتبطة بالالتهام الذاتي Beclin-1 و LC3-II، بالإضافة إلى البروتين المرتبط بالبقاء Bcl-2. تم استخدام التحليل المعلوماتي الحيوي وتجارب الإنقاذ لدراسة العلاقة التنظيمية بين miR-590-5p و SPRY2. أدى علاج IL-1β إلى زيادة ملحوظة في تعبير miR-590-5p مع تقليل مستويات الرنا والبروتينات في SPRY2 (P < 0.05). أدى فرط التعبير عن SPRY2 إلى انخفاض ملحوظ في تعبير بيكلين-1 وLC3-II، مع انخفاض يقارب 65٪ و77٪ على التوالي (P < 0.05). في المقابل، زاد تعبير miR-590-5p الزائد من تعبير بيكلين-1 وLC3-II وBcl-2، بينما أدى تثبيط miR-590-5p إلى عكس هذه التأثيرات وأعاد تعبير SPRY2. دعمت التحليلات الوظيفية SPRY2 كهدف تنظيمي محتمل في المراحل النهائية ل miR-590-5p. تحدد هذه النتائج محور miR-590-5p/SPRY2 كمنظم مهم لتعبير العلامات المرتبطة بالالتهام الذاتي وبقاء الخلايا الغضروفية تحت الظروف الالتهابية، وتشير إلى أهميته المحتملة كهدف علاجي في الالتهاب الدهني.

المقدمة

باعتباره الشكل الأكثر انتشارا لالتهاب المفاصل حول العالم، يعد التهاب المفاصل العظمي (OA) سببا رئيسيا للألم وضعف الحركة والإعاقة الجسدية، مما يفرض عبئا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية والمجتمع1. من الناحية المرضية، يتميز التهاب الدهوية بالتدهور التدريجي للغضروف المفصلي، والتهاب الزلالية، وإعادة تشكيل مرضية للعظم تحت الغضروجي1. تشير التقديرات الوبائية إلى أن حوالي 303 ملايين فرد حول العالم يتأثرون بالتهاب المفيض الدهني، ومن المتوقع أن يزداد هذا العدد مع تقدم عمر السكانوارتفاع معدلات السمنة. في الصين، يقدر انتشار التهاب المفاصل الركني الناتج عن أعراض الركبة ب 8.1٪، مع انتشار أعلى بشكل غير متناسب بين النساء والسكان الريفيين3. على الرغم من انتشاره العالي، لا تزال خيارات العلاج الحالية محدودة إلى حد كبير بإدارة الأعراض من خلال الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (NSAIDs) والتدخل الجراحي للمرض المتقدم4. غياب أدوية التهاب المفاصل العظمية المعدلة للمرض (DMOADs) يعكس فهما غير كامل للآليات الجزيئية التي تنظم توازن الخلايا الغضروفية والبقاء على قيدالحياة.

تعتمد السلامة الهيكلية والوظيفية للغضروف المفصلی على الخلايا الغضروفية المقيمة، التي تحافظ على دوران المصفوفة خارج الخلية (ECM) من خلال توازن بين الأنشطة الابتنائية والكاتابولية6. خلال تقدم التهاب الفتحات الهوائية، تتعرض الخلايا الغضروفية للإجهاد الميكانيكي غير الطبيعي ووسطاء التهابيين، لا سيما الإنترلوكين-1β (IL-1β) وعامل نخر الورم-α (TNF-α)، مما يعزز التحول من تخليق المصفوفة إلى تحلل المصفوفة6. يساهمIL-1 β في تدمير الغضاريف من خلال تحفيز إنتاج البروتينات المعدنية المصفوفية (MMPs) والجريكنازات مع كبح تخليق الكولاجين من النوع الثاني والبروتيوجليكانات7. بالإضافة إلى ذلك، يسبب IL-1β إجهادا تأكسديا وخللا في وظيفة الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى استمات الخلايا الغضروفية وشيخوختها8. وبالتالي، يبقى تحديد مسارات الإشارات داخل الخلايا التي تنظم بقاء الخلايا الغضروفية تحت الظروف الالتهابية أولوية لأبحاث التهاب الفوسمان.

الالتهام الذاتي هو مسار تدهور ليزوزومي محفوظ تطوريا يحافظ على التوازن الخلوي من خلال إزالة وإعادة تدوير العضيات التالفة وتجمعات البروتين9. الالتهام الذاتي الأساسي ضروري لبقاء الخلايا وتوازن الطاقة؛ ومع ذلك، يمكن أن يساهم الالتهام الذاتي غير المنظم في تقدم المرض9. في التهاب المفاصل الدهلية، يعتبر الالتهام الذاتي عادة استجابة وقائية تساعد الخلايا الغضروفية على التكيف مع الإجهاد الخلوي ومقاومة الاستماتةالمبرمجة. أشارت دراسات سابقة إلى أن النشاط الذاتي الاللي ينخفض أثناء تقدم التهاب المفاصل الفاصلي، خاصة في المرض المتقدم، مما يؤدي إلى ضعف في ضبط جودة الخلايا وزيادة فقدان الخلايا الغضروفية11. تستخدم عدة بروتينات عادة كمؤشرات على النشاط المرتبط بالالتهام الذاتي. يشارك بيكلين-1 في بدء تكوين الأوتوفاجوسوم، في حين يستخدم تحويل بروتين الميكروتوبول المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1 إلى السلسلة الخفيفة 3 (LC3-I إلى LC3-II) على نطاق واسع كمؤشر على تكوين الأوتوفاجوسوم12. على النقيض من ذلك، فإن لمفوما الخلايا B 2 (Bcl-2) تثبط الالتهام الذاتي المعتمد على بيكلين-1 بينما تمارس أيضا تأثيرات مضادة للاستماتة13. ومع ذلك، يتطلب تفسير العلامات المرتبطة بالالتفاسم الذاتي الحذر لأن القياسات الثابتة ل LC3-II وBeclin-1 لا يمكنها التمييز بشكل مستقل بين تكوين الأوتوفاجوسوم المعزز والتحلل الليسوزومي الضعيف. على الرغم من هذه القيود، يظل تعديل المسارات المرتبطة بالالتهام الذاتي استراتيجية علاجية واعدة لالتهاب الفصول الدهنية.

الميكرو RNA (miRNAs) هي RNA قصيرة غير مشفرة تنظم التعبير الجيني بعد النسخ عن طريق الارتباط بتسلسلات مكملة ضمن المناطق الثلاثية غير المترجمة (3′-UTRs) من RNA الرسول المستهدف، مما يؤدي إلى تحلل mRNA أو كبت انتقالي14. تم ربط التعبير الشاذ عن الميكرو RNA بتكوين الالتهاب الدهري من خلال تأثيراته على الالتهاب، الاستماتة المبرمجة، وإعادة تشكيل ECM15. من بين هذه الجزيئات، جذب miR-590-5p الانتباه بسبب أدواره التنظيمية في أيض العظام والعمليات المرضية الأخرى. أظهرت دراسات سابقة أن miR-590-5p يعزز التمايز العظامي ويثبط تكوين الدهون في الخلايا الجذعية الميزنشيمية16. في نماذج السرطان، يظهر miR-590-5p وظائف تعتمد على السياق إما كمنظم مسرطم أو مثبط للأورام17. علاوة على ذلك، تم الربط بملفات تعبير ميكروRNA المعدلة، بما في ذلك أعضاء عائلة miR-590، في إعادة تشكيل أنسجة المفاصل المرضي خلال OA18. ومع ذلك، لا يمكن تعميم الأدلة المستخلصة من نماذج الخلايا الجذعية أو السرطانية مباشرة على الخلايا الغضروفية المفصلية الناضجة. لذلك، لا يزال دور miR-590-5p في تنظيم استجابات الخلايا الغضروفية داخل البيئة الدقيقة الالتهابية للفتحة الصبغية غير مفهومة بشكل كامل.

لدراسة الآليات المحتملة في المراحل النهائية ل miR-590-5p في OA، أجريت تحليلات تنبؤ الأهداف في السيليكو ، مع تحديد Sprouty2 (SPRY2) كهدف محتمل في التبذير. ينتمي SPRY2 إلى عائلة بروتينات سبراتي، التي تنظم إشارات إنزيم التيروزين المستقبلي سلبا وتثبط تنشيط مسار RAS/MAPK/ERK 19. نظرا لأن إشارات MAPK تؤثر على تمايز الخلايا الغضروفية والاستجابات الالتهابية والالتهام الذاتي، فقد يمثل SPRY2 عقدة تنظيمية مهمة في فيزيولوجيا أمراض الحمض الصبغي20. تشير الدراسات السابقة إلى أن SPRY2 يمكنه كبح الاستجابات الالتهابية في نماذج التهاب المفاصل الروماتويدي21، ويشارك في تنظيم الموت المبرمج في أنظمة الظهارة22، ويرتبط بالاستجابات المرتبطة بالالتهام الذاتي في نماذج الإصابات الإقفاري23. على الرغم من أن هذه الملاحظات تشير إلى أن SPRY2 يشارك في تنظيم كل من الاستماتة المبرمجة والالتهام الذاتي، إلا أن دوره في الخلايا الغضروفية المفصلية لا يزال غير محدد بشكل جيد. لذلك افترضت أن miR-590-5p وSPRY2 يشكلان محورا تنظيميا يؤثر على بقاء الخلايا الغضروفية تحت ضغط الالتهاب.

استنادا إلى هذه الملاحظات، اقترح أن miR-590-5p يعدل الاستجابات المرتبطة بالالتهام الذاتي في الخلايا الغضروفية عن طريق تنظيم تعبير SPRY2. على الرغم من أن miR-590-5p و SPRY2 تم دراستهما بشكل فردي في سياقات بيولوجية أخرى، إلا أن علاقتهما الوظيفية في خلايا الغضار الغضروفية في التوتمي لم تثبت بعد. في هذه الدراسة، تم استخدام نموذج OA المستحث بواسطة IL-1β في خلايا الغضروفية البشرية C28/I2 لفحص أنماط التعبير ل miR-590-5p و SPRY2 وتقييم تأثيرها على تعبير بيكلين-1 وLC3-II وBcl-2. من خلال دراسة محور التنظيم miR-590-5p/SPRY2، توفر هذه الدراسة فهما للآليات فوق الجينية التي تكمن وراء بقاء الخلايا الغضروفية وتحدد هدفا علاجيا محتملا لالتهاب الغضروف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة حصريا باستخدام خط الخلايا الغضروفية البشري المتوفر تجاريا C28/I2. لم يشارك أي مشارك بشري، أو عينات أنسجة بشرية، أو مواد مشتقة من المرضى، أو حيوانات حية في هذا البحث. لذلك، لم تكن موافقة مجلس مراجعة المؤسسات (IRB) وموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) مطلوبة وفقا للإرشادات المؤسسية والوطنية. الأدوات والمواد الكيميائية والمجموعات والكواشف المستخدمة في البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. بناء نموذج زراعة الخلايا والتسحية الهيكلية

تم الحصول على خط الخلايا الغضروفية البشرية C28/I2 (التفاصيل المقدمة في جدول المواد) من مورد تجاري. لضمان قابلية التكرار التجريبي، تم التحقق من صحة الخلايا باستخدام تحليل التكرار القصير (STR) واختبارها بشكل روتيني لتأكيد غياب تلوث الفطر الفطري. تم استخدام الخلايا بين المقطعين 3 و8 في جميع التجارب. تم الحفاظ على الخلايا في DMEM مع 10٪ مصل البقر الجيني (FBS) و1٪ بنسلين-ستربتوميسين (جميع كواشف الزراعة مفصلة في جدول المواد) عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لتأسيس نموذج التهاب المفاصل العظمي (OA) في المختبر ، تم تحفيز خلايا C28/I2 باستخدام IL-1β البشري المؤتلف. استنادا إلى الأدبياتالمثبتة 6،7، تجارب أولية لتحسين الجرعة-الاستجابة المصممة لتحفيز حالة كاتابولية قوية دون سمية خلوية فورية مفرطة، تم علاج الخلايا ب 20 نانوغرام/مل IL-1β لمدة 24 ساعة.

2. التجميع التجريبي والتحويل

لتوضيح المسارات الميكانيكية، قسمت الدراسة إلى ثلاث وحدات تجريبية رئيسية، كل منها يحتوي على ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة على الأقل:

  1. كسب/فقدان وظيفة SPRY2:
    تم تخصيص الخلايا إلى نموذج التحكم (OA)، OA + الناقل الفارغ (NC)، بلازميد OA + SPRY2 (OE-SPRY2)، ومجموعات RNA صغيرة متداخلة (si-NC وثلاثة تراكيب محددة ل si-SPRY2: si-695، si-800، si-896) لفحص كفاءة التداخل.
  2. تعديل miR-590-5p:
    تم تقسيم الخلايا إلى مجموعة تحكم، نموذج OA، OA + تقليد NC، OA + mimic mimic mimic، OA + miR-590-5p mimic، OA + مثبط NC، وOA + miR-590-5p.
  3. التحقق الوظيفي من العلاقة التنظيمية بين miR-590-5p/SPRY2:
    لتقييم العلاقة التنظيمية المقترحة بين miR-590-5p وSPRY2 بشكل أعمق، خضعت الخلايا لظروف miR-590-5p المحاكاة والمثبطات لتحديد ما إذا كان تعديل miR-590-5p قد غير تعبير SPRY2 في نموذج OA.
    في عملية النقل، تم زرع خلايا C28/I2 في صفائح ذات 6 آبار بحجم 2 × 10 إلى5 خلايا/بئر. عند الوصول إلى التقاء 70٪–80٪، تم إجراء عمليات النقل باستخدام كاشف نقل تجاري قائم على الدهون وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والإجراءات المعتمدة لتوصيل RNA صغير في الخلايا الغضروفية24. باختصار، تم تخفيف البلازميدات (OE-SPRY2 وNC؛ 2 ميكروغرام/بئر) والأوليجوننيوكليوتيدات (miR-590-5p مقلد/مثبط وsiRNAs؛ 50 نانومول) في وسط مصلي مختزل. تم حضان مركبات الحمض النووي الدهني/الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إضافتها بشكل قطري إلى الخلايا في DMEM الخالي من المصل. بعد 6 ساعات من النقل، تم استبدال الوسط ب DMEM كامل يحتوي على 10٪ FBS، وتم زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية قبل استخراج RNA والبروتين.

3. كشف qPCR

تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي والميكرو الريبي باستخدام مجموعة استخراج مخصصة للميكرو الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تقييم نقاء وتركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف UV-Vis، واستخدمت عينات بنسب A260/A280 بين 1.8–2.0 للتحليلات اللاحقة. تم استخدام كواشف النسخ العكسي التجارية لتصنيع cDNA. كان إجراء دورة qPCR كما يلي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 40 دورة بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، و58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ يتبع ذلك تحليل منحنى الانصهار للتحقق من خصوصية البادئات وغياب الديمرات البادئية. خدم β-أكتين وU6 كعناصر تحكم داخلية ل mRNA و miRNA على التوالي. تم حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCt 25. جميع تسلسلات البرايمر، بما في ذلك تلك الخاصة بكول-II، SPRY2، بيكلين-1، LC3، Bcl-2، miR-590-5p، والجينات المرجعية، مدرجة في الجدول 1.

اسم البداية الأساس الأمامي (5′-3′)الأساس العكسي (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAGAGATGGAACGCTTCACGAATGG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-أكتينTGGCACCCAGCAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAACAAGG
Bcl-2TGGGATTCCTGGGGATTGACTCAGTCTACTTCCTGTGATGTGTG
بيكلين-1TCCCGTGGAATGGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGTATCTCTG
LC3-IIكاتكااGAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

الجدول 1: تسلسلات البادئات المستخدمة في التحليل الكمي لتحليل PCR (qPCR). تستخدم تسلسلات البادئية الأمامية والعكسية لتضخيم وقياس نصوص الهدف والتحكم المرجعي الداخلي بواسطة qPCR.

ما لم يذكر خلاف ذلك، تعبر البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه تلاه اختبار S-N-K بعد الاختبار. تشير الرموز: *P < 0.05 مقابل التحكم؛ #P < 0.05 مقابل النموذج المشار إليه أو مجموعة الضوابط السلبية؛ &P < 0.05 مقابل OA+مثبط-NC.

4. كشف البقع الغربية

تم جمع الخلايا وتحللها باستخدام محلول RIPA المدعوم بكوكتيلات مثبطات البروتياز والفوسفاتاز، وفقا لإجراءات استخلاص البروتين والتطميم المناعي المعتمدة. بعد الطرد المركزي عند 14,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي، تم جمع المادة الفائقة، وتم قياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA. تم تفكيك كميات متساوية من بروتين ليزات (30 ميكروغرام)، وحلها بواسطة SDS-PAGE لمدة 1.5 ساعة، ونقلها إلى أغشية PVDF عند 300 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعةو26 ساعة. تم حجب الأغشية بحليب جاف خالي من الدسم بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن بتريس-يحتوي على 0.1٪ Tween 20 (TBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، تلاها الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة مع أجسام مضادة أولية محددة (مثل مضاد SPRY2، تخفيف بنسبة 1:1000). بعد ثلاث غسلات في TBST، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية متقاربة ب HRP مناسبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تم تصور نطاقات البروتين باستخدام نظام كشف ECL وقياسها باستخدام برنامج ImageJ.

5. التحليل الإحصائي

تم تحليل البيانات باستخدام برامج التحليل الإحصائي. أجريت جميع التجارب باستخدام ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة على الأقل (n ≥ 3)، وتعرض البيانات الكمية كمتوسط ± انحراف معياري (SD). قبل الاختبار البارامتري، تم تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك، وتم تقييم تجانس التباين. تم تقييم الدلالة الإحصائية بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاه اختبار ستودنت-نيومان-كيول (S-N-K) بعد الوقوع للمقارنات المتعددة. تم اعتبار P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تأسيس نموذج التهاب الخلايا الغضروفية في المختبر

لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء أمراض التهاب المفاصل العظمي، تم إنشاء نموذج التهابي في المختبرات باستخدام خلايا غضروفية بشرية C28/I2 محفزة ب IL-1β. تم تأكيد صحة هذا النموذج من خلال تقييم تعبير سلسلة الكولاجين من النوع الثاني ألفا 1 (Col-II)، وهو مكون أساسي في مصفوفة الغضروف الهيالينية خارج الخلية وعلامة مميزة للخلايا الغضروفية السليمة. كشف التحليل الكمي أن التعرض ل IL-1β أدى إلى انخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أظهرت دراسات سابقة أن ال miRNA ينظم الالتهام الذاتي في عدة مراحل، بما في ذلك البدء، وإطالة الحويصلة، والنضج27. لقد تم توثيق تورط ال miRNA في مسببات الالتهاب الدهني بشكل متزايد، خاصة من خلال تأثيرات الالتهاب، والموت المبرمج، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية، والمسارات المرتبطة بالالتهام الذاتي. تم ربط miR-590-5p بالتوازن الخلوي والعمليات المرتبطة بالسرطان 28,29,30. في الس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون قسم طب الشيخوخة في مستشفى رويكانغ، جامعة قوانغشي للطب الصيني، على توفير المرافق التجريبية والدعم الفني لهذه الدراسة. كما يشكر المؤلفون طاقم المختبر وزملائهم على مساعدتهم في جمع البيانات وتحليلها. وقد دعم هذا العمل مشروع أبحاث العلوم الطبيعية في جامعة قوانغشي للطب الصيني (منحة رقم 2022MS039؛ يتوسط LncRNA-GAS5 تعبير SPRY2 لتثبيط الالتهام الذاتي في خلايا الغضروض الغضروفية في ركبة الفئران: دراسة آلية وتأثير التدخل المبكر لوصفة هوايو كوشي) ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (المؤسسة الإقليمية) (المنحة رقم 82160912؛ مناقشة آلية حول تحلل Skp2 في اليوبيكوتينات، تثبيط فوكس أو1 لتلال الخلايا الغضروفية في الركبة، وتأثير التدخل المبكر لوصفة هوايو كوشي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Anti-β-actin antibodyProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Control داخلي لتحليل Western blot
Anti-SPRY2 antibodyProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324كشف تعبير بروتين SPRY2
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23225تحديد تركيز البروتين الكلي
C28/I2 human chondrocyte cell linePunocelCP-H107نموذج خلية غضروفية في المختبر لدراسات التهاب المفاصل
Complete DMEMKeyGen BiotecKGM12800Sالوسط الأساسي لزراعة الخلايا الروتينية
CWBIO Ultrapure miRNA extraction kitCWBIOCW0627Sعزلة RNA الكلي و miRNA
ECL detection systemThermo Fisher Scientific32106تصور شعاعية كيميائية لشرائح البروتين
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco1891605مكمل نمو زراعة الخلايا
GraphPad Prism version 9.0GraphPad SoftwareN/Aالتحليل الإحصائي وتوليد الرسوم البيانية
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01عكس النسخ من mRNA إلى cDNA
ImageJ softwareNational Institutes of HealthN/Aقياس شدة شرائح Western blot
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015تعريب البلازميدات والأوليغونوكليوتيدات
miR-590-5p mimic, inhibitor, and NCsRiboBioCustom synthesizedتعديل تعبير miR-590-5p
miRNA 1st Strand cDNA Synthesis KitVazymeMR101-02عكس النسخ من miRNA إلى cDNA
Opti-MEM mediumGibco31985-062تحضير مجمعات التعريب
Penicillin-streptomycinGibco15140122الوقاية من التلوث البكتيري في زراعة الخلايا
Protease and phosphatase inhibitor cocktailsMedChemExpressHY-K0010حماية البروتينات أثناء الاستخراج
PVDF membranesMillipore SigmaISEQ00010غشاء نقل البروتين لـ immunoblotting
Recombinant human IL-1βMedChemExpressHY-P78459تحريض ظروف التهابية تشبه OA
RIPA bufferBeyotimeP0013Bتحلل الخلايا واستخراج البروتين
si-SPRY2 constructs and si-NCGenePharmaCustom synthesizedإسكات تعبير SPRY2
SPRY2 overexpression plasmid (OE) and empty vector (NC)GeneChemCustom constructedتقييم تأثيرات زيادة التعبير عن SPRY2
UV-VIS spectrophotometer (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000قياس تركيز RNA ونقاءه

المراجع

  1. Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393:1745-59.
  2. GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2020;396:1204-22.
  3. Tang X, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from the China Health and Retirement Longitudinal Study. Arthritis Rheumatol. 2016;68:648-53.
  4. Latourte A, Kloppenburg M, Richette P. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2020;16:673-88.
  5. Glyn-Jones S, et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386:376-87.
  6. Kapoor M, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:33-42.
  7. Goldring MB, Otero M. Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23:471-8.
  8. Lepetsos P, Papavassiliou AG. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta. 2016;1862:576-91.
  9. Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: Renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728-41.
  10. Caramés B, Olmer M, Kiosses WB, Lotz MK. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis Rheumatol. 2015;67:1568-76.
  11. Lotz MK, Caramés B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:579-87.
  12. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720-8.
  13. Pattingre S, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell. 2005;122:927-39.
  14. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-97.
  15. Miyaki S, Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8:543-52.
  16. Wu Z, Lin Y, Zhang Z, Pan Y. Melatonin-mediated miR-526b-3p and miR-590-5p upregulation promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Pineal Res. 2018;65:e12483.
  17. Chen M, Wang S, Chen Y. miR-590-5p suppresses hepatocellular carcinoma chemoresistance by targeting YAP1 expression. EBioMedicine. 2018;35:142-54.
  18. Endisha H, Rockel J, Jurisica I, Kapoor M. The complex landscape of microRNAs in articular cartilage: biology, pathology, and therapeutic targets. JCI Insight. 2018;3:e98630.
  19. Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? J Endocrinol. 2009;203:191-202.
  20. Loeser RF. Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage. Matrix Biol. 2014;39:11-6.
  21. Zhang W, Chen L, Xiong Y. Intraarticular gene transfer of SPRY2 suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:6727-35.
  22. Liu Y, et al. MicroRNA-124 facilitates lens epithelial cell apoptosis by inhibiting SPRY2 and MMP-2. Mol Med Rep. 2021;23:381.
  23. Wu Y, Gao Z, Zhang J. Transcription factor E2F1 aggravates neurological injury in ischemic stroke via microRNA-122-targeted Sprouty2. Neuropsychiatr Dis Treat. 2020;16:2633-47.
  24. Jiang P, Zheng Z, Tang Y. miR-590-5p affects chondrocyte proliferation, apoptosis, and inflammation by targeting FGF18 in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13:8728-41.
  25. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25:402-8.
  26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:4350-4.
  27. Panagopoulos PK, Lambrou GI. The involvement of microRNAs in osteoarthritis and recent developments: A narrative review. Mediterr J Rheumatol. 2018;29:67-79.
  28. Barwal TS, Sharma P. miR-590-5p: A double-edged sword in the oncogenesis process. Cancer Treat Res Commun. 2022;32:100593.
  29. Mou K, Chen M. miR-590-5p inhibits tumor growth in malignant melanoma by suppressing YAP1 expression. Oncol Rep. 2018;40:2056-66.
  30. D'Adamo S, et al. Autophagy in osteoarthritis: a target for new therapies. Curr Rheumatol Rep. 2020;22:37.
  31. Agarwal V, Bell GW, Nam JW, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 2015;4:e05005.
  32. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19:92-105.
  33. Lee CC, et al. Overexpression of sprouty 2 inhibits HGF/SF-mediated cell growth, invasion, migration, and cytokinesis. Oncogene. 2004;23:5193-202.
  34. Frank MJ, et al. Expression of sprouty2 inhibits B-cell proliferation and is epigenetically silenced in mouse and human B-cell lymphomas. Blood. 2009;113:2478-87.
  35. Cui S, et al. Hsa-miR-22-3p inhibits liver cancer cell EMT and cell migration/invasion by indirectly regulating SPRY2. PLoS One. 2023;18:e0281536.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الطبالعدد 233العدد 233قيمة فارغةالعددخلايا C28/I2نموذج فصال عظمي بشري (OA)miRNA-590-5pBeclin-1LC3IIBcl-2
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.